UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
a. Hasil Amplifikasi DNA Metode SYBR Green dengan Primer Sapi
Amplifikasi DNA dilakukan dengan beberapa percobaan dengan cara memodifikasi program proses amplifikasi yang bertujuan untuk
mendapatkan kondisi optimal dalam amplifikasi. Pada penelitian ini dilakukan modifikasi suhu annealing yaitu pada suhu 60
o
C, 62
o
C, 64
o
C, dan 65
o
C. Dari percobaan tersebut didapatkan hasil amplifikasi DNA yang terbaik yaitu pada suhu 65
o
C yang dapat dilihat pada gambar 4.4.
Gambar 4.4. Kurva Amplifikasi dengan Metode SYBR Green Menggunakan Primer Sapi
Keterangan : DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging Babi; NTC = No Template Control; dan CP = Crossing Point
Pada gambar 4.4, nilai CP hasil amplifikasi DNA daging sapi dan DNA gelatin sapi masing-masing adalah 14,21 dan 20,01. Secara teoritis,
seharusnya nilai CP pada DNA gelatin sapi lebih kecil dibandingkan DNA daging sapi karena konsentrasi DNA gelatin sapi yang digunakan
lebih tinggi dibanding DNA daging sapi. Hal ini dapat dikarenakan DNA pada gelatin memiliki nilai kemurnian yang rendah yaitu 1,5 dimana
terlalu banyak pengotor protein pada isolat DNA gelatin. Nilai kemurnia 1,5 memiliki perbandingan persentase protein dan asam nukleat yaitu
80 dan 20 Glasel, 1995. Oleh karena itu jumlah DNA yang teramplifikasi pada DNA gelatin sapi lebih sedikit dibandingkan pada
DNA daging sapi. Selain itu, pada gelatin banyak DNA yang terfragmentasi. Fragmentasi DNA dapat terjadi dikarenakan gelatin
merupakan produk olahan dari kolagen. Semakin banyak jumlah DNA
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yang terfragmentasi, semakin kecil situs DNA target yang teramplifikasi Edward et al., 1996.
Berdasarkan hasil kurva amplifikasi yang terdapat pada gambar 4.4, DNA daging babi, DNA gelatin babi, dan NTC tidak mengalami
kenaikan kurva amplifikasi. Hal ini menunjukkan bahwa metode SYBR Green dengan primer sapi dapat mengamplifikasi DNA sapi secara
spesifik. Spesifisitas proses amplifikasi menggunakan SYBR Green dapat dianalisa melalui Melting peaks. Proses amplifikasi yang spesifik akan
menghasilkan satu jenis puncak dengan nilai Tm yang sama. Pada gambar 4.5, DNA daging sapi dan DNA gelatin sapi memiliki
nilai Tm yang sama yaitu pada suhu 78
o
C. Nilai Tm tersebut merupakan Tm DNA target amplifikasi. Namun, pada DNA daging sapi, muncul
puncak Tm lainnya yaitu 81,78 yang menunjukkann telah terbentuknya produk amplifikasi yang nonspesifik. Pada daging babi, gelatin babi, dan
NTC tidak muncul puncak Tm yang menunjukkan bahwa tidak terjadi mis-priming ataupun primer-dimer. Primer-dimer adalah terbentuknya
struktur sekunder yang disebabkan karena menempelnya sesama primer sejenis ataupun primer yang tidak sejenis seperti antara primer forward
dengan komplemen primer reverse. Sedangkan mis-priming adalah penempelan primer diluar sekuen DNA target Ponchel, 2007.
Gambar 4.5. Melting Peaks Hasil Amplifikasi dengan Metode SYBR
Green Menggunakan Primer Sapi
Keterangan : DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging Babi; NTC = No Template Control
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pada penelitian ini, proses amplifikasi dilakukan modifikasi suhu annealing karena terdapat perbedaan jauh nilai Tm teoritis pada primer
forward sapi dan Tm pada primer reverse sapi sesuai dengan perhitungan pada lampiran 4, yakni 60
o
C dan 70
o
C. Nilai Tm primer akan mempengaruhi suhu annealing. Apabila suhu annealing yang terlalu
rendah dan tidak tepat, dapat menyebabkan primer menempel dengan DNA secara tidak spesifik sehingga dapat menyebabkan kesalahan
analisis. Menurut Scmittgen 2007 pasangan primer yang baik adalah kedua primer memiliki perbedaan nilai Tm tidak lebih dari 2
o
C. Berdasarkan Rahmawati 2012, optimasi suhu annealing dengan
metode gradien PCR pada primer sapi yang sama dengan penelitian ini didapatkan hasil suhu optimal 60
o
C Lampiran 5. Namun, setelah dilakukan amplifikasi dengan suhu annealing 60
o
C, terjadi amplifikasi pada DNA nontarget seperti DNA yang mengandung babi maupun NTC
No Template Control. Hal ini diduga terjadi karena suhu annealing yang digunakan terlalu rendah bagi primer reverse yang memiliki Tm
70
o
C, sehingga terjadi mis-priming atau primer-dimer. Oleh karena itu optimasi dilakukan dengan meninggikan suhu annealing. Setelah
dilakukan amplifikasi pada suhu annealing 62
o
C, 64
o
C, dan 65
o
C, didapatkan suhu yang paling baik untuk amplifikasi DNA dengan metode
SYBR Green pada primer sapi ini adalah 65
o
C. Pada suhu ini, hanya DNA yang mengandung sapi saja yang dapat teramplifikasi Gambar
4.4. Sedangkan menggunakan suhu annealing 60
o
C, 62
o
C, dan 64
o
C terjadi amplifikasi pada semua DNA baik DNA yang mengandung sapi,
mengandung babi, ataupun pada NTC No Template Control yang tidak mengandung DNA Lampiran 7-9.
b. Hasil Amplifikasi DNA Metode SYBR Green dengan Primer Babi
Kategori