Isolasi enzim selulase Prosedur Penelitian
a. Pengendapan dengan amonium sulfat [NH
4 2
SO
4
] Ekstrak kasar enzim yang diperoleh diendapkan dengan garam
amonium sulfat pada berbagai derajat kejenuhan yaitu 0-30; 30- 60; dan60-90. Skema proses pengendapan protein enzim
dengan penambahan amonium sulfat ditunjukkan pada Gambar 9. Sejumlah ekstrak kasar enzim yang diperoleh ditambahkan garam
amonium sulfat yang telah dihaluskan secara perlahan sambil diaduk dengan magnetik stirer pada suhu 4
o
C. Endapan protein enzim yang didapatkan pada tiap fraksi kejenuhan amonium sulfat dipisahkan dari
filtratnya dengan sentrifugasi dingin pada kecepatan 5000 rpm selama 20 menit. Kemudian endapan yang diperoleh dilarutkan dengan bufer
fosfat 0,1 M pH 6,0 dan diuji aktivitasnya dengan metode Mandels, serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry. Selanjutnya,
filtrat yang didapat dari fraksi 0-30 digunakan untuk diendapkan kembali dengan fraksi kejenuhan 30-60 dengan prosedur yang sama
Yandri et al., 2010.
Gambar 9. Skema pengendapan protein enzim dengan amonium sulfat.
b. Dialisis
Endapan enzim yang telah dilarutkan dari tiap fraksi amonium sulfat dengan aktivitas spesifik yang tinggi dimasukkan ke dalam kantong
selofan dan didialisis dengan bufer fosfat 0,01 M pH 6 selama 24 jam pada suhu dingin Pohl, 1990. Selama dialisis, dilakukan pergantian
bufer setiap 6 jam agar konsentrasi ion-ion di dalam kantong dialisis dapat dikurangi. Proses ini dilakukan secara kontinyu sampai ion-ion
di dalam kantong dialisis dapat diabaikan. Untuk mengetahui bahwa sudah tidak ada lagi ion-ion garam dalam kantong, maka diuji dengan
menambahkan larutan BaOH
2
atau BaCl
2
, bila masih ada ion sulfat dalam kantong, maka akan terbentuk endapan putih BaSO
4
. Semakin banyak endapan yang terbentuk, maka semakin banyak ion sulfat yang
ada dalam kantong. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas dengan metode Fuwa, serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.
+ NH
4 2
SO
4
0-30 Ekstrak Kasar Enzim
EndapanF1 Filtrat
EndapanF2 Filtrat
EndapanF3 Filtrat + NH
4 2
SO
4
30-60
+ NH
4 2
SO
4
60-90