BAB 4 METODE PENELITIAN
4.1 Jenis Penelitian :
Eksperimental Laboratorium Rancangan Penelitian :
Posttest Only Control Group Design
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian 4.2.1 Tempat Penelitian
: 1. Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU
2. Laboratorium Rumah Sakit Khusus Infeksi UNAIR
4.2.2 Waktu Penelitian : 8 bulan
4.3 Populasi, Sampel, dan Besar Sampel 4.3.1 Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah bakteri Enterococcus faecalis. 4.3.2 Sampel penelitian
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah suspensi Enterococcus faecalis ATCC 29212 yang telah diisolasi, diinkubasi, dan dibiakkan dengan media
Mueller Hinton Agar MHA. 4.3.3 Besar Sampel
Penentuan besar sampel sesuai dengan SOP Standard Operational Procedure yang ada di Laboratorium Rumah Sakit Khusus Infeksi Universitas Airlangga. Jumlah
pengulangan yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan rumus Federer 1991. t-1 r-1
≥ 15 7-1 r-
1 ≥ 15 6r
– 6 ≥ 15 6r ≥ 21
r ≥ 3 Keterangan :
t : jumlah perlakuan dalam penelitian r : jumlah perlakuan ulang sampel
Universitas Sumatera Utara
Jumlah perlakuan ulang r yang digunakaan dalam penelitian ini adalah empat kali pengulangan.
Penentuan nilai kadar hambat minimum : Kelompok I
: ekstrak dengan konsentrasi 3,125 = 4 sampel
Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 1,562
= 4 sampel Kelompok III
: ekstrak dengan konsentrasi 0,781 = 4 sampel
Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 0,39
= 4 sampel Kelompok V
: ekstrak dengan konsentrasi 0,195 = 4 sampel
Kelompok VI : ekstrak dengan konsentrasi 0,097
= 4 sampel Kelompok VII
: ekstrak dengan konsentrasi 0,048 = 4 sampel
Kelompok VIII : kontrol positif bakteri tanpa perlakuan = 4 sampel
Kelompok IX : kontrol negatif etanol teknis 70
= 4 sampel Jumlah sampel
= 36 sampel
4.3.3.1 Penentuan Nilai Daya Hambat Minimum
Metode yang digunakan dalam penentuan nilai kadar hambat minimum ekstrak kulit buah manggis ini adalah metode difusi Kirby Bauer 1966 teknik sumuran dengan
menetapkan konsentrasi sebesar 3,125, 1,562, 0,781, 0,39, 0,195, 0,097 ,
dan 0,048.
Cara pengukuran daya hambat menurut CLSI 2012 : Diameter zona hambat = vertikal + horizontal mm
2
: Diameter vertikal : Diameter horizontal
: Zona hambat
Universitas Sumatera Utara
4.4 Variabel dan Definisi Operasional 4.4.1 Variabel Penelitian
Variabel bebas
Ekstrak kulit
buah manggis
dengan konsentrasi mulai dari 3,125, 1,562, 0,781, 0,39,
0,195, 0,097 hingga 0,048
Variabel tergantung
Pertumbuhan bakteri E. faecalis pada media Mueller Hinton Agar
dengan pengukuran nilai kadar hambat minimum menggunakan
metode Kirby Bauer
Variabel terkendali
a. Asal buah manggis Garcinia mangostana L Kutacane, Aceh Tenggara
b. Berat kulit buah manggis sebelum pengeringan 1kg dan setelah dikeringkan 300 gram
c. Lama penyimpanan kulit buah manggis dan suhu sampai proses ekstraksi 7 hari, 40°C
d. Volume etanol teknis 70 yang dipakai 5 liter e. Waktu perendaman simplisia 3 jam
f. Waktu perkolasi 2 minggu g. Nomor kertas saring yang digunakan Whatman No.42
h. Jumlah kertas saring saat perkolasi 3 lapis i. Kecepatan tetes cairan dalam perkolator 30 tetesmenit
j. Sterilisasi alat, bahan coba, dan media k. Suspensi Enterococcus faecalis ATCC 29212
l. Mueller Hinton Agar sebagai media pertumbuhan bakteri Enterococcus faecalis
m. Suhu untuk menumbuhkan Enterococcus faecalis 37°C
n. Waktu pembiakan Enterococcus faecalis 24 jam o. Trypticase Soy Broth sebagai media pengencer bahan
coba
Variabel tidak terkendali
a. Kondisi tanah dan iklim tempat tumbuhnya buah manggis
b. Perlakuan terhadap buah manggis selama tumbuh
c. Lama penyimpanan buah manggis d. Waktu saat pengiriman dari bahan
coba sampai ke Laboratorium Rumah Sakit Khusus Infeksi
UNAIR e. Suhu saat pengiriman dari bahan
coba sampai ke Laboratorium Rumah Sakit Khusus Infeksi
UNAIR f. Suhu penguapan rotary evaporator
g. Suhu inkubator h. Kemampuan berdifusi dari bahan
coba
Universitas Sumatera Utara
4.4.2 Variabel bebas
Ekstrak kulit buah manggis dengan konsentrasi 3,125, 1,562, 0,781, 0,39, 0,195, 0,097, dan 0,048.
4.4.3 Variabel tergantung
Pertumbuhan bakteri Enterococcus faecalis pada media Mueller Hinton Agar MHA dengan pengukuran nilai zona hambat.
4.4.4 Variabel Terkendali Variabel pada penelitian ini terdiri atas :
a. Asal buah manggis Garcinia mangostana L Kutacane, Aceh Tenggara b. Berat kulit buah manggis sebelum pengeringan 1kg dan setelah dikeringkan
300 gram c. Lama penyimpanan kulit buah manggis dan suhu sampai proses ekstraksi 7
hari, 40°C d. Volume etanol teknis 70 yang dipakai 5 liter
e. Waktu perendaman simplisia 3 jam f. Waktu perkolasi 2 minggu
g. Nomor kertas saring yang digunakan Whatman No.42 h. Jumlah kertas saring saat perkolasi 3 lapis
i. Kecepatan tetes cairan dalam perkolator 30 tetes menit j. Sterilisasi alat, bahan coba, dan media
k. Suspensi Enterococcus faecalis ATCC 29212 l. Media Mueller Hinton Agar sebagai media pertumbuhan bakteri Enterococcus
faecalis m. Suhu untuk menumbuhkan Enterococcus faecalis 37°C
n. Waktu pembiakan Enterococcus faecalis 24 jam o. Media Trypticase Soy Broth sebagai media pengencer bahan coba
4.4.5 Variabel Tidak Terkendali
Variabel tidak terkendali pada penelitian ini terdiri atas : a. Kondisi tanah dan iklim tempat tumbuhnya buah manggis
b. Perlakuan terhadap buah manggis selama tumbuh
Universitas Sumatera Utara
c. Lama penyimpanan buah manggis d. Waktu saat pengiriman dari bahan coba sampai ke Laboratorium Rumah Sakit
Khusus Infeksi UNAIR e. Suhu saat pengiriman dari bahan coba sampai ke Laboratorium Rumah Sakit
Khusus Infeksi UNAIR f. Suhu penguapan rotary evaporator
g. Suhu inkubator h. Kemampuan berdifusi dari bahan coba
4.4.6 Definisi Operasional No.
Variabel Definisi Operasional
Cara Ukur Skala
Ukur Alat Ukur
Variabel Bebas
1. Ekstrak
etanol kulit
buah manggis
Ekstrak kental
yang diperoleh dengan melakukan
ekstraksi kulit buah manggis seberat 300 gram yang telah
dikeringkan selama tujuh
hari lalu dimaserasi dengan pelarut etanol teknis 70
dan diperkolasi selama dua minggu dengan kecepatan
tetes cairan 30 tetesmenit kemudian diuapkan dengan
menggunakan vacuum
rotavapor pada suhu 40°C hingga konsistensi kental
Mililiter Nominal
Timbangan dan
erlenmeyer
2. Ekstrak
etanol kulit
buah Ekstrak kental kulit buah
manggis yang
didapat dengan cara mengambil ½
Mililiter Nominal
Mikropipet
Universitas Sumatera Utara
manggis konsentrasi
3,125 dari
konsentrasi ekstrak
etanol kulit buah manggis 6,125 dan dilarutkan dalam
1 ml TSB 3.
Ekstrak etanol
kulit buah
manggis konsentrasi
1,562 Ekstrak kental kulit buah
manggis yang
didapat dengan cara mengambil ½
dari konsentrasi
ekstrak etanol kulit buah manggis
3,125 dan dilarutkan dalam 1 ml TSB
Mililiter Nominal
Mikropipet
4. Ekstrak
etanol kulit
buah manggis
konsentrasi 0,781
Ekstrak kental kulit buah manggis
yang didapat
dengan cara mengambil ½ dari
konsentrasi ekstrak
etanol kulit buah manggis 1,562 dan dilarutkan dalam
1 ml TSB Mililiter
Nominal Mikropipet
5. Ekstrak
etanol kulit
buah manggis
konsentrasi 0,39
Ekstrak kental kulit buah manggis
yang didapat
dengan cara mengambil ½ dari
konsentrasi ekstrak
etanol kulit buah manggis 0,781 dan dilarutkan dalam
1 ml TSB Mililiter
Nominal Mikropipet
6. Ekstrak
etanol kulit
buah manggis
Ekstrak kental kulit buah manggis
yang didapat
dengan cara mengambil ½ dari
konsentrasi ekstrak
Mililiter Nominal
Mikropipet
Universitas Sumatera Utara
konsentrasi 0,195
etanol kulit buah manggis 0,39 dan dilarutkan dalam
1 ml TSB 7.
Ekstrak etanol
kulit buah
manggis konsentrasi
0,097 Ekstrak kental kulit buah
manggis yang
didapat dengan cara mengambil ½
dari konsentrasi
ekstrak etanol kulit buah manggis
0,195 dan dilarutkan dalam 1 ml TSB
Mililiter Nominal
Mikropipet
8. Ekstrak
etanol kulit
buah manggis
konsentrasi 0,048
Ekstrak kental kulit buah manggis
yang didapat
dengan cara mengambil ½ dari
konsentrasi ekstrak
etanol kulit buah manggis 0,097 dan dilarutkan dalam
1 ml TSB Mililiter
Nominal Mikropipet
Variabel Tergantung
1. Pertumbuhan
Enterococcus faecalis
dengan pengukuran
nilai zona
hambat Zona bening di sekitar hole
pada masing-masing sampel yang
diukur dengan
menggunakan jangka dan penggaris ketelitian mm
Dengan menggunakan
rumus zona hambat =
vertikal + horizontal : 2
Rasio Jangka,
penggaris
Universitas Sumatera Utara
4.5 Metode Pelaksanaan Penelitian 4.5.1 Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan adalah : 1. Kulit buah manggis sebanyak 1 kg Kutacane, Aceh Tenggara
2. Etanol 70 5 liter Kimia Farma, Indonesia 3. Suspensi Enterococcus faecalis ATCC 29212 Laboratorium Rumah Sakit
Khusus Infeksi UNAIR, Surabaya, Indonesia 4. Media Mueller Hinton Agar Difco,USA
5. Media Trypticase Soy Broth Difco, USA
4.5.2 Alat Penelitian Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah :
1. Timbangan Home Line, China 2. Timbangan analitik Vibra, Japan
3. Blender Panasonic, Japan 4. Kertas perkamen 2 kajang
5. Kapas 250 gram Bio Panca, Indonesia 6. Kertas saring Whatman no.42, England
7. Aluminium foil 1 gulungan Total Wrap, Indonesia 8. Perkolator
9. Erlenmeyer Pyrex, USA 10. Vaccum rotavapor Stuart, 2010
11. Electronic balance Ohyo JP2 6000, Japan 12. Autoklaf Tommy, Japan
13. Vortex Iwaki model TM- 100, Japan 14. Inkubator CO
2
Sanyo, Japan 15. Pipet mikro Gilson, France
16. Piring petri Pyrex, Japan
17. Ose dan spiritus
18. Perforator Japan
Universitas Sumatera Utara
19. Penggaris Novus, Indonesia 20. Jangka Aigo, Japan
Gambar 3. Autoklaf Gambar 4. Timbangan
Gambar 5. Vortex analitik
4.5.3 Prosedur Penelitian 4.5.3.1 Prosedur pembuatan ekstrak kulit buah manggis
Sampel kulit buah manggis berasal dari buah manggis Garcinia mangostana L. yang diperoleh dari Kutacane, Aceh Tenggara. Proses pembuatan ekstrak kulit buah
manggis Garcinia mangostana L. dilakukan berdasarkan Standard Operational Procedure SOP Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU dengan
langkah-langkah sebagai berikut : a. Pembuatan simplisia
Buah manggis Garcinia mangostana L. ditimbang sebanyak 3 kg. Buah lalu dibersihkan dari kotoran, dicuci bersih di bawah air mengalir, dikupas, maka didapatkan
kulit buah manggis sebanyak 1 kg. Kulit buah manggis lalu diiris halus setebal ± 3 mm kemudian dikeringkan di dalam lemari pengering dengan suhu 40°C hingga kering dan
dialasi dengan kertas perkamen. Sampel yang telah kering kemudian ditimbang kembali dan diperoleh 300 gram kulit buah manggis kering. Selanjutnya, kulit buah manggis
yang telah kering tersebut diblender sampai menjadi serbuk halus simplisia.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 6. Buah manggis yang telah di- Gambar 7. Kulit buah manggis diiris halus
cuci bersih dan ditimbang
Gambar 8. Kulit manggis dikeringkan di Gambar 9. Kulit manggis diblender
dalam lemari pengering
Universitas Sumatera Utara
Gambar 10. Simplisia dimaserasi dalam
etanol teknis 70 selama 3 jam
b. Proses maserasi Sebanyak 300 gram simplisia dimasukkan ke dalam wadah dan direndam dengan etanol
teknis 70 selama 3 jam dalam keadaan tertutup. Diaduk sesekali dengan keadaan etanol cukup merendam sampel.
c. Proses perkolasi
Perkolator disiapkan dengan cara meletakkan kapas secukupnya pada bagian dasar wadah perkolator, kemudian di atas kapas tersebut diletakkan kertas saring
sebanyak 2 lembar. Kemudian masa simplisia yang telah direndam selama 3 jam tersebut dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator dengan hati
– hati sambil sesekali ditekan dengan sendok. Kemudian etanol 70 dituangkan ke dalam perkolator
dan massa simplisia disaring dengan lapisan kertas saring sampai cairan tersebut mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari untuk mengetahui
apakah perkolator sudah berfungsi dengan baik. Kemudian perkolator ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam.
Setelah 24 jam, bagian ujung perkolator yang juga disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan tetesan ± 30 tetesmenit.
Sampel pada tabung perkolator tetap dijaga dalam kondisi terendam etanol selama
Universitas Sumatera Utara
dilakukan penampungan perkolat. Tambahkan etanol teknis 70 sebanyak 23 dari tinggi perkolator ketika cairan penyari sudah hampir habis sehingga selalu terdapat
cairan penyari di atas simplisia hingga diperoleh ekstrak cair. Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan berwarna jernih dimana diperoleh
ekstrak cair sebanyak 3,5 liter.
Gambar 11. Proses perkolasi Gambar 12. Proses penguapan ekstrak
d. Ekstrak cair diuapkan dengan vacuum rotavapor pada suhu 40°C hingga konsistensi kental. Ekstrak yang telah kental tersebut ditimbang dengan timbangan
analitik.
4.5.3.2 Pengenceran Bahan Coba
Ekstrak kulit buah manggis Garcinia mangostana L. ditimbang menggunakan electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan
dengan cara dilarutkan dengan Trypticase Soy Broth TSB. Sebanyak 12 buah tabung disediakan, pada masing
–masing tabung diisi 1 ml TSB. Pada tabung pertama diisi 1 gram ekstrak kental kulit buah manggis kemudian divorteks hingga diperoleh ekstrak
kulit manggis dengan konsentrasi 100. Kemudian dilakukan pengenceran dengan cara pengambilan ½ dari ekstrak kulit buah manggis konsentrasi 100 menggunakan
Universitas Sumatera Utara
mikropipet dan diletakkan pada tabung ke-2 untuk mendapatkan ektrak kulit buah manggis konsentrasi 50 pengenceran ganda, demikian seterusnya sampai tabung
terakhir dan diperoleh ekstrak dengan konsentrasi 0,048.
4.5.3.3 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media Mueller Hinton Agar MHA sebanyak 38 gram dilarutkan ke dalam 1000 ml aquadest dan dipanaskan diatas
tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian dimasukkan ke dalam 10 tabung reaksi 20mltabung. Selanjutnya disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit.
Setelah disterilkan, media yang akan digunakan dipanaskan kembali dan dituangkan ke
dalam petri 20mlpetri dan dibiarkan hingga dingin.
Gambar 13. Media MHA dalam bentuk Gambar 14. Media MHA setelah dituang- cair setelah disterilkan dalam
kan ke dalam plate dan autoklaf
dibiarkan hingga dingin
4.5.3.4 Pembiakan Suspensi Bakteri
Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO
2
. Enterococcus faecalis yang digunakan adalah spesimen stem sel Enterococcus faecalis ATCC 29212 yang telah dibiakkan secara murni pada media Mueller Hinton
Agar MHA yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob.
Universitas Sumatera Utara
Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh
kekeruhan sesuai standar 0,5 Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1x10
8
CFUml
4.5.3.5 Penentuan Kadar Hambat Bahan Coba
Metode yang digunakan adalah difusi Kirby Bauer dengan teknik sumuran. Bahan coba ekstrak kulit buah manggis Garcinia mangostana L. yang akan digunakan
telah diencerkan dan dimulai dari konsentrasi 3,125, 1,562, 0,781, 0,39, 0,195, 0,097 hingga 0,048. Buat hole dengan menggunakan perforator pada media
MHA yang telah berisi suspensi bakteri. Teteskan ekstrak sesuai dengan konsentrasi yang telah ditentukan ke dalam masing-masing hole sebanyak 100µl. Tutup plate dan
masukkan ke dalam inkubator. Inkubasi dalam suhu 37° C selama 24 jam. Setelah 24 jam, ukur zona hambat yang terbentuk dengan jangka dan penggaris.
Gambar 15. Perforator untuk melubangi Gambar 16. Media dimasukkan ke dalam
media inkubator untuk diinkubasi
Universitas Sumatera Utara
4.6 Pengolahan dan Analisa Data Data dari setiap pemeriksaan dianalisis dengan memakai uji statistik, yaitu :
1. Uji normalitas Shapiro-Wilk untuk mengetahui data hasil penelitian
terdistribusi normal atau tidak.
2. Uji Kruskal-Wallis untuk mengetahui apakah ada perbedaan yang signifikan pada seluruh kelompok perlakuan.
3. Uji Mann-Whitney untuk mengetahui apakah ada perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan.
Universitas Sumatera Utara
BAB 5 HASIL PENELITIAN
5.1 Ekstrak Kulit Buah Manggis Garcinia mangostana L
Kategori