BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN
4.1 TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Bioindustri, LAPTIAB
– BPPT PUSPIPTEK, Serpong, Tangerang, Banten dengan waktu penelitian selama lima bulan dari Mei- September 2012.
4.2 BAHAN
Limbah pengolahan kertas
, Bacillus sp. BPPT CC RK2. Bahan kimia yang digunakan antara lain : medium Luria Bertani LB, dedak padi, air kelapa,
ekstrak khamir Scharlau, pepton Pronadisa, NaCl Merck, pereaksi Dinitrosalisilat acid DNS, Bouvine Serum Albumin Sigma-Aldrich, pereaksi
Bradford, agar Bacto, CMC Pronadisa, Na2HPO4
.
2H
2
O Merck, NaHPO4 Merck, NaOH Merck, H
2
SO
4
, metanol, butanol, asam asetat, glukosa Sigma, maltosa Sigma, sukrosa Sigma, galaktosa Sigma, arabinosa Sigma, ddH
2
O Milipore, akuades, enzim selulase komersil Primafast 200 Genencor.
4.3 ALAT
Spektrofotometer UV Vis Genesis, Lempeng KLT, Shaker Inkubator Kuhner, Shaker Inkubator GLF, Static Incubator Memmert, Laminar Air
Flow Babcock BF, Refrigerated Centrifuge Gyrozen, Sentrifuge Sigma, pHmeter Inolab, Waterbath, Termomixer Eppendorf, Timbangan analitik
Radwag, Autoklaf Hitachi , Hot plate magnetic stirrer Heindolph , Oven,
Pipet mikro Thermo, Mikrotube Eppendorf, cawan petri, dan alat-alat gelas Pyrex.
4.4 METODA
4.4 .1 Produksi Enzim Selulase dari Bacillus sp. BPPT CC RK2
Media starter dibuat dengan menginokulasikan sebanyak 1-2 ose isolat Bacillus sp. BPPT CC RK2 ke dalam media LB steril 10 media produksi,
kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C , agitasi 150 rpm selama 6 jam. Produksi enzim dilakukan dengan menginokulasikan media starter ke dalam media
produksi, dan diinkubasi pada suhu 37
o
C , agitasi 150 rpm selama 24 jam. Setelah 24 jam, enzim dipanen dengan cara sentrifugasi dengan agitasi 6000 rpm
menggunakan Refrigerated Centrifuge Zyrogen selama 15 menit pada suhu 4
o
C, kemudian supernatannya diambil sebagai fraksi enzim kasar, kemudian enzim kasar tersebut dianalisis aktivitas enzim dan kadar protein.
4.4.2. Proses Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas 4.4.2.1 Variasi Perlakuan Awal Substrat Limbah Pengolahan Kertas dan
Waktu Inkubasi
a. Pretreatment substrat
Sebanyak 5 gram substrat limbah pengolahan kertas
ditambah 100 ml NaOH 1N dalam erlenmeyer dibiarkan selama 6, 12, dan 24 jam. Kemudian
larutan disaring menggunakan kain nilon dan dicuci dengan air yang mengalir hingga pH netral, setelah itu substrat hasil pretreatment dikeringkan semalaman
dalam oven suhu 80˚ C. Dari hasil perlakuan, diambil sebanyak 100 mg substrat limbah pengolahan kertas kemudian dicampur dengan 1 ml larutan buffer phosfat
0,05 M pH 7 lalu ditambahkan enzim selulase kasar dengan variasi konsentrasi
enzim dengan aktivitas 6,12,18 unit kemudian diinkubasi selama 24,48,72,96, dan 120 jam pada suhu 50˚ C. Kadar gula reduksi dihitung dengan menggunakan
metoda DNS Miller, 1959 dan persen sakarifikasi Begum dan Alimon 2011.
b. Perlakuan substrat tanpa pretreatment
Sebanyak 5 gram substrat limbah pengolahan kertas basah
dikeringkan 12 jam
dalam oven suhu 80˚C. Dari hasil perlakuan, diambil sebanyak 100 mg substrat limbah kertas kemudian dicampur dengan 1 ml larutan buffer phosfat
0,05 M pH 7 lalu ditambahkan enzim selulase kasar dengan variasi konsentrasi enzim dengan aktivitas 6,12,18 unit kemudian diinkubasi selama 24,48,72,96, dan
120 jam pada suhu 50˚ C. Dihitung kadar gula reduksi dengan metoda DNS Miller, 1959 dan persen sakarifikasi Begum dan Alimon 2011.
4.4.2.2 Uji Sakarifikasi Limbah pengolahan Kertas dengan Variasi Konsentrasi Enzim
Sebanyak 100 mg substrat limbah pengolahan kertas dicampur dengan 1 ml larutan buffer phosfat 0,05 M pH 5,5 lalu ditambahkan enzim selulase kasar
dengan variasi konsentrasi enzim dengan aktivitas 6,12,18 Unit kemudian diinkubasi selama
96 jam pada suhu 37˚ C. Kadar gula reduksi dihitung dengan menggunakan metoda DNS Miller, 1959 dan persen sakarifikasi Begum
dan Alimon 2011.
4.4.2.3 Uji Sakarifikasi Limbah pengolahan Kertas dengan Variasi Substrat
Seperti prosedur 4.4.2.1 diatas dengan variasi substrat sebanyak 25 ,50, 100, 150, 200 mg ditambah enzim selulase kasar sebanyak 12 unit.
4.4.2.4 Uji Sakarifikasi Pembanding
a. Sakarifikasi limbah pengolahan kertas dengan Enzim Selulase Komersial
Enzim komersil yang digunakan yaitu enzim Primafast 200, dengan kondisi optimum sakarifikasi pada pH 5,5 dengan temperatur inkubasi 60° C.
Sakarifikasi dilakukan selama 96 jam, dan setiap 24 jam supernatan diambil untuk dihitung kadar gula reduksi dan persen sakarifikasi.
b. Blangko
Blangko yaitu sebanyak 100 mg substrat hasil pretreatment 24 jam ditambah buffer sitrat pH 5,5 kemudian diinkubasi pada suhu 37°C. Kadar gula
reduksi dan persen sakarifikasi diukur setiap 24 jam. Sebagai kontrol yaitu larutan buffer sitrat pH 5,5 diinkubasi pada suhu 37°C.
4.4.2.4 Analisa Produk Akhir Sakarifikasi a
Analisa Produk Dengan Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis
Analisa glukosa dilakukan secara kualitatif menggunakan kromatografi lapis tipis dengan larutan pengembang butanol: asam asetat:air 3:3:1. Sampel
ditotolkan dalam pelat silika gel, dan dibiarkan hingga pelarut bergerak menuju keatas dari pelat. Visualisasi kromatogram dilakukan dengan penampak bercak
H
2
SO
4
10 dalam metanol kemudian dikeringkan dalam oven suhu 110 ˚C
selama 5 menit Karmakar dan Ray, 2011. Sebagai pembanding digunakan berbagai standar gula, yaitu glukosa, xylosa, arabinosa, galaktosa, sukrosa dan
maltosa dengan konsentrasi 5 mgml.
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN
Kategori