menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan tetesan ±20 tetesmenit. Sampel pada tabung perkolator tetap dijaga dalam kondisi terendam etanol selama dilakukan
penampungan perkolat. Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan berwarna jernih. Semua perkolat digabung dan disaring, lalu
diuapkan dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator pada tekanan 1 ATM dengan temperatur
≤ 60°C sehingga hasil akhir yang didapat adalah ekstrak kental kulit buah manggis.
Gambar 7. Perkolasi Ekstrak
4.7.2 Pembuatan Suspensi Bahan Uji
Ekstrak kental kulit buah manggis ditimbang menggunakan electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara
dilarutkan dengan media Mueller Hinton Broth MHB. Ekstrak kental kulit buah manggis dimulai dari konsentrasi 100 karena belum diketahui konsentrasi ekstrak
yang mampu menghambat pertumbuhan S.mutans, maka itu pengujian dimulai dengan konsentrasi terbesar. Sediakan tabung untuk diisi 1 ml MHB, kemudian pada
tabung pertama diberi 1gr ekstrak kental kulit buah manggis kemudian divorteks sehingga didapatkan ekstrak etanol kulit buah manggis dengan konsentrasi 100.
Kemudian dilakukan pengenceran dengan cara mengambil setengah dari konsentrasi ekstrak etanol lerak 100 menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung
selanjutnya untuk mendapatkan ekstrak etanol kulit buah manggis 50 pengenceran berganda. Cara yang sama dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi selanjutnya
sampai dengan konsentrasi 0,02437. Masing-masing tabung tersebut kemudian diberi laber sesuai konsentrasinya.
4.7.3 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media MHA sebanyak 12 gram dilarutkan ke dalam 240 ml aquadest untuk 40 petri 20 mlpetri, lalu dipanaskan
diatas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian media yang telah masak, disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan udara 2 ATM,
suhu 151°C. Setelah disterilkan, media disimpan di dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu
dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.
4.7.4 Pembiakan Spesimen
Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO
2
. Streptococcus mutans yang digunakan adalah spesimen Streptococcus mutans ATCC 25175 yang telah dibiakkan secara murni pada media MHA yang telah
disiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan
dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10
8
CFUml.
4.7.5 Penentuan KHM bahan coba
Bahan coba ekstrak kulit buah manggis yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56, 0,78, 0,39, 0,195, 0,0975,
0,0487, dan 0,02437. Dari masing-masing konsentrasi tersebut diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai
konsentrasinya. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-
masing tabung bahan coba yang telah diberi label kemudian divorteks. Lalu tabung- tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam pada inkubator CO
2
dan
diamati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung-tabung tesebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba.
Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau bahan uji apapun
yang mampu menghambat pertumbuhan Streptococcus mutans dalam media perbenihan setelah diikubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam
perbenihan tersebut.
4.7.6 Penentuan KBM bahan coba
Hasil prosedur penentuan nilai KHM tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan penghitungan jumlah
koloni bakteri, yaitu pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625, 0,78, 0,39, 0,195, 0,0975, 0,0487, dan 0,02437 dengan metode
Drop Plate Mills Mesra. Bahan coba dengan konsentrasi tersebut masing-masing divorteks dan diambil 50 μl untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media
padat Mueller Hinton Agar, direplikasi 3 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
den media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap
berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan
suspensi. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian
dibuat jumlah rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah
koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri
pada media padat sebanyak 50 μl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml.
