Karakterisasi gen nifD bakteri metanotrof asal sawah

KARAKTERISASI GEN nifD BAKTERI METANOTROF ASAL SAWAH

RESTI RACHMAWATI

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

ABSTRAK
RESTI RACHMAWATI. Karakterisasi gen nifD Bakteri Metanotrof Asal Sawah. Dibimbing oleh
IMAN RUSMANA dan ALINA AKHDIYA.
Bakteri metanotrof adalah bakteri pengoksidasi CH4. Beberapa metanotrof mampu
memfiksasi nitrogen dengan menggunakan enzim nitrogenase. Enzim nitrogenase tersusun atas
dua komponen protein besi. Komponen I mengandung situs aktif untuk mereduksi nitrogen,
dikodekan oleh gen nifD dan nifK. Isolat metanotrof BGM 3 dan BGM 9 memiliki akumulasi
amonium yang tinggi pada media Nitrat Mineral Salt (NMS) tanpa nitrogen. Fragmen gen nifD
dari BGM 3 dan BGM 9 di amplifikasi dan disekuensing. Sekuen yang diperoleh dianalisis dengan
menggunakan perangkat bioinformatik seperti BLAST-N, BLAST-X, Expasy Translate Tools,
Conserved Domain (CDD) dan Scan PROSITE. Kontruksi filogenetik dibuat dengan menggukan

program MEGA 4. Analisis sekuen menunjukkan bahwa sekuen gen nifD dari BGM 3 dan BGM 9
mirip dengan gen nifD pada Xanthobacter autotropicus PY2. Nilai kemiripan dari sekuen gen
nifD tersebut cukup tinggi ( 92%-91% ). Gen nifD BGM 3 dan BGM 9 mengkodekan protein
FeMo yang didalamnya terdapat klaster 4Fe-4S dan 2Fe-2S. Gen nifD dari BGM 3, BGM 9
diduga dimiliki oleh nenek moyang yang sama dengan Xanthobacter autotropicus PY2 dan
Bradyhizobium japonicum USDA 110.
Kata kunci: Bakteri metanotrof, fiksasi nitrogen, nitrogenase, nifD

ABSTRACT
RESTI RACHMAWATI. Characterization nifD gene of Methanotrophic Bacteria from Ricefields.
Under supervision of IMAN RUSMANA and ALINA AKHDIYA.
Methanotrophic bacteria are methane oxidizing bacteria. Some methanotrophs able of fix
nitrogen using nitrogenase enzyme. Nitrogenase is composed of two multisubunit metallo protein.
Component I contains the active site to nitrogen reduction, encoded by the nifD and nifK genes.
Methanotrophic isolates of BGM 3 and BGM 9 had high ammonium accumulation cultured in
Nitrate Mineral Salts (NMS) free nitrogen medium. nifD gene fragmens from BGM 3 and BGM 9
were amplified and sequenced. Sequences analyzed using bioinformatics tools such as Blast-N,
Blast-X, Expasy Translate Tools, Conserved Domain (CDD) and Scan PROSITE. Phylogenetic
construction made using MEGA 4 software. Sequence analysis showed that the nifD sequences of
BGM 3 and BGM 9 most closely related to nifD fragmen of Xanthobacter autotropicus PY2. The

Identity values of nifD sequences was 92% and 91% respectively. nifD genes from these isolates
encode FeMo protein, which was 4Fe4S and 2Fe2S clusters. The nifD gene of BGM 3 and BGM 9
suspected to have same ancestor with the nifD gene of Xanthobacter autotropicus PY2 and
Bradyhizobium japonicum USDA 110.
Keyword: Methanotrophic bacteria, nitrogen fixation, nitrogenase, nifD

KARAKTERISASI GEN nifD BAKTERI METANOTROF ASAL SAWAH

RESTI RACHMAWATI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

Judul Skripsi :
Nama
:
NIM
:

Karakterisasi Gen nifD Bakteri Metanotrof Asal Sawah
Resti Rachmawati
G34062348

Menyetujui :

Pembimbing I,

Pembimbing II,

Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si
NIP 196507201991031002

Alina Akhdiya
NIP 196812082001122001

Mengetahui:
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor

(Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Sc)
NIP 196410021989031002

Tanggal Lulus :

PRAKATA
Alhamdulillahirobbil’alamin, puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberi
rahmat dan kemudahan dalam menyelesaikan karya ilmiah ini. Tema penelitian penulis yaitu tentang
kemampuan fiksasi nitrogen bakteri metanotrof, dengan judul Karakterisasi gen nifD Bakteri Metanotrof Asal
Sawah. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari sampai November 2010 di Laboratorium
Mikrobiologi Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Biologi Tanah Departemen
Tanah, Institut Pertanian Bogor.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si. dan Ibu Alina
Akhdiya, M.Si. selaku pembimbing atas saran dan bimbingannya dalam pelaksanaan penelitian dan
penyusunan karya ilmiah ini. Di samping itu, penulis sampaikan terima kasih dan syukur kepada keluarga atas
segala doa dan kasih sayangnya, kepada Yohan aripin dan teman-teman Biologi angkatan 43 khususnya yang
melakukan penelitian di laboratorium Mikrobiologi. Terima kasih penulis ucapkan kepada Bu Ratna, Mba Ari,
Ka Fina, Bang Jo, Dana, Tea, Vina, Rio dan Magda Serta pihak-pihak yang secara tidak langsung telah
membantu dalam pengumpulan data karya ilmiah ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, 23 Desember 2010

Resti Rachmawati

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor Jawa Barat pada tanggal 7 Juli 1988 dari ayahanda Ence Abdurahman
dan ibunda Siti Rogayah. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara. Tahun 2006 penulis lulus dari
SMU Kornita IPB dan lolos seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada
Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif sebagai Ketua Bidang Biosains Himpunan Mahasiswa
Biologi (Himabio) periode 2008-2009, dan asisten praktikum Mikrobiologi Dasar pada tahun 2009-2010,

asisten praktikum Biologi Cendawan dan Biologi Dasar pada tahun 2010. Selain itu, penulis menjadi
pengajar dibimbingan belajar biologi (B’expert) pada tahun 2008-2009, bimbingan belajar Katalis dan
Primagama pada tahun 2010-2011. Pada tahun yang sama, penulis mendapatkan juara 1 berkelompok dalam
kegiatan IPB Sosial Fair (ISF) untuk kategori Program Kreativitas Mahasiswa Pengabdian Masyarakat
(PKMM) dengan tema “Santripreneurship”. Penulis telah melaksanakan Praktik Kerja Lapang di Balai
Penelitian Tanah dari bulan Juli sampai Agustus 2009 dengan judul Seleksi Mikrob Termofilik Asal Lumpur
Lapindo Sebagai Pelarut Fosfat dan Penghasil Indole Acetic Acid (IAA).

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ............................................................................................................................ vii
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................................................... vii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................................... vii
PENDAHULUAN .............................................................................................................................. 1
Latar Belakang .......................................................................................................................... 1
Tujuan Penelitian....................................................................................................................... 1
Waktu dan Tempat ............................................................................................................................. 1
BAHAN DAN METODE .................................................................................................................. 1
Bahan dan Alat .......................................................................................................................... 1
Metode Penelitian ...................................................................................................................... 1

Pemurnian dan peremajaan isolat. .................................................................................... 1
Isolasi DNA, Amplifikasi Gen nifD, dan Visualisasi Amplikon ..................................... 1
Sekuensing DNA dan Analisis Bioinformatika ................................................................ 2
HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................................................... 2
Hasil......................... ................................................................................................................. 2
Isolasi DNA, Amplifikasi Gen nifD, dan Visualisasi Amplikon ...................................... 2
Sekuensing DNA dan Analisis Bioinformatika ................................................................ 2
Pembahasan ............................................................................................................................... 4
SIMPULAN ....................................................................................................................................... 5
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................................................ 6
LAMPIRAN ....................................................................................................................................... 7

DAFTAR TABEL
Halaman
1. Hasil analisis sekuen gen nifD dengan menggunakan program BLAST-N ........................ ............3
2. Hasil analisis sekuen gen nifD dengan menggunakan program BLAST-X .................................... 3
3. Analisis bioinformatik protein hasil translasi gen nifD BGM 3 dan BGM 9 dengan menggunakan
program SCAN PROSITE ............................................................................................................ 4

DAFTAR GAMBAR

Halaman
1. Amplifikasi gen nifD menghasilkan pita DNA berukuran ~1.9 kb . ............................................. 2
2. Filogenetik gen nifD bakteri metanotrof BGM 3 dan BGM 9 yang dibandingkan dengan gen
nifD dari beberapa spesies bakteri diazotrof menggunakan metode Neighbor Joining (NJ) dan
boostrop 100x ............................................................................................................................... 3
3. Analisis bioinformatik protein turunan sekuen gen nifD BGM 3 dan BGM 9 dengan
menggunakan program CDD (Conserved Domain) ...................................................................... 4
4. Struktur kuartener nitrogenase MoFe Alpa dengan menggunakan program Cn3D 4.1 ................ 5

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Sekuensing DNA ............................................................................................................................ 9
Urutan nukleotida hasil sekuen gen nifD BGM 3...................................................................... 9
Urutan nukleotida hasil sekuen gen nifD BGM9....................................................................... 9
Protein hasil translasi gen nifD BGM 3 dan BGM 9 ................................................................. 9
2. Hasil BLAST-N dan BLAST-X ................................................................................................... 10
Hasil BLAST-N sekuen gen nifD BGM 3 ............................................................................... 10
Hasil BLAST-N sekuen gen nifD BGM 9..................................................................................12

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Bakteri metanotrof adalah bakteri
gram
negatif,
bersifat
aerob
dan
menggunakan metan sebagai sumber karbon
penghasil energi (Hanson & Hanson 1996).
Bakteri metanotrof tipe II dan tipe X telah
diketahui memiliki kemampuan dalam
menambat nitrogen sedangkan hanya
beberapa bakteri metanotrof tipe I yang
dapat memfiksasi nitrogen (Auman et. al
2001). Kemampuan tersebut terkait dengan
keberadaan enzim nitrogenase (Dedysh et
al. 2004).
Enzim nitrogenase merupakan
kompleks enzim yang bertanggung jawab
dalam proses fiksasi ntrogen. Nitrogenase

terdiri atas dua komponen, yaitu komponen I
(dinitrogenase atau protein Fe-Mo) dan
komponen II (dinitrogenase reduktase atau
protein Fe). Komponen I merupakan
heterodimer dengan berat molekul 250 kDA
yang dikodekan oleh gen nifD dan nifK, dan
komponen II merupakan homodimer dengan
berat molekul 70kDA yang dikodekan oleh
gen nifH (Zehr et al. 1989).
Terdapat sekitar 20 gen nif yang
mengkodekan nitrogenase yaitu nifA , nifB,
nifZ, nifH, nifD, nifK, nifE, nifN, nifX, nifO,
nifU, nifS, nifV, nifW, nifT, nifY, nifE, nifM,
nifF, nifL (Lee et al. 2000) dan diatara 20
gen tersebut nifH dan nifD merupakan gen
terpenting
untuk
mengenali
adanya
nitrogenase karena mengkodekan sub unit

pembentuk nitrogenase. Gen struktural nifH,
D, dan K pada
dan
proteobakteria
terletak berdampingan dalam satu operon
sehingga membentuk operon nifHDK,
sedangkan diazotrof simbiotik yang tumbuh
lambat mempunyai gen nifH, D, dan K
yang terpisah membentuk operon nifH dan
nifDK (Choo et al. 2003)
Diantara
40
isolat
bakteri
metanotrof yang diisolasi dari sedimen
sawah di Bogor dan Sukabumi, tiga
diantaranya (BGM 1, BGM 3, dan BGM 9)
memiliki aktivitas oksidasi metan dan
fiksasi nitrogen yang tinggi (Hapsary 2008,
Sagala 2009). Isolat-isolat tersebut belum
dikarakterisasi gen pengkode enzim
nitrogenasenya.
Informasi tentang karakter enzim
nitrogenase
bakteri
metanotrof
asal
Indonesia masih sangat sedikit, sehingga
penelitian tersebut sangat diperlukan.
Informasi tersebut bermanfaat untuk

mendukung pemanfaatan bakteri tersebut
sebagai penambat nitrogen di lahan
pertanian.
Tujuan Penelitian
Penelitian
ini
bertujuan
mengkarakterisasi gen nifD pada isolat
bakteri metanotrof BGM 3 dan BGM 9
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai
bulan Februari 2010 sampai dengan bulan
November
2010
di
Laboratorium
Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA,
IPB.

BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan,
yaitu dua isolat metanotrof BGM 3 dan
BGM 9, medium Nitrate Mineral Salt
(NMS), Primer spesifik gen nifD dan
komponen PCR kit KAPA Hifi Polimerase,
1 kb Ladder (Promega).
Peralatan yang digunakan, yaitu
mesin PCR (Perkin Elmer Biosystem, USA),
Laminar Air Flow, otoklaf, sentrifuse,
elektroforesis mini-gel (BioRad Mini-Sub
Cell GT, CA, USA), UV Transluminator
(Hoefer
Scientific
Instruments,
San
Fransisco, USA), dan peralatan lainnya yang
biasanya digunakan di laboratorium
mikrobiologi
Metode Penelitian
Pemurnian dan peremajaan isolat.
Pemurnian dan peremajaan isolat
dilakukan dengan menggunakan metode
cawan gores pada medium NMS, kemudian
inkubasi dilakukan selama 14 hari pada suhu
ruang (Hanson 1998).
Isolasi DNA, Amplifikasi gen nifD,
dan Visualisasi Amplikon
Isolasi DNA genom dilakukan dengan
metode Lazo (Lazo et al. 1987). Amplifikasi
gen nifD menggunakan primer spesifik primer
spesifik untuk gen nifD yaitu nifHD-F
(CAGGAAATCTACATCGTCATGTC)
dengan nifD-R (TCCCANGARTGCATC
TGRCGGA) (Dedysh et al, 2004). Reaksi
PCR dengan menggunakan volume
campuran 25 µl. Komposisi reaksi PCR
yang digunakan adalah sebagai berikut : 5x
KAPAHifi GC Buffer (konsentrasi akhir 1x)

sebanyak 5,0 µL, 10mM dNTP mix
(konsentrasi akhir 0,3mM) 0,75µl, 10µM
primer (konsentrasi akhir 0,3µM) 0,75µl,
Template DNA (100ng) 0,5µl, dan 0,5µl.
KAPAHifi DNA Polymerase (1U/µl).
Sekuensing DNA dan Analisis
Bioinformatika
Pengurutan DNA hasil amplifikasi
dilakukan dengan memanfaatkan jasa
perusahaan sekuensing 1st Base di Singapura.
Sekuen yang diperoleh dijajarkan dengan data
pada GenBank menggunakan program BlastN, Blast-X dari situs NCBI (National Center
for Biotechnology Information) melalui
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
untuk
mengetahui tingkat kemiripan gen nifD dari
isolat yang dianalisa. Penurunan sekuen DNA
menjadi protein dilakukan menggunakan
Expasy translate tools. Konstruksi pohon
filogenetik dilakukan dengan menggunakan
program MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007),
metode Neighbor Joining (NJ) dengan
bootstrap 100x, sedangkan analisis protein
dilakukan menggunakan Conserved Domain
(CDD) dan SCAN PROSITE. Visualisasi
struktur protein menggunakan program Cn3D
4.1.

HASIL DAN PEMBAHASAN

M

1

2
~1,9 kb

Gambar 1 Amplifikasi gen nifD
menghasilkan pita DNA berukuran
~1.9 kb (Keterangan : M= 1 kb
ladder, Sumur 1=BGM 3, Sumur 2
=BGM 9).

Hasil
Isolasi, Amplifikasi Gen nifD,
dan Visualisasi Amplikon
Amplifikasi gen nifD dari kedua
isolat Metanotrof dengan menggunakan
primer nifHD-F dan nifD-R dapat dilakukan.
Hasil visualisasi amplikon pada gel
elekroforesis yang diamati di atas UV
transluminator memperlihatkan adanya pita
DNA berukuran ~1.9 kb (Gambar 1).
Sekuensing DNA dan Analisis
Bioinformatika
Produk amplifikasi gen nifD
disekuen
untuk
mengetahui
urutan
nukleotidanya. Sekuen yang diperoleh
(Lampiran 1) dianalisis kemiripannya
dengan data di GenBank menggunakan
program BLAST-N dan Blast-X (Tabel 1,
Tabel 2, dan Lampiran 2). Berdasarkan
analisis
program
tersebut
diketahui
homologi nitrogenase dari isolat yang diuji.

Tabel 1 Hasil analisis sekuen gen nifD
dengan menggunakan program
BLAST-N
Isolat

BGM 3

BGM 9

Sekuen
nitrogenase
bakteri yang
homolog
Nitrogenase
molybdenum-iron
protein alpha chain
(nifD) pada
Xanthobacter
autotrophicus Py2
Nitrogenase
molybdenum-iron
protein alpha chain
(nifD) pada
Xanthobacter
autotrophicus Py2

%identitas

No.
akses

92%

CP000
781.1

91%

CP000
781.1

Tabel 2

Isolat

BGM 3

BGM 9

Hasil analisis sekuen gen nifD
dengan menggunakan program
BLAST-X

Sekuen
nitrogenase
bakteri yang
homolog
Nitrogenase
molybdenum-iron
protein alpha chain
(nifD) pada
Xanthobacter
autotrophicus Py2
Nitrogenase
molybdenum-iron
protein alpha chain
(nifD) pada
Xanthobacter
autotrophicus Py2

%identitas

No.
akses

72%

YP_00
14150
05.1

71%

YP_00
14150
05.1

Analisis
sekuen
gen
nifD
menunjukkan bahwa BGM 3 dan BGM 9
memiliki gen nifD yang homolog dengan
gen nifD Xanthobacter autotrophicus Py2
(Lampiran
2).
Berdasarkan
analisis
filogenetik, gen nifD BGM 3 dan BGM 9
berkerabat dekat dengan Xanthobacter
autotrophicus Py2 dan Bradyhizobium
japonicum USDA 110 (Gambar 2). Gen
nifD BGM 3 dan 9 termasuk superfamili
protein Oxidoreductase nitrogenase dan sub
famili Nitrogenase MoFe (Gambar 3).
Pada Nitrogenase MoFe alpa
BGM3 dan BGM9 memiliki gugus 4Fe-4S
ferredoxin-type iron-sulfur binding region
(4Fe4S_FER_1) dan gugus 2 Fe-2S
ferredoxin-type iron-sulfur binding region
(Tabel 3).

Gambar 2 Filogenetik gen nifD metanotrof BGM 3 dan BGM 9 yang dibandingkan dengan gen
nifD beberapa spesies bakteri diazotrof menggunakan metode Neighbor Joining (NJ) dan
boostrop 100x

Gambar 3 Analisis bioinformatik protein turunan sekuen gen nifD BGM 3 dan BGM 9 dengan menggunakan program CDD (Conserved Domain)

Tabel 3 Analisis bioinformatik protein hasil translasi gen nifD BGM 3 dan BGM 9
dengan menggunakan program SCAN PROSITE
Klaster pada
domain
4Fe4S_FER_1
2FE2S_FER_1

Motif sekuen
CgGCGgCGtGCG
CTGGGCGGC,
CTGATCTAC,
CTGGTCGTC,
CTGAACGTC,
CTGGTCGGC

Urutan sekuen
62-73
75-83, 159-167, 12361244,
1339-1347,
1792-1800

No. Akses
PS00198
PS00197

4

F
D

C
B

E

A

Gambar 4 Struktur kuartener nitrogenase Fe-Mo Alpa dengan menggunakan program Cn3D 4.1 (Keterangan : Warna kuning = Interaksi Fe-Mo sub unit alpa and
beta, A = dimer protein Fe-Mo, B = residu FeMoCo terikat, C = residu kluster P sub unit alpa terikat , D = Fe-Mo sub unit alpa/ kontak protein Fe, E = helix
alpa, dan F = lembar beta ).

5

Pembahasan
Amplifikasi gen nifD dengan
primer nifHD-F dan nifD-R menghasilkan
amplikon berukuran 1,9kb untuk BGM 3
dan BGM 9 (Gambar 1). Primer tersebut
didesain dari sekuen nifH ke 436 dan sekuen
nifD Bradyrhzobium japonicum USDA 110
sehingga menghasilkan amplikon rata-rata
sebesar 1,9 kb. Amplikon ini didapat jika
nifD, nifH, dan nifK terletak dalam satu
operon (Dedysh et al. 2004). Transkripsi
enzim nitrogenase pada
dan
proteobakteria dikodekan oleh operon
nifHDK.
Sedangkan
pada
diazotrof
simbiotik yang tumbuh lambat enzim ini
dikodekan oleh dua operon yang berbeda
yaitu operon nifH dan nifDK (Choo et al.
2003).
Analisis Filogenetik menunjukkan
bahwa BGM 3, BGM 9 dan Xanthobacter
autotrophicus py2 dan Bradyrhizobium
japonicum USDA 110 berkerabat dekat bila
dilihat dari perkembangan gen nifD nya.
(Gambar 2). BGM 3, BGM 9 dan
Xanthobacter autotrophicus Py2 merupakan
diazotrof yang hidup bebas sedangkan
Bradyrhzobium japonicum USDA 110
merupakan diazotrof yang bersimbiosis dan
memiliki operon nifH yang terpisah dari
nifDK. Berdasarkan analisis gen 16S- rRNA
isolat BGM 3 memiliki kemiripan terdekat
dengan
Methylocystisparvus strain 57
(69%), sedangkan BGM 9 memiliki
kemiripan
dengan
Methylococcus
capsulatus strain texas (83% dan 85%)
(Astuti 2009). Nilai kemiripan sekuen nifD
BGM 3 dan BGM 9 lebih tinggi dari analsis
16S-rRNA tersebut. Sehingga kemungkinan
BGM 3 dan BGM 9 memiliki nenek
moyang bakteri pemfiksasi nitrogen yang
sama dengan Xanthobacter autotrophicus
py2 dan Bradyrhizobium japonicum USDA
110.
Penelitian yang dilakukan Dedysh
et al. (2004) juga menunjukkan bahwa nilai
kemiripan (identity values) dari sekuen nifH
dan nifD pada Methylocapsa acidiphila B2
dan Beijerinckia lebih tinggi (98.5 % dan
96.6 %) dibandingkan dengan hubungan
kekerabatannya berdasarkan 16S rRNA
sehingga kemungkinan dua bakteri tersebut
berasal dari nenek moyang bakteri
pemfiksasi nitrogen yang sama.
Nitrogenase
oxidoreduktase
merupakan sekelompok famili protein yang
mengkatalisis reduksi nitrogen menjadi
amonium dengan menggunakan ATP.

Selain ATP, proses tersebut membutuhkan
feredoksin tereduksi sebagai donor elektron,
sitokrom sebagai protein pembawa elektron,
dan koenzim. Proses fiksasi satu mol
nitrogen ini memerlukan energi sel
sebanyak 16 ATP.
Oxidoreduktase memiliki sub unit
alpa dan sub unit beta dari komponen I yang
secara genetik terbagi atas nitrogenase yang
tergantung pada atom molibdenum (Monitrogenase), nitrogenase yang tergantung
pada atom vanadium (V-nitrogenase), dan
nitrogenase
besi
(Fe-nitrogenase).
Nitrogenase alternatif vanadium dan
nitrogenase yang hanya mengandung besi
saja masing-masing dikodekan oleh gen vnf
dan anf dan mempunyai struktur heksamer
yang dikodekan oleh operon vnfDGK dan
anfDGK. (Caton 2007). Selain itu terdapat
beberapa sub unit Protochlorophyllide
(Pchlide) reductase and chlorophyllide
(chlide) reductase (Gambar 3).
Nitrogenase Fe-Mo terdiri dari dua
komponen protein terlarut yaitu komponen I
atau alpa berupa protein Fe-Mo dan
komponen II atau beta yaitu protein Fe
(Gambar 3). Fe-Mo alpa mempunyai berat
molekul antara 220-250 kD. Sub unit ini
berbentuk tetramer dengan dua metallokomplek heterodimer yang disebut klaster
fosfat (P) dan kofaktor besi molibdenum
(FeMo- co). Satu subunit memiliki sepasang
α-β dan sepasang klaster P dan molekul
FeMo-co. Molekul FeMo-co terdiri dari satu
gugus homositrat dan MoFe3-S3 (Caton
2007). Selain klaster P pada Nitrogenase
MoFe alpa BGM3 dan BGM9 ditemukan
juga klaster 4Fe-4S ferredoxin-type ironsulfur binding region (4Fe4S_FER_1) dan
klaster 2 Fe-2S ferredoxin-type iron-sulfur
binding region (Gambar 4). Klaster tersebut
dimiliki oleh protein Fe. Protein Fe
memiliki dua subunit α identik yang
mempunyai gugus 4Fe-4S ditengah. Protein
tersebut juga memiliki dua situs pengikatan
Mg-ATP yang terletak di setiap subunit,
dimana 4Fe-4S adalah donor elektron untuk
komplek Fe-Mo. Oleh karena itu, protein
ini sangat esensial untuk proses fiksasi
nitrogen (Caton 2007). 2Fe2S feredoksin
berperan dalam proses katabolisme NAD+
pada
kondisi
mikroaerofilik dengan
mereduksi 6-hydroxynicotinate menjadi
1,4,5,6-tetrahydroxy-6-oxonicotinate.
Metabolisme NAD+ dilakukan untuk
memenuhi kebutuhan akan nitrogen, karbon,
dan energi sel (Alhapel 2006) (Tabel 3).

SIMPULAN
Amplifikasi gen nifD BGM 3 dan
BGM 9 dengan menggunakan primer
nifHD-F dan nifD-R
menghasilkan
amplikon berukuran 1,9kb. Gen nifD, nifH
dan gen nifK pada isolat bakteri metanotrof
BGM 3 dan BGM 9 terletak dalam satu
operon. Sekuen gen nifD BGM 3 dan BGM
9 memiliki kemiripan terdekat dengan
sekuen
gen
nifD
Xanthobacter
autotrophicus Py2.

DAFTAR PUSTAKA
Alhapel A et al. 2006. Molecular and
functional analysis of nicotinate
catabolism in Eubacterium barkeri.
Proc Natl Acad Sci 103: 1234112346.
Astuti DD. 2009. Karakterisasi fisiologi dan
identifikasi molekuler isolat-isolat
bakteri
metanotrof asal sawah
wilayah Bogor dan Sukabumi.
[Skripsi]. Bogor: Departemen
Biologi, Institut Pertanian Bogor.
Auman AJ, Speake CC, Lidstrom ME. 2001.
nifH sequences and nitrogen
fixation in type I and type II
methanotrophs.
Appl
Environ
Microbiol 67(9): 4009-4016.
Caton IR. 2007. Abundance of nifH genes in
urban, agricultural, and pristine
prairie streams exposed to different
levels of nitrogen loading [thesis].
Wichita State University.
Choo QC, Samian MR, Najimudin N. 2003.
Phylogeny and characterization of
three nifH-homologous genes from
Paenibacillus azotofixans. Appl
Environ Microbiol 69(6): 36583662.
Dedysh SN, Ricke P, Liesack W. 2004.
NifH and NifD phylogenies: an
evolutionary basis
for
understanding nitrogen fixation
capabilities of methanotrophic
bacteria. Microbiol 150; 1301–
1313.
Hanson

RS.
1998.
Ecology
of
methylotrophic bacteria. Di dalam:

Burlage RS, Atlas R, Stahl, Geesey
G,
Dayler
G,
editor.
Techniques in microbial Ecology.
Oxford: Oxford University Press.
137162.
Hanson R, Hanson TE. 1996. Metanotrophic
Bacteria. J Microbiol Reviews 60 :
439-471
Hapsary W. 2008. Isolasi dan karakterisasi
bakteri metanotrof asal sawah di
Bogor dan Sukabumi [Skripsi].
Bogor:
Departemen
Biologi, Institut Pertanian Bogor.
Lazo GR, Roffey R, Gabriel DW. 1987.
Conservation of plasmid DNA
sequences
and
pathovar
identification
of
strain
Xanthomonas
campestris.
Pytopathology 77: 1461-1467.
Lee S, Reth A, Meletzus D, Sevilla M,
Kennedy C. 2000. Characterization
of major cluster of nif, fix, and
associated genes in sugarcane
endophyte,
Acetobacter
diazotrophicus.
J
Bacteriol.
182(24): 7088-7091.
Sagala BT. 2009. Seleksi dan uji aktivitas
fiksasi nitrogen (N2) bakteri
metanotrof asal sawah pada
konsentrasi oksigen (O2) berbeda
[skripsi]. Bogor : Departemen
Biologi, Institut Pertanian Bogor.
Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S.
2007.
MEGA4:
Molecular
evolutionary genetics analysis
(MEGA) software version 4.0. Mol
Biol Evol 24:1596–1599.
Zehr JP, McReynolds LA. 1989. Use of
degenerate oligonucleotides for
amplification
Trichodesmium
thiebauti. Appl Environ Microbiol.
55; 2522-2526.

LAMPIRAN

Lampiran 1. Hasil sekuen gen nifD
A. Urutan nukleotida hasil sekuen gen nifD BGM 3
CGCGAAGAGGCATGTATGCGGCCAACAACATCTCCAAGGGCATCCTGAAGTATGCGAACTCCGGCGGCGTG
CGCCTGGGCGGCCTGGTGTGCAACGAGCGCCAGACCGACAAGGAGTACGAGCTGGCGGAGTCGCTGGCGAA
GAAGCTCGGCACGCAGCTGATCTACTTCGTGCCGCGCGACAACATCGTGCAGCACGCCGAACTGCGCCGCAT
GACGGTGATCGAGTATGCGCCCGATTCCGCGCAGGCCCAGCACTACCGGAACCTTGCGACCAAGGTGCACGG
CAACTCGGGCAACGGCATCATCCCGACCCCGATCACCATGGACGAGCTCGAAGACCTGCTCATGGAGCACGG
CATCATGAAGGCCGTGGACGAGAGCATCGTCGGCAAGACCGCCGCAGAGCTGGCCGTCGGCTGAAGCCATC
GCGTCGATTGACCTGGGGCCGGCCTCAATTGCGGGGCCGGCCTGCCGAACGGCAACCCAACGAGAGCGAGA
TTGCGAAATGAGCTTGGCCCAACCGCAAAACGTTGCTGAAATCAAGGCGCGGAACAAGGAACTCATCGCGG
AAGTCCTCAAGGTTTATCCCGAGAAGACCGCGAAGCGCCGCGCGAAGCACCTCAACGTCCATGAGTCCGGCA
AGTCCGACTGCGGCGTGAAGTCGAACATCAAGTCCATCCCGGGCGTGATGACGATCCGCGGCTGCGCCTACG
CCGGTTCCAAGGGCGTGGTGTGGGGTCCGATCAAGGACATGATCCACATCTCCCACGGCCCCGTCGGCTGCG
GCCAGTACAGCTGGGCCGCCCGCCGCAACTACTACATGGGCAGGACCGGAATGGACACCTTGGTGAGGATG
CAGTTCACGTCCGACTTCCAGGAAAAGGACATCGTTTTCGGCGGGGACAAGAAGCTCGCCAAGATCATGGAC
GAAATCCAGGAGCTCTTCCCGCTCAACAACGGCATCACTGTCCAGTCCGAGTGTCCGATCGGCCTCATCGGC
GACGACATCGAGGCCGTGTCCAAGTCGAAGTCCAAGGAATACGACGGCAAGACCATCGTTCCGGTCCGCTGC
GAGGGCTTCCGCGGCGTGTCGCAGTCCCTCGGCCACCACATCGCCAACGACGCGGTGCGGGACTGGGTGTTC
GACAAGCTGGACCCGAACAAGGCTCCGCCCTTCGAGCCCTCGCCGTATGACGTCGCCATCATCGGCGACTAC
AACATCGGCGGCGATGCCTGGTCGTCCCGTATCCTCCTCGAGGAGATGGGCCTGCGCGTCATCGCCCAGTGG
TCGGGCGACGGCTCGCTCGCCGAGCTCGAGAACACCCCGCGGGCGAAGCTGAACGTCCTGCACTGCTACCGC
TCCATGAACTACATCTCCCGCCACATGGAAGAGAAGTTCGGGATCCCGTGGTGCGAGTACAACTTCTTCGGT
CCCTCCAAGATCGCGGAGTCGCTGCGCAAGATCGCCGCTTACTTCGACGACAAGATCAAGGAAGGCGCCGA
GCGCGTCATCGCCAAGTACGCGCCCCTCATGGACGCGGTGATCGCCAAGTATCGTCCGCGCCTCGAGGGCAA
GACGGTCATGCTGTACGTGGGCGGCCTGCGTCCCCGTCACGTGATCGGCGCGTACGAAGATCTCGGCATGGA
AGTGGTGGGCACGGGTTACGAGTTCGCCCACAACGACGACTATCAGCGCACCGCCCAGCACTACGTCAAGG
ATGGCACGCTCATCTATGACGACGTGACCGGCTACGAGTTCGAGAAGTTCGTCGAGAAGGTCCAGCCGGATC
TGGTCGGCTCGGGCATCAAGGAAAAGTACGTCTCCAGAAGATGCGCT

B. Urutan nukleotida hasil sekuen gen nifD BGM9
CCGCGAAGAGGCATGTTGCGGCCAACAACATCTCCAAGGGCATCCTGAAGTATGCGAACTCCGGCGGCGTG
CGCCTGGGCGGCCTGGTGTGCAACGAGCGCCAGACCGACAAGGAGTACGAGCTGGCGGAGTCGCTGGCGA
AGAAGCTCGGCACGCAGCTGATCTACTTCGTGCCGCGCGACAACATCGTGCAGCACGCCGAACTGCGCCGC
ATGACGGTGATCGAGTATGCGCCCGATTCCGCGCAGGCCCAGCACTACCGGAACCTTGCGACCAAGGTGCA
CGGCAACTCGGGCAACGGCATCATCCCGACCCCGATCACCATGGACGAGCTCGAAGACCTGCTCATGGAGC
AGGCATCATGAAGGCCGTGGACGAGAGCATCGTCGGCAAGACCGCCGCAGAGCTGGCCGTCGGCTGAAGC
CATCGCGTCGATTGACCTGGGGCCGGCCTCAATTGCGGGGCCGGCCTGCCGAACGGCAACCCAACGAGAGC
GAGATTGCGAAATGAGCTTGGCCCAACCGCAAAACGTTGCTGAAATCAAGGCGCGGAACAAGGAACTCAT
CGCGGAAGTCCTCAAGGTTTATCCCGAGAAGACCGCGAAGCGCCGCGCGAAGCACCTCAACGTCCATGAGT
CCGGCAAGTCCGACTGCGGCGTGAAGTCGAACATCAAGTCCATCCCGGGCGTGATGACGATCCGCGGCTGC
GCCTACGCCGGTTCCAAGGGCGTGGTGTGGGGTCCAATCAAGGACATGATCCACATCTCCCACAAATTTTCC
CAAGGGCCCCGTTGGGTGGGGCCAGTAAAGGTGGGCCGCCCGCCGGAAAATTATACATTGGCACGACCGG
CATCGACCCCTTCGGGACGATGCAGTTCACGTCCGATTTCCAGGAAAAGGACATCGTTTTCGGCGGCGACA
AGAAGCTCGCCAAGATCATGGACGAAATCCAGGAGCTCTTCCCGCTCAACAACGGCATCACTGTCCAGTCC
GAGTGCCCGATCGGCCTCATCGGCGACGACATCGAGGCCGTGTCCAAGTCGAAGTCCAAGGAATACGACGG
CAAGACCATCGTTCCGGTCCGCTGCGAGGGCTTCCGCGGCGTGTCGCAGTCCCTCGGCCACCACATCGCCA
ACGACGCGGTGCGGGACTGGGTGTTCGACAAGCTGGACCCGAACAAGGCTCCGCCCTTCGAGCCCTCGCCG
TATGACGTCGCCATCATCGGCGACTACAACATCGGCGGCGATGCCTGGTCGTCCCGTATCCTCCTCGAGGAG
ATGGGCCTGCGCGTCATCGCCCAGTGGTCGGGCGACGGCTCGCTCGCCGAGCTCGAGAACACCCCGCGGGC
GAAGCTGAACGTCCTGCACTGCTACCGCTCCATGAACTACATCTCCCGCCACATGGAAGAGAAGTTCGGGA
TCCCGTGGTGCGAGTACAACTTCTTCGGTCCCTCCAAGATCGCGGAGTCGCTGCGCAAGATCGCCGCTTACT
TCGACGACAAGATCAAGGAAGGCGCCGAGCGCGTCATCGCCAAGTACGCGCCCCTCATGGACGCGGTGATC
GCCAAGTATCGTCCGCGCCTCGAGGGCAAGACGGTCATGCTGTACGTGGGCGGCCTGCGTCCCCGTCACGT
GATCGGCGCGTACGAAGATCTCGGCATGGAAGTGGTGGGCACGGGTTACGAGTTCGCCCACAACGACGACT
ATCAGCGCACCGCCCAGCACTACGTCAAGGATGGCACGCTCATCTATGACGACGTGACCGGCTACGAGTTC
GAGAAGTTCGTCGAGAAGGTCCAGCCGGACCTGGTCGGCTCGGGCTCAAGGAAAAGTACTCTCCAGAAGAT
GCGGGCC

C. Protein hasil translasi gen nifD BGM 3 dan BGM 9
>5’3’ Frame 2 (BGM3)
XREEACMRPTTSPRAS*SMRTPAACAWAAWCATSARPTRSTSWRSRWRRSSARS*STSCRATTSCSTPNCAA*R*S
SMRPIPRRPSTTGTLRPRCTATRATASSRPRSPWTSSKTCSWSTAS*RPWTRASSARPPQSWPSAEAIASIDLGPASI
AGPACRTATQRERDCEMSLAQPQNVAEIKARNKELIAEVLKVYPEKTAKRRAKHLNVHESGKSDCGVKSNIKSIP
GVMTIRGCAYAGSKGVVWGPIKDMIHISHGPVGCGQYSWAARRNYYMGRTGMDTLVRMQFTSDFQEKDIVFGG

DKKLAKIMDEIQELFPLNNGITVQSECPIGLIGDDIEAVSKSKSKEYDGKTIVPVRCEGFRGVSQSLGHHIANDAVR
DWVFDKLDPNKAPPFEPSPYDVAIIGDYNIGGDAWSSRILLEEMGLRVIAQWSGDGSLAELENTPRAKLNVLHCY
RSMNYISRHMEEKFGIPWCEYNFFGPSKIAESLRKIAAYFDDKIKEGAERVIAKYAPLMDAVIAKYRPRLEGKTVM
LYVGGLRPRHVIGAYEDLGMEVVGTGYEFAHNDDYQRTAQHYVKDGTLIYDDVTGYEFEKFVEKVQPDLVGSG
IKEKYVSRRCA

>5’3’ Frame 3 (BGM 9)
REEACCGQQHLQGHPEVCELRRRAPGRPGVQRAPDRQGVRAGGVAGEEARHAADLLRAARQHRAARRTAPHD
GDRVCARFRAGPALPEPCDQGARQLGQRHHPDPDHHGRARRPAHGAGMKAVDESIVGKTAAELAVG*SHRVD*
PGAGLNCGAGLPNGNPTRARLRNELGPTAKRC*NQGAEQGTHRGSPQGLSREDREAPREAPQRP*VRQVRLRREV
EHQVHPGRDDDPRLRLRRFQGRGVGSNQGHDPHLPQIFPRAPLGGASKGGPPAGKLYIGTTGIDPFGTMQFTSDFQ
EKDIVFGGDKKLAKIMDEIQELFPLNNGITVQSECPIGLIGDDIEAVSKSKSKEYDGKTIVPVRCEGFRGVSQSLGH
HIANDAVRDWVFDKLDPNKAPPFEPSPYDVAIIGDYNIGGDAWSSRILLEEMGLRVIAQWSGDGSLAELENTPRA
KLNVLHCYRSMNYISRHMEEKFGIPWCEYNFFGPSKIAESLRKIAAYFDDKIKEGAERVIAKYAPLMDAVIAKYRP
RLEGKTVMLYVGGLRPRHVIGAYEDLGMEVVGTGYEFAHNDDYQRTAQHYVKDGTLIYDDVTGYEFEKFVEKV
QPDLVGSGSRKSTLQKMRA

Keterangan : A=alanin B=aspartat/asparagin C=cystine D=aspartat E=glutamat F=Fenilalanin G=glysin
H=histidin I=isoleusin M=metionin N=asparagin P=prolin Q=glutamin R=arginin S=serin T=threonine
V=valin W=tryptophan Y=tyrosin Z=glutamat X=any *=kodon stop

Lampiran 2. Hasil BLAST-N
A. Hasil BLAST-N sekuen gen nifD BGM3
gb|CP000781.1|
Xanthobacter autotrophicus Py2, complete genome
Features in this part of subject sequence:
nitrogenase iron protein
nitrogenase molybdenum-iron protein alpha chain
Score = 2529 bits (1369), Expect = 0.0
Identities = 1688/1838 (92%), Gaps = 37/1838 (2%)

Query

11

Sbjct

96890

Query

71

Sbjct

96950

Query

130

Sbjct

97009

Query

188

Sbjct

97067

Query

248

Sbjct

97127

Query

308

Sbjct

97187

Query

368

Sbjct

97247

Query

427

Sbjct

97302

Query

485

Sbjct

97350

Query

543

CATGTATGCGGCCAACAACATCTCCAAGGGCATCCTGAAGTATGCGAACTCCGGCGGCGT
||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| ||||||||||||||
CATGTATGCGGCCAACAACATCTCCAAGGGCATTCTGAAGTATGCCAACTCCGGCGGCGT

70

GCGCCTGGGCGGCCTGGTGTGCAACGAGCGCCAGACCGACAAGGAG-TACGAGCTGGCGG
|||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||| | |||||||| |
GCGCCTGGGCGGGCTGGTGTGCAACGAGCGCCAGACCGACAAGGAGCT-GGAGCTGGCCG

129

AG-TCGCTGGCGAAGAAGCTCGGCA-CGCAGCTGATCTACTTCGTGCCGCGCGACAACAT
|| | ||||| ||||||||||||| || |||||||||||||||||||||||||||||||
AGAAC-CTGGCCAAGAAGCTCGGCACCG-AGCTGATCTACTTCGTGCCGCGCGACAACAT

187

CGTGCAGCACGCCGAACTGCGCCGCATGACGGTGATCGAGTATGCGCCCGATTCCGCGCA
||||||||||||||| |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| | ||
CGTGCAGCACGCCGAGCTGCGCCGCATGACCGTGATCGAGTATGCGCCCGATTCGGAACA

247

GGCCCAGCACTACCGGAACCTTGCGACCAAGGTGCACGGCAACTCGGGCAACGGCATCAT
|||||||||||||||||||||||| |||||||| |||| |||| |||||||||||||||
GGCCCAGCACTACCGGAACCTTGCCACCAAGGTTCACGCCAACAAGGGCAACGGCATCAT

307

CCCGACCCCGATCACCATGGACGAGCTCGAAGACCTGCTCATGGAGCACGGCATCATGAA
||||||||| ||||| |||||||||||||| ||| |||| ||||||||||||||||||||
CCCGACCCCCATCACGATGGACGAGCTCGAGGACATGCTGATGGAGCACGGCATCATGAA

367

GGCCGTGGACGAGAG-CATCGTCGGCAAGACCGCCGCAGAGCTGGCCGTCGGCTGAAGCC
|||||| |||||||| || ||||||||||||||||| ||||| ||| | ||| || |
GGCCGTCGACGAGAGCCA-GGTCGGCAAGACCGCCGCCGAGCTCACCG-C--CTG-AGGC

426

ATCG-CGTCGATTGACCTGGGGCCGGCCTCAATTGCGGGGCCGGCCTGCCGAAC-GGCAA
| | || | | | | | |||||||| ||||||||||| |||||| | | | ||| |
-T-GACG-C-A--G--C-GAGGCCGGCCCCAATTGCGGGGTCGGCCT-TC-ATCTGGC-A

484

CCC--AACGAGAGCGAGATTGCGAAATGAGCTTGGCCCAACCGCAAAACGTTGCTGAAAT
||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||
CCCAAAACGAGAGCGAGATTGCGAAATGAGCTTGGCCCAACCGCAAAGCGTTGCTGAAAT

542

CAAGGCGCGGAACAAGGAACTCATCGCGGAAGTCCTCAAGGTTTATCCCGAGAAGACCGC
||||||||| ||||| ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||

602

96949

97008

97066

97126

97186

97246

97301

97349

97409

Sbjct

97410

CAAGGCGCGTAACAAAGAACTCATCGCGGAAGTTCTCAAGGTTTATCCCGAGAAGACCGC

97469

Query

603

662

Sbjct

97470

GAAGCGCCGCGCGAAGCACCTCAACGTCCATGAGTCCGGCAAGTCCGACTGCGGCGTGAA
|||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| |||||||||||
GAAGCGCCGCGCGAAGCACCTCAACGTCCACGAGTCCGGCAAGTCCGATTGCGGCGTGAA

Query

663

722

Sbjct

97530

GTCGAACATCAAGTCCATCCCGGGCGTGATGACGATCCGCGGCTGCGCCTACGCCGGTTC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || ||||||||
GTCGAACATCAAGTCCATCCCGGGCGTGATGACGATCCGCGGCTGCGCGTATGCCGGTTC

Query

723

782

Sbjct

97590

CAAGGGCGTGGTGTGGGGTCCGATCAAGGACATGATCCACATCTCCCACGGCCCCGTCGG
||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||| || ||
CAAGGGCGTGGTGTGGGGTCCCATCAAGGACATGATCCACATCTCCCACGGCCCGGTGGG

Query

783

842

Sbjct

97650

CTGCGGCCAGTACAGCTGGGCCGCCCGCCGCAACTACTACATGGGCAGGACCGGAATGGA
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||| ||| || || ||
CTGCGGCCAGTACAGCTGGGCCGCCCGCCGCAACTACTACATCGGCACGACGGGCATCGA

Query

843

902

Sbjct

97710

CACCTTGGTGAGGATGCAGTTCACGTCCGACTTCCAGGAAAAGGACATCGTTTTCGGCGG
|||||| |||| ||||||||||| || ||||||||||||||||||||||| ||||||||
CACCTTCGTGACCATGCAGTTCACCTCGGACTTCCAGGAAAAGGACATCGTCTTCGGCGG

Query

903

962

Sbjct

97770

GGACAAGAAGCTCGCCAAGATCATGGACGAAATCCAGGAGCTCTTCCCGCTCAACAACGG
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || |||||||| ||||||||
CGACAAGAAGCTCGCCAAGATCATGGACGAAATCCAGGACCTGTTCCCGCTGAACAACGG

Query

963

1022

Sbjct

97830

CATCACTGTCCAGTCCGAGTGTCCGATCGGCCTCATCGGCGACGACATCGAGGCCGTGTC
|||||| |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CATCACCGTCCAGTCCGAGTGCCCGATCGGCCTCATCGGCGACGACATCGAGGCCGTGTC

Query

1023

1082

Sbjct

97890

CAAGTCGAAGTCCAAGGAATACGACGGCAAGACCATCGTTCCGGTCCGCTGCGAGGGCTT
|||| |||||||||||||||||||| |||||||||||| ||||||||||||||||||||
CAAGGCGAAGTCCAAGGAATACGACAACAAGACCATCGTGCCGGTCCGCTGCGAGGGCTT

Query

1083

1142

Sbjct

97950

CCGCGGCGTGTCGCAGTCCCTCGGCCACCACATCGCCAACGACGCGGTGCGGGACTGGGT
|||||||||||| ||||| |||||||| |||||||||||||| ||| | |||||||||||
CCGCGGCGTGTCCCAGTCGCTCGGCCATCACATCGCCAACGATGCGATCCGGGACTGGGT

Query

1143

1201

Sbjct

98010

GTTCGACAAGCTGGACCCGAACAAGGCTCCGCC-CTTCGAGCCCTCGCCGTATGACGTCG
|||||||||| ||||||||||
||| || || ||||||||| || |||||||||||||
GTTCGACAAGATGGACCCGAATGCGGC-CCCCCGCTTCGAGCCGTCCCCGTATGACGTCG

Query

1202

1261

Sbjct

98069

CCATCATCGGCGACTACAACATCGGCGGCGATGCCTGGTCGTCCCGTATCCTCCTCGAGG
||||||||||||||||||||||||| ||||| |||||||| || || ||||| |||||||
CCATCATCGGCGACTACAACATCGGTGGCGACGCCTGGTCTTCGCGCATCCTGCTCGAGG

Query

1262

1321

Sbjct

98129

AGATGGGCCTGCGCGTCATCGCCCAGTGGTCGGGCGACGGCTCGCTCGCCGAGCTCGAGA
| |||||||||||||| ||||| |||||||| |||||||||||||| ||||||||||||
AAATGGGCCTGCGCGTGATCGCACAGTGGTCCGGCGACGGCTCGCTTGCCGAGCTCGAG-

Query

1322

1380

Sbjct

98188

AC-ACCCCGCGGGCGAAGCTGAACGTCCTGCACTGCTACCGCTCCATGAACTACATCTCC
| || ||| |||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||
GCGACTCCGAAGGCGAAGCTGAACGTCCTGCACTGCTACCGGTCCATGAACTACATCTCC

Query

1381

1439

Sbjct

98248

CGCCACATGGAAGAGAAGTTCGGGATCCCGTGGTGCGAGTACAACTTCTTCGGTCCC-TC
||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| ||| ||
CGCCACATGGAAGAGAAGTTCGGTATCCCGTGGTGCGAGTACAACTTCTTCGG-CCCGTC

Query

1440

1499

Sbjct

98307

CAAGATCGCGGAGTCGCTGCGCAAGATCGCCGCTTACTTCGACGACAAGATCAAGGAAGG
||||||||| ||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CAAGATCGCCGAGTCGCTGCGTAAGATCGCCGCTTACTTCGACGACAAGATCAAGGAAGG

Query

1500

1558

Sbjct

98367

CGCCGAGCGCGTCATCGCCAAGTACGC-GCCCCTCATGGACGCGGTGATCGCCAAGTATC
||||||||||||||||||||||||| | |||||||||||||||||| || |||||||| |
CGCCGAGCGCGTCATCGCCAAGTAC-CAGCCCCTCATGGACGCGGTCATTGCCAAGTACC

Query

1559

1618

Sbjct

98426

GTCCGCGCCTCGAGGGCAAGACGGTCATGCTGTACGTGGGCGGCCTGCGTCCCCGTCACG
||||||| |||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTCCGCGGCTCGAGGGCAAGACCGTCATGCTGTACGTGGGCGGCCTGCGTCCCCGTCACG

Query

1619

1678

Sbjct

98486

TGATCGGCGCGTACGAAGATCTCGGCATGGAAGTGGTGGGCACGGGTTACGAGTTCGCCC
|||||||||| |||||||| ||||||||||||||||| ||||| || |||||||||| ||
TGATCGGCGCCTACGAAGACCTCGGCATGGAAGTGGTCGGCACCGGCTACGAGTTCGGCC

97529

97589

97649

97709

97769

97829

97889

97949

98009

98068

98128

98187

98247

98306

98366

98425

98485

98545

Query

1679

Sbjct

98546

Query

1739

Sbjct

98606

Query

1799

Sbjct

98666

ACAACGACGACTATCAGCGCACCGCCCAGCACTACGTCAAGGATGGCACGCTCATCTATG
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||
ACAACGACGACTATCAGCGCACCGCCCAGCACTACGTCAAGGATGGCACGATCATCTATG

1738

ACGACGTGACCGGCTACGAGTTCGAGAAGTTCGTCGAGAAGGTCCAGCCGGATCTGGTCG
|||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| ||||
ACGACGTGACCGGCTATGAGTTCGAGAAGTTCGTCGAGAAGGTCCAGCCCGATCTCGTCG

1798

GCTCGGGCATCAAGGAAAAGTACGTCT-CCAGAAGATG
||||||||||||||||||||||||| | ||||||||||
GCTCGGGCATCAAGGAAAAGTACGTGTTCCAGAAGATG

98605

98665

1835
98703

B. Hasil BLAST-N sekuen gen nifD BGM9
gb|CP000781.1|
Xanthobacter autotrophicus Py2, complete genome
Length=5308934
Features in this part of subject sequence:
nitrogenase iron protein
nitrogenase molybdenum-iron protein alpha chain
Score = 2410 bits (1305), Expect = 0.0
Identities = 1681/1854 (91%), Gaps = 59/1854 (3%)

Sbjct

96890

Query

71

Sbjct

96950

Query

130

Sbjct

97009

Query

188

Sbjct

97067

Query

248

Sbjct

97127

Query

308

Sbjct

97187

Query

367

Sbjct

97247

Query

426

Sbjct

97302

Query

484

Sbjct

97350

Query

542

Sbjct

97410

Query

602

Sbjct

97470

Query

662

Sbjct

97530

Query

722

||||| ||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| ||||||||||||||
CATGTATGCGGCCAACAACATCTCCAAGGGCATTCTGAAGTATGCCAACTCCGGCGGCGT

96949

GCGCCTGGGCGGCCTGGTGTGCAACGAGCGCCAGACCGACAAGGAG-TACGAGCTGGCGG
|||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||| | |||||||| |
GCGCCTGGGCGGGCTGGTGTGCAACGAGCGCCAGACCGACAAGGAGCT-GGAGCTGGCCG

129

AG-TCGCTGGCGAAGAAGCTCGGCA-CGCAGCTGATCTACTTCGTGCCGCGCGACAACAT
|| | ||||| ||||||||||||| || |||||||||||||||||||||||||||||||
AGAAC-CTGGCCAAGAAGCTCGGCACCG-AGCTGATCTACTTCGTGCCGCGCGACAACAT

187

CGTGCAGCACGCCGAACTGCGCCGCATGACGGTGATCGAGTATGCGCCCGATTCCGCGCA
||||||||||||||| |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| | ||
CGTGCAGCACGCCGAGCTGCGCCGCATGACCGTGATCGAGTATGCGCCCGATTCGGAACA

247

GGCCCAGCACTACCGGAACCTTGCGACCAAGGTGCACGGCAACTCGGGCAACGGCATCAT
|||||||||||||||||||||||| |||||||| |||| |||| |||||||||||||||
GGCCCAGCACTACCGGAACCTTGCCACCAAGGTTCACGCCAACAAGGGCAACGGCATCAT

307

CCCGACCCCGATCACCATGGACGAGCTCGAAGACCTGCTCATGGAGCA-GGCATCATGAA
||||||||| ||||| |||||||||||||| ||| |||| |||||||| |||||||||||
CCCGACCCCCATCACGATGGACGAGCTCGAGGACATGCTGATGGAGCACGGCATCATGAA

366

GGCCGTGGACGAGAG-CATCGTCGGCAAGACCGCCGCAGAGCTGGCCGTCGGCTGAAGCC
|||||| |||||||| || ||||||||||||||||| ||||| ||| | ||| || |
GGCCGTCGACGAGAGCCA-GGTCGGCAAGACCGCCGCCGAGCTCACCG-C--CTG-AGGC

425

ATCG-CGTCGATTGACCTGGGGCCGGCCTCAATTGCGGGGCCGGCCTGCCGAAC-GGCAA
| | || | | | | | |||||||| ||||||||||| |||||| | | | ||| |
-T-GACG-C-A--G--C-GAGGCCGGCCCCAATTGCGGGGTCGGCCT-TC-ATCTGGC-A

483

CCC--AACGAGAGCGAGATTGCGAAATGAGCTTGGCCCAACCGCAAAACGTTGCTGAAAT
||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||
CCCAAAACGAGAGCGAGATTGCGAAATGAGCTTGGCCCAACCGCAAAGCGTTGCTGAAAT

541

CAAGGCGCGGAACAAGGAACTCATCGCGGAAGTCCTCAAGGTTTATCCCGAGAAGACCGC
||||||||| ||||| ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||
CAAGGCGCGTAACAAAGAACTCATCGCGGAAGTTCTCAAGGTTTATCCCGAGAAGACCGC

601

GAAGCGCCGCGCGAAGCACCTCAACGTCCATGAGTCCGGCAAGTCCGACTGCGGCGTGAA
|||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| |||||||||||
GAAGCGCCGCGCGAAGCACCTCAACGTCCACGAGTCCGGCAAGTCCGATTGCGGCGTGAA

661

GTCGAACATCAAGTCCATCCCGGGCGTGATGACGATCCGCGGCTGCGCCTACGCCGGTTC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || ||||||||
GTCGAACATCAAGTCCATCCCGGGCGTGATGACGATCCGCGGCTGCGCGTATGCCGGTTC

721

CAAGGGCGTGGTGTGGGGTCCAATCAAGGACATGATCCACATCTCCCACAAATTTTCCCA
||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| || | |
|

781

97008

97066

97126

97186

97246

97301

97349

97409

97469

97529

97589

Sbjct

97590

CAAGGGCGTGGTGTGGGGTCCCATCAAGGACATGATCCACATCT-CC-C--A------C-

97638

Query

782

839

Sbjct

97639

AGGGCCCCGTTGGG-TGGGGCCAGTAAAGGTGGGCCGCCCGCCGGAAAATTA-TACATTG
|| |||| |||| || |||||||| || ||||||||||||| | || || ||||| |
--GG-CCCGGTGGGCTGCGGCCAGTACAGCTGGGCCGCCCGCC-G-CAACTACTACATCG

Query

840

899

Sbjct

97694

GCACGACCGGCATCGACCCCTTCGGGACGATGCAGTTCACGTCCGATTTCCAGGAAAAGG
||||||| ||||||||| |||||| ||| ||||||||||| || || |||||||||||||
GCACGACGGGCATCGACACCTTCGTGACCATGCAGTTCACCTCGGACTTCCAGGAAAAGG

Query

900

959

Sbjct

97754

ACATCGTTTTCGGCGGCGACAAGAAGCTCGCCAAGATCATGGACGAAATCCAGGAGCTCT
||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || |
ACATCGTCTTCGGCGGCGACAAGAAGCTCGCCAAGATCATGGACGAAATCCAGGACCTGT

Query

960

1019

Sbjct

97814

TCCCGCTCAACAACGGCATCACTGTCCAGTCCGAGTGCCCGATCGGCCTCATCGGCGACG
||||||| |||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TCCCGCTGAACAACGGCATCACCGTCCAGTCCGAGTGCCCGATCGGCCTCATCGGCGACG

Query

1020

1079

Sbjct

97874

ACATCGAGGCCGTGTCCAAGTCGAAGTCCAAGGAATACGACGGCAAGACCATCGTTCCGG
|||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| |||||||||||| ||||
ACATCGAGGCCGTGTCCAAGGCGAAGTCCAAGGAATACGACAACAAGACCATCGTGCCGG

Query

1080

1139

Sbjct

97934

TCCGCTGCGAGGGCTTCCGCGGCGTGTCGCAGTCCCTCGGCCACCACATCGCCAACGACG
|||||||||||||||||||||||||||| ||||| |||||||| |||||||||||||| |
TCCGCTGCGAGGGCTTCCGCGGCGTGTCCCAGTCGCTCGGCCATCACATCGCCAACGATG

Query

1140

1198

Sbjct

97994

CGGTGCGGGACTGGGTGTTCGACAAGCTGGACCCGAACAAGGCTCCGCC-CTTCGAGCCC
|| | ||||||||||||||||||||| ||||||||||
||| || || |||||||||
CGATCCGGGACTGGGTGTTCGACAAGATGGACCCGAATGCGGC-CCCCCGCTTCGAGCCG

Query

1199

1258

Sbjct

98053

TCGCCGTATGACGTCGCCATCATCGGCGACTACAACATCGGCGGCGATGCCTGGTCGTCC
|| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| |||||||| ||
TCCCCGTATGACGTCGCCATCATCGGCGACTACAACATCGGTGGCGACGCCTGGTCTTCG

Query

1259

1318

Sbjct

98113

CGTATCCTCCTCGAGGAGATGGGCCTGCGCGTCATCGCCCAGTGGTCGGGCGACGGCTCG
|| ||||| |||||||| |||||||||||||| ||||| |||||||| ||||||||||||
CGCATCCTGCTCGAGGAAATGGGCCTGCGCGTGATCGCACAGTGGTCCGGCGACGGCTCG

Query

1319

1377

Sbjct

98173

CTCGCCGAGCTCGAGAAC-ACCCCGCGGGCGAAGCTGAACGTCCTGCACTGCTACCGCTC
|| |||||||||||| | || ||| |||||||||||||||||||||||||||||| ||
CTTGCCGAGCTCGAG-GCGACTCCGAAGGCGAAGCTGAACGTCCTGCACTGCTACCGGTC

Query

1378

1437

Sbjct

98232

CATGAACTACATCTCCCGCCACATGGAAGAGAAGTTCGGGATCCCGTGGTGCGAGTACAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||
CATGAACTACATCTCCCGCCACATGGAAGAGAAGTTCGGTATCCCGTGGTGCGAGTACAA

Query

1438

1496

Sbjct

98292

CTTCTTCGGTCCC-TCCAAGATCGCGGAGTCGCTGCGCAAGATCGCCGCTTACTTCGACG
||||||||| ||| ||||||||||| ||||||||||| ||||||||||||||||||||||
CTTCTTCGG-CCCGTCCAAGATCGCCGAGTCGCTGCGTAAGATCGCCGCTTACTTCGACG

Query

1497

1555

Sbjct

98351

ACAAGATCAAGGAAGGCGCCGAGCGCGTCATCGCCAAGTACGC-GCCCCTCATGGACGCG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | ||||||||||||||||
ACAAGATCAAGGAAGGCGCCGAGCGCGTCATCGCCAAGTAC-CAGCCCCTCATGGACGCG

Query

1556

1615

Sbjct

98410

GTGATCGCCAAGTATCGTCCGCGCCTCGAGGGCAAGACGGTCATGCTGTACGTGGGCGGC
|| || |||||||| |||||||| |||||||||||||| |||||||||||||||||||||
GTCATTGCCAAGTACCGTCCGCGGCTCGAGGGCAAGACCGTCATGCTGTACGTGGGCGGC

Query

1616

1675

Sbjct

98470

CTGCGTCCCCGTCACGTGATCGGCGCGTACGAAGATCTCGGCATGGAAGTGGTGGGCACG
|||||||||||||||||||||||||| |||||||| ||||||||||||||||| |||||
CTGCGTCCCCGTCACGTGATCGGCGCCTACGAAGACCTCGGCATGGAAGTGGTCGGCACC

Query

1676

1735

Sbjct

98530

GGTTACGAGTTCGCCCACAACGACGACTATCAGCGCACCGCCCAGCACTACGTCAAGGAT
|| |||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GGCTACGAGTTCGGCCACAACGACGACTATCAGCGCACCGCCCAGCACTACGTCAAGGAT

Query

1736

1795

Sbjct

98590

GGCACGCTCATCTATGACGACGTGACCGGCTACGAGTTCGAGAAGTTCGTCGAGAAGGTC
|||||| ||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||
GGCACGATCATCTATGACGACGTGACCGGCTATGAGTTCGAGAAGTTCGTCGAGAAGGTC

Query

1796

Sbjct

98650

CAGCCGGACCTGGTCGGCTCGGGC-TCAAGGAAAAGTAC-TCT-CCAGAAGATG
||||| || || |||||||||||| |||||||||||||| | | ||||||||||
CAGCCCGATCTCGTCGGCTCGGGCATCAAGGAAAAGTACGTGTTCCAGAAGATG

1846
98703

97693

97753

97813

97873

97933

97993

98052

98112

98172

98231

98291

98350

98409

98469

98529

98589

98649

KARAKTERISASI GEN nifD BAKTERI METANOTROF ASAL SAWAH

RESTI RACHMAWATI

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

ABSTRAK
RESTI RACHMAWATI. Karakterisasi gen nifD Bakteri Metanotrof Asal Sawah. Dibimbing oleh
IMAN RUSMANA dan ALINA AKHDIYA.
Bakteri metanotrof adalah bakteri pengoksidasi CH4. Beberapa metanotrof mampu
memfiksasi nitrogen dengan menggunakan enzim nitrogenase. Enzim nitrogenase tersusun atas
dua komponen protein besi. Komponen I mengandung situs aktif untuk mereduksi nitrogen,
dikodekan oleh gen nifD dan nifK. Isolat metanotrof BGM 3 dan BGM 9 memiliki akumulasi
amonium yang tinggi pada media Nitrat Mineral Salt (NMS) tanpa nitrogen. Fragmen gen nifD
dari BGM 3 dan BGM 9 di amplifikasi dan disekuensing. Sekuen yang diperoleh dianalisis dengan
menggunakan perangkat bioinformatik seperti BLAST-N, BLAST-X, Expasy Translate Tools,
Conserved Domain (CDD) dan Scan PROSITE. Kontruksi filogenetik dibuat dengan menggukan
program MEGA 4. Analisis sekuen menunjukkan bahwa sekuen gen nifD dari BGM 3 dan BGM 9
mirip dengan gen nifD pada Xanthobacter autotropicus PY2. Nilai kemiripan dari sekuen gen
nifD tersebut cukup tinggi ( 92%-91% ). Gen nifD BGM 3 dan BGM 9 mengkodekan protein
FeMo yang didalamnya terdapat klaster 4Fe-4S dan 2Fe-2S. Gen nifD dari BGM 3, BGM 9
diduga dimiliki oleh nenek moyang yang sama dengan Xanthobacter autotropicus PY2 dan
Bradyhizobium japonicum USDA 110.
Kata kunci: Bakteri metanotrof, fiksasi nitrogen, nitrogenase, nifD

ABSTRACT
RESTI RACHMAWATI. Characterization nifD gene of Methanotrophic Bacteria from Ricefields.
Under supervision of IMAN RUSMANA and ALINA AKHDIYA.
Methanotrophic bacteria are methane oxidizing bacteria. Some methanotrophs able of fix
nitrogen using nitrogenase enzyme. Nitrogenase is composed of two multisubunit metallo protein.
Component I contains the active site to nitrogen reduction, encoded by the nifD and nifK genes.
Methanotrophic isolates of BGM 3 and BGM 9 had high ammonium accumulation cultured in
Nitrate Mineral Salts (NMS) free nitrogen medium. nifD gene fragmens from BGM 3 and BGM 9
were amplified and sequenced. Sequences analyzed using bioinformatics tools such as Blast-N,
Blast-X, Expasy Translate Tools, Conserved Domain (CDD) and Scan PROSITE. Phylogenetic
construction made using MEGA 4 software. Sequence analysis showed that the nifD sequences of
BGM 3 and BGM 9 most closely related to nifD fragmen of Xanthobacter autotropicus PY2. The
Identity values of nifD sequences was 92% and 91% respectively. nifD genes from these isolates
encode FeMo protein, which was 4Fe4S and 2Fe2S clusters. The nifD gene of BGM 3 and BGM 9
suspected to have same ancestor with the nifD gene of Xanthobacter autotropicus PY2 and
Bradyhizobium japonicum USDA 110.
Keyword: Methanotrophic bacteria, nitrogen fixation, nitrogenase, nifD

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bakteri metanotrof adalah bakteri
gram
negatif,
bersifat
aerob
dan
menggunakan metan sebagai sumber karbon
penghasil energi (Hanson & Hanson 1996).
Bakteri metanotrof tipe II dan tipe X telah
diketahui memiliki kemampuan dalam
menambat nitrogen sedangkan hanya
beberapa bakteri metanotrof tipe I yang
dapat memfiksasi nitrogen (Auman et. al
2001). Kemampuan tersebut terkait dengan
keberadaan enzim nitrogenase (Dedysh et
al. 2004).
Enzim nitrogenase merupakan
kompleks enzim yang bertanggung jawab
dalam proses fiksasi ntrogen. Nitrogenase
terdiri atas dua komponen, yaitu komponen I
(dinitrogenase atau protein Fe-Mo) dan
komponen II (dinitrogenase reduktase atau
protein Fe). Komponen I merupakan
heterodimer dengan berat molekul 250 kDA
yang dikodekan oleh gen nifD dan nifK, dan
komponen II merupakan homodimer dengan
berat molekul 70kDA yang dikodekan oleh
gen nifH (Zehr et al. 1989).
Terdapat sekitar 20 gen nif yang
mengkodekan nitrogenase yaitu nifA , nifB,
nifZ, nifH, nifD, nifK, nifE, nifN, nifX, nifO,
nifU, nifS, nifV, nifW, nifT, nifY, nifE, nifM,
nifF, nifL (Lee et al. 2000) dan diatara 20
gen tersebut nifH dan nifD merupakan gen
terpenting
untuk
mengenali
adanya
nitrogenase karena mengkodekan sub unit
pembentuk nitrogenase. Gen struktural nifH,
D, dan K pada
dan
proteobakteria
terletak berdampingan dalam satu operon
sehingga membentuk operon ni