Isolasi Dan Karakterisasi Bacillus sp. Indigenus Penghasil Asam Indol Asetat Asal Tanah Rizosfer
ISOLASI DAN KARAKTERISASI Bacillus sp. INDIGENUS PENGHASIL
ASAM INDOL ASETAT ASAL TANAH RIZOSFER
Oleh:
Tika Widayanti
G34102021
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
ABSTRAK
TIKA WIDAYANTI. Isolasi dan Karakterisasi Bacillus sp. Indigenus Penghasil Asam Indol
Asetat Asal Tanah Rizosfer. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan NISA RACHMANIA
MUBARIK.
Genus Bacillus yang dikelompokkan sebagai plant growth-promoting bacteria (PGPB)
diisolasi dari tanah rizosfer yang berasal dari sebelas daerah di Pulau Jawa. Hasil karakterisasi
parsial menunjukkan sel Bacillus berbentuk batang, bersifat Gram positif, memiliki struktur
endospora, dan katalase positif, kecuali isolat HI-9, SI-2 dan PI-8 bersifat katalase negatif. Isolatisolat tersebut dianalisis kemampuannya dalam memproduksi asam indol asetat (AIA) berdasarkan
metode kolorimetri menggunakan reagen Salkowski. Hasil analisis AIA menunjukkan dari 63
isolat yang berhasil diisolasi, sebanyak 61 isolat mampu mensintesis AIA dengan konsentrasi
tertinggi dihasilkan isolat HI-2 dan TG-1 sebesar 67.2 ppm pada media dengan penambahan Ltriptofan 0.5 mM. Pada media tanpa penambahan L-triptofan sebesar 47.6 ppm dan 38.9 ppm,
masing-masing untuk isolat HI-2 dan TG-1. Kurva pertumbuhan dan penentuan sintesis AIA
dibuat dengan menggunakan isolat HI-2 sebagai model. Dari kurva tersebut dapat diketahui bahwa
produksi AIA sejalan dengan pertumbuhan sel bakteri. Konsentrasi AIA pada media yang
ditambahkan L-triptofan lebih tinggi dibandingkan konsentrasi AIA pada media tanpa
penambahan L-triptofan. AIA mulai dihasilkan pada jam ke-8, yaitu pada akhir fase logaritma dan
terus meningkat pada fase stasioner. Hal ini mengindikasikan bahwa AIA termasuk senyawa
metabolit sekunder pada bakteri. Dua belas isolat yang menghasilkan AIA tertinggi diuji
kemampuannya dalam melarutkan fosfat anorganik dengan cara menumbuhkannya pada media
Pikovskaya. Kemampuan melarutkan P terbesar dihasilkan oleh isolat DM-4 dengan indeks
pelarutan P sebesar 55.6. Isolat HI-2 dan BY-1 diuji kemampuannya dalam memacu pertumbuhan
kecambah biji kedelai. Hasil uji pemacuan perkecambahan biji memperlihatkan bahwa pengaruh
perlakuan bakteri tidak berbeda nyata terhadap pemanjangan batang kecambah, tetapi memberikan
pengaruh nyata terhadap pemanjangan akar primer dan percabangan akar lateral. Jumlah cabang
akar lateral kecambah yang diberi perlakuan lebih banyak dibanding kontrol. Sebaliknya, inokulasi
bakteri menghambat pemanjangan akar primer.
ABSTRACT
TIKA WIDAYANTI. Isolation and Characterization of Bacillus sp. Indigenous Producing
Indole Acetic Acid from Rhizosphere Soils. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and NISA
RACHMANIA MUBARIK.
Bacteria belonging to genus Bacillus as plant growth promoting bacteria (PGPB), had been
isolated from soil’s rhizosphere of eleven places in Java. Partial characterization shows the
bacteria had rod-shaped and Gram positive, endospore structures, and generally positive catalases,
except HI-9, SI-2, and PI-8 were negative catalases. These isolates were analysed for indole acetic
acid (IAA) production which were assayed colorimetrically using Salkowski’s reagent. IAA
production assay showed that 61 from 63 isolates produced IAA, in which HI-2 and TG-1 had the
highest concentration of IAA. These isolates produced 67.2 ppm IAA in media supplemented with
0.5 mM L-tryptophan, whereas 47.6 and 38.9 ppm each for HI-2 and TG-1 in media without Ltryptophan. Growth and IAA determination curve were made by using HI-2 as a model. The result
showed that IAA production parallel with bacterial growth. IAA concentration in media
supplemented with L-tryptophan higher than in media without L-tryptophan. IAA was produced
significantly at 8th hour at the end of logaritmic phase, and its concentration increased in the
stationer phase. This condition indicated that IAA is secondary metabolite compound of these
bacteria. Twelve isolates that produced the highest level of IAA were tested qualitatively in ability
for solubilizing inorganic phosphate by plating the bacteria in Pikovskaya’s medium. The highest
ability to solubilize P was produced by isolate DM-4 with 55.6 of phosphate solubilization index.
The ability to promote the growth of soybean seeds germination of HI-2 and BY-1 were tested.
The result of seeds germination promotion test suggested that the effect of IAA-producing bacteria
significantly were not different compared with the control regarding to the germination of stem
elongation, but its influenced significantly toward the lateral roots proliferation and primary roots
elongation. The number of lateral roots branch treated with IAA producing-bacteria higher than
that the control. In contrary, the elongation of primary roots was inhibited by the bacteria
inoculated.
ISOLASI DAN KARAKTERISASI Bacillus sp. INDIGENUS PENGHASIL
ASAM INDOL ASETAT ASAL TANAH RIZOSFER
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Oleh:
Tika Widayanti
G34102021
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
Judul Skripsi : Isolasi dan Karakterisasi Bacillus sp. Indigenus Penghasil Asam
Indol Asetat Asal Tanah Rizosfer
Nama
: Tika Widayanti
NIM
: G34102021
Menyetujui
Pembimbing I,
Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si.
NIP 131 957 319
Pembimbing II,
Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.
NIP 132 045 531
Mengetahui
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS.
NIP 131 473 999
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya
ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih adalah mikrob penghasil hormon tumbuhan,
dengan judul Isolasi dan Karakterisasi Bacillus sp. Indigenus Penghasil Asam Indol Asetat Asal
Tanah Rizosfer. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Penulis menghaturkan terima kasih kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. dan Dr. Nisa
Rachmania Mubarik, M.Si. selaku pembimbing atas ilmu pengetahuan dan saran yang telah
diberikan. Ucapan terima kasih kepada Dr. Ir. H. Ibnul Qayim sebagai dosen penguji dan wakil
komisi pendidikan atas saran dan diskusi yang diberikan. Penelitian ini dibiayai oleh The Second
Kennedy Round (SKR) JICA Jepang Tahun 2006 melalui kerjasama Departemen Pertanian dengan
Institut Pertanian Bogor yang berjudul ”Perbaikan dan Pemanfaatan Bahan Organik dan Mikrob
Tanah Potensial untuk Meningkatkan Produksi Tanaman di Jawa Tengah dan Jawa Barat” untuk
itu penulis juga menyampaikan terimakasih. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ary sebagai
teman seperjuangan, Vitria, Dewi, Tika T, Mia, Dhilah, Achie, Nirli, Ade, Wida, Disa, Eci, Ninda,
Ela, Ina, Adisty, Adit, Bian serta seluruh teman-teman Biologi Angkatan 39 atas persahabatan,
dukungan moral, dan perhatiannya. Ucapan terima kasih juga dihaturkan kepada Pa Djoni, Mba
Heni, Mba Rika, Bu It, Mba Rina dan staf laboratorium lainnya atas bantuannya. Terima kasih
juga penulis sampaikan kepada mama, papa, Rizki, serta seluruh keluarga atas segala doa dan
kasih sayang yang senantiasa diberikan. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Januari 2007
Tika Widayanti
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di kota Karawang pada tanggal 1 Februari 1985. Penulis merupakan
anak pertama dari dua bersaudara, dari ayah Karyono dan ibu Titin Handayani. Tahun 2002
penulis lulus dari SMU Negeri 1 Cikampek dan pada tahun yang sama masuk Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Ujian
Seleksi Masuk IPB (USMI).
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Mikrobiologi Dasar
(tahun akademik 2004/2005, 2005/2006, 2006/2007), Biologi Dasar (2005/2006, 2006/2007), dan
Botani Umum (2005/2006). Pada alih semester tahun 2005, penulis melaksanakan tugas praktek
lapang selama satu bulan di PT Pupuk Kujang Cikampek, Karawang, Jawa Barat. Penulis juga
menerima beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik (PPA) pada tahun 2006, serta terpilih sebagai
finalis Program Kreativitas Mahasiswa bidang Penulisan Ilmiah (PKMI) tahun 2005 dan Program
Kreativitas Mahasiswa bidang Penelitian (PKMP) tahun 2006 yang diadakan Direktorat Jenderal
Pendidikan Tinggi (DIKTI).
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL...................................................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................. viii
DAFTAR LAMPIRAN.............................................................................................................. viii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ................................................................................................................
Waktu dan Tempat Penelitian .........................................................................................
1
2
BAHAN DAN METODE
Bahan ..............................................................................................................................
Metode ............................................................................................................................
Isolasi Bacillus sp. dari Rizosfer..............................................................................
Karakterisasi Fisiologi Secara Parsial......................................................................
Analisis Produksi Asam Indol Asetat (AIA) ...........................................................
Kurva Pertumbuhan dan Penentuan Sintesis AIA ...................................................
Uji Pelarutan Fosfat .................................................................................................
Uji Perkecambahan Biji Kedelai .............................................................................
2
2
2
2
2
2
3
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil ................................................................................................................................
Isolasi Bacillus sp. dari Rizosfer..............................................................................
Karakterisasi Fisiologi Secara Parsial......................................................................
Analisis Produksi Asam Indol Asetat (AIA) ...........................................................
Kurva Pertumbuhan dan Penentuan Sintesis AIA ...................................................
Uji Pelarutan Fosfat .................................................................................................
Uji Perkecambahan Biji Kedelai .............................................................................
Pembahasan.....................................................................................................................
3
3
3
3
5
5
5
6
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan .........................................................................................................................
Saran ...............................................................................................................................
8
8
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................
9
LAMPIRAN...............................................................................................................................
11
DAFTAR TABEL
Halaman
1
2
3
Produksi asam indol asetat (AIA) dari isolat-isolat Bacillus sp. yang berhasil
diisolasi...............................................................................................................................
Hasil pengujian pelarutan fosfat dari 12 isolat Bacillus sp .................................................
Pengaruh inokulasi Bacillus sp. penghasil AIA terhadap perkecambahan biji kedelai.......
4
5
6
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
5
Hasil pewarnaan Gram menunjukan bakteri Gram positif berbentuk batang dengan
perbesaran 2000x (A), dan endospora dengan perbesaran 1000x, ditunjukkan dengan
tanda panah (B)...................................................................................................................
Pengukuran konsentrasi AIA pada isolat TG-1, (A) media kosong (kontrol 1),
(B) kultur pada media tanpa L-trp, (C) kultur pada media dengan L-trp, (D) media
kosong yang ditambah L-trp (kontrol 2) .............................................................................
Kurva pertumbuhan dan sintesis AIA dari isolat HI-2 yang diproduksi pada media LB....
Zona bening yang terbentuk pada media Pikovskaya menandakan trikalsium fosfat
yang telah terlarut (ditunjukkan dengan tanda panah) ........................................................
Hasil perkecambahan kedelai, (a) kontrol, (B) kecambah yang diinokulasi dengan
isolat BY-1, (C) kecambah yang diinokulasi dengan isolat HI-2 .......................................
3
5
5
5
6
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
Karakteristik koloni Bacillus sp. yang berhasil diisolasi dari 11 lokasi pengambilan
sampel.................................................................................................................................
Kurva standar pengukuran AIA ..........................................................................................
Kurva standar pertumbuhan isolat HI-2..............................................................................
12
14
14
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penggunaan senyawa kimia sebagai
pupuk dan pestisida di bidang pertanian
semakin
meningkat
seiring
dengan
berkembangnya pertanian modern. Hal ini
telah menyebabkan dampak negatif terhadap
lingkungan,
terutama
meningkatnya
pencemaran lingkungan. Masyarakat saat ini
juga cenderung lebih memilih pangan yang
bebas pestisida dan bahan kimia lainnya.
Kesadaran akan lingkungan yang sehat dan
perkembangan di bidang bioteknologi telah
mendorong
berkembangnya
penelitian
tentang
penggunaan
mikroorganisme,
khususnya bakteri dan cendawan, sebagai
agen pupuk hayati dan pestisida alami yang
ramah lingkungan. Penemuan ini diduga
akan menjadi trend baru dalam pertanian
modern.
Bakteri yang hidup di rizosfer yang
memberikan
pengaruh
positif
bagi
pertumbuhan
tanaman
dikelompokkan
sebagai
plant
growth-promoting
rhizobacteria (PGPR). Istilah ini ditujukan
untuk bakteri yang secara agresif
mengkolonisasi rizosfer dan permukaan
akar. PGPR juga dapat masuk ke dalam
struktur akar dan membentuk populasi
endofitik, misalnya Azospirillum sp. dan
Azotobacter sp. (Kloepper et al. 1999; Gray
& Smith 2005). Sedangkan untuk bakteri
pemacu pertumbuhan yang berasosiasi
dengan spesies tanaman dan umumnya
terdapat di berbagai habitat disebut plant
growth-promoting bacteria (PGPB) (Bashan
& Holguin 1998). PGPB memberikan
keuntungan melalui berbagai mekanisme
yang berbeda, misalnya produksi metabolit
sekunder seperti antibiotik, kitinase, β-1,3glukanase, sianida, substansi hormon,
sebagai
pengendali
biologi
melalui
kompetisi, induksi sistem pertahanan
terhadap patogen, produksi siderofor,
pelarutan fosfat dan fiksasi N 2 (Glick 1995;
Husen 2003).
Mikroorganisme mampu menghasilkan
hormon tumbuhan seperti auksin, sitokinin,
dan giberelin (Leveau & Lindow 2005).
Bakteri yang dapat menghasilkan auksin
antara lain Pseudomonas sp. Azospirillum
sp., Azotobacter sp., Bacillus sp.,
Lactobacillus sp., Paenibacillus polymyxa,
Enterobacter sp., Serratia marcescens,
Klebsiella sp., Alcaligenes faecalis dan
sianobakteria (Torres-Rubio et al. 2000;
Leveau & Lindow 2005).
Asam indol asetat (AIA) merupakan
hormon auksin utama pada tumbuhan yang
mengendalikan berbagai proses fisiologi
penting
meliputi
pembelahan
dan
perkembangan sel, diferensiasi jaringan,
serta respon terhadap cahaya dan gravitasi
(Salisbury & Ross 1992). Tumbuhan
mungkin tidak mensintesis AIA dalam
jumlah yang cukup untuk pertumbuhan yang
optimal. Oleh karena itu diperlukan
tambahan hormon pemacu pertumbuhan dari
luar, meskipun berdasarkan penelitianpenelitian yang telah dilakukan, respon
tanaman terhadap AIA yang dihasilkan
mikrob berbeda-beda tergantung spesies
tanaman dan konsentrasi AIA yang
dilepaskan (Patten & Glick 2002).
Biosintesis AIA oleh mikrob di tanah
meningkat dengan adanya L-triptofan yang
berasal dari eksudat akar atau sel-sel
organisme yang rusak, karena L-triptofan
merupakan
prekursor
pada
lintasan
biosintesis AIA (Benizri et al. 1998).
Mekanisme PGPB dalam memacu
pertumbuhan tanaman, selain menghasilkan
AIA diantaranya dengan melarutkan
senyawa fosfat dalam tanah. Bakteri pelarut
fosfat berpotensi meningkatkan ketersediaan
fosfat terlarut bagi tanaman, terutama pada
tanah yang banyak mengandung endapan
fosfor. Bakteri pelarut fosfat melepaskan
ikatan fosfat anorganik yang sukar larut
dengan mensekresikan sejumlah asam
organik. Mekanisme tersebut bukan satusatunya cara untuk melarutkan fosfat.
Beberapa
bakteri
seperti
B.
amyloliquefaciens, B. subtilis, Klebsiella
terrigena,
Pseudomonas
spp.
dan
Enterobacter sp. dilaporkan mempunyai
aktivitas fitase, suatu enzim golongan
fosfomonoesterase
yang
mampu
menghidrolisis polifosfat organik tak larut
(fitat) menjadi rangkaian ester fosfat
berbobot molekul rendah dari myo-inositol
dan fosfat yang penting untuk prokariot dan
eukariot (Idriss et al. 2002).
Bacillus sp. merupakan bakteri Gram
positif, berbentuk batang, dan memiliki
endospora. Bacillus sp termasuk kelompok
PGPB yang memiliki banyak potensi karena
mampu memproduksi AIA, melarutkan
fosfat, mensekresi siderofor, dan berperan
sebagai
agen
biokontrol
dengan
menginduksi sistem kekebalan tanaman
serta menghasilkan antibiotik (Compant et
al. 2005). Struktur endospora pada Bacillus
2
membuatnya memiliki eksistensi yang tinggi
di alam karena spora tersebut tahan terhadap
cekaman lingkungan. Hal ini menjadikannya
sebagai PGPB yang dapat diformulasikan
menjadi produk yang relatif stabil bila
digunakan dalam skala industri dan aplikasi
di lapangan (Emmert & Handelsman 1999).
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan
mengkarakterisasi Bacillus sp. indigenus
penghasil asam indol asetat asal tanah
rizosfer.
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan
Juni
sampai
November
2006,
di
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen
Biologi, FMIPA, IPB.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan ialah isolat
Bacillus yang berasal dari 11 lokasi
pengambilan sampel tanah rizosfer yang
diambil dari Demak, Kebumen, Rembang,
Boyolali, dan Tegal, Jawa Tengah, serta
Karawang, dan Indramayu, Jawa Barat
(Lampiran 1), serta biji kedelai Tanggamus
koleksi Dr. Ir Muhammad Jusuf (Pusat
Penelitian Sumber Daya Hayati dan
Bioteknologi, IPB).
Metode
Isolasi Bacillus sp. dari Rizosfer.
Isolasi Bacillus sp. dilakukan dengan
memasukkan 1 gram sampel tanah rizosfer
ke dalam tabung berisi 10 ml larutan garam
fisiologis (NaCl 0.85%), dikocok kuat, dan
dipanaskan di dalam penangas air pada suhu
80 °C selama 20 menit, kemudian dilakukan
pengenceran secara serial. Pengenceran 10-5,
10-6, dan 10-7 disebar sebanyak 100 µl pada
media agar-agar nutrien (NA), dan
diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang.
Koloni bakteri yang tumbuh diamati serta
dimurnikan pada media Luria Bertani Agar
(LA) yang mengandung NaCl 10 g, tripton
10 g, ekstrak khamir 5 g, dan agar-agar 20 g
untuk 1 L media.
Karakterisasi Fisiologi Secara Parsial.
Pewarnaan Gram, pewarnaan spora, uji
katalase dan preparat lekapan basah
dilakukan berdasarkan metode standar (Lay
1994).
Masing-masing
bakteri
yang
digunakan untuk pewarnaan Gram dan spora
berumur 12 dan 48 jam, dan uji katalase
menggunakan bakteri berumur 24 jam pada
media LA.
Analisis Produksi Asam Indol Asetat
(AIA). Produksi asam indol asetat diukur
berdasarkan
metode
kolorimetri
menggunakan reagen Salkowski (Gordon &
Weber 1951; Patten & Glick 2002) yang
mengandung 150 ml H 2 SO 4 pekat, 250 ml
akuades, dan 7.5 ml FeCl 3 0.5 M. Isolat
bakteri yang diperoleh diinokulasikan
sebanyak satu lup ke dalam dua media, yaitu
media LB yang ditambah dengan L-triptofan
(L-trp) 0.5 mM dan media LB tanpa
penambahan
L-trp.
Kultur
tersebut
kemudian dikocok dengan kecepatan 100
rpm selama 48 jam pada suhu ruang.
Selanjutnya kultur disentrifugasi pada
kecepatan 9000 g selama 30 menit.
Supernatan diambil sebanyak 2 ml dan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril,
kemudian ditambahkan 2 ml reagen
Salkowski dan dikocok dengan vortex.
Sebagai kontrol, digunakan media kosong
tanpa triptofan dan media yang ditambah
triptofan. Selanjutnya dibiarkan pada suhu
ruang dalam keadaan gelap selama satu jam
sebelum diukur absorbansinya menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang
510 nm. Konsentrasi AIA yang terdapat
dalam kultur ditentukan berdasarkan kurva
standar AIA (Lampiran 2). Isolat-isolat yang
menghasilkan AIA dalam jumlah cukup
besar diseleksi untuk pengujian pelarutan
fosfat.
Kurva Pertumbuhan dan Penentuan
Sintesis AIA. Isolat yang menghasilkan
AIA dengan jumlah paling besar, yaitu isolat
HI-2 digunakan sebagai model untuk
mengetahui produksi AIA. Satu lup biakan
HI-2 yang berumur 24 jam ditumbuhkan
dalam 15 ml media LB dan dikocok 100 rpm
pada suhu ruang, selama 6 jam. Inokulum
dipindahkan ke dalam 135 ml media
produksi LB yang telah ditambahkan 0.5
mM triptofan dan dikocok kembali dengan
kecepatan dan kondisi yang sama.
Kemudian setiap 3 jam dilakukan
pengukuran turbiditas (% transmitan) dan
kandungan AIA, sampai diperoleh fase
kematian. Kurva standar pertumbuhan
dibuat untuk mengetahui jumlah sel dan
dilakukan pada saat inokulum mulai
memasuki fase eksponensial dengan
menggunakan metode hitungan cawan dan
turbidimetri
(Lampiran
3).
Metode
turbidimetri
dilakukan
dengan
cara
3
mengukur turbiditas dari pengenceran 1:1,
1:2, 1:4, 1:8, 1:16, sedangkan hitungan
cawan dengan menyebar inokulum pada
pengenceran 10-6, 10-8, 10-9, 10-10.
Uji Pelarutan Fosfat. Dua belas isolat
bakteri terpilih diuji kemampuannya dalam
melarutkan fosfat. Isolat-isolat tersebut
ditumbuhkan dengan cara ditotol pada media
agar yang mengandung trikalsium fosfat,
yang merupakan modifikasi dari media
Pikovskaya (Rao & Sinha 1962) dengan
komposisi glukosa 10 g, Ca 3 HO 13 P 3 5 g,
(NH 4 ) 2 SO 4 0.5 g, KCl 0.2 g, MgSO 4 ·7H 2 O
0.1 g, ekstrak khamir 0.5 g, MnSO 4 25 mg,
dan FeSO 4 25 mg, serta agar-agar 15 g
dalam 1 L akuades. Setelah inkubasi selama
7 hari, zona bening yang terdapat di
sekeliling koloni diamati dan diukur indeks
pelarutan fosfatnya berdasarkan rumus:
Indeks pelarutan fosfat =
diameter zona bening − diameter koloni
diameter koloni
Uji Perkecambahan Biji Kedelai.
Perkecambahan biji dilakukan untuk melihat
respon AIA yang disintesis bakteri terhadap
pertumbuhan
kecambah
biji.
Uji
perkecambahan biji menggunakan kedelai
varietas Tanggamus sebagai model. Biji
kedelai
Tanggamus
disterilisasi
permukaannya dengan cara direndam dalam
etanol 95% selama 10 detik, kemudian
direndam dalam H 2 O 2 5% selama 5 menit
dan dibilas dengan akuades steril sebanyak 7
kali untuk menghilangkan residu peroksida.
Biji yang telah steril diletakkan pada
cawan yang dialasi kertas saring yang telah
dibasahi dengan akuades steril, kemudian
diletakkan di ruang gelap. Setelah 24 jam,
setiap biji yang telah mulai berkecambah
ditetesi dengan 100 μl kultur bakteri
(± 8x109 sel/ml). Isolat yang digunakan ialah
HI-2, mewakili isolat yang menghasilkan
AIA dengan konsentrasi tinggi, dan BY-1
mewakili isolat yang menghasilkan AIA
dengan konsentrasi rendah, serta media
kosong sebagai kontrol. Cawan tersebut
diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang
dalam kondisi gelap. Kemudian dilakukan
pengukuran panjang batang, panjang akar
primer, dan jumlah akar lateral. Setiap
perlakuan dilakukan sebanyak dua kali
ulangan dan setiap ulangan menggunakan
sepuluh biji kedelai. Hasil pengukuran
dianalisis secara statistik dengan one-way
Analysis
of
Variance
(ANOVA)
menggunakan program SPSS.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Isolasi Bacillus sp. dari Rizosfer. Hasil
isolasi Bacillus sp. dari 11 lokasi
pengambilan sampel tanah diperoleh
sebanyak 63 isolat yang berpotensi sebagai
penghasil AIA (Tabel 1). Pemanasan sampel
tanah bertujuan sebagai seleksi awal isolasi.
Bacillus sp. akan tahan terhadap pemanasan
karena memiliki struktur endospora,
sedangkan bakteri lain akan mati. Isolatisolat tersebut kemudian diamati karakter
koloninya secara visual.
Karakterisasi Fisiologi Secara Parsial.
Hasil pewarnaan Gram dan spora
menunjukkan sel bakteri bersifat Gram
positif, berbentuk batang dengan ukuran dan
penataan yang berbeda-beda, dan memiliki
endospora dengan bentuk dan letak yang
bervariasi (Gambar 1). Uji katalase
memperlihatkan hasil positif untuk seluruh
isolat, kecuali isolat HI-9, SI-2 dan PI-8.
1 µm
2 µm
A
B
Gambar 1 Hasil pewarnaan Gram isolat
HI-2 menunjukan bakteri Gram
positif berbentuk batang dengan
perbesaran 2000x (A), dan
endospora isolat PI-4 dengan
perbesaran 1000x, ditunjukkan
dengan tanda panah (B).
Analisis Produksi Asam Indol Asetat
(AIA). Dari 61 isolat yang memproduksi
AIA, isolat HI-2 menghasilkan konsentrasi
AIA tertinggi yaitu 67.2 ppm pada media
yang ditambah L-trp dan 47.6 ppm pada
media tanpa L-trp. Isolat TG-1 juga
memiliki konsentrasi yang sama dengan HI2 pada media yang ditambah L-trp, tetapi
pada media tanpa L-trp lebih rendah dari HI2, yaitu sebesar 38.9 ppm. Pengukuran AIA
dilakukan berdasarkan perubahan warna
supernatan
setelah
ditambah
reagen
Salkowski menjadi warna merah muda
(Gambar 2). Konsentrasi AIA pada kultur
bakteri yang ditumbuhkan pada media
dengan penambahan L-trp umumnya lebih
tinggi daripada konsentrasi AIA pada kultur
yang dtumbuhkan pada media tanpa L-trp.
4
Tabel 1 Produksi asam indol asetat (AIA) dari isolat-isolat Bacillus sp. yang berhasil diisolasi
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
Lokasi Pengambilan
Sampel
Asal Tanah
Ds. Kedung Dawa,
Kec. Gabus Wetan,
Indramayu
Rizosfer padi
Ds. Sidadadi, Kec.
Haurgeulis,
Indramayu
Rizosfer padi
Patrol, Indramayu
Rizosfer padi
Ds. Mekar Gading,
Kec. Sliyeg,
Indramayu
Rizosfer padi
Ds. Santi, Kec.
Losarang, Indramayu
Rizosfer padi
Ds. Cariumulya Kec.
Telaga Sari,
Karawang
Rizosfer padi
Tegal
Rizosfer padi
Sawah
Demak
Rizosfer kacang dan
bahan organik
Kebumen
Rizosfer padi
Rizosfer kacang tanah
Boyolali
Rizosfer kacang tanah
Rembang
Pupuk kompos
Kode
Isolat
GI-1
GI-2
GI-3
GI-4
GI-5
GI-6
HI-1
HI-2
HI-3
HI-4
HI-5
HI-6
HI-7
HI-8
HI-9
PI-1
PI-2
PI-3
PI-4
PI-5
PI-6
PI-7
PI-8
PI-9
PI-10
SI-1
SI-2
SI-3
SI-4
SI-5
SI-6
LI-1
LI-2
LI-3
LI-4
TK-1
TK-2
TK-3
TK-4
TK-5
TG-1
TG-2
TG-3
TG-4
TG-5
TG-6
DM-1
DM-2
DM-3
DM-4
DM-5
DM-6
DM-7
KB-1
KB-2
KB-3
BY-1
BY-2
BY-3
BY-4
RB-1
RB-2
RB-3
Konsentrasi AIA
tanpa triptofan
(ppm)
5.5
37.5
5.8
5.8
0.0
5.3
29.8
47.6
0.5
3.9
8.6
3.9
1.7
4.1
0.0
6.0
9.1
4.1
32.1
5.3
7.4
3.3
0.0
9.5
3.9
7.0
4.5
5.3
4.5
7.4
4.7
5.8
5.3
1.8
5.8
8.3
8.3
8.6
29.7
3.7
38.9
1.7
6.6
3.3
5.3
6.4
28.6
5.3
4.1
5.8
5.0
6.6
6.2
22.7
9.3
8.8
6.2
6.0
11.2
11.0
3.6
3.0
6.3
Konsentrasi AIA dengan
triptofan 0.5 mM
(ppm)
4.5
46.3
1.9
31.7
4.9
4.5
39.1
67.2
5.82
11.0
10.8
8.7
6.0
6.3
0.0
4.0
2.0
3.3
53.6
4.0
6.1
4.0
0.0
9.8
3.6
10.3
3.6
7.7
6.5
7.5
8.5
7.7
6.3
2.5
3.3
8.3
11.1
10.8
34.9
7.6
67.2
1.2
3.3
7.0
6.0
7.0
37.2
5.9
4.9
14.5
9.1
7.0
7.2
20.9
6.3
8.8
7.0
6.3
6.2
11.3
6.4
2.8
5.5
5
A
Gambar 2
B
C
menunjukkan
kemampuan
melarutkan
fosfat. Aktivitas pelarutan fosfat ditandai
dengan terbentuknya zona bening di sekitar
koloni bakteri (Gambar 4). Berdasarkan
hasil uji pelarutan P, indeks pelarutan P
terbesar dihasilkan oleh isolat DM-4 yaitu
55.6, kemudian disusul isolat TK-4 (50) dan
HI-4 (42.9) (Tabel 2). Isolat HI-2 dan TG-1
yang menghasilkan AIA tertinggi memiliki
indeks pelarutan P masing-masing sebesar
16.7 dan 25. Sedangkan pada isolat KB-1
tidak menunjukkan adanya pelarutan fosfat.
D
Pengukuran konsentrasi AIA
pada isolat TG-1, (A) media
kosong (kontrol 1), (B) kultur
pada media tanpa L-trp,
(C) kultur pada media dengan
L-trp, (D) media kosong yang
ditambah L-trp (kontrol 2).
Kurva Pertumbuhan dan Penentuan
Sintesis AIA. Pertumbuhan isolat HI-2
cenderung
tidak
dipengaruhi
oleh
penambahan triptofan (Gambar 3). Isolat
HI-2 mulai memproduksi AIA pada jam
ke-8, baik pada media dengan penambahan
L-trp maupun media tanpa L-trp.
Konsentrasi AIA pada media dengan L-trp
terus meningkat dan mencapai konsentrasi
tertinggi pada jam ke-31, yaitu 61.2 ppm
dengan jumlah sel 8.3x109 sel/ml. Pada
media tanpa L-trp, konsentrasi AIA
mencapai puncak pada jam ke-43, yaitu
sebesar 53.9 ppm dengan jumlah sel 8.3x109
sel/ml.
Gambar 4
Tabel 2 Hasil pengujian pelarutan fosfat
dari 12 isolat Bacillus sp.
Konsentrasi AIA
(ppm)
65
Log sel
6.9
6.8
6.7
6.6
6.5
6.4
6.3
6.2
6.1
6
5.9
55
45
35
25
15
5
-5
0
4
8
12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52
Waktu (jam)
Pertumbuhan HI-2 dalam media dengan penambahan triptofan
Pertumbuhan HI-2 dalam media tanpa penambahan triptofan
Produksi AIA dengan penambahan triptofan
Produksi AIA tanpa penambahan triptofan
Gambar 3 Kurva pertumbuhan dan sintesis
AIA dari isolat HI-2 yang
diproduksi pada media LB.
Uji Pelarutan Fosfat. Uji pelarutan
fosfat dilakukan terhadap 12 isolat yang
menghasilkan AIA tertinggi. Dari 12 isolat
yang diuji, diperoleh 11 isolat yang
Zona bening yang terbentuk
pada
media
Pikovskaya
menandakan trikalsium fosfat
yang
telah
terlarut
(ditunjukkan dengan tanda
panah).
Kode Isolat
HI-2
TG-1
PI-4
GI-2
HI-1
DM-1
TK-4
GI-4
KB-1
DM-4
HI-4
BY-4
Pelarutan
Fosfat
Indeks Pelarutan
Fosfat
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
16.7
25
16.7
12.5
11.1
28.6
50.0
6.3
55.6
42.9
3.9
Uji Pengecambahan Biji Kedelai.
Pemberian inokulasi bakteri penghasil AIA
tidak memberikan pengaruh berbeda nyata
terhadap pemanjangan batang, tetapi
memberikan
pengaruh
terhadap
perkembangan akar primer dan akar lateral
kecambah kedelai (Tabel 3). Akar primer
kecambah yang diinokulasi dengan Bacillus
sp.
penghasil
AIA
lebih
pendek
dibandingkan dengan kontrol (Gambar 5).
Tetapi jumlah akar lateral kecambah yang
diberi perlakuan bakteri cenderung lebih
6
banyak dibandingkan dengan kontrol. Isolat
BY-1 yang menghasilkan AIA rendah
menginduksi pertumbuhan akar lateral lebih
banyak daripada isolat HI-2 yang
menghasilkan konsentrasi AIA tinggi.
Tabel 3 Pengaruh inokulasi Bacillus sp.
penghasil
AIA
terhadap
perkecambahan biji kedelai
Perlakuan
Kontrol
BY-1
HI-2
Panjang
batang
(cm)
4.4a
4.0a
3.9a
Panjang
akar primer
(cm)
3.7a
0.9b
1.3b
Jumlah
akar
lateral
35.9a
41.7b
36.9ab
Angka yang diikuti huruf yang sama dalam satu kolom
tidak berbeda nyata pada taraf 5% menurut uji Duncan
A
B
C
Gambar 5 Hasil perkecambahan kedelai,
(a) kontrol, (B) kecambah yang
diinokulasi dengan isolat BY-1,
(C) kecambah yang diinokulasi
dengan isolat HI-2.
Pembahasan
Asam indol asetat (AIA) adalah jenis
auksin yang penting bagi pertumbuhan
tanaman. AIA terlibat dalam berbagai proses
fisiologi tumbuhan seperti inisiasi akar,
pemanjangan sel, diferensiasi jaringan
pembuluh, dan proses pembungaan (Husen
& Saraswati 2003). Sebanyak 63 isolat
Bacillus berhasil diisolasi dari 11 lokasi
pengambilan sampel. Hasil karakterisasi
fisiologis menunjukkan sel Bacillus
berbentuk batang, bersifat Gram positif,
memiliki endospora, dan pada umumnya
bersifat katalase positif, kecuali untuk isolat
HI-9, SI-2, dan PI-8 bersifat katalase negatif.
Dari 63 isolat yang diuji, diperoleh sebanyak
61 isolat yang dapat mensintesis AIA. Dua
isolat yang menghasilkan AIA dengan
konsentrasi tertinggi adalah isolat HI-2 dan
TG-1.
Namun
pada
media
tanpa
penambahan
L-trp,
isolat
TG-1
menghasilkan
AIA
lebih
rendah
dibandingkan dengan isolat HI-2. Isolat HI-2
memiliki karakter koloni bundar dengan
tepian rata, berwarna krem kecoklatan,
berlendir,
dan
elevasinya
cembung.
Sedangkan isolat TG-1 memiliki karakter
koloni bundar dengan tepian rata, warna
putih krem, berlendir dan elevasinya
cembung (Lampiran 3). Beberapa spesies
Bacillus yang telah diketahui berperan
sebagai PGPB adalah
B. subtilis, B.
pumilus, B. cereus, B. brevis, B. polymyxa,
B. pasteurii, B. amyloliquifaciens (Ryu et al.
2004; Shishido et al. 1996)
Reagen Salkowski yang digunakan dalam
pengukuran AIA dapat bereaksi dengan
asam indol piruvat yang terakumulasi dalam
filtrat yang diuji sehingga menyebabkan
terbentuknya warna merah. Asam indol
piruvat merupakan produk dari katalisis
triptofan
yang
dilakukan
triptofan
transaminase. Katalisis oleh enzim ini
merupakan langkah awal dalam lintasan
biosintesis AIA (Patten & Glick 2002).
Glickmann dan Dessaux (1995) juga
melaporkan bahwa Salkowski dapat
mendeteksi keberadaan senyawa-senyawa
antara dalam sintesis AIA, seperti triptofan,
indol etanolamin (triptamin), indol etanol
(triptofol), asam indol piruvat, asam indol
laktat (ILA) dan indol asetamida (IAM).
Hasil pengukuran AIA dari isolat
Bacillus yang diperoleh memperlihatkan
bahwa sebagian besar isolat yang
ditumbuhkan pada media yang ditambah
dengan triptofan menunjukkan konsentrasi
AIA yang lebih tinggi dibandingkan
konsentrasi AIA pada media tanpa
penambahan triptofan. Hal ini terjadi karena
L-triptofan (L-trp) merupakan prekursor
pada biosintesis AIA. Biosintesis AIA baik
pada tumbuhan maupun pada bakteri dapat
terjadi melalui lintasan yang bergantung Ltrp (tryptophan-dependent pathway) atau
tidak bergantung L-trp (tryptophanindependent pathway). Lintasan yang tidak
bergantung L-trp menggunakan indol
sebagai prekursor dalam sintesis auksin.
Pada bakteri patogen tanaman, seperti
Agrobacterium
tumefaciens
dan
Pseudomonas syringae, AIA dihasilkan dari
L-trp melalui lintasan indol asetamida yang
memiliki keterlibatan dalam menginduksi
tumor tanaman. Sedangkan pada bakteri
nonpatogen, seperti PGPB, sintesis AIA
umumnya terjadi melalui lintasan asam indol
piruvat yang tergantung L-trp (Patten &
Glick 2002).
AIA dapat dideteksi pada isolat yang
ditumbuhkan pada media tanpa penambahan
7
L-trp, sehingga dapat diindikasikan bahwa
Bacillus mampu mensintesis AIA tanpa
keberadaan L-trp. Bacillus sp. juga diketahui
dapat membentuk L-trp di dalam selnya.
Regulasi gen yang terlibat dalam biosintesis
L-trp telah dipelajari secara ekstensif pada
B. subtilis, B. pumilus, B. halodurans, dan
B. stearothermophilus. B. subtilis memiliki
operon trpEDCFBA yang mengandung 6
dari 7 gen yang diperlukan dalam biosintesis
triptofan dari asam khorismat (prekursor
kelompok asam amino) (Szigeti et al. 2004).
Sedangkan beberapa kelompok bakteri
seperti Azospirillum sp. tidak dapat
mensintesis AIA tanpa keberadaan L-trp
dalam media tumbuhnya. Di tanah, bakteri
rizosfer
memperoleh
L-trp
untuk
mensintesis AIA dari eksudat akar atau selsel organisme yang rusak.
Pola produksi AIA sejalan dengan
pertumbuhan sel bakteri. Dari kurva
pertumbuhan dan penentuan sintesis AIA
dapat dilihat bahwa AIA mulai disintesis
pada awal fase log meskipun dalam jumlah
yang sedikit. AIA diproduksi secara
signifikan pada akhir fase logaritma, yaitu
pada jam ke-8. Pada media dengan
penambahan L-trp, saat sel mulai memasuki
fase stasioner, yaitu pada jam ke-10,
produksi AIA meningkat dengan pesat (27.1
ppm), kemudian terus meningkat hingga
mencapai puncak pada jam ke-31 (61.2
ppm). Sedangkan dalam media tanpa
penambahan L-trp, konsentrasi AIA
mencapai puncak pada jam ke-43 (53.7
ppm). Memasuki fase kematian, produksi
AIA sedikit demi sedikit mengalami
penurunan.
Produksi AIA pada isolat HI-2 yang
ditumbuhkan dalam media tanpa L-trp lebih
rendah dibanding produksi AIA oleh isolat
HI-2 dalam media yang ditambah L-trp.
Konsentrasi AIA yang dihasilkan tergantung
aktivitas dan jumlah sel, ketersediaan nutrisi
dalam media dan substrat L-trp. Gambar 3
menunjukkan bahwa penambahan L-trp
sangat berpengaruh terhadap produksi AIA,
tetapi cenderung tidak mempengaruhi
pertumbuhan sel isolat HI-2. Dari hasil
tersebut dapat diduga bahwa AIA yang
disintesis bakteri merupakan senyawa
metabolit sekunder, namun perlu analisis
lebih lanjut fase pertumbuhan dihasilkannya
enzim-enzim yang terlibat dalam biosintesis
AIA.
Metabolit
sekunder
biasanya
dihasilkan saat sel kekurangan nutrisi atau
dalam kondisi pertumbuhan suboptimal,
adanya biosintesis atau penambahan induser,
atau penurunan rata-rata pertumbuhan sel
bakteri (Somers et al. 2005).
Bacillus termasuk kelompok bakteri
pelarut fosfat yang sudah banyak dipelajari.
Spesies Bacillus yang dilaporkan dapat
melarutkan fosfat antara lain B. brevis, B.
cereus, B. circulans, B. firmus, B.
licheniformis,
B.
megaterium,
B.
mesentricus, B. mycoides, B. polymyxa, B.
pumilis, B. pulvifaciens dan B. subtilis (Tilak
et al. 2005). Uji pelarutan fosfat
menunjukkan bahwa isolat DM-4 memiliki
indeks zona bening pelarutan fosfat yang
paling tinggi, yaitu sebesar 55.6. Indeks
zona bening berkorelasi dengan kemampuan
melarutkan fosfat.
Peranan mikrob dalam melarutkan
senyawa fosfat terkait dengan asam organik
yang dihasilkan dari aktivitas mikrob
(Premono 1998). Asam alifatik dengan βhidroksil dan α-hidroksil seperti sitrat dan
oksalat sangat efektif dalam melarutkan
batuan
fosfat.
Premono
(1998)
mengungkapkan beberapa teori yang
berhubungan erat dengan pelarutan P karena
aktivitas mikrob, diantaranya (i) pelepasan
ortofosfat dari ikatan logam-P melalui
pembentukan kompleks logam-organik, (ii)
persaingan anion organik dan ortofosfat
pada tapak jerapan koloid tanah yang
bermuatan positif, (iii) perubahan muatan
tapak jerapan oleh ligan organik.
Berdasarkan Idriss et al. (2002), pelarutan
fosfat oleh bakteri, misalnya pada B. subtilis
dan B. amyloliquifaciens, juga terjadi karena
aktivitas fosfatase dan fitase (enzim yang
menghidrolisis
fosfat
organik
sukar
larut/fitat).
AIA
yang
disekresikan
bakteri
meningkatkan pertumbuhan akar tanaman
secara langsung dengan menstimulasi
pemanjangan
atau
pembelahan
sel.
Kemampuan produksi AIA dari dua isolat
bakteri, yaitu isolat BY-1 dan HI-2 dikaji
potensinya
dalam
meningkatkan
pertumbuhan kecambah kacang kedelai.
Kedelai kultivar Tanggamus digunakan
sebagai model tanaman dalam rangka
mengembangkan potensi galur-galur kedelai
tahan asam yang dapat diaplikasikan pada
lahan asam. Kedelai Tanggamus memiliki
kandungan protein paling tinggi, yaitu
sebesar 44.5% namun produktivitasnya
relatif rendah dan ukuran bijinya kecil
(Yulianti 2006).
Pengaruh perlakuan bakteri tidak berbeda
nyata terhadap pemanjangan batang
kecambah kedelai, tetapi memberikan
8
pengaruh
yang
berbeda
terhadap
pemanjangan
akar
primer
dan
perkembangan akar lateral kecambah biji.
Akar primer kecambah yang diinokulasi
dengan Bacillus sp. penghasil AIA lebih
pendek dan memiliki percabangan akar
lateral yang lebih banyak dibandingkan
dengan kontrol, terutama isolat BY-1.
Patten & Glick (2002) menyebutkan
bahwa konsentrasi AIA yang rendah, yaitu
sekitar 10-9–10-12 M, akan menstimulasi
pemanjangan akar lateral, sedangkan
konsentrasi AIA yang tinggi yang dihasilkan
oleh inokulum dengan kepadatan tinggi
menstimulasi pembentukan akar lateral dan
adventif. Tetapi pada penelitian ini,
inokulasi kecambah baik menggunakan
isolat HI-2 maupun BY-1 menunjukkan
adanya penghambatan pemanjangan akar
primer. Hal ini dapat disebabkan konsentrasi
AIA pada kultur yang diinokulasikan masih
tergolong taraf yang tinggi (± 10-5-10-3 M).
Nilai tersebut diperkirakan dari jumlah
bakteri pada kultur sel. Aryantha et al.
(2004) menyatakan kecambah kacang hijau
yang ditumbuhkan secara hidroponik dengan
produk cair dari aktinomiset galur LC (36.4
µg AIA/ml media) dan Bacillus galur D3
(52.5 µg AIA/ml
media) mampu
meningkatkan jumlah akar lateral dan
panjang kecambah pada pengenceran 20
kali. Sedangkan kultur aktinomiset galur LC
pada pengenceran 40 dan 60 kali telah
memberikan efek peningkatan panjang
kecambah yang optimum. Hasil tersebut
sesuai dengan sifat hormon tumbuh yang
efektif dalam jumlah yang sangat rendah
(Aryantha et al. 2004).
Glick (1995) melaporkan mekanisme
terjadinya penghambatan pertumbuhan
tanaman akibat produksi AIA yang
berlebihan. AIA eksogenus dalam jumlah
yang tinggi akan meningkatkan transkripsi
dan
aktivitas
aminosiklopropana-1karboksilat (ACC) sintase. Enzim ini akan
mengkatalisis produksi ACC di tanaman.
Senyawa ACC merupakan prekursor dari
hormon
tumbuhan
etilen,
sehingga
konsentrasi etilen di tanaman meningkat.
Etilen
berperan
sebagai
modulator
fitohormon lain dan mencegah terjadinya
pertumbuhan yang berlebihan (overgrowth).
Etilen juga berfungsi menghambat elongasi
akar pada proses perkecambahan. Beberapa
PGPB menstimulasi elongasi akar secara
tidak langsung dengan menghasilkan
aktivitas ACC deaminase yang dapat
menginaktivasi ACC di tanaman (Patten &
Glick 2002).
Produksi AIA sebagai hormon tanaman
oleh bakteri tidak berfungsi sebagai hormon
pada sel bakteri itu sendiri, namun lebih
mengarah kepada perkembangan hubungan
interaksi antara bakteri dengan tanaman.
Keuntungannya
bagi
bakteri
yang
berasosiasi dengan akar yaitu meningkatnya
suplai nutrisi berupa produk metabolit hasil
fiksasi karbon yang dilakukan tanaman.
Produk metabolit tersebut dilepaskan ke
rizosfer melalui akar sebagai eksudat, lisat
dan getah (Patten & Glick 2002). Pada
Azospirillum brasilense, biosintesis AIA dari
L-trp diduga bertujuan untuk mereduksi
tingkat toksisitas L-trp (Bar & Okon 1992).
Sedangkan Dosselaere et al. (1997)
menyebutkan bahwa AIA memiliki peranan
fisiologi tertentu di dalam bakteri, dan bukan
hanya merupakan produk akhir dari proses
detoksifikasi. Hal ini karena gen ipdC yang
diklon dari A. brasilense dinduksi oleh AIA,
bukan oleh L-trp. Gen ipdC merupakan
salah satu dari dua gen yang terlibat dalam
keseluruhan sintesis AIA.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Sejumlah 61 isolat Bacillus sp. yang
diperoleh dari 11 lokasi pengambilan sampel
tanah rizosfer diketahui dapat mensintesis
AIA. Isolat HI-2 dan TG-1 menghasilkan
konsentrasi AIA tertinggi, yaitu sebesar 67.2
ppm pada media dengan penambahan
triptofan, sedangkan pada media tanpa
penambahan triptofan sebesar 47.6 ppm dan
38.9 ppm masing-masing untuk isolat HI-2
dan TG-1. AIA mulai disintesis oleh isolat
HI-2 pada jam ke-8 dan mencapai puncak
pada fase stasioner. Pada uji pelarutan P,
isolat DM-4 memiliki indeks pelarutan P
tertinggi yaitu 55.6. Inokulasi dengan
Bacillus penghasil AIA dapat meningkatkan
jumlah akar lateral kecambah kedelai.
Saran
Perlu dilakukan optimasi umur dan
jumlah inokulan, serta konsentrasi AIA yang
diberikan untuk mendapatkan respon
tanaman yang lebih baik. Karakterisasi
fisiologis lainnya seperti analisis produksi
giberelin,
sitokinin,
kitinase,
β-1,3glukanase, siderofor, antibiotik, dan deteksi
ACC deaminase juga perlu dilakukan untuk
mencari
galur
yang
berpotensi
meningkatkan pertumbuhan tanaman.
9
DAFTAR PUSTAKA
Aryantha INP, Lestari DP, Pengesti NPD.
2004. Potensi isolat bakteri penghasil
IAA dalam peningkatan pertumbuhan
kecambah kacang hijau pada kondisi
hidroponik. J Mikrobiol Indones 9:4346.
Bar T, Okon Y. 1992. Induction of indole-3acetic acid synthesis and possible
toxicity of tryptophan in Azospirillum
brasilense Sp7. Symbiosis 13:191-198.
Bashan Y, Holguin G. 1998. Proposal for
the division of plant growth-promoting
rhizobacteria into two classifications:
biocontrol-PGPB
(plant
growthpromoting bacteria) and PGPB. Soil
Biol Biochem 30:1225–1228.
Benizri E, Courtade A, Picard C, Gucker A.
1998. Role of maize root exudates in
the
production
of
auxins
by
Pseudomonas fluorescens M.3.1. Soil
Biol Biochem 30:1481-1484.
Compant S, Duffy B, Nowak J, Clement C,
Barka EA. 2005. Minireview: Use of of
plant growth-promoting bacteria for
biocontrol of plant diseases: principles,
mechanisms of action, and future
prospects. Appl Environ Microbiol
71:4951-4959.
Dosselaere F et al. 1997. Indole-3-acetic
biosynthesis in Azospirillum brasilense.
Di dalam: Proceedings of the Fourth
International Workshop on Plant
Growth-Promoting
Rhizobacteria;
Sapporo, 5-10 Okt 1997. Hlm 306-309.
Emmert EAB, Handelsman J. 1999.
Biocontrol of plant disease : a (Gram-)
positive perspective. FEMS Microbiol
Lett 171:1-9.
Glick BR. 1995. The enhancement of plant
growth by free-living bacteria. Can J
Microbiol 41:109–117.
Glickmann E, Dessaux Y. 1995. A critical
examination of the specificity of the
Salkowski
reagen
for
indolic
compounds
produced
by
phytopathogenic bacteria. Appl Environ
Microbiol 61:793-796.
Gordon SA, Weber RP. 1951. Colorimetric
estimation of indoleacetic acid. Plant
physiol 26:192-197.
Gray EJ, Smith DL. 2005. Intracellular and
extracellular PGPR: commonalities and
distinctions in the plant-bacterium
signaling processes. Soil Biol Biochem
37:395–412.
Husen E. 2003. Screening of soil bacteria for
plant growth promotion activities in
vitro. [komunikasi singkat]. Indones J
Agric Sci 4:27-31.
Husen E, Saraswati R. 2003. Effect of IAAproducing bacteria on the growth of hot
pepper. J Mikrobiol Indones 8:22-26.
Idriss EE et al. 2002. Extracellular phytase
aktivity of Bacillus amyloliquefaciens
FZB45 contributes to its plant-growthpromoting
effect.
Microbiology
148:2097-2109.
Kloepper JW et al. 1999. Plant root-bacterial
interactions in biological control of
soilborne diseases and potential
extension to systemic and foliar
diseases. Austral Plant Pathol 28:21–
26.
Lay BW. 1994. Analisis Mikroba di
Laboratorium. Jakarta: PT Raja
Grafindo Persada.
Leveau JHJ, Lindow SE. 2005. Utilization
of the plant hormone indole-3-acetic
acid for growth by Pseudomonas putida
strain 1290. Appl Environ Microbiol
71:2365-2371.
Patten CL, Glick BR. 2002. Role of
Pseudomonas putida indoleacetic acid
in development of the host plant root
system. Appl Environ Microbiol
68:3795-3801.
Premono ME. 1998. Mikrob pelarut fosfat
untuk mengefisiensikan pupuk fosfat
dan prospeknya di Indonesia. Hayati
5:85-94.
Rao SWCB, Sinha MK. 1962. Phosphate
dissolving microorganism in the soil
and rhizosphere. Indian J Sci 23:272278.
Ryu CM et al. 2004. Bacterial volatiles
induce
systemic
resistance
in
Arabidopsis. Plant Physiol 134:1017–
1026.
Salisbury FB, Ross CW. 1992. Plant
Physiology. Ed ke-4. California: Worth
Publishing, Inc.
Shishido M, Massicotte HB, Chanway CP.
1996. Effect of plant growth promoting
Bacillus strains on pine and spruce
seedling growth and mycorrhizal
infection. Ann Bot 77:433-441.
Somers E, Ptacek D, Gysegom P, Srinivasan
M, Vanderleyden J. 2005. Azospirillum
brasilense produces the auxin-like
phenylacetic acid by using the key
enzyme for indole-3-acetic acid
biosynthesis. Appl Environ Microbiol
71:1803-1810.
10
Szigeti R, Milescu M, Gollnick P. 2004.
Regulation
of
the
tryptophan
biosynthetic
genes
in
Bacillus
halodurans: common elements but
different strategies than those used by
Bacillus subtilis. J Bacteriol 186:818828.
Tilak KVBR et al. 2005. Diversity of plant
growth and soil health supporting
bacteria. Curr Sci 89:136-150.
Torres-Rubio MG, Valencia-Plata SA,
Bernal-Castillo J, Martinez-Nieto P.
2000. Isolation of Enterobacteria,
Azospirillum sp. and Pseudomonas sp.,
producers of indol-3-acetic acid and
siderofor, from Colombian rice rizosfer.
Rev Latinoamericana de Microbiol
42:171-176.
Yulianti NN. 2006. Uji daya hasil galur
harapan kedelai kultivar Slamet x Wase
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
11
LAMPIRAN
12
Lampiran 1 Karakteristik koloni Bacillus sp. yang berhasil diisolasi dari 11 lokasi pengambilan
sampel
Lokasi Sampel
Kode
isolat
GI-2
GI-3
GI-4
GI-5
GI-6
HI-1
HI-2
Bundar
Berlendir
HI-3
HI-4
Bundar
Bundar
Tidak
beraturan
Bundar
Tidak
beraturan
Bundar
Bundar
Tidak
beraturan
Bundar
Bundar
Bundar
Tidak
beraturan
Bundar
Bundar
Bundar
Tidak
beraturan
Bundar
Tidak
beraturan
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar,
menyebar
Bundar
Bundar
Tidak
beraturan,
menyebar
Bundar
Tidak
beraturan,
seperti jari
tangan
Berlendir
Berlendir
Krem
Krem
Putih
Putih keruh
Coklat
Krem
Krem
kecoklatan
Putih
Krem
Berlendir
Putih keruh
GI-1
Ds. Kedung Dawa,
Kec. Gabus Wetan,
Indramayu
(6 isolat)
Ds. Sidadadi, Kec.
Haurgeulis,
Indramayu
(9 isolat)
HI-5
HI-6
HI-7
HI-8
HI-9
PI-1
PI-2
PI-3
PI-4
Patrol, Indramayu
(10 isolat)
PI-5
PI-6
PI-7
PI-8
PI-9
PI-10
SI-1
Ds. Mekar Gading,
Kec. Sliyeg,
Indramayu
(6 isolat)
SI-2
SI-3
SI-4
SI-5
SI-6
LI-1
Ds. Santi
Kec. Losarang,
Indramayu
(4 isolat)
LI-2
LI-3
LI-4
TK-1
Ds. Cariumulya Kec.
Telaga Sari,
Karawang
(5 isolat)
TK-2
Kering
Krem
Berlendir
Berlendir
Berlendir
Kering
Berlendir
Berlendir
Tepian
Berlekuklekuk
Rata
Rata
Rata
Rata
Rata
Rata
Cembung
Cembung
Cembung
Cembung
Cembung
Timbul
Rata
Cembung
Cembung
Cembung
Berlendir
Putih keruh
Berlendir
Berlendir
Berlendir
Krem
Putih keruh
Krem
Kering
Krem
Berlendir
Berlendir
Berlendir
Krem
Krem
Kuning
Rata
Rata
Berlekuklekuk
Rata
Berlekuklekuk
Rata
Rata
Berlekuklekuk
Rata
Rata
Rata
Berlekuklekuk
Rata
Rata
Rata
Seperti berpati
Putih
Kering
Putih keruh
Seperti berpati
Agak kering, keriput
Putih
Krem
Elevasi
Datar
Datar
Cembung
Timbul
Cembung
Timbul
Datar
Cembung
Cembung
Cembung
Datar
Cembung
Cembung
Cembung
Berlendir
Krem
Berombak
Datar
Kering, seperti berpati
Putih keruh
Timbul
Kering
Putih keruh
Berlendir
Kering
Berlendir
Berlendir
Agak kering, keriput
Putih
Putih keruh
Krem
Krem
Krem
Rata
Berlekuklekuk
Rata
Rata
Rata
Rata
Rata
Cembung
Cembung
Cembung
Timbul
Timbul
Timbul
Berlendir
Putih
Bergerigi
Cembung
Berlendir
Berlendir
Krem
Kuning
Rata
Rata
Cembung
Cembung
Kering
Krem
Berlekuklekuk
Timbul
Berlendir
Kuning
Rata
Cembung
Seperti berpati
(starchy)
Krem
kekuningan
Bercabang
-cabang
Timbul
Rata
Timbul
Rata
Berlekuklekuk
Rata
Berlekuklekuk
Cembung
TK-3
Bundar
Keriput dan berlendir
TK-4
Berlendir
Kering
Krem
TG-1
Bundar
Tidak
beraturan
Bundar
Putih agak
transparan
Putih keruh
Berlendir
Putih krem
TG-2
Seperti bintang
Berlendir
Krem
TG-3
Bundar
Berlendir
TG-4
TG -5
Bundar
Bundar
TG-6
Tidak
beraturan
TK-5
Tegal
(6 isolat)
Karakteristik koloni bakteri
Permukaan
Warna
Bentuk
Tidak
beraturan
Bu
ASAM INDOL ASETAT ASAL TANAH RIZOSFER
Oleh:
Tika Widayanti
G34102021
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
ABSTRAK
TIKA WIDAYANTI. Isolasi dan Karakterisasi Bacillus sp. Indigenus Penghasil Asam Indol
Asetat Asal Tanah Rizosfer. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan NISA RACHMANIA
MUBARIK.
Genus Bacillus yang dikelompokkan sebagai plant growth-promoting bacteria (PGPB)
diisolasi dari tanah rizosfer yang berasal dari sebelas daerah di Pulau Jawa. Hasil karakterisasi
parsial menunjukkan sel Bacillus berbentuk batang, bersifat Gram positif, memiliki struktur
endospora, dan katalase positif, kecuali isolat HI-9, SI-2 dan PI-8 bersifat katalase negatif. Isolatisolat tersebut dianalisis kemampuannya dalam memproduksi asam indol asetat (AIA) berdasarkan
metode kolorimetri menggunakan reagen Salkowski. Hasil analisis AIA menunjukkan dari 63
isolat yang berhasil diisolasi, sebanyak 61 isolat mampu mensintesis AIA dengan konsentrasi
tertinggi dihasilkan isolat HI-2 dan TG-1 sebesar 67.2 ppm pada media dengan penambahan Ltriptofan 0.5 mM. Pada media tanpa penambahan L-triptofan sebesar 47.6 ppm dan 38.9 ppm,
masing-masing untuk isolat HI-2 dan TG-1. Kurva pertumbuhan dan penentuan sintesis AIA
dibuat dengan menggunakan isolat HI-2 sebagai model. Dari kurva tersebut dapat diketahui bahwa
produksi AIA sejalan dengan pertumbuhan sel bakteri. Konsentrasi AIA pada media yang
ditambahkan L-triptofan lebih tinggi dibandingkan konsentrasi AIA pada media tanpa
penambahan L-triptofan. AIA mulai dihasilkan pada jam ke-8, yaitu pada akhir fase logaritma dan
terus meningkat pada fase stasioner. Hal ini mengindikasikan bahwa AIA termasuk senyawa
metabolit sekunder pada bakteri. Dua belas isolat yang menghasilkan AIA tertinggi diuji
kemampuannya dalam melarutkan fosfat anorganik dengan cara menumbuhkannya pada media
Pikovskaya. Kemampuan melarutkan P terbesar dihasilkan oleh isolat DM-4 dengan indeks
pelarutan P sebesar 55.6. Isolat HI-2 dan BY-1 diuji kemampuannya dalam memacu pertumbuhan
kecambah biji kedelai. Hasil uji pemacuan perkecambahan biji memperlihatkan bahwa pengaruh
perlakuan bakteri tidak berbeda nyata terhadap pemanjangan batang kecambah, tetapi memberikan
pengaruh nyata terhadap pemanjangan akar primer dan percabangan akar lateral. Jumlah cabang
akar lateral kecambah yang diberi perlakuan lebih banyak dibanding kontrol. Sebaliknya, inokulasi
bakteri menghambat pemanjangan akar primer.
ABSTRACT
TIKA WIDAYANTI. Isolation and Characterization of Bacillus sp. Indigenous Producing
Indole Acetic Acid from Rhizosphere Soils. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and NISA
RACHMANIA MUBARIK.
Bacteria belonging to genus Bacillus as plant growth promoting bacteria (PGPB), had been
isolated from soil’s rhizosphere of eleven places in Java. Partial characterization shows the
bacteria had rod-shaped and Gram positive, endospore structures, and generally positive catalases,
except HI-9, SI-2, and PI-8 were negative catalases. These isolates were analysed for indole acetic
acid (IAA) production which were assayed colorimetrically using Salkowski’s reagent. IAA
production assay showed that 61 from 63 isolates produced IAA, in which HI-2 and TG-1 had the
highest concentration of IAA. These isolates produced 67.2 ppm IAA in media supplemented with
0.5 mM L-tryptophan, whereas 47.6 and 38.9 ppm each for HI-2 and TG-1 in media without Ltryptophan. Growth and IAA determination curve were made by using HI-2 as a model. The result
showed that IAA production parallel with bacterial growth. IAA concentration in media
supplemented with L-tryptophan higher than in media without L-tryptophan. IAA was produced
significantly at 8th hour at the end of logaritmic phase, and its concentration increased in the
stationer phase. This condition indicated that IAA is secondary metabolite compound of these
bacteria. Twelve isolates that produced the highest level of IAA were tested qualitatively in ability
for solubilizing inorganic phosphate by plating the bacteria in Pikovskaya’s medium. The highest
ability to solubilize P was produced by isolate DM-4 with 55.6 of phosphate solubilization index.
The ability to promote the growth of soybean seeds germination of HI-2 and BY-1 were tested.
The result of seeds germination promotion test suggested that the effect of IAA-producing bacteria
significantly were not different compared with the control regarding to the germination of stem
elongation, but its influenced significantly toward the lateral roots proliferation and primary roots
elongation. The number of lateral roots branch treated with IAA producing-bacteria higher than
that the control. In contrary, the elongation of primary roots was inhibited by the bacteria
inoculated.
ISOLASI DAN KARAKTERISASI Bacillus sp. INDIGENUS PENGHASIL
ASAM INDOL ASETAT ASAL TANAH RIZOSFER
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Oleh:
Tika Widayanti
G34102021
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
Judul Skripsi : Isolasi dan Karakterisasi Bacillus sp. Indigenus Penghasil Asam
Indol Asetat Asal Tanah Rizosfer
Nama
: Tika Widayanti
NIM
: G34102021
Menyetujui
Pembimbing I,
Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si.
NIP 131 957 319
Pembimbing II,
Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.
NIP 132 045 531
Mengetahui
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS.
NIP 131 473 999
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya
ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih adalah mikrob penghasil hormon tumbuhan,
dengan judul Isolasi dan Karakterisasi Bacillus sp. Indigenus Penghasil Asam Indol Asetat Asal
Tanah Rizosfer. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Penulis menghaturkan terima kasih kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. dan Dr. Nisa
Rachmania Mubarik, M.Si. selaku pembimbing atas ilmu pengetahuan dan saran yang telah
diberikan. Ucapan terima kasih kepada Dr. Ir. H. Ibnul Qayim sebagai dosen penguji dan wakil
komisi pendidikan atas saran dan diskusi yang diberikan. Penelitian ini dibiayai oleh The Second
Kennedy Round (SKR) JICA Jepang Tahun 2006 melalui kerjasama Departemen Pertanian dengan
Institut Pertanian Bogor yang berjudul ”Perbaikan dan Pemanfaatan Bahan Organik dan Mikrob
Tanah Potensial untuk Meningkatkan Produksi Tanaman di Jawa Tengah dan Jawa Barat” untuk
itu penulis juga menyampaikan terimakasih. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ary sebagai
teman seperjuangan, Vitria, Dewi, Tika T, Mia, Dhilah, Achie, Nirli, Ade, Wida, Disa, Eci, Ninda,
Ela, Ina, Adisty, Adit, Bian serta seluruh teman-teman Biologi Angkatan 39 atas persahabatan,
dukungan moral, dan perhatiannya. Ucapan terima kasih juga dihaturkan kepada Pa Djoni, Mba
Heni, Mba Rika, Bu It, Mba Rina dan staf laboratorium lainnya atas bantuannya. Terima kasih
juga penulis sampaikan kepada mama, papa, Rizki, serta seluruh keluarga atas segala doa dan
kasih sayang yang senantiasa diberikan. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Januari 2007
Tika Widayanti
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di kota Karawang pada tanggal 1 Februari 1985. Penulis merupakan
anak pertama dari dua bersaudara, dari ayah Karyono dan ibu Titin Handayani. Tahun 2002
penulis lulus dari SMU Negeri 1 Cikampek dan pada tahun yang sama masuk Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Ujian
Seleksi Masuk IPB (USMI).
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Mikrobiologi Dasar
(tahun akademik 2004/2005, 2005/2006, 2006/2007), Biologi Dasar (2005/2006, 2006/2007), dan
Botani Umum (2005/2006). Pada alih semester tahun 2005, penulis melaksanakan tugas praktek
lapang selama satu bulan di PT Pupuk Kujang Cikampek, Karawang, Jawa Barat. Penulis juga
menerima beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik (PPA) pada tahun 2006, serta terpilih sebagai
finalis Program Kreativitas Mahasiswa bidang Penulisan Ilmiah (PKMI) tahun 2005 dan Program
Kreativitas Mahasiswa bidang Penelitian (PKMP) tahun 2006 yang diadakan Direktorat Jenderal
Pendidikan Tinggi (DIKTI).
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL...................................................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................. viii
DAFTAR LAMPIRAN.............................................................................................................. viii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ................................................................................................................
Waktu dan Tempat Penelitian .........................................................................................
1
2
BAHAN DAN METODE
Bahan ..............................................................................................................................
Metode ............................................................................................................................
Isolasi Bacillus sp. dari Rizosfer..............................................................................
Karakterisasi Fisiologi Secara Parsial......................................................................
Analisis Produksi Asam Indol Asetat (AIA) ...........................................................
Kurva Pertumbuhan dan Penentuan Sintesis AIA ...................................................
Uji Pelarutan Fosfat .................................................................................................
Uji Perkecambahan Biji Kedelai .............................................................................
2
2
2
2
2
2
3
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil ................................................................................................................................
Isolasi Bacillus sp. dari Rizosfer..............................................................................
Karakterisasi Fisiologi Secara Parsial......................................................................
Analisis Produksi Asam Indol Asetat (AIA) ...........................................................
Kurva Pertumbuhan dan Penentuan Sintesis AIA ...................................................
Uji Pelarutan Fosfat .................................................................................................
Uji Perkecambahan Biji Kedelai .............................................................................
Pembahasan.....................................................................................................................
3
3
3
3
5
5
5
6
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan .........................................................................................................................
Saran ...............................................................................................................................
8
8
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................
9
LAMPIRAN...............................................................................................................................
11
DAFTAR TABEL
Halaman
1
2
3
Produksi asam indol asetat (AIA) dari isolat-isolat Bacillus sp. yang berhasil
diisolasi...............................................................................................................................
Hasil pengujian pelarutan fosfat dari 12 isolat Bacillus sp .................................................
Pengaruh inokulasi Bacillus sp. penghasil AIA terhadap perkecambahan biji kedelai.......
4
5
6
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
5
Hasil pewarnaan Gram menunjukan bakteri Gram positif berbentuk batang dengan
perbesaran 2000x (A), dan endospora dengan perbesaran 1000x, ditunjukkan dengan
tanda panah (B)...................................................................................................................
Pengukuran konsentrasi AIA pada isolat TG-1, (A) media kosong (kontrol 1),
(B) kultur pada media tanpa L-trp, (C) kultur pada media dengan L-trp, (D) media
kosong yang ditambah L-trp (kontrol 2) .............................................................................
Kurva pertumbuhan dan sintesis AIA dari isolat HI-2 yang diproduksi pada media LB....
Zona bening yang terbentuk pada media Pikovskaya menandakan trikalsium fosfat
yang telah terlarut (ditunjukkan dengan tanda panah) ........................................................
Hasil perkecambahan kedelai, (a) kontrol, (B) kecambah yang diinokulasi dengan
isolat BY-1, (C) kecambah yang diinokulasi dengan isolat HI-2 .......................................
3
5
5
5
6
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
Karakteristik koloni Bacillus sp. yang berhasil diisolasi dari 11 lokasi pengambilan
sampel.................................................................................................................................
Kurva standar pengukuran AIA ..........................................................................................
Kurva standar pertumbuhan isolat HI-2..............................................................................
12
14
14
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penggunaan senyawa kimia sebagai
pupuk dan pestisida di bidang pertanian
semakin
meningkat
seiring
dengan
berkembangnya pertanian modern. Hal ini
telah menyebabkan dampak negatif terhadap
lingkungan,
terutama
meningkatnya
pencemaran lingkungan. Masyarakat saat ini
juga cenderung lebih memilih pangan yang
bebas pestisida dan bahan kimia lainnya.
Kesadaran akan lingkungan yang sehat dan
perkembangan di bidang bioteknologi telah
mendorong
berkembangnya
penelitian
tentang
penggunaan
mikroorganisme,
khususnya bakteri dan cendawan, sebagai
agen pupuk hayati dan pestisida alami yang
ramah lingkungan. Penemuan ini diduga
akan menjadi trend baru dalam pertanian
modern.
Bakteri yang hidup di rizosfer yang
memberikan
pengaruh
positif
bagi
pertumbuhan
tanaman
dikelompokkan
sebagai
plant
growth-promoting
rhizobacteria (PGPR). Istilah ini ditujukan
untuk bakteri yang secara agresif
mengkolonisasi rizosfer dan permukaan
akar. PGPR juga dapat masuk ke dalam
struktur akar dan membentuk populasi
endofitik, misalnya Azospirillum sp. dan
Azotobacter sp. (Kloepper et al. 1999; Gray
& Smith 2005). Sedangkan untuk bakteri
pemacu pertumbuhan yang berasosiasi
dengan spesies tanaman dan umumnya
terdapat di berbagai habitat disebut plant
growth-promoting bacteria (PGPB) (Bashan
& Holguin 1998). PGPB memberikan
keuntungan melalui berbagai mekanisme
yang berbeda, misalnya produksi metabolit
sekunder seperti antibiotik, kitinase, β-1,3glukanase, sianida, substansi hormon,
sebagai
pengendali
biologi
melalui
kompetisi, induksi sistem pertahanan
terhadap patogen, produksi siderofor,
pelarutan fosfat dan fiksasi N 2 (Glick 1995;
Husen 2003).
Mikroorganisme mampu menghasilkan
hormon tumbuhan seperti auksin, sitokinin,
dan giberelin (Leveau & Lindow 2005).
Bakteri yang dapat menghasilkan auksin
antara lain Pseudomonas sp. Azospirillum
sp., Azotobacter sp., Bacillus sp.,
Lactobacillus sp., Paenibacillus polymyxa,
Enterobacter sp., Serratia marcescens,
Klebsiella sp., Alcaligenes faecalis dan
sianobakteria (Torres-Rubio et al. 2000;
Leveau & Lindow 2005).
Asam indol asetat (AIA) merupakan
hormon auksin utama pada tumbuhan yang
mengendalikan berbagai proses fisiologi
penting
meliputi
pembelahan
dan
perkembangan sel, diferensiasi jaringan,
serta respon terhadap cahaya dan gravitasi
(Salisbury & Ross 1992). Tumbuhan
mungkin tidak mensintesis AIA dalam
jumlah yang cukup untuk pertumbuhan yang
optimal. Oleh karena itu diperlukan
tambahan hormon pemacu pertumbuhan dari
luar, meskipun berdasarkan penelitianpenelitian yang telah dilakukan, respon
tanaman terhadap AIA yang dihasilkan
mikrob berbeda-beda tergantung spesies
tanaman dan konsentrasi AIA yang
dilepaskan (Patten & Glick 2002).
Biosintesis AIA oleh mikrob di tanah
meningkat dengan adanya L-triptofan yang
berasal dari eksudat akar atau sel-sel
organisme yang rusak, karena L-triptofan
merupakan
prekursor
pada
lintasan
biosintesis AIA (Benizri et al. 1998).
Mekanisme PGPB dalam memacu
pertumbuhan tanaman, selain menghasilkan
AIA diantaranya dengan melarutkan
senyawa fosfat dalam tanah. Bakteri pelarut
fosfat berpotensi meningkatkan ketersediaan
fosfat terlarut bagi tanaman, terutama pada
tanah yang banyak mengandung endapan
fosfor. Bakteri pelarut fosfat melepaskan
ikatan fosfat anorganik yang sukar larut
dengan mensekresikan sejumlah asam
organik. Mekanisme tersebut bukan satusatunya cara untuk melarutkan fosfat.
Beberapa
bakteri
seperti
B.
amyloliquefaciens, B. subtilis, Klebsiella
terrigena,
Pseudomonas
spp.
dan
Enterobacter sp. dilaporkan mempunyai
aktivitas fitase, suatu enzim golongan
fosfomonoesterase
yang
mampu
menghidrolisis polifosfat organik tak larut
(fitat) menjadi rangkaian ester fosfat
berbobot molekul rendah dari myo-inositol
dan fosfat yang penting untuk prokariot dan
eukariot (Idriss et al. 2002).
Bacillus sp. merupakan bakteri Gram
positif, berbentuk batang, dan memiliki
endospora. Bacillus sp termasuk kelompok
PGPB yang memiliki banyak potensi karena
mampu memproduksi AIA, melarutkan
fosfat, mensekresi siderofor, dan berperan
sebagai
agen
biokontrol
dengan
menginduksi sistem kekebalan tanaman
serta menghasilkan antibiotik (Compant et
al. 2005). Struktur endospora pada Bacillus
2
membuatnya memiliki eksistensi yang tinggi
di alam karena spora tersebut tahan terhadap
cekaman lingkungan. Hal ini menjadikannya
sebagai PGPB yang dapat diformulasikan
menjadi produk yang relatif stabil bila
digunakan dalam skala industri dan aplikasi
di lapangan (Emmert & Handelsman 1999).
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan
mengkarakterisasi Bacillus sp. indigenus
penghasil asam indol asetat asal tanah
rizosfer.
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan
Juni
sampai
November
2006,
di
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen
Biologi, FMIPA, IPB.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan ialah isolat
Bacillus yang berasal dari 11 lokasi
pengambilan sampel tanah rizosfer yang
diambil dari Demak, Kebumen, Rembang,
Boyolali, dan Tegal, Jawa Tengah, serta
Karawang, dan Indramayu, Jawa Barat
(Lampiran 1), serta biji kedelai Tanggamus
koleksi Dr. Ir Muhammad Jusuf (Pusat
Penelitian Sumber Daya Hayati dan
Bioteknologi, IPB).
Metode
Isolasi Bacillus sp. dari Rizosfer.
Isolasi Bacillus sp. dilakukan dengan
memasukkan 1 gram sampel tanah rizosfer
ke dalam tabung berisi 10 ml larutan garam
fisiologis (NaCl 0.85%), dikocok kuat, dan
dipanaskan di dalam penangas air pada suhu
80 °C selama 20 menit, kemudian dilakukan
pengenceran secara serial. Pengenceran 10-5,
10-6, dan 10-7 disebar sebanyak 100 µl pada
media agar-agar nutrien (NA), dan
diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang.
Koloni bakteri yang tumbuh diamati serta
dimurnikan pada media Luria Bertani Agar
(LA) yang mengandung NaCl 10 g, tripton
10 g, ekstrak khamir 5 g, dan agar-agar 20 g
untuk 1 L media.
Karakterisasi Fisiologi Secara Parsial.
Pewarnaan Gram, pewarnaan spora, uji
katalase dan preparat lekapan basah
dilakukan berdasarkan metode standar (Lay
1994).
Masing-masing
bakteri
yang
digunakan untuk pewarnaan Gram dan spora
berumur 12 dan 48 jam, dan uji katalase
menggunakan bakteri berumur 24 jam pada
media LA.
Analisis Produksi Asam Indol Asetat
(AIA). Produksi asam indol asetat diukur
berdasarkan
metode
kolorimetri
menggunakan reagen Salkowski (Gordon &
Weber 1951; Patten & Glick 2002) yang
mengandung 150 ml H 2 SO 4 pekat, 250 ml
akuades, dan 7.5 ml FeCl 3 0.5 M. Isolat
bakteri yang diperoleh diinokulasikan
sebanyak satu lup ke dalam dua media, yaitu
media LB yang ditambah dengan L-triptofan
(L-trp) 0.5 mM dan media LB tanpa
penambahan
L-trp.
Kultur
tersebut
kemudian dikocok dengan kecepatan 100
rpm selama 48 jam pada suhu ruang.
Selanjutnya kultur disentrifugasi pada
kecepatan 9000 g selama 30 menit.
Supernatan diambil sebanyak 2 ml dan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril,
kemudian ditambahkan 2 ml reagen
Salkowski dan dikocok dengan vortex.
Sebagai kontrol, digunakan media kosong
tanpa triptofan dan media yang ditambah
triptofan. Selanjutnya dibiarkan pada suhu
ruang dalam keadaan gelap selama satu jam
sebelum diukur absorbansinya menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang
510 nm. Konsentrasi AIA yang terdapat
dalam kultur ditentukan berdasarkan kurva
standar AIA (Lampiran 2). Isolat-isolat yang
menghasilkan AIA dalam jumlah cukup
besar diseleksi untuk pengujian pelarutan
fosfat.
Kurva Pertumbuhan dan Penentuan
Sintesis AIA. Isolat yang menghasilkan
AIA dengan jumlah paling besar, yaitu isolat
HI-2 digunakan sebagai model untuk
mengetahui produksi AIA. Satu lup biakan
HI-2 yang berumur 24 jam ditumbuhkan
dalam 15 ml media LB dan dikocok 100 rpm
pada suhu ruang, selama 6 jam. Inokulum
dipindahkan ke dalam 135 ml media
produksi LB yang telah ditambahkan 0.5
mM triptofan dan dikocok kembali dengan
kecepatan dan kondisi yang sama.
Kemudian setiap 3 jam dilakukan
pengukuran turbiditas (% transmitan) dan
kandungan AIA, sampai diperoleh fase
kematian. Kurva standar pertumbuhan
dibuat untuk mengetahui jumlah sel dan
dilakukan pada saat inokulum mulai
memasuki fase eksponensial dengan
menggunakan metode hitungan cawan dan
turbidimetri
(Lampiran
3).
Metode
turbidimetri
dilakukan
dengan
cara
3
mengukur turbiditas dari pengenceran 1:1,
1:2, 1:4, 1:8, 1:16, sedangkan hitungan
cawan dengan menyebar inokulum pada
pengenceran 10-6, 10-8, 10-9, 10-10.
Uji Pelarutan Fosfat. Dua belas isolat
bakteri terpilih diuji kemampuannya dalam
melarutkan fosfat. Isolat-isolat tersebut
ditumbuhkan dengan cara ditotol pada media
agar yang mengandung trikalsium fosfat,
yang merupakan modifikasi dari media
Pikovskaya (Rao & Sinha 1962) dengan
komposisi glukosa 10 g, Ca 3 HO 13 P 3 5 g,
(NH 4 ) 2 SO 4 0.5 g, KCl 0.2 g, MgSO 4 ·7H 2 O
0.1 g, ekstrak khamir 0.5 g, MnSO 4 25 mg,
dan FeSO 4 25 mg, serta agar-agar 15 g
dalam 1 L akuades. Setelah inkubasi selama
7 hari, zona bening yang terdapat di
sekeliling koloni diamati dan diukur indeks
pelarutan fosfatnya berdasarkan rumus:
Indeks pelarutan fosfat =
diameter zona bening − diameter koloni
diameter koloni
Uji Perkecambahan Biji Kedelai.
Perkecambahan biji dilakukan untuk melihat
respon AIA yang disintesis bakteri terhadap
pertumbuhan
kecambah
biji.
Uji
perkecambahan biji menggunakan kedelai
varietas Tanggamus sebagai model. Biji
kedelai
Tanggamus
disterilisasi
permukaannya dengan cara direndam dalam
etanol 95% selama 10 detik, kemudian
direndam dalam H 2 O 2 5% selama 5 menit
dan dibilas dengan akuades steril sebanyak 7
kali untuk menghilangkan residu peroksida.
Biji yang telah steril diletakkan pada
cawan yang dialasi kertas saring yang telah
dibasahi dengan akuades steril, kemudian
diletakkan di ruang gelap. Setelah 24 jam,
setiap biji yang telah mulai berkecambah
ditetesi dengan 100 μl kultur bakteri
(± 8x109 sel/ml). Isolat yang digunakan ialah
HI-2, mewakili isolat yang menghasilkan
AIA dengan konsentrasi tinggi, dan BY-1
mewakili isolat yang menghasilkan AIA
dengan konsentrasi rendah, serta media
kosong sebagai kontrol. Cawan tersebut
diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang
dalam kondisi gelap. Kemudian dilakukan
pengukuran panjang batang, panjang akar
primer, dan jumlah akar lateral. Setiap
perlakuan dilakukan sebanyak dua kali
ulangan dan setiap ulangan menggunakan
sepuluh biji kedelai. Hasil pengukuran
dianalisis secara statistik dengan one-way
Analysis
of
Variance
(ANOVA)
menggunakan program SPSS.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Isolasi Bacillus sp. dari Rizosfer. Hasil
isolasi Bacillus sp. dari 11 lokasi
pengambilan sampel tanah diperoleh
sebanyak 63 isolat yang berpotensi sebagai
penghasil AIA (Tabel 1). Pemanasan sampel
tanah bertujuan sebagai seleksi awal isolasi.
Bacillus sp. akan tahan terhadap pemanasan
karena memiliki struktur endospora,
sedangkan bakteri lain akan mati. Isolatisolat tersebut kemudian diamati karakter
koloninya secara visual.
Karakterisasi Fisiologi Secara Parsial.
Hasil pewarnaan Gram dan spora
menunjukkan sel bakteri bersifat Gram
positif, berbentuk batang dengan ukuran dan
penataan yang berbeda-beda, dan memiliki
endospora dengan bentuk dan letak yang
bervariasi (Gambar 1). Uji katalase
memperlihatkan hasil positif untuk seluruh
isolat, kecuali isolat HI-9, SI-2 dan PI-8.
1 µm
2 µm
A
B
Gambar 1 Hasil pewarnaan Gram isolat
HI-2 menunjukan bakteri Gram
positif berbentuk batang dengan
perbesaran 2000x (A), dan
endospora isolat PI-4 dengan
perbesaran 1000x, ditunjukkan
dengan tanda panah (B).
Analisis Produksi Asam Indol Asetat
(AIA). Dari 61 isolat yang memproduksi
AIA, isolat HI-2 menghasilkan konsentrasi
AIA tertinggi yaitu 67.2 ppm pada media
yang ditambah L-trp dan 47.6 ppm pada
media tanpa L-trp. Isolat TG-1 juga
memiliki konsentrasi yang sama dengan HI2 pada media yang ditambah L-trp, tetapi
pada media tanpa L-trp lebih rendah dari HI2, yaitu sebesar 38.9 ppm. Pengukuran AIA
dilakukan berdasarkan perubahan warna
supernatan
setelah
ditambah
reagen
Salkowski menjadi warna merah muda
(Gambar 2). Konsentrasi AIA pada kultur
bakteri yang ditumbuhkan pada media
dengan penambahan L-trp umumnya lebih
tinggi daripada konsentrasi AIA pada kultur
yang dtumbuhkan pada media tanpa L-trp.
4
Tabel 1 Produksi asam indol asetat (AIA) dari isolat-isolat Bacillus sp. yang berhasil diisolasi
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
Lokasi Pengambilan
Sampel
Asal Tanah
Ds. Kedung Dawa,
Kec. Gabus Wetan,
Indramayu
Rizosfer padi
Ds. Sidadadi, Kec.
Haurgeulis,
Indramayu
Rizosfer padi
Patrol, Indramayu
Rizosfer padi
Ds. Mekar Gading,
Kec. Sliyeg,
Indramayu
Rizosfer padi
Ds. Santi, Kec.
Losarang, Indramayu
Rizosfer padi
Ds. Cariumulya Kec.
Telaga Sari,
Karawang
Rizosfer padi
Tegal
Rizosfer padi
Sawah
Demak
Rizosfer kacang dan
bahan organik
Kebumen
Rizosfer padi
Rizosfer kacang tanah
Boyolali
Rizosfer kacang tanah
Rembang
Pupuk kompos
Kode
Isolat
GI-1
GI-2
GI-3
GI-4
GI-5
GI-6
HI-1
HI-2
HI-3
HI-4
HI-5
HI-6
HI-7
HI-8
HI-9
PI-1
PI-2
PI-3
PI-4
PI-5
PI-6
PI-7
PI-8
PI-9
PI-10
SI-1
SI-2
SI-3
SI-4
SI-5
SI-6
LI-1
LI-2
LI-3
LI-4
TK-1
TK-2
TK-3
TK-4
TK-5
TG-1
TG-2
TG-3
TG-4
TG-5
TG-6
DM-1
DM-2
DM-3
DM-4
DM-5
DM-6
DM-7
KB-1
KB-2
KB-3
BY-1
BY-2
BY-3
BY-4
RB-1
RB-2
RB-3
Konsentrasi AIA
tanpa triptofan
(ppm)
5.5
37.5
5.8
5.8
0.0
5.3
29.8
47.6
0.5
3.9
8.6
3.9
1.7
4.1
0.0
6.0
9.1
4.1
32.1
5.3
7.4
3.3
0.0
9.5
3.9
7.0
4.5
5.3
4.5
7.4
4.7
5.8
5.3
1.8
5.8
8.3
8.3
8.6
29.7
3.7
38.9
1.7
6.6
3.3
5.3
6.4
28.6
5.3
4.1
5.8
5.0
6.6
6.2
22.7
9.3
8.8
6.2
6.0
11.2
11.0
3.6
3.0
6.3
Konsentrasi AIA dengan
triptofan 0.5 mM
(ppm)
4.5
46.3
1.9
31.7
4.9
4.5
39.1
67.2
5.82
11.0
10.8
8.7
6.0
6.3
0.0
4.0
2.0
3.3
53.6
4.0
6.1
4.0
0.0
9.8
3.6
10.3
3.6
7.7
6.5
7.5
8.5
7.7
6.3
2.5
3.3
8.3
11.1
10.8
34.9
7.6
67.2
1.2
3.3
7.0
6.0
7.0
37.2
5.9
4.9
14.5
9.1
7.0
7.2
20.9
6.3
8.8
7.0
6.3
6.2
11.3
6.4
2.8
5.5
5
A
Gambar 2
B
C
menunjukkan
kemampuan
melarutkan
fosfat. Aktivitas pelarutan fosfat ditandai
dengan terbentuknya zona bening di sekitar
koloni bakteri (Gambar 4). Berdasarkan
hasil uji pelarutan P, indeks pelarutan P
terbesar dihasilkan oleh isolat DM-4 yaitu
55.6, kemudian disusul isolat TK-4 (50) dan
HI-4 (42.9) (Tabel 2). Isolat HI-2 dan TG-1
yang menghasilkan AIA tertinggi memiliki
indeks pelarutan P masing-masing sebesar
16.7 dan 25. Sedangkan pada isolat KB-1
tidak menunjukkan adanya pelarutan fosfat.
D
Pengukuran konsentrasi AIA
pada isolat TG-1, (A) media
kosong (kontrol 1), (B) kultur
pada media tanpa L-trp,
(C) kultur pada media dengan
L-trp, (D) media kosong yang
ditambah L-trp (kontrol 2).
Kurva Pertumbuhan dan Penentuan
Sintesis AIA. Pertumbuhan isolat HI-2
cenderung
tidak
dipengaruhi
oleh
penambahan triptofan (Gambar 3). Isolat
HI-2 mulai memproduksi AIA pada jam
ke-8, baik pada media dengan penambahan
L-trp maupun media tanpa L-trp.
Konsentrasi AIA pada media dengan L-trp
terus meningkat dan mencapai konsentrasi
tertinggi pada jam ke-31, yaitu 61.2 ppm
dengan jumlah sel 8.3x109 sel/ml. Pada
media tanpa L-trp, konsentrasi AIA
mencapai puncak pada jam ke-43, yaitu
sebesar 53.9 ppm dengan jumlah sel 8.3x109
sel/ml.
Gambar 4
Tabel 2 Hasil pengujian pelarutan fosfat
dari 12 isolat Bacillus sp.
Konsentrasi AIA
(ppm)
65
Log sel
6.9
6.8
6.7
6.6
6.5
6.4
6.3
6.2
6.1
6
5.9
55
45
35
25
15
5
-5
0
4
8
12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52
Waktu (jam)
Pertumbuhan HI-2 dalam media dengan penambahan triptofan
Pertumbuhan HI-2 dalam media tanpa penambahan triptofan
Produksi AIA dengan penambahan triptofan
Produksi AIA tanpa penambahan triptofan
Gambar 3 Kurva pertumbuhan dan sintesis
AIA dari isolat HI-2 yang
diproduksi pada media LB.
Uji Pelarutan Fosfat. Uji pelarutan
fosfat dilakukan terhadap 12 isolat yang
menghasilkan AIA tertinggi. Dari 12 isolat
yang diuji, diperoleh 11 isolat yang
Zona bening yang terbentuk
pada
media
Pikovskaya
menandakan trikalsium fosfat
yang
telah
terlarut
(ditunjukkan dengan tanda
panah).
Kode Isolat
HI-2
TG-1
PI-4
GI-2
HI-1
DM-1
TK-4
GI-4
KB-1
DM-4
HI-4
BY-4
Pelarutan
Fosfat
Indeks Pelarutan
Fosfat
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
16.7
25
16.7
12.5
11.1
28.6
50.0
6.3
55.6
42.9
3.9
Uji Pengecambahan Biji Kedelai.
Pemberian inokulasi bakteri penghasil AIA
tidak memberikan pengaruh berbeda nyata
terhadap pemanjangan batang, tetapi
memberikan
pengaruh
terhadap
perkembangan akar primer dan akar lateral
kecambah kedelai (Tabel 3). Akar primer
kecambah yang diinokulasi dengan Bacillus
sp.
penghasil
AIA
lebih
pendek
dibandingkan dengan kontrol (Gambar 5).
Tetapi jumlah akar lateral kecambah yang
diberi perlakuan bakteri cenderung lebih
6
banyak dibandingkan dengan kontrol. Isolat
BY-1 yang menghasilkan AIA rendah
menginduksi pertumbuhan akar lateral lebih
banyak daripada isolat HI-2 yang
menghasilkan konsentrasi AIA tinggi.
Tabel 3 Pengaruh inokulasi Bacillus sp.
penghasil
AIA
terhadap
perkecambahan biji kedelai
Perlakuan
Kontrol
BY-1
HI-2
Panjang
batang
(cm)
4.4a
4.0a
3.9a
Panjang
akar primer
(cm)
3.7a
0.9b
1.3b
Jumlah
akar
lateral
35.9a
41.7b
36.9ab
Angka yang diikuti huruf yang sama dalam satu kolom
tidak berbeda nyata pada taraf 5% menurut uji Duncan
A
B
C
Gambar 5 Hasil perkecambahan kedelai,
(a) kontrol, (B) kecambah yang
diinokulasi dengan isolat BY-1,
(C) kecambah yang diinokulasi
dengan isolat HI-2.
Pembahasan
Asam indol asetat (AIA) adalah jenis
auksin yang penting bagi pertumbuhan
tanaman. AIA terlibat dalam berbagai proses
fisiologi tumbuhan seperti inisiasi akar,
pemanjangan sel, diferensiasi jaringan
pembuluh, dan proses pembungaan (Husen
& Saraswati 2003). Sebanyak 63 isolat
Bacillus berhasil diisolasi dari 11 lokasi
pengambilan sampel. Hasil karakterisasi
fisiologis menunjukkan sel Bacillus
berbentuk batang, bersifat Gram positif,
memiliki endospora, dan pada umumnya
bersifat katalase positif, kecuali untuk isolat
HI-9, SI-2, dan PI-8 bersifat katalase negatif.
Dari 63 isolat yang diuji, diperoleh sebanyak
61 isolat yang dapat mensintesis AIA. Dua
isolat yang menghasilkan AIA dengan
konsentrasi tertinggi adalah isolat HI-2 dan
TG-1.
Namun
pada
media
tanpa
penambahan
L-trp,
isolat
TG-1
menghasilkan
AIA
lebih
rendah
dibandingkan dengan isolat HI-2. Isolat HI-2
memiliki karakter koloni bundar dengan
tepian rata, berwarna krem kecoklatan,
berlendir,
dan
elevasinya
cembung.
Sedangkan isolat TG-1 memiliki karakter
koloni bundar dengan tepian rata, warna
putih krem, berlendir dan elevasinya
cembung (Lampiran 3). Beberapa spesies
Bacillus yang telah diketahui berperan
sebagai PGPB adalah
B. subtilis, B.
pumilus, B. cereus, B. brevis, B. polymyxa,
B. pasteurii, B. amyloliquifaciens (Ryu et al.
2004; Shishido et al. 1996)
Reagen Salkowski yang digunakan dalam
pengukuran AIA dapat bereaksi dengan
asam indol piruvat yang terakumulasi dalam
filtrat yang diuji sehingga menyebabkan
terbentuknya warna merah. Asam indol
piruvat merupakan produk dari katalisis
triptofan
yang
dilakukan
triptofan
transaminase. Katalisis oleh enzim ini
merupakan langkah awal dalam lintasan
biosintesis AIA (Patten & Glick 2002).
Glickmann dan Dessaux (1995) juga
melaporkan bahwa Salkowski dapat
mendeteksi keberadaan senyawa-senyawa
antara dalam sintesis AIA, seperti triptofan,
indol etanolamin (triptamin), indol etanol
(triptofol), asam indol piruvat, asam indol
laktat (ILA) dan indol asetamida (IAM).
Hasil pengukuran AIA dari isolat
Bacillus yang diperoleh memperlihatkan
bahwa sebagian besar isolat yang
ditumbuhkan pada media yang ditambah
dengan triptofan menunjukkan konsentrasi
AIA yang lebih tinggi dibandingkan
konsentrasi AIA pada media tanpa
penambahan triptofan. Hal ini terjadi karena
L-triptofan (L-trp) merupakan prekursor
pada biosintesis AIA. Biosintesis AIA baik
pada tumbuhan maupun pada bakteri dapat
terjadi melalui lintasan yang bergantung Ltrp (tryptophan-dependent pathway) atau
tidak bergantung L-trp (tryptophanindependent pathway). Lintasan yang tidak
bergantung L-trp menggunakan indol
sebagai prekursor dalam sintesis auksin.
Pada bakteri patogen tanaman, seperti
Agrobacterium
tumefaciens
dan
Pseudomonas syringae, AIA dihasilkan dari
L-trp melalui lintasan indol asetamida yang
memiliki keterlibatan dalam menginduksi
tumor tanaman. Sedangkan pada bakteri
nonpatogen, seperti PGPB, sintesis AIA
umumnya terjadi melalui lintasan asam indol
piruvat yang tergantung L-trp (Patten &
Glick 2002).
AIA dapat dideteksi pada isolat yang
ditumbuhkan pada media tanpa penambahan
7
L-trp, sehingga dapat diindikasikan bahwa
Bacillus mampu mensintesis AIA tanpa
keberadaan L-trp. Bacillus sp. juga diketahui
dapat membentuk L-trp di dalam selnya.
Regulasi gen yang terlibat dalam biosintesis
L-trp telah dipelajari secara ekstensif pada
B. subtilis, B. pumilus, B. halodurans, dan
B. stearothermophilus. B. subtilis memiliki
operon trpEDCFBA yang mengandung 6
dari 7 gen yang diperlukan dalam biosintesis
triptofan dari asam khorismat (prekursor
kelompok asam amino) (Szigeti et al. 2004).
Sedangkan beberapa kelompok bakteri
seperti Azospirillum sp. tidak dapat
mensintesis AIA tanpa keberadaan L-trp
dalam media tumbuhnya. Di tanah, bakteri
rizosfer
memperoleh
L-trp
untuk
mensintesis AIA dari eksudat akar atau selsel organisme yang rusak.
Pola produksi AIA sejalan dengan
pertumbuhan sel bakteri. Dari kurva
pertumbuhan dan penentuan sintesis AIA
dapat dilihat bahwa AIA mulai disintesis
pada awal fase log meskipun dalam jumlah
yang sedikit. AIA diproduksi secara
signifikan pada akhir fase logaritma, yaitu
pada jam ke-8. Pada media dengan
penambahan L-trp, saat sel mulai memasuki
fase stasioner, yaitu pada jam ke-10,
produksi AIA meningkat dengan pesat (27.1
ppm), kemudian terus meningkat hingga
mencapai puncak pada jam ke-31 (61.2
ppm). Sedangkan dalam media tanpa
penambahan L-trp, konsentrasi AIA
mencapai puncak pada jam ke-43 (53.7
ppm). Memasuki fase kematian, produksi
AIA sedikit demi sedikit mengalami
penurunan.
Produksi AIA pada isolat HI-2 yang
ditumbuhkan dalam media tanpa L-trp lebih
rendah dibanding produksi AIA oleh isolat
HI-2 dalam media yang ditambah L-trp.
Konsentrasi AIA yang dihasilkan tergantung
aktivitas dan jumlah sel, ketersediaan nutrisi
dalam media dan substrat L-trp. Gambar 3
menunjukkan bahwa penambahan L-trp
sangat berpengaruh terhadap produksi AIA,
tetapi cenderung tidak mempengaruhi
pertumbuhan sel isolat HI-2. Dari hasil
tersebut dapat diduga bahwa AIA yang
disintesis bakteri merupakan senyawa
metabolit sekunder, namun perlu analisis
lebih lanjut fase pertumbuhan dihasilkannya
enzim-enzim yang terlibat dalam biosintesis
AIA.
Metabolit
sekunder
biasanya
dihasilkan saat sel kekurangan nutrisi atau
dalam kondisi pertumbuhan suboptimal,
adanya biosintesis atau penambahan induser,
atau penurunan rata-rata pertumbuhan sel
bakteri (Somers et al. 2005).
Bacillus termasuk kelompok bakteri
pelarut fosfat yang sudah banyak dipelajari.
Spesies Bacillus yang dilaporkan dapat
melarutkan fosfat antara lain B. brevis, B.
cereus, B. circulans, B. firmus, B.
licheniformis,
B.
megaterium,
B.
mesentricus, B. mycoides, B. polymyxa, B.
pumilis, B. pulvifaciens dan B. subtilis (Tilak
et al. 2005). Uji pelarutan fosfat
menunjukkan bahwa isolat DM-4 memiliki
indeks zona bening pelarutan fosfat yang
paling tinggi, yaitu sebesar 55.6. Indeks
zona bening berkorelasi dengan kemampuan
melarutkan fosfat.
Peranan mikrob dalam melarutkan
senyawa fosfat terkait dengan asam organik
yang dihasilkan dari aktivitas mikrob
(Premono 1998). Asam alifatik dengan βhidroksil dan α-hidroksil seperti sitrat dan
oksalat sangat efektif dalam melarutkan
batuan
fosfat.
Premono
(1998)
mengungkapkan beberapa teori yang
berhubungan erat dengan pelarutan P karena
aktivitas mikrob, diantaranya (i) pelepasan
ortofosfat dari ikatan logam-P melalui
pembentukan kompleks logam-organik, (ii)
persaingan anion organik dan ortofosfat
pada tapak jerapan koloid tanah yang
bermuatan positif, (iii) perubahan muatan
tapak jerapan oleh ligan organik.
Berdasarkan Idriss et al. (2002), pelarutan
fosfat oleh bakteri, misalnya pada B. subtilis
dan B. amyloliquifaciens, juga terjadi karena
aktivitas fosfatase dan fitase (enzim yang
menghidrolisis
fosfat
organik
sukar
larut/fitat).
AIA
yang
disekresikan
bakteri
meningkatkan pertumbuhan akar tanaman
secara langsung dengan menstimulasi
pemanjangan
atau
pembelahan
sel.
Kemampuan produksi AIA dari dua isolat
bakteri, yaitu isolat BY-1 dan HI-2 dikaji
potensinya
dalam
meningkatkan
pertumbuhan kecambah kacang kedelai.
Kedelai kultivar Tanggamus digunakan
sebagai model tanaman dalam rangka
mengembangkan potensi galur-galur kedelai
tahan asam yang dapat diaplikasikan pada
lahan asam. Kedelai Tanggamus memiliki
kandungan protein paling tinggi, yaitu
sebesar 44.5% namun produktivitasnya
relatif rendah dan ukuran bijinya kecil
(Yulianti 2006).
Pengaruh perlakuan bakteri tidak berbeda
nyata terhadap pemanjangan batang
kecambah kedelai, tetapi memberikan
8
pengaruh
yang
berbeda
terhadap
pemanjangan
akar
primer
dan
perkembangan akar lateral kecambah biji.
Akar primer kecambah yang diinokulasi
dengan Bacillus sp. penghasil AIA lebih
pendek dan memiliki percabangan akar
lateral yang lebih banyak dibandingkan
dengan kontrol, terutama isolat BY-1.
Patten & Glick (2002) menyebutkan
bahwa konsentrasi AIA yang rendah, yaitu
sekitar 10-9–10-12 M, akan menstimulasi
pemanjangan akar lateral, sedangkan
konsentrasi AIA yang tinggi yang dihasilkan
oleh inokulum dengan kepadatan tinggi
menstimulasi pembentukan akar lateral dan
adventif. Tetapi pada penelitian ini,
inokulasi kecambah baik menggunakan
isolat HI-2 maupun BY-1 menunjukkan
adanya penghambatan pemanjangan akar
primer. Hal ini dapat disebabkan konsentrasi
AIA pada kultur yang diinokulasikan masih
tergolong taraf yang tinggi (± 10-5-10-3 M).
Nilai tersebut diperkirakan dari jumlah
bakteri pada kultur sel. Aryantha et al.
(2004) menyatakan kecambah kacang hijau
yang ditumbuhkan secara hidroponik dengan
produk cair dari aktinomiset galur LC (36.4
µg AIA/ml media) dan Bacillus galur D3
(52.5 µg AIA/ml
media) mampu
meningkatkan jumlah akar lateral dan
panjang kecambah pada pengenceran 20
kali. Sedangkan kultur aktinomiset galur LC
pada pengenceran 40 dan 60 kali telah
memberikan efek peningkatan panjang
kecambah yang optimum. Hasil tersebut
sesuai dengan sifat hormon tumbuh yang
efektif dalam jumlah yang sangat rendah
(Aryantha et al. 2004).
Glick (1995) melaporkan mekanisme
terjadinya penghambatan pertumbuhan
tanaman akibat produksi AIA yang
berlebihan. AIA eksogenus dalam jumlah
yang tinggi akan meningkatkan transkripsi
dan
aktivitas
aminosiklopropana-1karboksilat (ACC) sintase. Enzim ini akan
mengkatalisis produksi ACC di tanaman.
Senyawa ACC merupakan prekursor dari
hormon
tumbuhan
etilen,
sehingga
konsentrasi etilen di tanaman meningkat.
Etilen
berperan
sebagai
modulator
fitohormon lain dan mencegah terjadinya
pertumbuhan yang berlebihan (overgrowth).
Etilen juga berfungsi menghambat elongasi
akar pada proses perkecambahan. Beberapa
PGPB menstimulasi elongasi akar secara
tidak langsung dengan menghasilkan
aktivitas ACC deaminase yang dapat
menginaktivasi ACC di tanaman (Patten &
Glick 2002).
Produksi AIA sebagai hormon tanaman
oleh bakteri tidak berfungsi sebagai hormon
pada sel bakteri itu sendiri, namun lebih
mengarah kepada perkembangan hubungan
interaksi antara bakteri dengan tanaman.
Keuntungannya
bagi
bakteri
yang
berasosiasi dengan akar yaitu meningkatnya
suplai nutrisi berupa produk metabolit hasil
fiksasi karbon yang dilakukan tanaman.
Produk metabolit tersebut dilepaskan ke
rizosfer melalui akar sebagai eksudat, lisat
dan getah (Patten & Glick 2002). Pada
Azospirillum brasilense, biosintesis AIA dari
L-trp diduga bertujuan untuk mereduksi
tingkat toksisitas L-trp (Bar & Okon 1992).
Sedangkan Dosselaere et al. (1997)
menyebutkan bahwa AIA memiliki peranan
fisiologi tertentu di dalam bakteri, dan bukan
hanya merupakan produk akhir dari proses
detoksifikasi. Hal ini karena gen ipdC yang
diklon dari A. brasilense dinduksi oleh AIA,
bukan oleh L-trp. Gen ipdC merupakan
salah satu dari dua gen yang terlibat dalam
keseluruhan sintesis AIA.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Sejumlah 61 isolat Bacillus sp. yang
diperoleh dari 11 lokasi pengambilan sampel
tanah rizosfer diketahui dapat mensintesis
AIA. Isolat HI-2 dan TG-1 menghasilkan
konsentrasi AIA tertinggi, yaitu sebesar 67.2
ppm pada media dengan penambahan
triptofan, sedangkan pada media tanpa
penambahan triptofan sebesar 47.6 ppm dan
38.9 ppm masing-masing untuk isolat HI-2
dan TG-1. AIA mulai disintesis oleh isolat
HI-2 pada jam ke-8 dan mencapai puncak
pada fase stasioner. Pada uji pelarutan P,
isolat DM-4 memiliki indeks pelarutan P
tertinggi yaitu 55.6. Inokulasi dengan
Bacillus penghasil AIA dapat meningkatkan
jumlah akar lateral kecambah kedelai.
Saran
Perlu dilakukan optimasi umur dan
jumlah inokulan, serta konsentrasi AIA yang
diberikan untuk mendapatkan respon
tanaman yang lebih baik. Karakterisasi
fisiologis lainnya seperti analisis produksi
giberelin,
sitokinin,
kitinase,
β-1,3glukanase, siderofor, antibiotik, dan deteksi
ACC deaminase juga perlu dilakukan untuk
mencari
galur
yang
berpotensi
meningkatkan pertumbuhan tanaman.
9
DAFTAR PUSTAKA
Aryantha INP, Lestari DP, Pengesti NPD.
2004. Potensi isolat bakteri penghasil
IAA dalam peningkatan pertumbuhan
kecambah kacang hijau pada kondisi
hidroponik. J Mikrobiol Indones 9:4346.
Bar T, Okon Y. 1992. Induction of indole-3acetic acid synthesis and possible
toxicity of tryptophan in Azospirillum
brasilense Sp7. Symbiosis 13:191-198.
Bashan Y, Holguin G. 1998. Proposal for
the division of plant growth-promoting
rhizobacteria into two classifications:
biocontrol-PGPB
(plant
growthpromoting bacteria) and PGPB. Soil
Biol Biochem 30:1225–1228.
Benizri E, Courtade A, Picard C, Gucker A.
1998. Role of maize root exudates in
the
production
of
auxins
by
Pseudomonas fluorescens M.3.1. Soil
Biol Biochem 30:1481-1484.
Compant S, Duffy B, Nowak J, Clement C,
Barka EA. 2005. Minireview: Use of of
plant growth-promoting bacteria for
biocontrol of plant diseases: principles,
mechanisms of action, and future
prospects. Appl Environ Microbiol
71:4951-4959.
Dosselaere F et al. 1997. Indole-3-acetic
biosynthesis in Azospirillum brasilense.
Di dalam: Proceedings of the Fourth
International Workshop on Plant
Growth-Promoting
Rhizobacteria;
Sapporo, 5-10 Okt 1997. Hlm 306-309.
Emmert EAB, Handelsman J. 1999.
Biocontrol of plant disease : a (Gram-)
positive perspective. FEMS Microbiol
Lett 171:1-9.
Glick BR. 1995. The enhancement of plant
growth by free-living bacteria. Can J
Microbiol 41:109–117.
Glickmann E, Dessaux Y. 1995. A critical
examination of the specificity of the
Salkowski
reagen
for
indolic
compounds
produced
by
phytopathogenic bacteria. Appl Environ
Microbiol 61:793-796.
Gordon SA, Weber RP. 1951. Colorimetric
estimation of indoleacetic acid. Plant
physiol 26:192-197.
Gray EJ, Smith DL. 2005. Intracellular and
extracellular PGPR: commonalities and
distinctions in the plant-bacterium
signaling processes. Soil Biol Biochem
37:395–412.
Husen E. 2003. Screening of soil bacteria for
plant growth promotion activities in
vitro. [komunikasi singkat]. Indones J
Agric Sci 4:27-31.
Husen E, Saraswati R. 2003. Effect of IAAproducing bacteria on the growth of hot
pepper. J Mikrobiol Indones 8:22-26.
Idriss EE et al. 2002. Extracellular phytase
aktivity of Bacillus amyloliquefaciens
FZB45 contributes to its plant-growthpromoting
effect.
Microbiology
148:2097-2109.
Kloepper JW et al. 1999. Plant root-bacterial
interactions in biological control of
soilborne diseases and potential
extension to systemic and foliar
diseases. Austral Plant Pathol 28:21–
26.
Lay BW. 1994. Analisis Mikroba di
Laboratorium. Jakarta: PT Raja
Grafindo Persada.
Leveau JHJ, Lindow SE. 2005. Utilization
of the plant hormone indole-3-acetic
acid for growth by Pseudomonas putida
strain 1290. Appl Environ Microbiol
71:2365-2371.
Patten CL, Glick BR. 2002. Role of
Pseudomonas putida indoleacetic acid
in development of the host plant root
system. Appl Environ Microbiol
68:3795-3801.
Premono ME. 1998. Mikrob pelarut fosfat
untuk mengefisiensikan pupuk fosfat
dan prospeknya di Indonesia. Hayati
5:85-94.
Rao SWCB, Sinha MK. 1962. Phosphate
dissolving microorganism in the soil
and rhizosphere. Indian J Sci 23:272278.
Ryu CM et al. 2004. Bacterial volatiles
induce
systemic
resistance
in
Arabidopsis. Plant Physiol 134:1017–
1026.
Salisbury FB, Ross CW. 1992. Plant
Physiology. Ed ke-4. California: Worth
Publishing, Inc.
Shishido M, Massicotte HB, Chanway CP.
1996. Effect of plant growth promoting
Bacillus strains on pine and spruce
seedling growth and mycorrhizal
infection. Ann Bot 77:433-441.
Somers E, Ptacek D, Gysegom P, Srinivasan
M, Vanderleyden J. 2005. Azospirillum
brasilense produces the auxin-like
phenylacetic acid by using the key
enzyme for indole-3-acetic acid
biosynthesis. Appl Environ Microbiol
71:1803-1810.
10
Szigeti R, Milescu M, Gollnick P. 2004.
Regulation
of
the
tryptophan
biosynthetic
genes
in
Bacillus
halodurans: common elements but
different strategies than those used by
Bacillus subtilis. J Bacteriol 186:818828.
Tilak KVBR et al. 2005. Diversity of plant
growth and soil health supporting
bacteria. Curr Sci 89:136-150.
Torres-Rubio MG, Valencia-Plata SA,
Bernal-Castillo J, Martinez-Nieto P.
2000. Isolation of Enterobacteria,
Azospirillum sp. and Pseudomonas sp.,
producers of indol-3-acetic acid and
siderofor, from Colombian rice rizosfer.
Rev Latinoamericana de Microbiol
42:171-176.
Yulianti NN. 2006. Uji daya hasil galur
harapan kedelai kultivar Slamet x Wase
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
11
LAMPIRAN
12
Lampiran 1 Karakteristik koloni Bacillus sp. yang berhasil diisolasi dari 11 lokasi pengambilan
sampel
Lokasi Sampel
Kode
isolat
GI-2
GI-3
GI-4
GI-5
GI-6
HI-1
HI-2
Bundar
Berlendir
HI-3
HI-4
Bundar
Bundar
Tidak
beraturan
Bundar
Tidak
beraturan
Bundar
Bundar
Tidak
beraturan
Bundar
Bundar
Bundar
Tidak
beraturan
Bundar
Bundar
Bundar
Tidak
beraturan
Bundar
Tidak
beraturan
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar,
menyebar
Bundar
Bundar
Tidak
beraturan,
menyebar
Bundar
Tidak
beraturan,
seperti jari
tangan
Berlendir
Berlendir
Krem
Krem
Putih
Putih keruh
Coklat
Krem
Krem
kecoklatan
Putih
Krem
Berlendir
Putih keruh
GI-1
Ds. Kedung Dawa,
Kec. Gabus Wetan,
Indramayu
(6 isolat)
Ds. Sidadadi, Kec.
Haurgeulis,
Indramayu
(9 isolat)
HI-5
HI-6
HI-7
HI-8
HI-9
PI-1
PI-2
PI-3
PI-4
Patrol, Indramayu
(10 isolat)
PI-5
PI-6
PI-7
PI-8
PI-9
PI-10
SI-1
Ds. Mekar Gading,
Kec. Sliyeg,
Indramayu
(6 isolat)
SI-2
SI-3
SI-4
SI-5
SI-6
LI-1
Ds. Santi
Kec. Losarang,
Indramayu
(4 isolat)
LI-2
LI-3
LI-4
TK-1
Ds. Cariumulya Kec.
Telaga Sari,
Karawang
(5 isolat)
TK-2
Kering
Krem
Berlendir
Berlendir
Berlendir
Kering
Berlendir
Berlendir
Tepian
Berlekuklekuk
Rata
Rata
Rata
Rata
Rata
Rata
Cembung
Cembung
Cembung
Cembung
Cembung
Timbul
Rata
Cembung
Cembung
Cembung
Berlendir
Putih keruh
Berlendir
Berlendir
Berlendir
Krem
Putih keruh
Krem
Kering
Krem
Berlendir
Berlendir
Berlendir
Krem
Krem
Kuning
Rata
Rata
Berlekuklekuk
Rata
Berlekuklekuk
Rata
Rata
Berlekuklekuk
Rata
Rata
Rata
Berlekuklekuk
Rata
Rata
Rata
Seperti berpati
Putih
Kering
Putih keruh
Seperti berpati
Agak kering, keriput
Putih
Krem
Elevasi
Datar
Datar
Cembung
Timbul
Cembung
Timbul
Datar
Cembung
Cembung
Cembung
Datar
Cembung
Cembung
Cembung
Berlendir
Krem
Berombak
Datar
Kering, seperti berpati
Putih keruh
Timbul
Kering
Putih keruh
Berlendir
Kering
Berlendir
Berlendir
Agak kering, keriput
Putih
Putih keruh
Krem
Krem
Krem
Rata
Berlekuklekuk
Rata
Rata
Rata
Rata
Rata
Cembung
Cembung
Cembung
Timbul
Timbul
Timbul
Berlendir
Putih
Bergerigi
Cembung
Berlendir
Berlendir
Krem
Kuning
Rata
Rata
Cembung
Cembung
Kering
Krem
Berlekuklekuk
Timbul
Berlendir
Kuning
Rata
Cembung
Seperti berpati
(starchy)
Krem
kekuningan
Bercabang
-cabang
Timbul
Rata
Timbul
Rata
Berlekuklekuk
Rata
Berlekuklekuk
Cembung
TK-3
Bundar
Keriput dan berlendir
TK-4
Berlendir
Kering
Krem
TG-1
Bundar
Tidak
beraturan
Bundar
Putih agak
transparan
Putih keruh
Berlendir
Putih krem
TG-2
Seperti bintang
Berlendir
Krem
TG-3
Bundar
Berlendir
TG-4
TG -5
Bundar
Bundar
TG-6
Tidak
beraturan
TK-5
Tegal
(6 isolat)
Karakteristik koloni bakteri
Permukaan
Warna
Bentuk
Tidak
beraturan
Bu