isolat dengan cara membandingkannya antara volume emulsi dibagi dengan total volume filtrat lalu dikali 100 Hamzah et al., 2013. Alur kerja screening
aktivitas biosurfaktan dapat dilihat pada Lampiran 4.
= 100
3.3.4 Uji Potensi Bakteri dalam Memproduksi Biosurfaktan 3.3.4.1 Penentuan Kurva Standar Rhamnosa
Kurva standar Rhamnosa dibuat dengan menggunakan biosurfaktan murni dari jenis Rhamnosa yang diperoleh dari Tokyo Chemical Industries, Jepang.
Rhamnosa dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda yang dilarutkan dengan larutan natrium bikarbonat NaHCO
3
0,05M. Rhamnosa dibuat dengan konsentrasi 10, 50, 100 dan 200 ppm, masing-masing dimasukkan ke dalam
tabung reaksi sebanyak 2 ml. Pada setiap larutan ditambah 3,6 ml larutan orsinol, dipanaskan hingga mendidih, didinginkan pada temperatur kamar selama 15 menit
dan dianalisis dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 421 nm. Persamaan garis regresi kurva standar rhamnosa ditentukan dengan metode Least
Square Glover Mitchell, 2002 dalam Warsito, 2009. Alur kerja penentuan kurva standar rhamnosa dapat dilihat pada Lampiran 5.
Y= a + bX a = Y – bX b =
n∑XY- ∑X∑Y n ∑X
2
- ∑X
2
Dimana: a = intersep b = slope koefisien regresi
Y = absorbansi X = konsentrasi
3.3.4.2 Produksi Biosurfaktan
Untuk memacu bakteri memproduksi biosurfaktan bakteri ditumbuhkan pada media BHB yang mengandung 2 Round Up. Sebanyak 2 ml inokulum cair
isolat bakteri yang setara dengan kekeruhan larutan Mc-Farland diinokulasikan ke dalam 100 ml media BHB yang mengandung 2 Round Up. Media diinkubasi
pada waterbath shaker dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang selama 15 hari. Konsentrasi biosurfaktan yang terbentuk dianalisis dengan metode orsinol yang
Universitas Sumatera Utara
dimodifikasi Chandrasekaran Be Miller, 1980. Media cair dari hasil inkubasi disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit untuk memisahkan
media biakan dengan bakterinya dan diambil supernatannya. Sebanyak 4 ml supernatan diekstrak dengan 2 ml dietilether selama 5 menit. Lapisan ether
diambil dengan pipet tetes, dikeringkan dan dilarutkan kembali dalam 2 ml larutan natrium bikarbonat NaHCO
3
0,05 M. Larutan sampel tersebut di homogenkan dengan vorteks dan ditambah 3,6 ml larutan orsinol, dipanaskan hingga mendidih,
didinginkan pada temperatur kamar selama 15 menit dan dianalisis dengan spektrofotometer. Alur kerja produksi biosurfaktan secara kuantitatif dapat dilihat
pada Lampiran 6. 3.3.5 Uji Potensi Bakteri Penghasil Biosurfaktan dalam Mendegradasi
Herbisida dan Analisis Residu Glifosat Untuk menguji kemampuan isolat bakteri penghasil biosurfaktan dalam
mendegradasi glifosat, sebanyak 2 isolat bakteri yang paling bagus potensinya dalam uji sebelumnya ditumbuhkan pada tanah yang mengandung 2 herbisida
berbahan aktif glifosat. Sebanyak 5 ml inokulum cair isolat bakteri 10
7
selml diinokulasikan ke dalam 500 g tanah yang mengandung 2 Round Up. Kemudian
diinkubasi selama 15 hari. Selama 15 hari masa inkubasi, setiap 5 hari hari 0, 5, 10 dan 15 tanah diambil dan diperiksa kandungan residunya Anupama Paul,
2009. Analisis residu pestisida di dalam tanah menggunakan High-Performance Liquid Chromatographic Analysis sehingga diperoleh nilai konsentrasi herbisida
tersisa dari masing-masing sampel. Alur kerja uji potensi bakteri penghasil biosurfaktan dalam mendegradasi herbisida dan analisis residu glifosat dapat
dilihat pada Lampiran 7.
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pertumbuhan Sel Bakteri dalam Media BHB + 2 Round Up Sebanyak 10 Isolat bakteri Laboratorium Mikrobiologi FMIPA USU hasil isolasi
dari Laut Belawan Sumatera Utara yang telah disubkultur dan diinokulasi ke media BHB yang mengandung 2 Round Up diinkubasi selama 15 hari. Sel isolat
bakteri dihitung jumlahnya dengan metode Standard Plate Count SPC pada hari ke- 5, 10 dan 15. Hasil Pengukuran pertumbuhan isolat bakteri asal Laut Belawan
dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Pertumbuhan sel isolat bakteri penghasil biosurfaktan dari Laut Belawan
pada media BHB selama 15 hari
Kode Isolat
Jumlah Sel CFUml Hari ke-0
Hari ke-5 Hari ke-10
Hari ke-15
NF 1 2x10
6
69x10
6
40 x10
7
10 x10
8
NF 2 2 x10
6
57 x10
6
18 x10
7
5 x10
8
NF 4 2 x10
6
95 x10
6
14 x10
7
10 x10
8
NF 5 2 x10
6
54 x10
6
35 x10
7
38 x10
8
NF 6 2 x10
6
90 x10
6
126 x10
7
20 x10
8
NF 7 2 x10
6
71 x10
6
40 x10
7
23 x10
8
NF 8 2 x10
6
65 x10
6
26 x10
7
7 x10
8
NF 9 2 x10
6
40 x10
6
16 x10
7
10 x10
8
NF 10 2 x10
6
28 x10
6
10 x10
7
30 x10
8
NF 11 2 x10
6
94 x10
6
26 x10
7
14 x10
8
Dari Tabel 1 dapat dilihat bahwa dari hari ke-0 sampai ke-15 semua isolat mengalami kenaikan jumlah sel. Isolat NF5 menunjukkan pertumbuhan sel
tertinggi dengan jumlah 38 x 10
8
CFUml diikuti NF10 dengan jumlah 30 x 10
8
CFUml pada hari ke-15 sedangkan NF2 menunjukkan pertumbuhan terendah dengan jumlah 5 x 10
8
CFUml. Pertambahan jumlah sel bakteri dikarenakan tersedianya nutrisi pada media dimana dalam hal ini bakteri mampu menggunakan
glifosat dan senyawa lainnya yang terdapat pada media sebagai sumber karbon untuk pertumbuhannya. Namun terlihat adanya perbedaan jumlah sel masing-
masing isolat pada hari ke-15 dikarenakan masing-masing isolat memiliki kemampuan yang berbeda dalam mendegradasi glifosat. Hidayat et al. 2006
menyatakan bahwa, laju peningkatan jumlah mikroorganisme tergantung pada
Universitas Sumatera Utara
komposisi dan kondisi fisik lingkungan pertumbuhan yang mampu mendukung mikroorganisme untuk mensintesis sel baru.
Menurut Horowitz et al. 2005, nutrien merupakan hal yang sangat penting artinya bagi pertumbuhan mikroba termasuk bakteri penghasil
biosurfaktan. Beberapa penelitian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa elemen makro yang memegang peranan penting dalam menunjang pertumbuhan
bakteri penghasil biosurfaktan adalah elemen karbon dan nitrogen.
Menurut Okoh 2006, pertumbuhan bakteri biasanya dipengaruhi oleh banyak faktor, diantaranya adalah nilai pH, suhu, nutrien, ketersediaan oksigen,
dan faktor-faktor lainnya. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Yunita 2011 bahwa, isolat bakteri SpB 4, SpB8, SpB12 dan SpB13 asal Laut Belawan
yang diinkubasi dalam media BHB dengan glifosat menunjukkan pertambahan jumlah sel sampai pada hari ke-6. Isolat SpB12 menunujukkan pertumbuhan
tertinggi pada hari ke 6 dengan jumlah 135 x 10
13
CFUml. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri asal Belawan mampu menggunakan glifosat sebagai sumber karbon
untuk nutrisi pertumbuhannya.
Menurut Alexander 1994, nutrisi merupakan faktor yang berpengaruh besar dalam sintesis dan pertumbuhan sel serta dalam aktivitas enzim yang
dihasilkan oleh bakteri untuk mendegradasi polutan. Beberapa nutrisi penting yang dibutuhkan mikroorganisme adalah karbon, nitrogen, dan fosfor. Pada
dasarnya semua mikrroganisme memerlukan karbon sebagai sumber energi untuk aktivitasnya. Nitrogen dan fosfor merupakan penyusun senyawa-senyawa penting
dalam sel yang menentukan aktivitas pertumbuhan mikrooganisme. Ketiga unsur ini harus ada dalam rasio yang tepat agar tercapai pertumbuhan bakteri yang
optimal. Rasio C:N yang rendah kandungan unsur N yang tinggi akan meningkatkan emisi dari nitrogen sebagai amonium yang dapat menghalangi
perkembangbiakan bakteri, sedangkan rasio C:N yang tinggi kandungan unsur N yang relatif rendah akan menyebabkan proses degradasi berlangsung lebih lambat
karena nitrogen akan menjadi faktor penghambat growth-rate limiting factor.
Universitas Sumatera Utara
4.2 Aktivitas Biosurfaktan Aktivitas biosurfaktan dapat ditandai dengan terbentuknya lapisan emulsi diantara
lapisan N-heksan dan media. Dari 10 isolat yang telah diinkubasi dalam media BHB terdapat 9 isolat yang menghasilkan lapisan emulsi dengan indeks emulsi
yang bervariasi. Hasil aktivitas biosurfaktan dapat dilihat dalam Gambar 3.
Gambar 3. Indeks emulsi aktivitas biosurfaktan isolat asal Laut Belawan dalam media BHB selama 15 hari
Gambar 3 dapat menunjukkan bahwa isolat NF9 dan NF1 memiliki indeks emulsi terbesar dengan nilai masing-masing 48 dan 38. Sedangkan indeks
emulsi terendah adalah NF10 dengan nilai 1. Hal ini berbeda dengan hasil pengukuran pertumbuhan sel Tabel 2. NF5 dan NF10 diketahui menunjukkan
pertumbuhan sel yang paling tinggi tetapi indeks emulsi yang dihasilkan masing- masing 26 dan 1. Hal ini dikarenakan setiap isolat bakteri memiliki
kemampuan yang berbeda dalam menghasilkan biosurfaktan. Menurut Duvnjak et al. 1983 biosurfaktan yang dihasilkan masing-masing mikroba berbeda
bergantung pada jenis mikroba dan nutrien yang dikonsumsinya. Demikian pula untuk jenis mikroba yang sama, jumlah surfaktan yang dihasilkan berbeda
berdasarkan nutrien yang dikonsumsinya.
Berdasarkan hasil penelitian Fatimah 2007, mengenai uji produksi biosurfaktan oleh Pseudomonas sp. pada substrat yang berbeda menunjukkan
hasil uji aktivitas emulsifikasi menunjukkan bahwa besarnya kemampuan biosurfaktan dalam mengemulsi hidrokarbon bergantung pada jenis biosurfaktan
10 20
30 40
50 60
NF 1 NF 2
NF 4 NF 5
NF 6 NF 7
NF 8 NF 9 NF 10 NF 11
In deks
Em ul
si
Isolat
Universitas Sumatera Utara
dan minyak uji yang digunakan. Biosurfaktan yang dihasilkan dalam kultur dengan substrat glukosa mempunyai aktivitas emulsifikasi yang lebih baik
dibanding yang lain.
Menurut Rosenberg et al. 1980, perbedaan tipe dan komponen biosurfaktan yang dihasilkan tiap-tiap isolat akan mempengaruhi aktivitas emulsi
yang terjadi pada permukaan cairan. Menurut Desai Desai 1993, kemampuan bakteri untuk menggunakan karbon dari substrat pertumbuhannya untuk
menentukan pengubahan karbon tersebut dalam bentuk biosurfaktan. Biosurfaktan yang dihasikan oleh masing-masing bakteri bisa saja berbeda kualitas maupun
kuantitasnya ketika ditumbuhkan pada substrat yang berbeda, sehingga memberikan aktivitas emulsifikasi yang berlainan, serta perbedaan kemampuan
dalam menurunkan tegangan permukaaan kultur.
Hasil penelitian Ciccyliona dan Nawfa 2012 mengenai pengaruh pH terhadap produksi biosurfaktan oleh bakteri Pseudomonas aeruginosa lokal
menunjukkan bahwa pada uji aktivitas biosurfaktan terjadi proses emulsifikasi antara pelarut dan hidrokarbon uji pada ketiga larutan uji. Hal ini menunjukkan
bahwa endapan yang diuji adalah biosurfaktan. Ketiga hidrokarbon yang digunakan dalam penelitian ini adalah oli, minyak tanah dan N-heksana. Aktivitas
emulsi biosurfaktan yang terbesar ditunjukkan oleh penggunaan hidrokarbon oli dan terendah oleh N-heksan.
Hasil aktivitas biosurfaktan bakteri asal Laut Belawan pada penelitian ini menunjukkan hasil yang lebih tinggi dibandingkan dengan aktivitas biosurfaktan
asal Laut Belawan dalam mendegradasi naftalen yang telah dilakukan Panjaitan 2010, dimana aktivitas biosurfaktan tertinggi ditunjukkan oleh isolat Sp4 dengan
nilai aktivitas emulsi sebesar 28,9. Aktivitas biosurfaktan tertinggi dari bakteri pendegradasi propineb asal tanah pertanian Berastagi ditunjukkan oleh isolat
CBA02 sebesar 34 Utami, 2013, bakteri pendegradasi karbosulfan asal tanah pertanian Berastagi menunjukkan aktivitas biosurfaktan sebesar 41,8 Damanik,
2013.
Universitas Sumatera Utara
4.3 Produksi Biosurfaktan Konsentrasi biosurfaktan diukur dengan menggunakan spektrofotometer dengan
panjang gelombang 421 nm. Konsentrasi biosurfaktan yang terbentuk dapat dilihat dalam Gambar 4.
Gambar 4. Konsentrasi biosurfaktan yang dihasilkan bakteri selama 15 hari inkubasi
Gambar 4 menunjukkan bahwa semua isolat mengalami kenaikan konsentrasi biosurfaktan sampai hari ke-15. Pada hari ke-5 konsentrasi
biosurfaktan tertinggi ditunjukkan oleh NF5 dengan konsentrasi 1,9 ppm sedangkan terendah NF1 dengan 0,7 ppm. Pada hari ke-10 semua isolat
mengalami peningkatan konsentrasi biosurfaktan dimana NF1 menunjukkan konsentrasi tertinggi dengan 1,3 ppm dan NF9 terendah dengan 0,5 ppm. Pada
hari ke-15 konsentrasi tertinggi ditunjukkan oleh NF1 dengan 6 ppm dan terendah NF11 dengan konsentrasi 2,7 ppm. Hasil ini menunjukkan bahwa semua isolat
mampu memproduksi biosurfaktan sekalipun sumber karbon yang diberikan adalah glifosat yang bersifat larut dalam air. Hasil serupa ditunjukkan oleh
penelitian Yunita 2012, isolat asal Laut Belawan yang ditumbuhkan dalam media dengan sumber karbon glifosat juga memproduksi biosurfaktan dengan
konsentrasi lebih tinggi. Isolat SpB4 menghasilkan konsentrasi biosurfaktan sampai 70 dan SpB12 sampai 72.
0,00 1,00
2,00 3,00
4,00 5,00
6,00 7,00
NF 1 NF 2 NF 4 NF 5
NF 6 NF 7 NF 8 NF 9 NF 10 NF 11
Biosurfa kta
n ya
ng Di
produk si
ppm
Isolat
Hari ke-5 Hari ke-10
Hari ke-15
Universitas Sumatera Utara
Hasil produksi ini lebih rendah dibandingkan konsentrasi biosurfaktan bakteri asal Laut Belawan dalam mendegradasi karbofuran dari penelitian yang
telah dilakukan Fadhilah 2015, dimana pada minggu ketiga isolat NF7 menunjukkan nilai produksi biosurfaktan tertinggi sebesar 16,15 ppm diikuti NF1
dan NF2 dengan nilai 15,84 ppm. Perbedaan nilai produksi biosurfaktan ini dapat dikarenakan perbedaan sumber karbon yang digunakan oleh bakteri untuk
metabolismenya.
Menurut penelitian yang telah dilakukan Devianto Kardena 2010, diketahui bahwa peningkatan konsentrasi glukosa dapat meningkatkan
pertumbuhan bakteri Azotobacter vinelandii serta produksi biosurfaktan. Pada konsentrasi glukosa 2 biomassa yang terbentuk sebesar 1,24 gram dengan
produksi biosurfaktan total sebesar 9,191 gram. Sedangkan 9,56 gram glukosa tidak terpakai dalam produksi biosurfaktan. Pada konsentrasi glukosa 3,5 wv
diperoleh 14,3 gram biosurfaktan dari 1,94 gram biomassa yang terbentuk. Glukosa yang tidak dipergunakan dalam produksi sebesar 17,8 gram. Bila
membandingkan antara glukosa yang tidak terpakai dalam produksi biosurfaktan, maka semakin besar penambahan konsentrasi ini tidak memberikan efisiensi
peningkatan produksi. Glukosa yang tidak terpakai dalam produksi biosurfaktan kemungkinan digunakan sebagai energi pada saat adaptasi, namun masih
dimungkinkan keberadaan glukosa yang tidak dipakai sama sekali. Ghazali Ahmad 1997 menyatakan bahwa, faktor-faktor yang dapat mempengaruhi
jumlah produksi biosurfaktan antara lain sumber karbon alami; sumber nitrogen; serta parameter fisika dan kimia seperti aerasi, suhu, dan pH.
Biosurfaktan dapat diproduksi dari berbagai substrat yang dapat diperbaharui.
4.4 Pertumbuhan Sel Bakteri dalam Tanah
