Isolasi enzim selulase Prosedur Penelitian

a. Pengendapan dengan amonium sulfat [NH 4 2 SO 4 ] Ekstrak kasar enzim yang diperoleh diendapkan dengan garam amonium sulfat pada berbagai derajat kejenuhan yaitu 0-30; 30- 60; dan60-90. Skema proses pengendapan protein enzim dengan penambahan amonium sulfat ditunjukkan pada Gambar 9. Sejumlah ekstrak kasar enzim yang diperoleh ditambahkan garam amonium sulfat yang telah dihaluskan secara perlahan sambil diaduk dengan magnetik stirer pada suhu 4 o C. Endapan protein enzim yang didapatkan pada tiap fraksi kejenuhan amonium sulfat dipisahkan dari filtratnya dengan sentrifugasi dingin pada kecepatan 5000 rpm selama 20 menit. Kemudian endapan yang diperoleh dilarutkan dengan bufer fosfat 0,1 M pH 6,0 dan diuji aktivitasnya dengan metode Mandels, serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry. Selanjutnya, filtrat yang didapat dari fraksi 0-30 digunakan untuk diendapkan kembali dengan fraksi kejenuhan 30-60 dengan prosedur yang sama Yandri et al., 2010. Gambar 9. Skema pengendapan protein enzim dengan amonium sulfat. b. Dialisis Endapan enzim yang telah dilarutkan dari tiap fraksi amonium sulfat dengan aktivitas spesifik yang tinggi dimasukkan ke dalam kantong selofan dan didialisis dengan bufer fosfat 0,01 M pH 6 selama 24 jam pada suhu dingin Pohl, 1990. Selama dialisis, dilakukan pergantian bufer setiap 6 jam agar konsentrasi ion-ion di dalam kantong dialisis dapat dikurangi. Proses ini dilakukan secara kontinyu sampai ion-ion di dalam kantong dialisis dapat diabaikan. Untuk mengetahui bahwa sudah tidak ada lagi ion-ion garam dalam kantong, maka diuji dengan menambahkan larutan BaOH 2 atau BaCl 2 , bila masih ada ion sulfat dalam kantong, maka akan terbentuk endapan putih BaSO 4 . Semakin banyak endapan yang terbentuk, maka semakin banyak ion sulfat yang ada dalam kantong. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas dengan metode Fuwa, serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry. + NH 4 2 SO 4 0-30 Ekstrak Kasar Enzim EndapanF1 Filtrat EndapanF2 Filtrat EndapanF3 Filtrat + NH 4 2 SO 4 30-60 + NH 4 2 SO 4 60-90