Isolasi dan Optimasi Produksi Senyawa Antimikrob Bakteri Asam Laktat
1
ISOLASI DAN OPTIMASI PRODUKSI SENYAWA ANTIMIKROB
BAKTERI ASAM LAKTAT
NOVAN KURNIAWAN
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
2
ABSTRACT
NOVAN KURNIAWAN. Isolation and Optimation of Antimicrobial Compound
Production of Lactic Acid Bacteria. Under the direction of LAKSMI AMBARSARI dan
SURYANI.
Lactic acid bacteria is the bacteria that naturally held in milk. Lactic acid bacteria is
able to produce antimicrobial compound that can be used as food preservatives. Thie
aim of this research is to isolate lactic acid bacteria from milk and yoghurt and to
optimize antimicrobial compound production by doing variation of production time, pH,
and temperature. Production time will be variated from 10, 15, 20, 25, 30, 35 hours, pH
from 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, and temperature from 50, 60, 70, 80, 90, 100 ºC.
Lactic acid bacteria has been isolated and were grown in de Man Ragosa Sharpe
Agar medium (MRS). The result showed that there are 3 form isolated bacteria. First
isolate came from yoghurt (YI) and the othres two came from milk (SI dan SII). The
results of antimicrobial activities again Salmonella thypimurium bacteria by using
diffusion agar methode in treptose proteose peptone yeast (TPPY) have found that : YI
isolate has the highest activity with inhibite zone 23 mm, SII isolate 20 mm, and SI
isolate did not shown antimicrobial activity. The results of optimimalization of
production for YI isolate were production time with 15 hour, pH 3, and temperature 80
ºC. YI isolate has antimicrobial activity againt’s Gram positive bacteria (Bacillus
subtilis) and Gram negative (Eschericia coli) with each inhibits zone 33 mm and 29
mm.
3
ABSTRAK
NOVAN KURNIAWAN. Isolasi dan Optimasi Produksi Senyawa Antimikrob Bakteri
Asam Laktat. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan SURYANI.
Bakteri asam laktat adalah bakteri yang secara alamiah terdapat pada susu. Bakteri
asam laktat mampu memproduksi senyawa antimikrob yang dapat digunakan sebagai
alternatif bahan pengawet produk pangan alami yang aman. Penelitian ini bertujuan
untuk mengisolasi bakteri asam laktat yang berasal dari susu dan yoghurt serta
mengoptimalisasikan produksi senyawa antimikrob yang dihasilkan dengan melakukan
variasi terhadap waktu produksi, pH, dan suhu. Waktu produksi di variasikan pada 10,
15, 20, 25, 30, 35 jam, pH pada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan suhu pada 50, 60, 70, 80, 90, 100
°C.
Bakteri asam laktat telah berhasil diisolasi dan ditumbuhkan dalam media de Man
Rogosa Sharpe Agar (MRS). Hasil percobaan diperoleh 3 bentuk isolat, yaitu satu jenis
isolat berasal dari yoghurt (YI) dan dua jenis isolat berasal dari susu (SI dan SII). Hasil
penentuan aktivitas antimikrob terhadap bakteri Salmonella thypimurium dengan
metode sumur agar pada media treptose proteose peptone yeast (TPPY) diperoleh:
isolat YI memiliki aktivitas tertinggi dengan zona hambat sebesar 23 mm, isolat SII
sebesar 20 mm, sedangkan isolat SI tidak menunjukkan adanya aktivitas antimikrob.
Hasil penentuan optimasi produksi terhadap isolat YI diperoleh waktu produksi 15 jam,
pH 3, dan suhu 80 °C. Isolat YI mempunyai aktivitas antimikrob terhadap bakteri Gram
positif (Bacillus subtilis) dan Gram negatif (Eschericia coli) dengan zona hambat
masing-masing adalah 33 mm dan 29 mm.
4
ISOLASI DAN OPTIMASI PRODUKSI SENYAWA ANTIMIKROB
BAKTERI ASAM LAKTAT
NOVAN KURNIAWAN
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
5
Judul Skripsi : Isolasi dan Optimasi Produksi Senyawa Antimikrob Bakteri
Asam Laktat
Nama
: Novan Kurniawan
NIM
: G44102016
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Laksmi Ambarsari, M.S.
Ketua
Dr. Suryani, M.Sc.
Anggota
Diketahui
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S
NIP 131473999
Tanggal Lulus :
6
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di kota Palembang, Sumatra Selatan, pada tanggal 24 November
1984 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara pasangan Rustam dan Hidayati. Penulis
menjalani pendidikan formal di TK Muhamadiah Lubuk Linggau Sumatera Selatan
(SUM-SEL), SD Xaverius Lubuk Linggau (SUMSEL), SD St. Yosep Lahat SUMSEL,
SMP Xaverius I Palembang SUMSEL, SMP St. Yosep Lahat SUMSEL, SMU Negeri I
Kolaka Sulawesi Tenggara (SULTRA), SMU Dwiwarna Bogor Jawa Barat (JABAR)
dan lulus pada tahun 2002. Pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB
melalui jalur undangan seleksi masuk IPB di Program Studi Biokimia, Jurusan Kimia,
yang saat ini sudah menjadi Departemen Biokimia.
Selama mengikuti perkuliahan penulis pernah aktif di BEM TPB IPB Departemen
Olahraga dan Seni periode 2002/2003, wakil ketua turnamen Futsal IPB, ketua
Dormitory Farewell Party, Anggota Aktif International Asosiation Agricultural Student
(IAAS), kepala Departemen Pengembangan Bahasa Inggris Himpunan Mahasiswa
Kimia IPB, ketua UKM (unit kegiatan mahasiswa) tenis lapangan, asisten mata kuliah
olahraga dan seni, dan wakil komandan tingkat Biokimia angkatan 39.
Penulis juga pernah mengikuti beberapa lomba seperti juara pertama lomba penulisan
esai Korea (pertukaran pelajar ke Korea) FMIPA IPB, peringkat keenam lomba
penulisan esai Korea IPB, juara pertama lomba bola basket FMIPA IPB, juara pertama
tunggal putra tenis lapangan dies natalis IPB mahasiswa, juara ketiga ganda putra tenis
lapangan dies natalis IPB. Pada tahun 2005, penulis melaksanakan praktek lapangan di
BBIA (Balai Besar Industri Agro) di jalan Ir. H. Djuanda Bogor.
7
PRAKATA
Syukur alhamdullilah penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena atas rahmat serta
hidayah-Nya akhirnya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan karya
ilmiah dengan judul Isolasi dan Optimasi Produksi Senyawa Antimikrob Bakteri Asam
Laktat. Tak lupa pula penulis menyampaikan sholawat serta salam terhadap Rasulullah
SAW beserta para sahabatnya sampai akhir zaman kelak. Karya ilmiah ini merupakan
salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Program Studi Biokimia pada
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam yang dilakukan penulis sejak bulan
Januari 2007 sampai bulan Mei 2007, di laboratorium Biokimia, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu dalam
penyelesaian karya ilmiah ini, terutama kepada kedua dosen pembimbing yaitu Dr.
Laksmi Ambarsari, MS dan Dr. Suryani, M.Sc yang telah memberikan arahan,
bimbingan, dan dorongan semangat selama menyusun karya ilmiah ini. Ucapan terima
kasih juga penulis sampaikan kepada teman-teman seperjuangan Yayu, Sunanti, Solina,
Eka, Dewi, Efi, Tisha, Putu atas kebersamaan dan bantuannya. Juga tak lupa untuk staf
laboratorium Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, dan Ir. AE
Zaenal Hasan, M.Si atas bantuan dan kerjasamanya. Penghargaan juga saya sampaikan
kepada mentor non akademik saya pak Rosadi dan pak Basith atas bimbingan tentang
kesabaran yang hakiki. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada keluargaku
tercinta Ayah, Ibu, adikku Rico dan Aldi, serta Marisa Puspitasari yang telah
memberikan dukungan baik moril maupun materi serta segala doa dan kasih sayangnya.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih jauh dari sempurna, karena itu
penulis sangat mengharapkan kritik dan saran demi kesempurnaan karya ilmiah ini.
Akhirnya penulis berharap agar karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.
Bogor, Agustus 2007
Novan Kurniawan
8
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ............................................................................................. viii
DAFTAR GAMBAR.........................................................................................
ix
DAFTAR LAMPIRAN .....................................................................................
x
PENDAHULUAN .............................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA
Senyawa Antimikrob ................................................................................
Yoghurt.....................................................................................................
2
3
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat .......................................................................................
Metode ....................................................................................................
4
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat Bakteri Asam Laktat ......................................................................
Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob........................................................
Waktu Optimum Produksi Antimikrob ...................................................
pH dan Suhu Optimum Aktivitas Antimikrob.........................................
5
5
6
7
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan..................................................................................................
Saran ........................................................................................................
9
9
DAFTAR PUSTAKA.......................................................................................
9
LAMPIRAN ....................................................................................................
11
9
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Pengaruh pH terhadap aktivitas senyawa antimikrob pada bakteri
S. thypimurium.....................................................................................
7
2 Pengaruh suhu terhadap aktivitas senyawa antimikrob pada bakteri
S. thypimurium......................................................................................
8
3 Zona hambat senyawa antimikrob pada E. coli dan B. subtilis ............
8
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Isolat-isolat bakteri yang diisolasi dari susu dan ditumbuhkan di dalam
media MRS pada 42 °C selama 18 jam ................................................
6
2 Isolat-isolat bakteri yang diisolasi dari yoghurt dan ditumbuhkan
di dalam media MRS pada 42 °C selama 18 jam..................................
6
3 Perbandingan aktivitas antimikrob dari isolat yang diperoleh yang
ditumbuhkan didalam media NA pada 37 °C selama 18 jam................
6
4 Grafik hasil uji penentuan waktu optimum produksi senyawa
antimikrob pada selang waktu 10, 15, 20, 25, 30, dan 35 jam .............
7
5 Kurva pertumbuhan bakteri terhadap waktu.........................................
7
6 Hasil uji senyawa antimikrob yang telah mengalami optimasi terhadap
bakteri E.coli yang ditumbuhkan di dalam media NA dengan waktu
inkubasi 18 jam pada suhu 37 °C .........................................................
8
7 Hasil uji senyawa antimikrob yang telah mengalami optimasi terhadap
bakteri B.subtilis yang ditumbuhkan di dalam media NA dengan waktu
inkubasi 18 jam ada suhu 37 °C.............................................................
8
10
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Alur strategi penelitian .......................................................................... 12
2 Isolasi dan pengujian waktu optimum produksi senyawa antimikrob .. 13
3 Penentuan pH optimum untuk produksi senyawa antimikrob............... 14
4 Penentuan suhu optimum untuk produksi senyawa antimikrob ............ 15
5 Uji hasil optimasi terhadap B. subtilis dan E. coli................................. 16
1
ISOLASI DAN OPTIMASI PRODUKSI SENYAWA ANTIMIKROB
BAKTERI ASAM LAKTAT
NOVAN KURNIAWAN
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
2
ABSTRACT
NOVAN KURNIAWAN. Isolation and Optimation of Antimicrobial Compound
Production of Lactic Acid Bacteria. Under the direction of LAKSMI AMBARSARI dan
SURYANI.
Lactic acid bacteria is the bacteria that naturally held in milk. Lactic acid bacteria is
able to produce antimicrobial compound that can be used as food preservatives. Thie
aim of this research is to isolate lactic acid bacteria from milk and yoghurt and to
optimize antimicrobial compound production by doing variation of production time, pH,
and temperature. Production time will be variated from 10, 15, 20, 25, 30, 35 hours, pH
from 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, and temperature from 50, 60, 70, 80, 90, 100 ºC.
Lactic acid bacteria has been isolated and were grown in de Man Ragosa Sharpe
Agar medium (MRS). The result showed that there are 3 form isolated bacteria. First
isolate came from yoghurt (YI) and the othres two came from milk (SI dan SII). The
results of antimicrobial activities again Salmonella thypimurium bacteria by using
diffusion agar methode in treptose proteose peptone yeast (TPPY) have found that : YI
isolate has the highest activity with inhibite zone 23 mm, SII isolate 20 mm, and SI
isolate did not shown antimicrobial activity. The results of optimimalization of
production for YI isolate were production time with 15 hour, pH 3, and temperature 80
ºC. YI isolate has antimicrobial activity againt’s Gram positive bacteria (Bacillus
subtilis) and Gram negative (Eschericia coli) with each inhibits zone 33 mm and 29
mm.
3
ABSTRAK
NOVAN KURNIAWAN. Isolasi dan Optimasi Produksi Senyawa Antimikrob Bakteri
Asam Laktat. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan SURYANI.
Bakteri asam laktat adalah bakteri yang secara alamiah terdapat pada susu. Bakteri
asam laktat mampu memproduksi senyawa antimikrob yang dapat digunakan sebagai
alternatif bahan pengawet produk pangan alami yang aman. Penelitian ini bertujuan
untuk mengisolasi bakteri asam laktat yang berasal dari susu dan yoghurt serta
mengoptimalisasikan produksi senyawa antimikrob yang dihasilkan dengan melakukan
variasi terhadap waktu produksi, pH, dan suhu. Waktu produksi di variasikan pada 10,
15, 20, 25, 30, 35 jam, pH pada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan suhu pada 50, 60, 70, 80, 90, 100
°C.
Bakteri asam laktat telah berhasil diisolasi dan ditumbuhkan dalam media de Man
Rogosa Sharpe Agar (MRS). Hasil percobaan diperoleh 3 bentuk isolat, yaitu satu jenis
isolat berasal dari yoghurt (YI) dan dua jenis isolat berasal dari susu (SI dan SII). Hasil
penentuan aktivitas antimikrob terhadap bakteri Salmonella thypimurium dengan
metode sumur agar pada media treptose proteose peptone yeast (TPPY) diperoleh:
isolat YI memiliki aktivitas tertinggi dengan zona hambat sebesar 23 mm, isolat SII
sebesar 20 mm, sedangkan isolat SI tidak menunjukkan adanya aktivitas antimikrob.
Hasil penentuan optimasi produksi terhadap isolat YI diperoleh waktu produksi 15 jam,
pH 3, dan suhu 80 °C. Isolat YI mempunyai aktivitas antimikrob terhadap bakteri Gram
positif (Bacillus subtilis) dan Gram negatif (Eschericia coli) dengan zona hambat
masing-masing adalah 33 mm dan 29 mm.
4
ISOLASI DAN OPTIMASI PRODUKSI SENYAWA ANTIMIKROB
BAKTERI ASAM LAKTAT
NOVAN KURNIAWAN
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
5
Judul Skripsi : Isolasi dan Optimasi Produksi Senyawa Antimikrob Bakteri
Asam Laktat
Nama
: Novan Kurniawan
NIM
: G44102016
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Laksmi Ambarsari, M.S.
Ketua
Dr. Suryani, M.Sc.
Anggota
Diketahui
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S
NIP 131473999
Tanggal Lulus :
6
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di kota Palembang, Sumatra Selatan, pada tanggal 24 November
1984 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara pasangan Rustam dan Hidayati. Penulis
menjalani pendidikan formal di TK Muhamadiah Lubuk Linggau Sumatera Selatan
(SUM-SEL), SD Xaverius Lubuk Linggau (SUMSEL), SD St. Yosep Lahat SUMSEL,
SMP Xaverius I Palembang SUMSEL, SMP St. Yosep Lahat SUMSEL, SMU Negeri I
Kolaka Sulawesi Tenggara (SULTRA), SMU Dwiwarna Bogor Jawa Barat (JABAR)
dan lulus pada tahun 2002. Pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB
melalui jalur undangan seleksi masuk IPB di Program Studi Biokimia, Jurusan Kimia,
yang saat ini sudah menjadi Departemen Biokimia.
Selama mengikuti perkuliahan penulis pernah aktif di BEM TPB IPB Departemen
Olahraga dan Seni periode 2002/2003, wakil ketua turnamen Futsal IPB, ketua
Dormitory Farewell Party, Anggota Aktif International Asosiation Agricultural Student
(IAAS), kepala Departemen Pengembangan Bahasa Inggris Himpunan Mahasiswa
Kimia IPB, ketua UKM (unit kegiatan mahasiswa) tenis lapangan, asisten mata kuliah
olahraga dan seni, dan wakil komandan tingkat Biokimia angkatan 39.
Penulis juga pernah mengikuti beberapa lomba seperti juara pertama lomba penulisan
esai Korea (pertukaran pelajar ke Korea) FMIPA IPB, peringkat keenam lomba
penulisan esai Korea IPB, juara pertama lomba bola basket FMIPA IPB, juara pertama
tunggal putra tenis lapangan dies natalis IPB mahasiswa, juara ketiga ganda putra tenis
lapangan dies natalis IPB. Pada tahun 2005, penulis melaksanakan praktek lapangan di
BBIA (Balai Besar Industri Agro) di jalan Ir. H. Djuanda Bogor.
7
PRAKATA
Syukur alhamdullilah penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena atas rahmat serta
hidayah-Nya akhirnya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan karya
ilmiah dengan judul Isolasi dan Optimasi Produksi Senyawa Antimikrob Bakteri Asam
Laktat. Tak lupa pula penulis menyampaikan sholawat serta salam terhadap Rasulullah
SAW beserta para sahabatnya sampai akhir zaman kelak. Karya ilmiah ini merupakan
salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Program Studi Biokimia pada
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam yang dilakukan penulis sejak bulan
Januari 2007 sampai bulan Mei 2007, di laboratorium Biokimia, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu dalam
penyelesaian karya ilmiah ini, terutama kepada kedua dosen pembimbing yaitu Dr.
Laksmi Ambarsari, MS dan Dr. Suryani, M.Sc yang telah memberikan arahan,
bimbingan, dan dorongan semangat selama menyusun karya ilmiah ini. Ucapan terima
kasih juga penulis sampaikan kepada teman-teman seperjuangan Yayu, Sunanti, Solina,
Eka, Dewi, Efi, Tisha, Putu atas kebersamaan dan bantuannya. Juga tak lupa untuk staf
laboratorium Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, dan Ir. AE
Zaenal Hasan, M.Si atas bantuan dan kerjasamanya. Penghargaan juga saya sampaikan
kepada mentor non akademik saya pak Rosadi dan pak Basith atas bimbingan tentang
kesabaran yang hakiki. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada keluargaku
tercinta Ayah, Ibu, adikku Rico dan Aldi, serta Marisa Puspitasari yang telah
memberikan dukungan baik moril maupun materi serta segala doa dan kasih sayangnya.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih jauh dari sempurna, karena itu
penulis sangat mengharapkan kritik dan saran demi kesempurnaan karya ilmiah ini.
Akhirnya penulis berharap agar karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.
Bogor, Agustus 2007
Novan Kurniawan
8
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ............................................................................................. viii
DAFTAR GAMBAR.........................................................................................
ix
DAFTAR LAMPIRAN .....................................................................................
x
PENDAHULUAN .............................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA
Senyawa Antimikrob ................................................................................
Yoghurt.....................................................................................................
2
3
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat .......................................................................................
Metode ....................................................................................................
4
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat Bakteri Asam Laktat ......................................................................
Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob........................................................
Waktu Optimum Produksi Antimikrob ...................................................
pH dan Suhu Optimum Aktivitas Antimikrob.........................................
5
5
6
7
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan..................................................................................................
Saran ........................................................................................................
9
9
DAFTAR PUSTAKA.......................................................................................
9
LAMPIRAN ....................................................................................................
11
9
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Pengaruh pH terhadap aktivitas senyawa antimikrob pada bakteri
S. thypimurium.....................................................................................
7
2 Pengaruh suhu terhadap aktivitas senyawa antimikrob pada bakteri
S. thypimurium......................................................................................
8
3 Zona hambat senyawa antimikrob pada E. coli dan B. subtilis ............
8
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Isolat-isolat bakteri yang diisolasi dari susu dan ditumbuhkan di dalam
media MRS pada 42 °C selama 18 jam ................................................
6
2 Isolat-isolat bakteri yang diisolasi dari yoghurt dan ditumbuhkan
di dalam media MRS pada 42 °C selama 18 jam..................................
6
3 Perbandingan aktivitas antimikrob dari isolat yang diperoleh yang
ditumbuhkan didalam media NA pada 37 °C selama 18 jam................
6
4 Grafik hasil uji penentuan waktu optimum produksi senyawa
antimikrob pada selang waktu 10, 15, 20, 25, 30, dan 35 jam .............
7
5 Kurva pertumbuhan bakteri terhadap waktu.........................................
7
6 Hasil uji senyawa antimikrob yang telah mengalami optimasi terhadap
bakteri E.coli yang ditumbuhkan di dalam media NA dengan waktu
inkubasi 18 jam pada suhu 37 °C .........................................................
8
7 Hasil uji senyawa antimikrob yang telah mengalami optimasi terhadap
bakteri B.subtilis yang ditumbuhkan di dalam media NA dengan waktu
inkubasi 18 jam ada suhu 37 °C.............................................................
8
10
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Alur strategi penelitian .......................................................................... 12
2 Isolasi dan pengujian waktu optimum produksi senyawa antimikrob .. 13
3 Penentuan pH optimum untuk produksi senyawa antimikrob............... 14
4 Penentuan suhu optimum untuk produksi senyawa antimikrob ............ 15
5 Uji hasil optimasi terhadap B. subtilis dan E. coli................................. 16
PENDAHULUAN
Kerusakan makanan sering kali terjadi pada
produk-produk olahan hasil industri. Kerusakan
ini biasanya ditimbulkan oleh mikroorganisme
pembusuk dan bakteri pembentuk spora. Untuk
mengatasi hal tersebut maka diperlukan suatu
bahan tambahan makanan yang berfungsi untuk
menghindari kerusakan akibat mikroorganisme
sehingga tidak menimbulkan bahaya bagi
kesehatan konsumen. Salah satu upaya untuk
mencegah kerusakan oleh mikroorganisme
adalah dengan penambahan zat pengawet.
Zat pengawet dapat dibedakan dalam tiga
golongan utama berdasarkan banyaknya dosisi
yang dapat diterima per harinya. Pertama, zat
pengawet yang termasuk dalam golongan
GRAS (Generally Recognized as Safe) yang
umumnya bersifat alami, sehingga aman
dikonsumsi oleh masyarakat dengan dosisi yang
tinggi (tidak menimbulkan efek samping).
Kedua, zat pengawet yang termasuk dalam
golongan ADI (Acceptable Daily Intake), yang
selalu ditetapkan batas penggunaan hariannya
(daily intake) untuk melindungi kesehatan
konsumen. Ketiga, zat pengawet yang memang
tidak layak dikonsumsi, seperti formalin karena
dapat
menyebabkan
kanker
paru-paru,
gangguan pada alat pencernaan dan jantung
(Broughton 1990).
Ada beberapa contoh pengawet yang
berbahaya jika dikonsumsi secara berlebihan,
yaitu kalsium benzoat. Bahan pengawet ini
dapat menghambat pertumbuhan bakteri
penghasil toksin (racun), bakteri spora dan
bakteri bukan pembusuk. Asam benzoat
digunakan untuk mengawetkan minuman
ringan, minuman anggur, saus sari buah, sirup,
dan ikan asin. Bahan ini bisa menyebabkan
dampak negatif pada penderita asma dan bagi
orang yang peka terhadap aspirin. Kalsium
benzoat bisa memicu terjadinya serangan asma
dan natrium benzoat dapat menyebabkan
sistemic lupus erythematosus (SLE) yang
menyerang sistem kekebalan tubuh. Menurut
data yang dikutip dari rumah sakit Hasan
Sadikin Bandung selama tahun 2006 ini sudah
350 orang yang terkena penyakit (anonymus
2006).
Kasus-kasus yang terjadi pada masyarakat
mengindikasikan bahwa menggunakan zat
pengawet alami adalah solusi yang tepat.
Pengawet
alami
yang
berasal
dari
mikroorganisme, tumbuhan, dan hewan
seharusnya sudah mulai digunakan untuk
menggantikan pengawet yang berbahaya.
Sebagai contoh adalah zat pengawet yang
berasal dari selasih. Selasih memiliki aktivitas
antibakteri terhadap Saphylococcus aureus,
Salmonella enteritidis, Escherichia coli ;
aktivitas antiseptik terhadap Proteus vulgaris,
Bacillus subtilis, Salmonella paratyph; aktivitas
antifungi
terhadap
Candida
albicans,
Penicillium notatum, Microsporeum gyseum;
aktivitas larvasida terhadap lalat rumah dan
nyamuk, serta repelan terhadap serangga
(Adnyana 2006).
Bahan pengawet yang aman juga dapat
berasal dari mikroorganisme, antara lain adalah
bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri asam
laktat. Hasil penelitian yang telah dilakukan
sebelumnya disebutkan bahwa bakteriosin dapat
menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif
dan Gram negatif (Oryazabal 1998). Bakteriosin
juga dapat menghambat pertumbuhan bakteri S.
thypimurium, B.subtilis, dan E.coli (Wiryawan
2005).
Salah satu jenis bekteriosin yang telah
diproduksi dalam skala industri adalah nisin.
Nisin tidak dapat diproduksi secara sintetik
melainkan oleh bakteri asam laktat. Nisin juga
stabil dalam suhu tinggi dan stabil dalam
kondisi asam sehingga dapat digunakan pada
proses industri yang menggunakan suhu tinggi
dan kondisi asam tanpa merusak kinerjanya.
Penyimpanan yang dilakukan pada suhu antara
4-25 °C dapat menstabilkan nisin sampai dua
tahun (anonymus 2001). Nilai LD50 nisin sama
dengan nilai LD50 garam yaitu 7 g/kg berat
badan (Naidu 2000).
Produksi senyawa antimikroba dari bakteri
asam laktat belum dilakukan dalam skala
industri di Indonesia, sehingga dibutuhkan
penelitian pendahuluan untuk mendapatkan
parameter yang valid agar diperoleh hasil yang
optimal. Mengkombinasikan media produksi
dengan waktu, pH, dan suhu, yang telah
optimum, diharapkan dapat mengefektifkan
produksi senyawa antimikrob agar dapat
diperoleh manfaat maksimal sebagai pengganti
bahan pengawet sintetik yang sangat merugikan
kesehatan masyarakat.
Penelitian ini memiliki tujuan jangka
panjang untuk memproduksi antimikrob (nisin)
sebagai alternatif bahan pengawet pangan alami
yang aman bagi kesehatan masyarakat,
sedangkan untuk tujuan jangka pendek
penelitian ini adalah untuk mengisolasi bakteri
penghasil senyawa antimikrob dan menentukan
kondisi optimum produksi senyawa antimikrob
dari isolat bakteri tersebut.
13
TINJAUAN PUSTAKA
Senyawa Antimikrob
Senyawa antimikrob adalah senyawa yang
memiliki aktivitas penghambatan terhadap
pertumbuhan mikroba, terutama mikroba
patogen. Senyawa tersebut umumnya berasal
dari tumbuhan maupun mikroorganisme. Salah
satu senyawa antimikrob yang terkenal adalah
bawang putih yang dapat menghambat
pertumbuhan bakteri S. thypimurium dengan
konsentrasi 2% (Sunanti 2007).
Produksi
dan
penggunaan
senyawa
antimikrob yang berasal dari tanaman telah
lama digunakan terutama pada pengobatan
tradisional. Contohnya, kemangi dan selasih
secara empiris telah digunakan dalam
pengobatan tradisional untuk berbagai macam
penyakit. Teh yang dibuat dari daun selasih atau
herbanya digunakan untuk mengatasi mual,
disentri, atau menurunkan panas (sebagai
antipiretik).
Dalam
kitab
pengobatan
“Ayurveda”, selasih memiliki khasiat sebagai
antibakteri, antiseptik, antispasmodik (sakit
perut), diaforetik (peluruh keringat), sakit
kepala, demam, sakit telinga, obat sakit ginjal
dan sebagai afrodisiaka (peningkat libido).
Penggunaannya dapat dalam bentuk jus, infus,
dan serbuk (Adnyana 2006).
Senyawa antimikrob yang berasal dari
mikroorganisme juga telah banyak digunakan
antara lain nisin, nisin merupakan bagian dari
bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri asam
laktat. Nisin telah digunakan di banyak negara
sebagai bahan pengawet yang aman, dan nisin
memiliki aktivitas antimikroba khususnya pada
bakteri Gram positif (Broughton 1990).
Bakteriosin
Bakteriosin adalah senyawa metabolit
sekunder yang dihasilkan oleh bakteri asam
laktat selama proses fermentasi yang bersifat
menghambat petumbuhan mikroorganisme
merugikan. Oyarzabal (1998), menyatakan
bakteri asam laktat dapat menghasilkan
substansi bakteriosin yang bersifat antimikrob
terhadap pertumbuhan bakteri Gram positif dan
atau Gram negatif. Pendapat ini telah didukung
dengan beberapa penelitian diantaranya
bakteriosin Plantaricin C yang mampu
menghambat Bacillus subtilis, (Gonzalez et al.,
1994), bakteriosin Pediocin L50, bersifat
“broad spectrum”, diantaranya menghambat E.
faecalis (Cintas et al. 1995), dan Salmonella
typhimurium (Steven et al. 1991).
Secara in vitro Audisio et al. (1999),
melaporkan aksi hambat terhadap bakteri
patogenik pada manusia dan unggas yaitu
Salmonella
spp.
(Galinarum,
Pulorum,
Enteridis dan Typhymurium) didapat dengan
cara menggabungkan bakteri asam laktat
dengan bakteriosin, sehingga berpeluang untuk
dijadikan sebagai avian probiotics yang mahal
saat ini. Hambatan pertumbuhan bakteri
Salmonella typhymurium FNCC 0050, E. coli
FNCC 0091 dan Bacillus cereus oleh
bakteriosin juga dilaporkan oleh Djaafar et al.,
(1995). Hambatan pertumbuhan ditunjukkan
dengan adanya perpanjangan fase lag maupun
penekanan populasi pasca 12 jam inkubasi
setelah ditambah metabolit bakteriosin, masingmasing pada S. thypimurium FNCC 0050 dari
fase lag 1 jam menjadi 6 jam, E. coli FNCC
0091 dari 1 jam menjadi 3 jam, dan pada B.
cereus dari 3 jam menjadi 7 jam.
Nisin
Nisin, termasuk bakteriosin, merupakan
senyawa polipeptida anti bakteri yang
diproduksi dari hasil fermentasi bakteri asam
laktat (BAL) Lactobacillus bulgaricus (Hoover
& Davidson 1993) yang diakui penggunaannya
oleh banyak negara sebagai pengawet alami
makanan mentah atau makanan olahan yang
aman dikonsumsi serta terbukti dapat
mengontrol dan menghambat pertumbuhan
bakteri pembusuk dan patogen. Nisin juga tidak
menimbulkan efek samping pada manusia
karena tidak toksik dan tidak aktif oleh enzim
proteolitik dalam saluran pencernaan.
Nama nisin diturunkan dari “Grup N
streptococci (sekarang lebih dikenal dengan
lactococci) Inhibitory Substances IN (yang
merupakan akhiran untuk nama sebuah
antibiotik)”. Bahan ini aktif melawan bakteri
lain, terutama spora bakteri Gram positif
(Broughton 1990).
Nisin bersifat ampifilik dengan residu
hidrofobik pada ujung N dan residu hidrofilik
pada ujung C. Distribusi polar dan non polar
pada molekul nisin ada relevansinya dengan
aktivitas cara kerja biologik. Nisin adalah
polipeptida kationik dengan muatan 2 atau 3,
tidak mengandung asam-asam amino aromatik
sehingga tidak diserap pada 260 atau 280 nm.
Kelarutan, stabilitas, dan aktivitas biologik
tergantung pada pH larutan; pada pH yang
rendah nisin lebih mudah larut, stabil, dan
beraktivitas tinggi. Pada pH netral atau basa,
nisin tidak larut. Kelarutan nisin pada pH 2
adalah 57 mg/mL, pada pH 6 adalah 1,5 mg/mL
dan pH 8,5 adalah 0,25 mg/mL. kestabilan nisin
14
sejalan dengan kelarutannya. Dalam HCl pada
pH 2,5 atau kurang dan nisin akan tetap stabil
sekalipun mengalami pemanasan tinggi (Adam
2000).
Nisin
sebgai
antimikrob
memiliki
kemampuan terbatas. Nisin tidak dapat
menghambat bakteri Gram negatif (kecuali
Neisseria dan Flavobacter), khamir, virus serta
bakteri Gram positif tertentu, seperti beberapa
spesies Lactobacillus dan Enterococcus
faecalis. Akan tetapi bakteri Gram negatif dapat
dihambat jika membran sel bakteri mengalami
kerusakan (Steven et al.1991). Nisin
menghambat bakteri Gram positif, terutama
bakteri pembentuk spora seperti klostridia dan
basili serta jenis-jenis bakteri lain yaitu
stafilokoki,
laktokoki,
korinebakteria,
leukonostok,
pediokoki,
pneumokoki,
aktinomisetes,
streptokoki,
mikrokoki,
laktobasili dan Mycobacteria. Sensitivitas
mikrob terhadap nisin berbeda-beda (Broughton
1990).
Pertumbuhan
Bacillus
stearothermophillus dapat dihambat pada kadar
nisin kurang dari 2 IU/mL, B.cereus perlu 75100 IU/mL. B. megaterium perlu 25-100 IU/mL
dan B. polymixa perlu 50 IU/mL, sedangkan
Clostridum botulinum tipe A dan B dihambat
pada taraf 500-2500 IU/mL serta untuk tipe B
perlu 50-1000 IU/mL (Broughton 1990).
Target penghambatan pada sel vegetatif
mikrob adalah membran sitoplasma. Nisin
menimbulkan kebocoran dengan keluarnya
adenosin trifosfat, sehingga terjadi lisis pada
membran. Kebocoran membran sitoplasma
terjadi karena nisin mengaktifkan gugus
sulfidril pada membran tersebut (Abee 1995).
Pada spora, nisin lebih bersifat sporosidal
daripada sporostatik. Nisin menghambat
pertunasan
spora
pada
saat
awal
penggembungan untuk tumbuh; spora yang
rusak karena pemanasan lebih peka terhadap
nisin (Broughton 1990).
Yoghurt
Yoghurt merupakan salah satu jenis produk
fermentasi yang terkenal. Berbagai jenis susu
dapat digunakan untuk membuat yoghurt, antara
lain susu segar, susu krim, susu yang telah
dihilangkan sebagian lemaknya dan susu skim
(susu tanpa lemak). Pembuatan
yoghurt
merupakan salah satu metode yang tertua dalam
sejarah pengawetan susu. Dewasa ini yoghurt
telah mengalami perkembangan dalam proses
pembuatannya sehingga menghasilkan yoghurt
dengan cita rasa dan flavor yang semakin baik
dan bervariasi. Yoghurt berasal dari bahasa
Turki yaitu “jughurt” yang berarti susu asam.
Menurut SNI 01.2981.1982, yoghurt adalah
produk yang diperoleh dari susu yang
dipasteurisasi kemudian difermentasi dengan
menggunakan bakteri tertentu sampai diperoleh
bau dan rasa yang khas dengan atau tanpa
penambahan bahan lain yang diizinkan.
Tamime
dan
Robinson
(1989),
mengklasifikasikan yoghurt komersial ke dalam
tiga kelompok yaitu plain atau natural yoghurt,
fruit yoghurt, dan flavoured yoghurt. Natural
atau plain yoghurt merupakan tipe tradisional
dengan bau tajam dan rasa asam, sedangkan
fruit yoghurt dibuat dengan penambahan buahbuahan dan pemanis pada plain yoghurt dan
flavoured yoghurt dibuat dengan penggunaan
aroma buah dan senyawa sintesis.
Klasifikasi yoghurt berdasarkan metode
pembuatannya, dibagi dalam tiga tipe, yaitu : set
yoghurt, stirred yoghurt, dan fluid yoghurt. Set
yoghurt diproduksi dengan inkubasi didalam
tempat-tempat kecil khusus, yoghurt yang
dihasilkan berupa cairan kental dan setengah
padat. Stirred yoghurt diinkubasi pada tempat
besar dan selanjutnya koagulan yang terbentuk
dipotong-potong dan didinginkan pada tempattempat khusus yang lebih kecil. Fluid yoghurt
dibuat secara hampir sama dengan stirred
yoghurt,
tetapi
hasil
yang
diperoleh
kekentalannya berbeda yaitu lebih encer
(Tamime dan Robinson 1989).
Kultur starter yoghurt pada umumnya terdiri
dari bakteri asam laktat Lactobacillus
bulgaricus dan Streptococus thermophilus yang
merupakan pasangan bakteri utama dalam
pembuatan yoghurt. Bergabungnya kedua
bakteri ini akan menghasilkan nilai organoleptik
yang lebih tinggi dibandingkan dengan
penggunaan kultur tunggalnya. Keadaan ini
disebabkan karena adanya simbiosis antara L.
bulgaricus dengan S. thermophilus yang saling
menguntungkan, karena bakteri yang satu
mensintesis dan membebaskan senyawa yang
saling menguntungkan atau menstimulasi
bakteri lainnya (Tamime & Robinson 1999).
Spesies L. bulgaricus merupakan bakteri
berbentuk batang, gram positif, tidak berspora,
non motil. Suhu optimum pertumbuhan 40-43
°C, masih dapat tumbuh pada suhu 45 °C atau
kadang-kadang pada suhu 50-52 °C dan tidak
dapat tumbuh pada suhu 15 °C (Deibel &
Seeley 1974). Spesies L. bulgaricus bersifat
anaerobik, yaitu lebih senang hidup tanpa atau
dengan sedikit oksigen. Pada pembuatan
yoghurt, L. bulgaricus berperan dalam
penurunan pH sampai sekitar 4. selain itu,
L.bulgaricus juga memberi kontribusi terhadap
flavor yoghurt melalui produksi asam laktat,
asetaldehid, asam asetat, dan diasetil (Winarno
15
2003). L. bulgaricus di dalam susu lebih bersifat
proteolitik yang berkontribusi pada tekstur dan
aroma produk susu fermentasi, yaitu dengan
membebaskan valin, histidin, dan glisin yang
diperlukan oleh S. thermophilus
selama
pertumbuhannya. Bakteri penghasil asam laktat
seperti L. bulgaricus ini juga menghasilkan
senyawa yang berisfat antimikroba yang disebut
nisin (Adams 2000).
Prinsip dasar fermentasi yoghurt adalah
inokulasi bakteri kultur starter pada susu yang
telah dipanaskan. Komponen karbohidrat utama
pada susu adalah laktosa. Laktosa digunakan
oleh kultur starter sebagai sumber energi untuk
pertumbuhannya. Laktosa akan dihidrolisis
dengan produk akhir asam piruvat. Selanjutnya
asam piruvat akan diubah menjadi asam laktat
oleh enzim laktat dehidrogenase. Selain
menghasilkan aroma yang khas, asam laktat
juga berperan dalam pembentukan gel yoghurt.
Secara sederhana, reaksi perubahan laktosa
menjadi asam laktat adalah sebagai berikut
(Tamime & Robinson 1989):
Laktosa + air Æ Asam laktat
C12H22O11
H2O 4C3H6O3
Asam yang terbentuk selama fermentasi
yoghurt terutama adalah asam laktat. Asam
laktat yang diproduksi berbeda dalam
konfigurasi struktur dan rotasi optik. Dua
isomer yang mungkin terjadi asam laktat leavodan dekstro-rotasi (Tamime & Deeth 1980).
Manfaat yoghurt bagi kesehatan tubuh telah
banyak dibuktikan oleh banyak peneliti di
dunia. Yoghurt memiliki kandungan nilai gizi
yang baik dan mudah dicerna oleh tubuh. Selain
untuk tujuan kesehatan, yoghurt juga sering
dikonsumsi untuk tujuan diet. Yoghurt yang
dikonsumsi
secara
teratur
dapat
menyeimbangkan mikroflora usus sehingga
bakteri-bakteri yang merugikan dapat ditekan
jumlahnya dan sebaliknya usus akan didominasi
oleh bakteri yang menguntungkan bagi
kesehatan (Silvia 2002).
Yoghurt pada umumnya digunakan sebagai
bahan pencegah penyakit saluran pencernaan
seperti diare. Khususnya pada bayi yang
mengalami tidak dapat untuk mencerna laktosa,
gastroenteritis (sakit perut), dan pengobatan
konstipasi (sembelit). Bagi orang
yang
menderita tidak dapat mencerna laktosa,
yoghurt adalah makanan alternatif yang sangat
bermanfaat karena bakteri asam laktat, melalui
proses fermentasi akan mengubah laktosa
menjadi asam laktat, begitu pula penderita tidak
toleran terhadap laktosa dapat mengkonsumsi
yoghurt dengan aman (Gillian & Kim 1984).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah susu
sapi perah, dengan jarak 30 menit setelah
diperah, dan yoghurt tanpa rasa (plain yoghurt),
bakteri uji Salmonella thypimurium, Bacillus
subtilis, Escherichia coli yang berasal dari
Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian
Bogor, Media produksi antimikroba yang
digunakan adalah treptose proteose peptone
yeast (TPPY) pH 6.0, dengan komposisi
(sukrosa 1 g, pepton 1 g, ekstrak khamir 1 g,
K2HPO4 1 g, NaCl 0,2 g, MgSO4 0,02 g,
akuades 95,78 mL). de Man Rogosa Sharpe
Agar/MRS agar digunakan sebagai media
seleksi bakteri dengan komposisi (pepton 10 g,
beef extract 10 g, yeast extract 5 g, K2HPO4 2
g, amonium sitrat 2 g, glukosa 2 g, sodium
asetat 3H2O 20 g, MgSO4 7H2O 0,58 g, MnSO4
4H2O 0,28 g, agar 15 g, akuades sampai 1000
mL), alkohol 70%. Nutrien agar (NA) sebagai
media tumbuh bakteri uji dengan komposisi
(beef extract 3 g, pepton 5 g, bacto agar 15 g,
akuades sampai 1000 mL).
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini
adalah autoklaf, inkubator, oven, neraca
analitik, bunsen, labu Erlenmeyer, tabung
reaksi, kapas, sudip, gelas ukur, pipet,
alumunium foil, karet, kertas, ruang laminar,
magnetik stirer, sentrifus Beckman dengan rotor
JA 20 untuk volume contoh 500 mL, cawan
petri, jarum ose.
Metode Penelitian
Isolasi
Bakteri
Penghasil
Senyawa
Antimikrob dari Yoghurt dan Susu
(Dwijoseputro 1978)
Sampel yoghurt dan susu masing-masing
sebanyak 1 mL diencerkan 0-100 kali,
kemudian dari masing-masing pengenceran
diambil 0,1 mL dan disebar dengan
menggunakan alat sebar pada media MRS agar
yang telah padat pada cawan petri. Selanjutnya
diinkubasi selama 18 jam, suhu 42 °C.
Isolasi Senyawa Antimikrob
Isolasi dilakukan sesuai dengan metode dari
Wiryawan (2005). Isolat bakteri diambil
sebanyak satu ose dan diinokulasikan ke dalam
Erlenmeyer yang berisi 10 mL media TPPY
steril kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C
selama 18 jam. Selanjutnya dilakukan
sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm
selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh
16
diendapkan dengan menggunakan etanol absolut
sebanyak dua kali volume dalam keadaan
dingin, sambil diaduk, kemudian diendapkan
selama satu malam pada suhu dingin.
Selanjutnya disentrifugasi kembali pada
kecepatan 10000 rpm selama 30 menit. Pelet
yang diperoleh diuapkan di dalam oven pada
suhu 40 °C selama 12 jam. Pelet yang sudah
bebas dari pelarut etanol dilarutkan kembali
dengan buffer Tris-HCl dengan konsentrasi 0,1
M kurang lebih 2 kali bobot pelet dan ditetesi 12 tetes HCl 0,5 M sampai pelet tersebut larut
kembali. Pelet tersebut merupakan
ekstrak
kasar
senyawa
antimikrob yang akan diujikan pada bakteri
S. thypimurium dengan menggunakan metode
sumur agar.
Senyawa antimikrob diproduksi sesuai
dengan waktu optimum yang telah diperoleh
pada tahap sebelumnya. Hasil yang didapat
kemudian diperlakukan dengan variasi pH dan
suhu.
Penentuan pH dan suhu optimum produksi
senyawa
antimikrob
dilakukan
dengan
memvariasikan pH pada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 dan
suhu pada 50, 60, 70, 80, 90, 100 °C. Masingmasing ekstrak kasar senyawa antimikrob
diujikan aktivitas antimikrobnya dengan
menggunakan bakteri S. thypimurium. Setelah
diperoleh pH optimum dan suhu optimum maka
dilakukan pengujian selanjutnya terhadap
bakteri uji B. subtilis dan E. coli.
Uji Aktivitas Senyawa Antimikrob dari
Isolat Bakteri
Isolat Bakteri Asam Laktat
Pengujian terhadap bakteri uji (S.
thypimurium) dilakukan dengan menggunakan
metode sumur agar (well diffusion agar)
(Bintang 1982). Biakan bakteri uji yang telah
disegarkan dalam media NB, diambil sebanyak
0,1 mL dan diinokulasikan ke dalam cawan
petri steril. Setelah petri yang berisi biakan
bakteri dan media NA memadat, sumur (lubang)
dibuat dengan menggunakan pangkal pipet
Pasteur dengan diameter 6-7 mm. Ekstrak kasar
senyawa antimikrob dari isolat yoghurt dan susu
dipipet sebanyak 0,05 mL serta kontrol (pelarut
Tris-HCl). Selanjutnya cawan diinkubasi pada
suhu 25 °C selama 18 jam. Aktivitas antimikrob
ditentukan dengan cara mengukur diameter
zona bening yang terbentuk.
Penentuan Waktu
Antimikrob
Optimum
Produksi
Isolat bakteri YI disegarkan di dalam media
produksi TPPY sambil dilakukan pengocokan
dengan menggunakan shaker water bath pada
suhu 37 ºC selama 18 jam. Sebanyak 1% dari
volume isolat yang telah disegarkan dipipet
kedalam Erlenmeyer yang telah berisi media
produksi TPPY. Ekstrak antimikroba diisolasi
setelah melalui inkubasi dengan menggunakan
variasi waktu 10, 15, 20, 25, 30, dan 35 jam
pada suhu 37 ºC. Ekstrak kasar senyawa
antimilrob selanjutnya akan diuji aktivitasnya
terhadap bakteri S. thypimurium dengan
menggunakan metode sumur agar.
Karakterisasi Antimikrob
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat yang diperoleh diisolasi dari plain
yoghurt (yoghurt murni yang belum diberikan
zat tambahan dan mengalami pemanasan) dan
susu yang telah mengalami pengenceran 0
sampai 100 kali. Hasil pengenceran selanjutnya
ditumbuhkan di dalam media MRS, yang
merupakan media selektif untuk pertumbuhan
bakteri asam laktat, dengan cara disebar.
Hasil percobaan diperoleh 14 isolat dari susu
dan 14 isolat dari yoghurt (Gambar 1 dan 2).
Isolat-isolat yang didapat muncul setelah
dilakukan inkubasi pada suhu 42 °C selama 18
jam. Isolat-isolat tersebut kemudian diseleksi
dan didapatkan tiga bentuk isolat yang berbeda,
satu bentuk isolat berasal dari yoghurt (YI) dan
dua bentuk isolat berasal dari susu (SI dan SII).
Isolat YI memiliki ciri-ciri berwarna putih,
permukaan licin, dan berbentuk bulat
memanjang; isolat SI berwarna coklat muda,
permukaan kasar, dan berbentuk seperti akar;
dan isolat SII berwarna putih kecoklatan,
permukaan halus, dan berbentuk bulat. Ketiga
bentuk isolat tersebut dipilih untuk pengujian
aktivitas antimikrob.
Gambar 1 Isolat-isolat bakteri yang diisolasi
dari susu dan ditumbuhkan di
17
dalam media MRS pada 42 °C
selama 18 jam.
masing isolat. Dengan demikian dapat
disimpulkan bahwa isolat YI lebih unggul
dibandingkan isolat SI dan SII.
Waktu Optimum Produksi Antimikrob
Penentuan waktu optimum produksi
senyawa
antimikrob
dilakukan
untuk
mengetahui waktu produksi terbaik bakteri
asam laktat dalam menghasilkan senyawa
antimikrob. Waktu optimum produksi senyawa
antimikrob diperoleh dengan melakukan variasi
waktu produksi dari 10, 15, 20, 25, 30, dan 35
jam. Produksi senyawa antimikrob dilakukan
pada media TPPY dengan suhu inkubasi 37 °C
dan variasi konsentrasi uji 5 mg/mL, 15 mg/mL,
dan 20 mg/mL (b/v) terhadap bakteri
S.thypimurium.
Variasi konsentrasi uji
dilakukan untuk mengetahui konsentrasi hambat
efektif dari senyawa antimikrob.
Berdasarkan hasil pengamatan (Gambar 4)
diperoleh waktu optimum produksi pada jam ke
15 dengan zona hambat terhadap bakteri S.
thypimurium, pada konsentrasi 20 mg/mL dan
15 mg/mL, adalah 16 mm dan 10 mm. Pada
Gambar 2 Isolat-isolat bakteri yang diisolasi
dari yoghurt dan ditumbuhkan didalam media MRS pada 42 °C
selama 18 jam.
Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob
Ekstrak kasar senyawa antimikrob diperoleh
setelah melalui beberapa tahap. Tahap pertama
adalah produksi senyawa antimikrob di dalam
media TPPY selama 18 jam pada suhu 37 ºC.
Tahap kedua adalah pemisahan sel dengan
senyawa antimikrob. Pemisahan sel dilakukan
dengan melakukan sentrifugasi pada kecepatan
10000 rpm selama 30 menit. Supernatan
diambil dan ditambahkan etanol absolut, sambil
diaduk, pada suhu dingin sebanyak dua kali
volume dari volume supernatan. Penambahan
etanol absolut dilakukan untuk mengendapkan
senyawa antimikrob yang sebagian besar
disusun oleh protein, selain itu juga merupakan
tahap awal pemurnian senyawa antimikrob dari
pengotor yang ada. Tahap ketiga adalah
pemisahaan hasil pengendapan. Pemisahan
dilakukan dengan sentrifugasi pada kecepatan
10000 rpm selama 30 menit. Pelet yang
diperoleh kemudian dikeringkan pada oven
untuk menguapkan etanol absolut. Tahap
terakhir atau tahap keempat adalah pelarutan
kembali hasil pengeringan pada bufer Tris-HCl
sebanyak dua kali bobot pelet kering. Pelet yang
telah dilarutkan didalam bufer Tris-HCl yang
merupakan ekstrak kasar senyawa antimikrob
yang akan diuji aktivitasnya. Pengujian
dilakukan terhadap bakteri uji S. thypimurium
yang ditumbuhkan di dalam media NA dan
diinkubasi pada suhu 37 °C selama 18 jam.
Berdasarkan hasil pengamatan diperoleh
zona hambat dari isolat YI sebesar 23 mm, isolat
SII 20 mm, dan isolat SI tidak menunjukan
aktivitas penghambatan (Gambar 3). Zona
hambat yang diamati menunjukkan aktivitas
ekstrak kasar senyawa antimikrob terhadap
pertumbuhan bakteri uji. Semakin besar zona
hambat yang diamati maka semakin baik
aktivitas senyawa antimikrob dari masing-
SII
KpH2
SI
YI
Gambar 3 Aktivitas antimikrob isolat YI, SI,
dan SII dengan kontrol KpH 2.
Semua isolat ditumbuhkan di dalam
media NA dan zona hambat isolat
YI sebesar 23 mm.
Z
o
n
a
H
a
m
b
a
t
(mm)
Gambar 4
Waktu Inkubasi (jam)
Grafik hasil uji penentuan waktu
optimum
produksi
senyawa
antimikrob. Zona hambat isolat YI
18
dengan konsentrasi 20 (biru muda),
15 (biru tua), dan 5 mg/mL (ungu)
pada selang waktu 10, 15, 20, 25,
30, dan 35 jam.
jam ke 10, tidak terdapat zona hambat pada
konsentrasi 5 mg/mL dan 15 mg/mL, sedangkan
pada waktu 20 sampai 35 jam kemampuan
menghambat bakteri cenderung menurun.
Kondisi ini dimungkinkan terjadi karena
senyawa antimikrob yang merupakan metabolit
sekunder telah di produksi pada jam ke 15 (tepat
pada akhir fase log) sehingga pada jam ke 20
sampai 35 bakteri telah memasuki fase stasioner
yang produksi senyawa antimikrobnya telah
menurun dan perbandingan jumlah selnya telah
konstan akibat metabolit sekunder yang
diproduksi (Gambar 5). Pada konsentrasi uji 5
dan 15 mg/mL zona hambat yang dihasilkan
lebih kecil dibandingkan dengan konsentrasi 20
mg/mL, sehingga dapat disimpulkan bahwa
konsentrasi hambat efektif adalah 20 mg/mL.
Hasil pengujian tersebut menunjukkan
bahwa waktu optimum produksi diperoleh pada
15 jam setalah inkubasi dengan konsentrasi 20
mg/mL. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian
yang telah dilakukan oleh peneliti sebelumnya
yang menunjukkan bahwa konsentrasi hambat
efektif untuk penghambatan bakteri S.
thypimurium terdapat pada konsentrasi 20
mg/mL dengan waktu inkubasi selama 18 jam
(Suarsana 2005).
pH dan Suhu Optimum Aktivitas
Antimikrob
Karakterisasi senyawa antimikrob dilakukan
dengan perlakuan pH dan suhu yang berbedabeda. Variasi pH yang digunakan adalah pH 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8. pH optimum yang diperoleh
akan digunakan
untuk menentukan suhu optimum produksi
Gambar 5 Kurva pertumbuhan bakteri
terhadap waktu
senyawa antimikrob. Variasi suhu yang
digunakan adalah 50, 60, 70, 80, 90, 100 °C.
Data pada Tabel 1 menunjukkan bahwa pada
pH 2 senyawa antimikrob menunjukkan zona
hambat terbesar yaitu 27 mm. Kontrol pH 2
yang digunakan juga menunjukkan zona hambat
sebesar
11
mm.
Walaupun
kinerja
penghambatan pertumbuhan bakteri tertinggi
terjadi pada pH 2, pH optimum untuk perlakuan
adalah pada pH 3. Hal ini disebabkan karena
zona hambat yang dihasilkan adalah murni dari
aktivitas senyawa antimikrob tanpa dipengaruhi
derajat keasaman yang tinggi dari pelarut yang
digunakan. Jika pH optimum yang dipakai
adalah pH 2, dikhawatirkan untuk produksi
da
ISOLASI DAN OPTIMASI PRODUKSI SENYAWA ANTIMIKROB
BAKTERI ASAM LAKTAT
NOVAN KURNIAWAN
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
2
ABSTRACT
NOVAN KURNIAWAN. Isolation and Optimation of Antimicrobial Compound
Production of Lactic Acid Bacteria. Under the direction of LAKSMI AMBARSARI dan
SURYANI.
Lactic acid bacteria is the bacteria that naturally held in milk. Lactic acid bacteria is
able to produce antimicrobial compound that can be used as food preservatives. Thie
aim of this research is to isolate lactic acid bacteria from milk and yoghurt and to
optimize antimicrobial compound production by doing variation of production time, pH,
and temperature. Production time will be variated from 10, 15, 20, 25, 30, 35 hours, pH
from 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, and temperature from 50, 60, 70, 80, 90, 100 ºC.
Lactic acid bacteria has been isolated and were grown in de Man Ragosa Sharpe
Agar medium (MRS). The result showed that there are 3 form isolated bacteria. First
isolate came from yoghurt (YI) and the othres two came from milk (SI dan SII). The
results of antimicrobial activities again Salmonella thypimurium bacteria by using
diffusion agar methode in treptose proteose peptone yeast (TPPY) have found that : YI
isolate has the highest activity with inhibite zone 23 mm, SII isolate 20 mm, and SI
isolate did not shown antimicrobial activity. The results of optimimalization of
production for YI isolate were production time with 15 hour, pH 3, and temperature 80
ºC. YI isolate has antimicrobial activity againt’s Gram positive bacteria (Bacillus
subtilis) and Gram negative (Eschericia coli) with each inhibits zone 33 mm and 29
mm.
3
ABSTRAK
NOVAN KURNIAWAN. Isolasi dan Optimasi Produksi Senyawa Antimikrob Bakteri
Asam Laktat. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan SURYANI.
Bakteri asam laktat adalah bakteri yang secara alamiah terdapat pada susu. Bakteri
asam laktat mampu memproduksi senyawa antimikrob yang dapat digunakan sebagai
alternatif bahan pengawet produk pangan alami yang aman. Penelitian ini bertujuan
untuk mengisolasi bakteri asam laktat yang berasal dari susu dan yoghurt serta
mengoptimalisasikan produksi senyawa antimikrob yang dihasilkan dengan melakukan
variasi terhadap waktu produksi, pH, dan suhu. Waktu produksi di variasikan pada 10,
15, 20, 25, 30, 35 jam, pH pada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan suhu pada 50, 60, 70, 80, 90, 100
°C.
Bakteri asam laktat telah berhasil diisolasi dan ditumbuhkan dalam media de Man
Rogosa Sharpe Agar (MRS). Hasil percobaan diperoleh 3 bentuk isolat, yaitu satu jenis
isolat berasal dari yoghurt (YI) dan dua jenis isolat berasal dari susu (SI dan SII). Hasil
penentuan aktivitas antimikrob terhadap bakteri Salmonella thypimurium dengan
metode sumur agar pada media treptose proteose peptone yeast (TPPY) diperoleh:
isolat YI memiliki aktivitas tertinggi dengan zona hambat sebesar 23 mm, isolat SII
sebesar 20 mm, sedangkan isolat SI tidak menunjukkan adanya aktivitas antimikrob.
Hasil penentuan optimasi produksi terhadap isolat YI diperoleh waktu produksi 15 jam,
pH 3, dan suhu 80 °C. Isolat YI mempunyai aktivitas antimikrob terhadap bakteri Gram
positif (Bacillus subtilis) dan Gram negatif (Eschericia coli) dengan zona hambat
masing-masing adalah 33 mm dan 29 mm.
4
ISOLASI DAN OPTIMASI PRODUKSI SENYAWA ANTIMIKROB
BAKTERI ASAM LAKTAT
NOVAN KURNIAWAN
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
5
Judul Skripsi : Isolasi dan Optimasi Produksi Senyawa Antimikrob Bakteri
Asam Laktat
Nama
: Novan Kurniawan
NIM
: G44102016
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Laksmi Ambarsari, M.S.
Ketua
Dr. Suryani, M.Sc.
Anggota
Diketahui
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S
NIP 131473999
Tanggal Lulus :
6
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di kota Palembang, Sumatra Selatan, pada tanggal 24 November
1984 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara pasangan Rustam dan Hidayati. Penulis
menjalani pendidikan formal di TK Muhamadiah Lubuk Linggau Sumatera Selatan
(SUM-SEL), SD Xaverius Lubuk Linggau (SUMSEL), SD St. Yosep Lahat SUMSEL,
SMP Xaverius I Palembang SUMSEL, SMP St. Yosep Lahat SUMSEL, SMU Negeri I
Kolaka Sulawesi Tenggara (SULTRA), SMU Dwiwarna Bogor Jawa Barat (JABAR)
dan lulus pada tahun 2002. Pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB
melalui jalur undangan seleksi masuk IPB di Program Studi Biokimia, Jurusan Kimia,
yang saat ini sudah menjadi Departemen Biokimia.
Selama mengikuti perkuliahan penulis pernah aktif di BEM TPB IPB Departemen
Olahraga dan Seni periode 2002/2003, wakil ketua turnamen Futsal IPB, ketua
Dormitory Farewell Party, Anggota Aktif International Asosiation Agricultural Student
(IAAS), kepala Departemen Pengembangan Bahasa Inggris Himpunan Mahasiswa
Kimia IPB, ketua UKM (unit kegiatan mahasiswa) tenis lapangan, asisten mata kuliah
olahraga dan seni, dan wakil komandan tingkat Biokimia angkatan 39.
Penulis juga pernah mengikuti beberapa lomba seperti juara pertama lomba penulisan
esai Korea (pertukaran pelajar ke Korea) FMIPA IPB, peringkat keenam lomba
penulisan esai Korea IPB, juara pertama lomba bola basket FMIPA IPB, juara pertama
tunggal putra tenis lapangan dies natalis IPB mahasiswa, juara ketiga ganda putra tenis
lapangan dies natalis IPB. Pada tahun 2005, penulis melaksanakan praktek lapangan di
BBIA (Balai Besar Industri Agro) di jalan Ir. H. Djuanda Bogor.
7
PRAKATA
Syukur alhamdullilah penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena atas rahmat serta
hidayah-Nya akhirnya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan karya
ilmiah dengan judul Isolasi dan Optimasi Produksi Senyawa Antimikrob Bakteri Asam
Laktat. Tak lupa pula penulis menyampaikan sholawat serta salam terhadap Rasulullah
SAW beserta para sahabatnya sampai akhir zaman kelak. Karya ilmiah ini merupakan
salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Program Studi Biokimia pada
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam yang dilakukan penulis sejak bulan
Januari 2007 sampai bulan Mei 2007, di laboratorium Biokimia, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu dalam
penyelesaian karya ilmiah ini, terutama kepada kedua dosen pembimbing yaitu Dr.
Laksmi Ambarsari, MS dan Dr. Suryani, M.Sc yang telah memberikan arahan,
bimbingan, dan dorongan semangat selama menyusun karya ilmiah ini. Ucapan terima
kasih juga penulis sampaikan kepada teman-teman seperjuangan Yayu, Sunanti, Solina,
Eka, Dewi, Efi, Tisha, Putu atas kebersamaan dan bantuannya. Juga tak lupa untuk staf
laboratorium Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, dan Ir. AE
Zaenal Hasan, M.Si atas bantuan dan kerjasamanya. Penghargaan juga saya sampaikan
kepada mentor non akademik saya pak Rosadi dan pak Basith atas bimbingan tentang
kesabaran yang hakiki. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada keluargaku
tercinta Ayah, Ibu, adikku Rico dan Aldi, serta Marisa Puspitasari yang telah
memberikan dukungan baik moril maupun materi serta segala doa dan kasih sayangnya.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih jauh dari sempurna, karena itu
penulis sangat mengharapkan kritik dan saran demi kesempurnaan karya ilmiah ini.
Akhirnya penulis berharap agar karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.
Bogor, Agustus 2007
Novan Kurniawan
8
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ............................................................................................. viii
DAFTAR GAMBAR.........................................................................................
ix
DAFTAR LAMPIRAN .....................................................................................
x
PENDAHULUAN .............................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA
Senyawa Antimikrob ................................................................................
Yoghurt.....................................................................................................
2
3
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat .......................................................................................
Metode ....................................................................................................
4
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat Bakteri Asam Laktat ......................................................................
Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob........................................................
Waktu Optimum Produksi Antimikrob ...................................................
pH dan Suhu Optimum Aktivitas Antimikrob.........................................
5
5
6
7
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan..................................................................................................
Saran ........................................................................................................
9
9
DAFTAR PUSTAKA.......................................................................................
9
LAMPIRAN ....................................................................................................
11
9
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Pengaruh pH terhadap aktivitas senyawa antimikrob pada bakteri
S. thypimurium.....................................................................................
7
2 Pengaruh suhu terhadap aktivitas senyawa antimikrob pada bakteri
S. thypimurium......................................................................................
8
3 Zona hambat senyawa antimikrob pada E. coli dan B. subtilis ............
8
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Isolat-isolat bakteri yang diisolasi dari susu dan ditumbuhkan di dalam
media MRS pada 42 °C selama 18 jam ................................................
6
2 Isolat-isolat bakteri yang diisolasi dari yoghurt dan ditumbuhkan
di dalam media MRS pada 42 °C selama 18 jam..................................
6
3 Perbandingan aktivitas antimikrob dari isolat yang diperoleh yang
ditumbuhkan didalam media NA pada 37 °C selama 18 jam................
6
4 Grafik hasil uji penentuan waktu optimum produksi senyawa
antimikrob pada selang waktu 10, 15, 20, 25, 30, dan 35 jam .............
7
5 Kurva pertumbuhan bakteri terhadap waktu.........................................
7
6 Hasil uji senyawa antimikrob yang telah mengalami optimasi terhadap
bakteri E.coli yang ditumbuhkan di dalam media NA dengan waktu
inkubasi 18 jam pada suhu 37 °C .........................................................
8
7 Hasil uji senyawa antimikrob yang telah mengalami optimasi terhadap
bakteri B.subtilis yang ditumbuhkan di dalam media NA dengan waktu
inkubasi 18 jam ada suhu 37 °C.............................................................
8
10
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Alur strategi penelitian .......................................................................... 12
2 Isolasi dan pengujian waktu optimum produksi senyawa antimikrob .. 13
3 Penentuan pH optimum untuk produksi senyawa antimikrob............... 14
4 Penentuan suhu optimum untuk produksi senyawa antimikrob ............ 15
5 Uji hasil optimasi terhadap B. subtilis dan E. coli................................. 16
1
ISOLASI DAN OPTIMASI PRODUKSI SENYAWA ANTIMIKROB
BAKTERI ASAM LAKTAT
NOVAN KURNIAWAN
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
2
ABSTRACT
NOVAN KURNIAWAN. Isolation and Optimation of Antimicrobial Compound
Production of Lactic Acid Bacteria. Under the direction of LAKSMI AMBARSARI dan
SURYANI.
Lactic acid bacteria is the bacteria that naturally held in milk. Lactic acid bacteria is
able to produce antimicrobial compound that can be used as food preservatives. Thie
aim of this research is to isolate lactic acid bacteria from milk and yoghurt and to
optimize antimicrobial compound production by doing variation of production time, pH,
and temperature. Production time will be variated from 10, 15, 20, 25, 30, 35 hours, pH
from 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, and temperature from 50, 60, 70, 80, 90, 100 ºC.
Lactic acid bacteria has been isolated and were grown in de Man Ragosa Sharpe
Agar medium (MRS). The result showed that there are 3 form isolated bacteria. First
isolate came from yoghurt (YI) and the othres two came from milk (SI dan SII). The
results of antimicrobial activities again Salmonella thypimurium bacteria by using
diffusion agar methode in treptose proteose peptone yeast (TPPY) have found that : YI
isolate has the highest activity with inhibite zone 23 mm, SII isolate 20 mm, and SI
isolate did not shown antimicrobial activity. The results of optimimalization of
production for YI isolate were production time with 15 hour, pH 3, and temperature 80
ºC. YI isolate has antimicrobial activity againt’s Gram positive bacteria (Bacillus
subtilis) and Gram negative (Eschericia coli) with each inhibits zone 33 mm and 29
mm.
3
ABSTRAK
NOVAN KURNIAWAN. Isolasi dan Optimasi Produksi Senyawa Antimikrob Bakteri
Asam Laktat. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan SURYANI.
Bakteri asam laktat adalah bakteri yang secara alamiah terdapat pada susu. Bakteri
asam laktat mampu memproduksi senyawa antimikrob yang dapat digunakan sebagai
alternatif bahan pengawet produk pangan alami yang aman. Penelitian ini bertujuan
untuk mengisolasi bakteri asam laktat yang berasal dari susu dan yoghurt serta
mengoptimalisasikan produksi senyawa antimikrob yang dihasilkan dengan melakukan
variasi terhadap waktu produksi, pH, dan suhu. Waktu produksi di variasikan pada 10,
15, 20, 25, 30, 35 jam, pH pada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan suhu pada 50, 60, 70, 80, 90, 100
°C.
Bakteri asam laktat telah berhasil diisolasi dan ditumbuhkan dalam media de Man
Rogosa Sharpe Agar (MRS). Hasil percobaan diperoleh 3 bentuk isolat, yaitu satu jenis
isolat berasal dari yoghurt (YI) dan dua jenis isolat berasal dari susu (SI dan SII). Hasil
penentuan aktivitas antimikrob terhadap bakteri Salmonella thypimurium dengan
metode sumur agar pada media treptose proteose peptone yeast (TPPY) diperoleh:
isolat YI memiliki aktivitas tertinggi dengan zona hambat sebesar 23 mm, isolat SII
sebesar 20 mm, sedangkan isolat SI tidak menunjukkan adanya aktivitas antimikrob.
Hasil penentuan optimasi produksi terhadap isolat YI diperoleh waktu produksi 15 jam,
pH 3, dan suhu 80 °C. Isolat YI mempunyai aktivitas antimikrob terhadap bakteri Gram
positif (Bacillus subtilis) dan Gram negatif (Eschericia coli) dengan zona hambat
masing-masing adalah 33 mm dan 29 mm.
4
ISOLASI DAN OPTIMASI PRODUKSI SENYAWA ANTIMIKROB
BAKTERI ASAM LAKTAT
NOVAN KURNIAWAN
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
5
Judul Skripsi : Isolasi dan Optimasi Produksi Senyawa Antimikrob Bakteri
Asam Laktat
Nama
: Novan Kurniawan
NIM
: G44102016
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Laksmi Ambarsari, M.S.
Ketua
Dr. Suryani, M.Sc.
Anggota
Diketahui
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S
NIP 131473999
Tanggal Lulus :
6
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di kota Palembang, Sumatra Selatan, pada tanggal 24 November
1984 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara pasangan Rustam dan Hidayati. Penulis
menjalani pendidikan formal di TK Muhamadiah Lubuk Linggau Sumatera Selatan
(SUM-SEL), SD Xaverius Lubuk Linggau (SUMSEL), SD St. Yosep Lahat SUMSEL,
SMP Xaverius I Palembang SUMSEL, SMP St. Yosep Lahat SUMSEL, SMU Negeri I
Kolaka Sulawesi Tenggara (SULTRA), SMU Dwiwarna Bogor Jawa Barat (JABAR)
dan lulus pada tahun 2002. Pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB
melalui jalur undangan seleksi masuk IPB di Program Studi Biokimia, Jurusan Kimia,
yang saat ini sudah menjadi Departemen Biokimia.
Selama mengikuti perkuliahan penulis pernah aktif di BEM TPB IPB Departemen
Olahraga dan Seni periode 2002/2003, wakil ketua turnamen Futsal IPB, ketua
Dormitory Farewell Party, Anggota Aktif International Asosiation Agricultural Student
(IAAS), kepala Departemen Pengembangan Bahasa Inggris Himpunan Mahasiswa
Kimia IPB, ketua UKM (unit kegiatan mahasiswa) tenis lapangan, asisten mata kuliah
olahraga dan seni, dan wakil komandan tingkat Biokimia angkatan 39.
Penulis juga pernah mengikuti beberapa lomba seperti juara pertama lomba penulisan
esai Korea (pertukaran pelajar ke Korea) FMIPA IPB, peringkat keenam lomba
penulisan esai Korea IPB, juara pertama lomba bola basket FMIPA IPB, juara pertama
tunggal putra tenis lapangan dies natalis IPB mahasiswa, juara ketiga ganda putra tenis
lapangan dies natalis IPB. Pada tahun 2005, penulis melaksanakan praktek lapangan di
BBIA (Balai Besar Industri Agro) di jalan Ir. H. Djuanda Bogor.
7
PRAKATA
Syukur alhamdullilah penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena atas rahmat serta
hidayah-Nya akhirnya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan karya
ilmiah dengan judul Isolasi dan Optimasi Produksi Senyawa Antimikrob Bakteri Asam
Laktat. Tak lupa pula penulis menyampaikan sholawat serta salam terhadap Rasulullah
SAW beserta para sahabatnya sampai akhir zaman kelak. Karya ilmiah ini merupakan
salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Program Studi Biokimia pada
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam yang dilakukan penulis sejak bulan
Januari 2007 sampai bulan Mei 2007, di laboratorium Biokimia, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu dalam
penyelesaian karya ilmiah ini, terutama kepada kedua dosen pembimbing yaitu Dr.
Laksmi Ambarsari, MS dan Dr. Suryani, M.Sc yang telah memberikan arahan,
bimbingan, dan dorongan semangat selama menyusun karya ilmiah ini. Ucapan terima
kasih juga penulis sampaikan kepada teman-teman seperjuangan Yayu, Sunanti, Solina,
Eka, Dewi, Efi, Tisha, Putu atas kebersamaan dan bantuannya. Juga tak lupa untuk staf
laboratorium Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, dan Ir. AE
Zaenal Hasan, M.Si atas bantuan dan kerjasamanya. Penghargaan juga saya sampaikan
kepada mentor non akademik saya pak Rosadi dan pak Basith atas bimbingan tentang
kesabaran yang hakiki. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada keluargaku
tercinta Ayah, Ibu, adikku Rico dan Aldi, serta Marisa Puspitasari yang telah
memberikan dukungan baik moril maupun materi serta segala doa dan kasih sayangnya.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih jauh dari sempurna, karena itu
penulis sangat mengharapkan kritik dan saran demi kesempurnaan karya ilmiah ini.
Akhirnya penulis berharap agar karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.
Bogor, Agustus 2007
Novan Kurniawan
8
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ............................................................................................. viii
DAFTAR GAMBAR.........................................................................................
ix
DAFTAR LAMPIRAN .....................................................................................
x
PENDAHULUAN .............................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA
Senyawa Antimikrob ................................................................................
Yoghurt.....................................................................................................
2
3
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat .......................................................................................
Metode ....................................................................................................
4
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat Bakteri Asam Laktat ......................................................................
Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob........................................................
Waktu Optimum Produksi Antimikrob ...................................................
pH dan Suhu Optimum Aktivitas Antimikrob.........................................
5
5
6
7
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan..................................................................................................
Saran ........................................................................................................
9
9
DAFTAR PUSTAKA.......................................................................................
9
LAMPIRAN ....................................................................................................
11
9
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Pengaruh pH terhadap aktivitas senyawa antimikrob pada bakteri
S. thypimurium.....................................................................................
7
2 Pengaruh suhu terhadap aktivitas senyawa antimikrob pada bakteri
S. thypimurium......................................................................................
8
3 Zona hambat senyawa antimikrob pada E. coli dan B. subtilis ............
8
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Isolat-isolat bakteri yang diisolasi dari susu dan ditumbuhkan di dalam
media MRS pada 42 °C selama 18 jam ................................................
6
2 Isolat-isolat bakteri yang diisolasi dari yoghurt dan ditumbuhkan
di dalam media MRS pada 42 °C selama 18 jam..................................
6
3 Perbandingan aktivitas antimikrob dari isolat yang diperoleh yang
ditumbuhkan didalam media NA pada 37 °C selama 18 jam................
6
4 Grafik hasil uji penentuan waktu optimum produksi senyawa
antimikrob pada selang waktu 10, 15, 20, 25, 30, dan 35 jam .............
7
5 Kurva pertumbuhan bakteri terhadap waktu.........................................
7
6 Hasil uji senyawa antimikrob yang telah mengalami optimasi terhadap
bakteri E.coli yang ditumbuhkan di dalam media NA dengan waktu
inkubasi 18 jam pada suhu 37 °C .........................................................
8
7 Hasil uji senyawa antimikrob yang telah mengalami optimasi terhadap
bakteri B.subtilis yang ditumbuhkan di dalam media NA dengan waktu
inkubasi 18 jam ada suhu 37 °C.............................................................
8
10
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Alur strategi penelitian .......................................................................... 12
2 Isolasi dan pengujian waktu optimum produksi senyawa antimikrob .. 13
3 Penentuan pH optimum untuk produksi senyawa antimikrob............... 14
4 Penentuan suhu optimum untuk produksi senyawa antimikrob ............ 15
5 Uji hasil optimasi terhadap B. subtilis dan E. coli................................. 16
PENDAHULUAN
Kerusakan makanan sering kali terjadi pada
produk-produk olahan hasil industri. Kerusakan
ini biasanya ditimbulkan oleh mikroorganisme
pembusuk dan bakteri pembentuk spora. Untuk
mengatasi hal tersebut maka diperlukan suatu
bahan tambahan makanan yang berfungsi untuk
menghindari kerusakan akibat mikroorganisme
sehingga tidak menimbulkan bahaya bagi
kesehatan konsumen. Salah satu upaya untuk
mencegah kerusakan oleh mikroorganisme
adalah dengan penambahan zat pengawet.
Zat pengawet dapat dibedakan dalam tiga
golongan utama berdasarkan banyaknya dosisi
yang dapat diterima per harinya. Pertama, zat
pengawet yang termasuk dalam golongan
GRAS (Generally Recognized as Safe) yang
umumnya bersifat alami, sehingga aman
dikonsumsi oleh masyarakat dengan dosisi yang
tinggi (tidak menimbulkan efek samping).
Kedua, zat pengawet yang termasuk dalam
golongan ADI (Acceptable Daily Intake), yang
selalu ditetapkan batas penggunaan hariannya
(daily intake) untuk melindungi kesehatan
konsumen. Ketiga, zat pengawet yang memang
tidak layak dikonsumsi, seperti formalin karena
dapat
menyebabkan
kanker
paru-paru,
gangguan pada alat pencernaan dan jantung
(Broughton 1990).
Ada beberapa contoh pengawet yang
berbahaya jika dikonsumsi secara berlebihan,
yaitu kalsium benzoat. Bahan pengawet ini
dapat menghambat pertumbuhan bakteri
penghasil toksin (racun), bakteri spora dan
bakteri bukan pembusuk. Asam benzoat
digunakan untuk mengawetkan minuman
ringan, minuman anggur, saus sari buah, sirup,
dan ikan asin. Bahan ini bisa menyebabkan
dampak negatif pada penderita asma dan bagi
orang yang peka terhadap aspirin. Kalsium
benzoat bisa memicu terjadinya serangan asma
dan natrium benzoat dapat menyebabkan
sistemic lupus erythematosus (SLE) yang
menyerang sistem kekebalan tubuh. Menurut
data yang dikutip dari rumah sakit Hasan
Sadikin Bandung selama tahun 2006 ini sudah
350 orang yang terkena penyakit (anonymus
2006).
Kasus-kasus yang terjadi pada masyarakat
mengindikasikan bahwa menggunakan zat
pengawet alami adalah solusi yang tepat.
Pengawet
alami
yang
berasal
dari
mikroorganisme, tumbuhan, dan hewan
seharusnya sudah mulai digunakan untuk
menggantikan pengawet yang berbahaya.
Sebagai contoh adalah zat pengawet yang
berasal dari selasih. Selasih memiliki aktivitas
antibakteri terhadap Saphylococcus aureus,
Salmonella enteritidis, Escherichia coli ;
aktivitas antiseptik terhadap Proteus vulgaris,
Bacillus subtilis, Salmonella paratyph; aktivitas
antifungi
terhadap
Candida
albicans,
Penicillium notatum, Microsporeum gyseum;
aktivitas larvasida terhadap lalat rumah dan
nyamuk, serta repelan terhadap serangga
(Adnyana 2006).
Bahan pengawet yang aman juga dapat
berasal dari mikroorganisme, antara lain adalah
bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri asam
laktat. Hasil penelitian yang telah dilakukan
sebelumnya disebutkan bahwa bakteriosin dapat
menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif
dan Gram negatif (Oryazabal 1998). Bakteriosin
juga dapat menghambat pertumbuhan bakteri S.
thypimurium, B.subtilis, dan E.coli (Wiryawan
2005).
Salah satu jenis bekteriosin yang telah
diproduksi dalam skala industri adalah nisin.
Nisin tidak dapat diproduksi secara sintetik
melainkan oleh bakteri asam laktat. Nisin juga
stabil dalam suhu tinggi dan stabil dalam
kondisi asam sehingga dapat digunakan pada
proses industri yang menggunakan suhu tinggi
dan kondisi asam tanpa merusak kinerjanya.
Penyimpanan yang dilakukan pada suhu antara
4-25 °C dapat menstabilkan nisin sampai dua
tahun (anonymus 2001). Nilai LD50 nisin sama
dengan nilai LD50 garam yaitu 7 g/kg berat
badan (Naidu 2000).
Produksi senyawa antimikroba dari bakteri
asam laktat belum dilakukan dalam skala
industri di Indonesia, sehingga dibutuhkan
penelitian pendahuluan untuk mendapatkan
parameter yang valid agar diperoleh hasil yang
optimal. Mengkombinasikan media produksi
dengan waktu, pH, dan suhu, yang telah
optimum, diharapkan dapat mengefektifkan
produksi senyawa antimikrob agar dapat
diperoleh manfaat maksimal sebagai pengganti
bahan pengawet sintetik yang sangat merugikan
kesehatan masyarakat.
Penelitian ini memiliki tujuan jangka
panjang untuk memproduksi antimikrob (nisin)
sebagai alternatif bahan pengawet pangan alami
yang aman bagi kesehatan masyarakat,
sedangkan untuk tujuan jangka pendek
penelitian ini adalah untuk mengisolasi bakteri
penghasil senyawa antimikrob dan menentukan
kondisi optimum produksi senyawa antimikrob
dari isolat bakteri tersebut.
13
TINJAUAN PUSTAKA
Senyawa Antimikrob
Senyawa antimikrob adalah senyawa yang
memiliki aktivitas penghambatan terhadap
pertumbuhan mikroba, terutama mikroba
patogen. Senyawa tersebut umumnya berasal
dari tumbuhan maupun mikroorganisme. Salah
satu senyawa antimikrob yang terkenal adalah
bawang putih yang dapat menghambat
pertumbuhan bakteri S. thypimurium dengan
konsentrasi 2% (Sunanti 2007).
Produksi
dan
penggunaan
senyawa
antimikrob yang berasal dari tanaman telah
lama digunakan terutama pada pengobatan
tradisional. Contohnya, kemangi dan selasih
secara empiris telah digunakan dalam
pengobatan tradisional untuk berbagai macam
penyakit. Teh yang dibuat dari daun selasih atau
herbanya digunakan untuk mengatasi mual,
disentri, atau menurunkan panas (sebagai
antipiretik).
Dalam
kitab
pengobatan
“Ayurveda”, selasih memiliki khasiat sebagai
antibakteri, antiseptik, antispasmodik (sakit
perut), diaforetik (peluruh keringat), sakit
kepala, demam, sakit telinga, obat sakit ginjal
dan sebagai afrodisiaka (peningkat libido).
Penggunaannya dapat dalam bentuk jus, infus,
dan serbuk (Adnyana 2006).
Senyawa antimikrob yang berasal dari
mikroorganisme juga telah banyak digunakan
antara lain nisin, nisin merupakan bagian dari
bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri asam
laktat. Nisin telah digunakan di banyak negara
sebagai bahan pengawet yang aman, dan nisin
memiliki aktivitas antimikroba khususnya pada
bakteri Gram positif (Broughton 1990).
Bakteriosin
Bakteriosin adalah senyawa metabolit
sekunder yang dihasilkan oleh bakteri asam
laktat selama proses fermentasi yang bersifat
menghambat petumbuhan mikroorganisme
merugikan. Oyarzabal (1998), menyatakan
bakteri asam laktat dapat menghasilkan
substansi bakteriosin yang bersifat antimikrob
terhadap pertumbuhan bakteri Gram positif dan
atau Gram negatif. Pendapat ini telah didukung
dengan beberapa penelitian diantaranya
bakteriosin Plantaricin C yang mampu
menghambat Bacillus subtilis, (Gonzalez et al.,
1994), bakteriosin Pediocin L50, bersifat
“broad spectrum”, diantaranya menghambat E.
faecalis (Cintas et al. 1995), dan Salmonella
typhimurium (Steven et al. 1991).
Secara in vitro Audisio et al. (1999),
melaporkan aksi hambat terhadap bakteri
patogenik pada manusia dan unggas yaitu
Salmonella
spp.
(Galinarum,
Pulorum,
Enteridis dan Typhymurium) didapat dengan
cara menggabungkan bakteri asam laktat
dengan bakteriosin, sehingga berpeluang untuk
dijadikan sebagai avian probiotics yang mahal
saat ini. Hambatan pertumbuhan bakteri
Salmonella typhymurium FNCC 0050, E. coli
FNCC 0091 dan Bacillus cereus oleh
bakteriosin juga dilaporkan oleh Djaafar et al.,
(1995). Hambatan pertumbuhan ditunjukkan
dengan adanya perpanjangan fase lag maupun
penekanan populasi pasca 12 jam inkubasi
setelah ditambah metabolit bakteriosin, masingmasing pada S. thypimurium FNCC 0050 dari
fase lag 1 jam menjadi 6 jam, E. coli FNCC
0091 dari 1 jam menjadi 3 jam, dan pada B.
cereus dari 3 jam menjadi 7 jam.
Nisin
Nisin, termasuk bakteriosin, merupakan
senyawa polipeptida anti bakteri yang
diproduksi dari hasil fermentasi bakteri asam
laktat (BAL) Lactobacillus bulgaricus (Hoover
& Davidson 1993) yang diakui penggunaannya
oleh banyak negara sebagai pengawet alami
makanan mentah atau makanan olahan yang
aman dikonsumsi serta terbukti dapat
mengontrol dan menghambat pertumbuhan
bakteri pembusuk dan patogen. Nisin juga tidak
menimbulkan efek samping pada manusia
karena tidak toksik dan tidak aktif oleh enzim
proteolitik dalam saluran pencernaan.
Nama nisin diturunkan dari “Grup N
streptococci (sekarang lebih dikenal dengan
lactococci) Inhibitory Substances IN (yang
merupakan akhiran untuk nama sebuah
antibiotik)”. Bahan ini aktif melawan bakteri
lain, terutama spora bakteri Gram positif
(Broughton 1990).
Nisin bersifat ampifilik dengan residu
hidrofobik pada ujung N dan residu hidrofilik
pada ujung C. Distribusi polar dan non polar
pada molekul nisin ada relevansinya dengan
aktivitas cara kerja biologik. Nisin adalah
polipeptida kationik dengan muatan 2 atau 3,
tidak mengandung asam-asam amino aromatik
sehingga tidak diserap pada 260 atau 280 nm.
Kelarutan, stabilitas, dan aktivitas biologik
tergantung pada pH larutan; pada pH yang
rendah nisin lebih mudah larut, stabil, dan
beraktivitas tinggi. Pada pH netral atau basa,
nisin tidak larut. Kelarutan nisin pada pH 2
adalah 57 mg/mL, pada pH 6 adalah 1,5 mg/mL
dan pH 8,5 adalah 0,25 mg/mL. kestabilan nisin
14
sejalan dengan kelarutannya. Dalam HCl pada
pH 2,5 atau kurang dan nisin akan tetap stabil
sekalipun mengalami pemanasan tinggi (Adam
2000).
Nisin
sebgai
antimikrob
memiliki
kemampuan terbatas. Nisin tidak dapat
menghambat bakteri Gram negatif (kecuali
Neisseria dan Flavobacter), khamir, virus serta
bakteri Gram positif tertentu, seperti beberapa
spesies Lactobacillus dan Enterococcus
faecalis. Akan tetapi bakteri Gram negatif dapat
dihambat jika membran sel bakteri mengalami
kerusakan (Steven et al.1991). Nisin
menghambat bakteri Gram positif, terutama
bakteri pembentuk spora seperti klostridia dan
basili serta jenis-jenis bakteri lain yaitu
stafilokoki,
laktokoki,
korinebakteria,
leukonostok,
pediokoki,
pneumokoki,
aktinomisetes,
streptokoki,
mikrokoki,
laktobasili dan Mycobacteria. Sensitivitas
mikrob terhadap nisin berbeda-beda (Broughton
1990).
Pertumbuhan
Bacillus
stearothermophillus dapat dihambat pada kadar
nisin kurang dari 2 IU/mL, B.cereus perlu 75100 IU/mL. B. megaterium perlu 25-100 IU/mL
dan B. polymixa perlu 50 IU/mL, sedangkan
Clostridum botulinum tipe A dan B dihambat
pada taraf 500-2500 IU/mL serta untuk tipe B
perlu 50-1000 IU/mL (Broughton 1990).
Target penghambatan pada sel vegetatif
mikrob adalah membran sitoplasma. Nisin
menimbulkan kebocoran dengan keluarnya
adenosin trifosfat, sehingga terjadi lisis pada
membran. Kebocoran membran sitoplasma
terjadi karena nisin mengaktifkan gugus
sulfidril pada membran tersebut (Abee 1995).
Pada spora, nisin lebih bersifat sporosidal
daripada sporostatik. Nisin menghambat
pertunasan
spora
pada
saat
awal
penggembungan untuk tumbuh; spora yang
rusak karena pemanasan lebih peka terhadap
nisin (Broughton 1990).
Yoghurt
Yoghurt merupakan salah satu jenis produk
fermentasi yang terkenal. Berbagai jenis susu
dapat digunakan untuk membuat yoghurt, antara
lain susu segar, susu krim, susu yang telah
dihilangkan sebagian lemaknya dan susu skim
(susu tanpa lemak). Pembuatan
yoghurt
merupakan salah satu metode yang tertua dalam
sejarah pengawetan susu. Dewasa ini yoghurt
telah mengalami perkembangan dalam proses
pembuatannya sehingga menghasilkan yoghurt
dengan cita rasa dan flavor yang semakin baik
dan bervariasi. Yoghurt berasal dari bahasa
Turki yaitu “jughurt” yang berarti susu asam.
Menurut SNI 01.2981.1982, yoghurt adalah
produk yang diperoleh dari susu yang
dipasteurisasi kemudian difermentasi dengan
menggunakan bakteri tertentu sampai diperoleh
bau dan rasa yang khas dengan atau tanpa
penambahan bahan lain yang diizinkan.
Tamime
dan
Robinson
(1989),
mengklasifikasikan yoghurt komersial ke dalam
tiga kelompok yaitu plain atau natural yoghurt,
fruit yoghurt, dan flavoured yoghurt. Natural
atau plain yoghurt merupakan tipe tradisional
dengan bau tajam dan rasa asam, sedangkan
fruit yoghurt dibuat dengan penambahan buahbuahan dan pemanis pada plain yoghurt dan
flavoured yoghurt dibuat dengan penggunaan
aroma buah dan senyawa sintesis.
Klasifikasi yoghurt berdasarkan metode
pembuatannya, dibagi dalam tiga tipe, yaitu : set
yoghurt, stirred yoghurt, dan fluid yoghurt. Set
yoghurt diproduksi dengan inkubasi didalam
tempat-tempat kecil khusus, yoghurt yang
dihasilkan berupa cairan kental dan setengah
padat. Stirred yoghurt diinkubasi pada tempat
besar dan selanjutnya koagulan yang terbentuk
dipotong-potong dan didinginkan pada tempattempat khusus yang lebih kecil. Fluid yoghurt
dibuat secara hampir sama dengan stirred
yoghurt,
tetapi
hasil
yang
diperoleh
kekentalannya berbeda yaitu lebih encer
(Tamime dan Robinson 1989).
Kultur starter yoghurt pada umumnya terdiri
dari bakteri asam laktat Lactobacillus
bulgaricus dan Streptococus thermophilus yang
merupakan pasangan bakteri utama dalam
pembuatan yoghurt. Bergabungnya kedua
bakteri ini akan menghasilkan nilai organoleptik
yang lebih tinggi dibandingkan dengan
penggunaan kultur tunggalnya. Keadaan ini
disebabkan karena adanya simbiosis antara L.
bulgaricus dengan S. thermophilus yang saling
menguntungkan, karena bakteri yang satu
mensintesis dan membebaskan senyawa yang
saling menguntungkan atau menstimulasi
bakteri lainnya (Tamime & Robinson 1999).
Spesies L. bulgaricus merupakan bakteri
berbentuk batang, gram positif, tidak berspora,
non motil. Suhu optimum pertumbuhan 40-43
°C, masih dapat tumbuh pada suhu 45 °C atau
kadang-kadang pada suhu 50-52 °C dan tidak
dapat tumbuh pada suhu 15 °C (Deibel &
Seeley 1974). Spesies L. bulgaricus bersifat
anaerobik, yaitu lebih senang hidup tanpa atau
dengan sedikit oksigen. Pada pembuatan
yoghurt, L. bulgaricus berperan dalam
penurunan pH sampai sekitar 4. selain itu,
L.bulgaricus juga memberi kontribusi terhadap
flavor yoghurt melalui produksi asam laktat,
asetaldehid, asam asetat, dan diasetil (Winarno
15
2003). L. bulgaricus di dalam susu lebih bersifat
proteolitik yang berkontribusi pada tekstur dan
aroma produk susu fermentasi, yaitu dengan
membebaskan valin, histidin, dan glisin yang
diperlukan oleh S. thermophilus
selama
pertumbuhannya. Bakteri penghasil asam laktat
seperti L. bulgaricus ini juga menghasilkan
senyawa yang berisfat antimikroba yang disebut
nisin (Adams 2000).
Prinsip dasar fermentasi yoghurt adalah
inokulasi bakteri kultur starter pada susu yang
telah dipanaskan. Komponen karbohidrat utama
pada susu adalah laktosa. Laktosa digunakan
oleh kultur starter sebagai sumber energi untuk
pertumbuhannya. Laktosa akan dihidrolisis
dengan produk akhir asam piruvat. Selanjutnya
asam piruvat akan diubah menjadi asam laktat
oleh enzim laktat dehidrogenase. Selain
menghasilkan aroma yang khas, asam laktat
juga berperan dalam pembentukan gel yoghurt.
Secara sederhana, reaksi perubahan laktosa
menjadi asam laktat adalah sebagai berikut
(Tamime & Robinson 1989):
Laktosa + air Æ Asam laktat
C12H22O11
H2O 4C3H6O3
Asam yang terbentuk selama fermentasi
yoghurt terutama adalah asam laktat. Asam
laktat yang diproduksi berbeda dalam
konfigurasi struktur dan rotasi optik. Dua
isomer yang mungkin terjadi asam laktat leavodan dekstro-rotasi (Tamime & Deeth 1980).
Manfaat yoghurt bagi kesehatan tubuh telah
banyak dibuktikan oleh banyak peneliti di
dunia. Yoghurt memiliki kandungan nilai gizi
yang baik dan mudah dicerna oleh tubuh. Selain
untuk tujuan kesehatan, yoghurt juga sering
dikonsumsi untuk tujuan diet. Yoghurt yang
dikonsumsi
secara
teratur
dapat
menyeimbangkan mikroflora usus sehingga
bakteri-bakteri yang merugikan dapat ditekan
jumlahnya dan sebaliknya usus akan didominasi
oleh bakteri yang menguntungkan bagi
kesehatan (Silvia 2002).
Yoghurt pada umumnya digunakan sebagai
bahan pencegah penyakit saluran pencernaan
seperti diare. Khususnya pada bayi yang
mengalami tidak dapat untuk mencerna laktosa,
gastroenteritis (sakit perut), dan pengobatan
konstipasi (sembelit). Bagi orang
yang
menderita tidak dapat mencerna laktosa,
yoghurt adalah makanan alternatif yang sangat
bermanfaat karena bakteri asam laktat, melalui
proses fermentasi akan mengubah laktosa
menjadi asam laktat, begitu pula penderita tidak
toleran terhadap laktosa dapat mengkonsumsi
yoghurt dengan aman (Gillian & Kim 1984).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah susu
sapi perah, dengan jarak 30 menit setelah
diperah, dan yoghurt tanpa rasa (plain yoghurt),
bakteri uji Salmonella thypimurium, Bacillus
subtilis, Escherichia coli yang berasal dari
Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian
Bogor, Media produksi antimikroba yang
digunakan adalah treptose proteose peptone
yeast (TPPY) pH 6.0, dengan komposisi
(sukrosa 1 g, pepton 1 g, ekstrak khamir 1 g,
K2HPO4 1 g, NaCl 0,2 g, MgSO4 0,02 g,
akuades 95,78 mL). de Man Rogosa Sharpe
Agar/MRS agar digunakan sebagai media
seleksi bakteri dengan komposisi (pepton 10 g,
beef extract 10 g, yeast extract 5 g, K2HPO4 2
g, amonium sitrat 2 g, glukosa 2 g, sodium
asetat 3H2O 20 g, MgSO4 7H2O 0,58 g, MnSO4
4H2O 0,28 g, agar 15 g, akuades sampai 1000
mL), alkohol 70%. Nutrien agar (NA) sebagai
media tumbuh bakteri uji dengan komposisi
(beef extract 3 g, pepton 5 g, bacto agar 15 g,
akuades sampai 1000 mL).
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini
adalah autoklaf, inkubator, oven, neraca
analitik, bunsen, labu Erlenmeyer, tabung
reaksi, kapas, sudip, gelas ukur, pipet,
alumunium foil, karet, kertas, ruang laminar,
magnetik stirer, sentrifus Beckman dengan rotor
JA 20 untuk volume contoh 500 mL, cawan
petri, jarum ose.
Metode Penelitian
Isolasi
Bakteri
Penghasil
Senyawa
Antimikrob dari Yoghurt dan Susu
(Dwijoseputro 1978)
Sampel yoghurt dan susu masing-masing
sebanyak 1 mL diencerkan 0-100 kali,
kemudian dari masing-masing pengenceran
diambil 0,1 mL dan disebar dengan
menggunakan alat sebar pada media MRS agar
yang telah padat pada cawan petri. Selanjutnya
diinkubasi selama 18 jam, suhu 42 °C.
Isolasi Senyawa Antimikrob
Isolasi dilakukan sesuai dengan metode dari
Wiryawan (2005). Isolat bakteri diambil
sebanyak satu ose dan diinokulasikan ke dalam
Erlenmeyer yang berisi 10 mL media TPPY
steril kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C
selama 18 jam. Selanjutnya dilakukan
sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm
selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh
16
diendapkan dengan menggunakan etanol absolut
sebanyak dua kali volume dalam keadaan
dingin, sambil diaduk, kemudian diendapkan
selama satu malam pada suhu dingin.
Selanjutnya disentrifugasi kembali pada
kecepatan 10000 rpm selama 30 menit. Pelet
yang diperoleh diuapkan di dalam oven pada
suhu 40 °C selama 12 jam. Pelet yang sudah
bebas dari pelarut etanol dilarutkan kembali
dengan buffer Tris-HCl dengan konsentrasi 0,1
M kurang lebih 2 kali bobot pelet dan ditetesi 12 tetes HCl 0,5 M sampai pelet tersebut larut
kembali. Pelet tersebut merupakan
ekstrak
kasar
senyawa
antimikrob yang akan diujikan pada bakteri
S. thypimurium dengan menggunakan metode
sumur agar.
Senyawa antimikrob diproduksi sesuai
dengan waktu optimum yang telah diperoleh
pada tahap sebelumnya. Hasil yang didapat
kemudian diperlakukan dengan variasi pH dan
suhu.
Penentuan pH dan suhu optimum produksi
senyawa
antimikrob
dilakukan
dengan
memvariasikan pH pada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 dan
suhu pada 50, 60, 70, 80, 90, 100 °C. Masingmasing ekstrak kasar senyawa antimikrob
diujikan aktivitas antimikrobnya dengan
menggunakan bakteri S. thypimurium. Setelah
diperoleh pH optimum dan suhu optimum maka
dilakukan pengujian selanjutnya terhadap
bakteri uji B. subtilis dan E. coli.
Uji Aktivitas Senyawa Antimikrob dari
Isolat Bakteri
Isolat Bakteri Asam Laktat
Pengujian terhadap bakteri uji (S.
thypimurium) dilakukan dengan menggunakan
metode sumur agar (well diffusion agar)
(Bintang 1982). Biakan bakteri uji yang telah
disegarkan dalam media NB, diambil sebanyak
0,1 mL dan diinokulasikan ke dalam cawan
petri steril. Setelah petri yang berisi biakan
bakteri dan media NA memadat, sumur (lubang)
dibuat dengan menggunakan pangkal pipet
Pasteur dengan diameter 6-7 mm. Ekstrak kasar
senyawa antimikrob dari isolat yoghurt dan susu
dipipet sebanyak 0,05 mL serta kontrol (pelarut
Tris-HCl). Selanjutnya cawan diinkubasi pada
suhu 25 °C selama 18 jam. Aktivitas antimikrob
ditentukan dengan cara mengukur diameter
zona bening yang terbentuk.
Penentuan Waktu
Antimikrob
Optimum
Produksi
Isolat bakteri YI disegarkan di dalam media
produksi TPPY sambil dilakukan pengocokan
dengan menggunakan shaker water bath pada
suhu 37 ºC selama 18 jam. Sebanyak 1% dari
volume isolat yang telah disegarkan dipipet
kedalam Erlenmeyer yang telah berisi media
produksi TPPY. Ekstrak antimikroba diisolasi
setelah melalui inkubasi dengan menggunakan
variasi waktu 10, 15, 20, 25, 30, dan 35 jam
pada suhu 37 ºC. Ekstrak kasar senyawa
antimilrob selanjutnya akan diuji aktivitasnya
terhadap bakteri S. thypimurium dengan
menggunakan metode sumur agar.
Karakterisasi Antimikrob
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat yang diperoleh diisolasi dari plain
yoghurt (yoghurt murni yang belum diberikan
zat tambahan dan mengalami pemanasan) dan
susu yang telah mengalami pengenceran 0
sampai 100 kali. Hasil pengenceran selanjutnya
ditumbuhkan di dalam media MRS, yang
merupakan media selektif untuk pertumbuhan
bakteri asam laktat, dengan cara disebar.
Hasil percobaan diperoleh 14 isolat dari susu
dan 14 isolat dari yoghurt (Gambar 1 dan 2).
Isolat-isolat yang didapat muncul setelah
dilakukan inkubasi pada suhu 42 °C selama 18
jam. Isolat-isolat tersebut kemudian diseleksi
dan didapatkan tiga bentuk isolat yang berbeda,
satu bentuk isolat berasal dari yoghurt (YI) dan
dua bentuk isolat berasal dari susu (SI dan SII).
Isolat YI memiliki ciri-ciri berwarna putih,
permukaan licin, dan berbentuk bulat
memanjang; isolat SI berwarna coklat muda,
permukaan kasar, dan berbentuk seperti akar;
dan isolat SII berwarna putih kecoklatan,
permukaan halus, dan berbentuk bulat. Ketiga
bentuk isolat tersebut dipilih untuk pengujian
aktivitas antimikrob.
Gambar 1 Isolat-isolat bakteri yang diisolasi
dari susu dan ditumbuhkan di
17
dalam media MRS pada 42 °C
selama 18 jam.
masing isolat. Dengan demikian dapat
disimpulkan bahwa isolat YI lebih unggul
dibandingkan isolat SI dan SII.
Waktu Optimum Produksi Antimikrob
Penentuan waktu optimum produksi
senyawa
antimikrob
dilakukan
untuk
mengetahui waktu produksi terbaik bakteri
asam laktat dalam menghasilkan senyawa
antimikrob. Waktu optimum produksi senyawa
antimikrob diperoleh dengan melakukan variasi
waktu produksi dari 10, 15, 20, 25, 30, dan 35
jam. Produksi senyawa antimikrob dilakukan
pada media TPPY dengan suhu inkubasi 37 °C
dan variasi konsentrasi uji 5 mg/mL, 15 mg/mL,
dan 20 mg/mL (b/v) terhadap bakteri
S.thypimurium.
Variasi konsentrasi uji
dilakukan untuk mengetahui konsentrasi hambat
efektif dari senyawa antimikrob.
Berdasarkan hasil pengamatan (Gambar 4)
diperoleh waktu optimum produksi pada jam ke
15 dengan zona hambat terhadap bakteri S.
thypimurium, pada konsentrasi 20 mg/mL dan
15 mg/mL, adalah 16 mm dan 10 mm. Pada
Gambar 2 Isolat-isolat bakteri yang diisolasi
dari yoghurt dan ditumbuhkan didalam media MRS pada 42 °C
selama 18 jam.
Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob
Ekstrak kasar senyawa antimikrob diperoleh
setelah melalui beberapa tahap. Tahap pertama
adalah produksi senyawa antimikrob di dalam
media TPPY selama 18 jam pada suhu 37 ºC.
Tahap kedua adalah pemisahan sel dengan
senyawa antimikrob. Pemisahan sel dilakukan
dengan melakukan sentrifugasi pada kecepatan
10000 rpm selama 30 menit. Supernatan
diambil dan ditambahkan etanol absolut, sambil
diaduk, pada suhu dingin sebanyak dua kali
volume dari volume supernatan. Penambahan
etanol absolut dilakukan untuk mengendapkan
senyawa antimikrob yang sebagian besar
disusun oleh protein, selain itu juga merupakan
tahap awal pemurnian senyawa antimikrob dari
pengotor yang ada. Tahap ketiga adalah
pemisahaan hasil pengendapan. Pemisahan
dilakukan dengan sentrifugasi pada kecepatan
10000 rpm selama 30 menit. Pelet yang
diperoleh kemudian dikeringkan pada oven
untuk menguapkan etanol absolut. Tahap
terakhir atau tahap keempat adalah pelarutan
kembali hasil pengeringan pada bufer Tris-HCl
sebanyak dua kali bobot pelet kering. Pelet yang
telah dilarutkan didalam bufer Tris-HCl yang
merupakan ekstrak kasar senyawa antimikrob
yang akan diuji aktivitasnya. Pengujian
dilakukan terhadap bakteri uji S. thypimurium
yang ditumbuhkan di dalam media NA dan
diinkubasi pada suhu 37 °C selama 18 jam.
Berdasarkan hasil pengamatan diperoleh
zona hambat dari isolat YI sebesar 23 mm, isolat
SII 20 mm, dan isolat SI tidak menunjukan
aktivitas penghambatan (Gambar 3). Zona
hambat yang diamati menunjukkan aktivitas
ekstrak kasar senyawa antimikrob terhadap
pertumbuhan bakteri uji. Semakin besar zona
hambat yang diamati maka semakin baik
aktivitas senyawa antimikrob dari masing-
SII
KpH2
SI
YI
Gambar 3 Aktivitas antimikrob isolat YI, SI,
dan SII dengan kontrol KpH 2.
Semua isolat ditumbuhkan di dalam
media NA dan zona hambat isolat
YI sebesar 23 mm.
Z
o
n
a
H
a
m
b
a
t
(mm)
Gambar 4
Waktu Inkubasi (jam)
Grafik hasil uji penentuan waktu
optimum
produksi
senyawa
antimikrob. Zona hambat isolat YI
18
dengan konsentrasi 20 (biru muda),
15 (biru tua), dan 5 mg/mL (ungu)
pada selang waktu 10, 15, 20, 25,
30, dan 35 jam.
jam ke 10, tidak terdapat zona hambat pada
konsentrasi 5 mg/mL dan 15 mg/mL, sedangkan
pada waktu 20 sampai 35 jam kemampuan
menghambat bakteri cenderung menurun.
Kondisi ini dimungkinkan terjadi karena
senyawa antimikrob yang merupakan metabolit
sekunder telah di produksi pada jam ke 15 (tepat
pada akhir fase log) sehingga pada jam ke 20
sampai 35 bakteri telah memasuki fase stasioner
yang produksi senyawa antimikrobnya telah
menurun dan perbandingan jumlah selnya telah
konstan akibat metabolit sekunder yang
diproduksi (Gambar 5). Pada konsentrasi uji 5
dan 15 mg/mL zona hambat yang dihasilkan
lebih kecil dibandingkan dengan konsentrasi 20
mg/mL, sehingga dapat disimpulkan bahwa
konsentrasi hambat efektif adalah 20 mg/mL.
Hasil pengujian tersebut menunjukkan
bahwa waktu optimum produksi diperoleh pada
15 jam setalah inkubasi dengan konsentrasi 20
mg/mL. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian
yang telah dilakukan oleh peneliti sebelumnya
yang menunjukkan bahwa konsentrasi hambat
efektif untuk penghambatan bakteri S.
thypimurium terdapat pada konsentrasi 20
mg/mL dengan waktu inkubasi selama 18 jam
(Suarsana 2005).
pH dan Suhu Optimum Aktivitas
Antimikrob
Karakterisasi senyawa antimikrob dilakukan
dengan perlakuan pH dan suhu yang berbedabeda. Variasi pH yang digunakan adalah pH 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8. pH optimum yang diperoleh
akan digunakan
untuk menentukan suhu optimum produksi
Gambar 5 Kurva pertumbuhan bakteri
terhadap waktu
senyawa antimikrob. Variasi suhu yang
digunakan adalah 50, 60, 70, 80, 90, 100 °C.
Data pada Tabel 1 menunjukkan bahwa pada
pH 2 senyawa antimikrob menunjukkan zona
hambat terbesar yaitu 27 mm. Kontrol pH 2
yang digunakan juga menunjukkan zona hambat
sebesar
11
mm.
Walaupun
kinerja
penghambatan pertumbuhan bakteri tertinggi
terjadi pada pH 2, pH optimum untuk perlakuan
adalah pada pH 3. Hal ini disebabkan karena
zona hambat yang dihasilkan adalah murni dari
aktivitas senyawa antimikrob tanpa dipengaruhi
derajat keasaman yang tinggi dari pelarut yang
digunakan. Jika pH optimum yang dipakai
adalah pH 2, dikhawatirkan untuk produksi
da