UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.1.2 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometri UV
Konsentrasi dan kemurnian isolat DNA dianalisis dengan menggunakan spektrofotometri UV. Hasil analisis terlihat pada tabel 6.
Tabel 5. Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil ekstraksi dan isolasi
No. Sampel
Konsentrasi Kemurnian
A280A260
1. Daging Sapi
85,99 ngμl
1,804 2.
Daging Babi 80,08
ngμl 1,824
3. Gelatin Sapi
19, 38 ngμl
1,566 4.
Gelatin Babi 13,
63 ngμl 1,573
Analisis konsentrasi dan kemurnian isolat DNA menggunakan spektrofotometri UV dilakukan pada panjang gelombang 260 nm dan 280
nm. Konsentrasi DNA yang didapatkan pada daging berkisar antara 80 ngμl
– 85 ngμl dengan kemurnian kisaran 1,8. Sedangkan konsentrasi DNA yang didapatkan pada gelatin berkisar antara 13
ngμl – 19 ngμl dengan kemurnian kisaran 1,5. DNA dapat dikatakan murni dari protein apabila
nilai rasio
A260A280 yaitu
berkisar antara 1,8
sampai 2,0
Sambrook et al., 2001. Konsentrasi isolat DNA daging yang didapatkan jauh lebih besar
dibandingkan DNA gelatin. Hal ini dikarenakan pada daging memiliki jumlah sel yang banyak, sedangkan gelatin merupakan produk hasil olahan
dari kolagen sehingga isolat DNA gelatin yang didapatkan sedikit. Nilai kemurnian hasil isolasi pada gelatin dengan nilai dibawah 1,8 menunjukkan
bahwa masih bayak pengotor protein pada hasil isolat DNA gelatin Sambrook et al., 2001. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan Glasel
1995, nilai kemurnian 1,5 memiliki perbandingan persentase teoritis protein dan asam nukleat yaitu sekitar 80 dan 20. Hal ini menunjukkan
bahwa kit komersial ekstraksi dan isolasi DNA yang digunakan belum mampu memisahkan DNA gelatin dari pengotor protein dengan baik.
4.2 Hasil Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI
Runutan basa primer dan probe yang diperoleh dari penelitian Tanabe S. et al., 2007, dianalisa secara in silico dengan cara BLAST berdasarkan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
informasi database NCBI melalui internet. Tujuan dari proses ini adalah untuk mengetahui apakah primer dan probe yang digunakan merupakan
primer-probe spesifik yang hanya mengamplifikasi satu jenis spesies.
Gambar 4.2 Hasil uji spesifitas primer babi dengan BLAST melalui
database NCBI
Keterangan:
=
primer forward babi; = Probe babi;
=
Primer reverse babi.
Hasil BLAST dari database NCBI pada primer forward babi, primer reverse babi, dan probe babi menunjukkan bahwa primer
–probe yang digunakan spesifik untuk DNA babi dengan nilai maksimum identitas 100.
DNA target yang akan diamplifikasi yaitu pada DNA mitokondria-sitokrom b dengan panjang amplifikasi 131 pasang basa Gambar 4.2.
Gambar 4.3 Hasil Uji Spesifitas Primer Sapi dengan BLAST Melalui
Database NCBI
Keterangan:
=
primer forward sapi; = Probe sapi;
=
Primer reverse sapi.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Hasil BLAST dari database NCBI pada primer-probe sapi juga menunjukkan bahwa primer-probe sapi yang digunakan spesifik untuk DNA
sapi digunakan spesifik untuk DNA sapi dengan nilai maksimum identitas 100. DNA target yang akan diamplifikasi yaitu pada DNA mitokondria-
sitokrom b dengan panjang amplifikasi 120 pasang basa Gambar 4.3.
4.3 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Menggunakan Real Time PCR
Amplifikasi DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi menggunkan Real Time PCR dilakukan dengan dua metode, yaitu metode SYBR Green
dan metode Hydrolysis Probe. Hasil amplifikasi dari kedua metode dibandingkan satu sama lain dengan melihat spesifisitas dalam
mengamplifikasi DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi.
4.3.1 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Menggunakan Real Time PCR dengan Metode SYBR Green
Konsentrasi DNA daging sapi; DNA daging babi; DNA gelatin sapi; dan DNA gelatin babi yang digunakan dalam proses amplifikasi masing-
masing adalah 8, 59 ngμL; 8,0 ngμL; 19,38 ngμL; dan 13,63 ngμL.
Konsentrasi DNA daging yang digunakan dilakukan pengenceran sebanyak sepuluh kali dari isolat DNA agar mendapatkan kurva amplifikasi yang
optimal, yaitu kurva yang didapatkan tidak terlalu cepat mencapai fasa plateau pada awal siklus Roche
d
, 2008. Analisis kurva amplifikasi dilihat melalui kenaikan kurva dan nilai CP Crossing Point pada kurva
amplifikasi. Spesifisitas hasil amplifikasi dapat dilihat melalui nilai Tm Melting Temperature pada melt curve.
CP adalah jumlah siklus dimana sampel mulai terbaca di atas Arbitrary Fluorescence Level AFL yang menunjukkan awal mulainya fase
pertumbuhan eksponensial. Oleh karena itu, semakin rendah nilai CP semakin tinggi jumlah DNA target. Tm adalah suhu dimana 50 bagian
dari DNA telah terbuka menjadi untai tunggal. Nilai Tm tergantung dari jumlah basa A, G, T, dan C. Primer yang spesifik akan menghasilkan satu
puncak Tm pada DNA target Sambrook et al., 2001.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
a. Hasil Amplifikasi DNA Metode SYBR Green dengan Primer Sapi
