Karakterisasi Gen Particulate Methane Monooxygenase (pMMO) Bakteri Metanotrof Asal Sawah
i
KARAKTERISASI GEN PARTICULATE METHANE
MONOOXYGENASE (pMMO) BAKTERI METANOTROF
ASAL SAWAH
ANNISA RETNO FITRIANI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ii
ABSTRAK
ANNISA RETNO FITRIANI. Karakterisasi Gen Particulate Methane Monooxygenase (pMMO)
Bakteri Metanotrof Asal Sawah. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA AKHDIYA.
Bakteri metanotrof adalah bakteri pengoksidasi metan yang memiliki enzim yang
spesifik yaitu enzim metan monooksigenase (MMO). Aplikasi bakteri metanotrof dapat
mengurangi emisi metan di lahan sawah. Terdapat dua jenis enzim MMO, yaitu soluble MMO
(sMMO) dan particulate MMO (pMMO). Enzim pMMO adalah enzim terikat membran yang
dimiliki oleh seluruh bakteri metanotrof. Isolat BGM 1 dan SKM 14 menunjukkan morfologi
koloni yang berbeda ketika ditumbuhkan pada media Nitrate Mineral Salt (NMS) + 1% metanol.
Amplifikasi gen pMMO dengan menggunakan primer A189f dan A682r menunjukkan pita DNA
berukuran ~300 bp untuk isolat BGM 1 dan ~500 bp untuk isolat SKM 14. Sekuen yang
diperoleh dianalisis menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X. Analisis sekuen amplikon
dari BGM 1 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan
kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (87%) dan asam amino pada protein (71%) acyl-coA
dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus Py2. Sedangkan analisis sekuen amplikon dari SKM
14 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan kemiripan
tertinggi dengan sekuen gen (84%) dan asam amino pada protein (62%) subunit B cytochrome bc1
Sinorhizobium fredii HH103.
Kata kunci: Metan, Bakteri metanotrof, Enzim pMMO
ABSTRACT
ANNISA RETNO FITRIANI. Characterization of Particulate Methane Monooxygenase (pMMO)
Gene of Methanotrophs from the Rice Field. Under direction of IMAN RUSMANA and ALINA
AKHDIYA.
Metanotrophic bacteria are a methane oxidizing bacteria that have specific enzyme called
methane monooxygenase (MMO). Application of metanotrophic bacteria can reduce emission of
methane in rice fields. There are two types of MMO enzymes, i.e. soluble MMO (sMMO) and
particulate MMO (pMMO). The pMMO enzyme is a membrane-bound enzyme that is present in
all metanotrophic bacteria. BGM 1 and SKM 14 isolates showed a different colony morphology
when grown on Nitrate Mineral Salt (NMS) medium + 1% methanol. The pMMO gene
amplification using A189f and A682r primer showed a ~300 bp and ~500 bp of DNA band for
BGM 1 and SKM 14 isolates respectively. The sequences were analyzed using BLAST-N and
BLAST-X program. Analysis of amplicon sequence from BGM 1 using BLAST-N and BLAST-X
program showed highest similarity with sequence of gene (87%) and amino acid in protein (71%)
acyl-coA dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus Py2 respectively. Whereas analysis of
amplicon sequence from SKM 14 using BLAST-N and BLAST-X program showed highest
similarity with sequence of gene (84%) and amino acid in protein (62%) subunit B cytochrome
bc1 Sinorhizobium fredii HH103 respectively.
Keywords: Methane, Methanotrophic bacteria, pMMO enzyme
iii
KARAKTERISASI GEN PARTICULATE METHANE
MONOOXYGENASE (pMMO) BAKTERI METANOTROF
ASAL SAWAH
ANNISA RETNO FITRIANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
iv
Judul
Nama
NIM
: Karakterisasi Gen Particulate Methane Monooxygenase (pMMO)
Bakteri Metanotrof Asal Sawah
: Annisa Retno Fitriani
: G34080114
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si
NIP 196507201990021002
Alina Akhdiya, M.Si
NIP 196812082001122001
Mengetahui:
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Sc
NIP 196410021989031002
Tanggal Lulus:
v
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya,
sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang
dilaksanakan sejak bulan Desember 2011 sampai 2012 ini ialah Karakterisasi Gen Particulate
Methane Monooxygenase (pMMO) Bakteri Metanotrof Asal Sawah.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Ibu Alina
Akhdiya, M.Si atas bimbingan, bantuan pendanaan, dan pengarahan yang diberikan selama
penelitian dan penyusunan skripsi ini. Terima kasih kepada Bapak Dr. Tri Atmowidi, M.Si. atas
saran dan masukan yang telah diberikan sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Terima kasih juga
kepada Papa, Mama, Teh Fifi, Kak Beny, Aziz, dan Tika atas segala doa, dukungan, dan kasih
sayangnya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Hadi Rakhmanto, Tri Lugina, Retno,
Ayang, Raya, Rima, Rizqi Ammar, Nida, Rini, Tata, Tya, dan Desti atas dukungan dan bantuan
yang diberikan. Terima kasih juga kepada keluarga besar laboratorium Mikrobiologi, Whendi,
Citra, Andri, Azizah, Ai, Dita, Issanto, Aida, Prima, Putri, Kak Sipri, Mbak Lena, Pak Jaka, Bu
Heni, Mas Aldian, serta teman-teman Biologi 45 atas segala doa, dukungan, dan perhatiannya.
Serta pihak-pihak yang secara tidak langsung telah membantu dalam pengumpulan data karya
ilmiah ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, November 2012
Annisa Retno Fitriani
vi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pekalongan pada tanggal 15 April 1991 dari ayah Joni Aliando dan
Ibu Henny. Penulis merupakan anak kedua dari empat bersaudara.
Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 5 Bogor dan pada tahun yang sama lulus seleksi
masuk IPB melalui Seleksi Masuk Perguruan Tinggi Negeri. Penulis memilih program studi
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif menjadi anggota Divisi Pengembangan
Sumber Daya Manusia (PSDM) Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) pada tahun 2009-2010,
Ketua Divisi Kesekretariatan Grand Biodiversity Biologi IPB tahun 2010, Sekretaris Masa
Pengenalan Departemen (MPD) Biologi tahun 2010, Divisi Acara Workshop dan Diskusi Artikel
Ilmiah Populer Biologi tahun 2010. Penulis menjadi peserta lomba Pekan Ilmiah Mahasiswa
FMIPA tahun 2010 dengan judul “Ragam Cendawan Entomopatogen di Wahana Wisata
Cangkuang”.
Penulis melakukan studi lapang di Taman Wisata dan Cagar Alam Pangandaran dengan judul
makalah “Keragaman Kapang dan Khamir yang Berasosiasi dengan Serangga dan Sarang
Serangga di Taman Wisata Alam Pangandaran”. Penulis juga melakukan Praktik Lapang di
Perusahaan Daerah Air Minum (PDAM) Tirta Pakuan Kota Bogor pada bulan Juli 2011, dengan
judul makalah “Manajemen Pengolahan Air di Perusahaan Daerah Air Minum Tirta Pakuan Kota
Bogor”. Penulis juga menerima beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik (PPA) pada tahun ajaran
2011-2012.
vii
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..................................................................................................................... iv
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................. iv
DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................................................. iv
PENDAHULUAN....................................................................................................................... 1
Latar belakang ....................................................................................................................... 1
Tujuan ................................................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE ........................................................................................................... 1
Waktu dan Tempat ................................................................................................................ 1
Bahan......... ............................................................................................................................ 1
Metode Penelitian .................................................................................................................. 1
Peremajaan dan Pengkulturan Bakteri Metanotrof..................... ................................... 1
Isolasi Genom, Amplifikasi Gen pMMO, dan Visualisasi Amplikon ........................... 1
Perunutan DNA dan Analisis Bioinformatika ............................................................... 2
HASIL ......................................................................................................................................... 2
Peremajaan dan Pengkulturan Bakteri Metanotrof ................................................................ 2
Amplifikasi Gen pMMO dan Visualisasi Amplikon .............................................................. 2
Perunutan DNA dan Analisis Bioinformatika ....................................................................... 3
PEMBAHASAN ......................................................................................................................... 3
SIMPULAN ................................................................................................................................ 4
SARAN ...................................................................................................................................... 4
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................. 4
LAMPIRAN ................................................................................................................................ 6
viii
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Morfologi koloni isolat bakteri metanotrof BGM 1 dan SKM 14 pada media NMS .............. 2
2. Hasil analisis sekuen amplikon gen pMMO dengan menggunakan program BLAST-N...... . 3
3. Hasil analisis sekuen amplikon gen pMMO dengan menggunakan program BLAST-X ....... 3
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Koloni isolat bakteri metanotrof yang ditumbuhkan pada media NMS + 1% metanol.
(A) Koloni BGM 1 berwarna putih. (B) Koloni SKM 14 berwarna krem jingga ................... 2
2. Pita DNA hasil amplifikasi gen pMMO dari isolat bakteri metanotrof BGM 1 dan
SKM 14.......... ......................................................................................................................... 3
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Komposisi media Nitrate Mineral Salt (NMS) 300 ml + 1% metanol .................................... 7
2. Sekuen pita DNA isolat BGM 1 dan SKM 14......................................................................... 8
3. Hasil sekuen gen pMMO, BLAST-N, dan BLAST-X isolat BGM 1 dan SKM 14 ............... 10
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Suasana anaerob pada bagian bawah
sedimen sawah merupakan habitat yang sesuai
untuk bakteri penghasil metan (metanogen).
Bakteri metanogen menggunakan CO2, metil,
dan asetat sebagai sumber karbon yang
kemudian diubah menjadi metan melalui
proses metanogenesis. Sebaliknya pada
permukaan sedimen terdapat oksigen terlarut
sehingga suasananya menjadi aerob dan sangat
cocok untuk pertumbuhan bakteri metanotrof.
Bakteri metanotrof adalah bakteri Gram
negatif yang menggunakan metan sebagai
sumber karbon untuk menghasilkan energinya.
Whittenburry et al. (1970) menggolongkan
bakteri metanotrof ke dalam lima genus
berdasarkan perbedaan morfologi, tipe bentuk
fase
istirahat,
struktur
membran
intrasitoplasma, dan beberapa karakter
fisiologis. Kelima genus tersebut ialah
Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus,
Methylosistis, dan Methylosinus. Sedangkan
berdasarkan perbedaan jalur biosintesisnya
(jalur RuMP dan Serin), bakteri metanotrof
digolongkan menjadi tiga tipe, yaitu
metanotrof tipe I (Methylomonas dan
Methylobacter), tipe II (Methylosistis dan
Methylosinus), dan tipe X (Methylococcus
capsulatus) (Hanson & Hanson 1996).
Karakteristik penting dari metanotrof
ialah memiliki enzim metan monooksigenase
(MMO) yang dapat mengkatalisis metan
menjadi metanol. Oksidasi metan oleh bakteri
metanotrof di lahan sawah dapat mencapai
80% dari total metan yang diproduksi oleh
bakteri metanogen (Conrad & Rothfus 1991).
Selain dapat mengoksidasi metan, enzim
MMO juga berperan dalam degradasi berbagai
senyawa polutan seperti trikloroetilen, isomerisomer dari dikloroetilen, vinil klorida, dan
kloroform (Graham et al. 1992). Terdapat dua
tipe MMO, yaitu soluble MMO (sMMO) dan
particulate MMO (pMMO) (Hanson &
Hanson 1996). Enzim pMMO merupakan
enzim terikat membran yang dimiliki oleh
seluruh bakteri metanotrof dan dapat
terekspresi dalam media dengan kandungan
tembaga yang tinggi. Sedangkan enzim sMMO
hanya dimiliki oleh beberapa bakteri
metanotrof dan dapat terekspresi dalam media
dengan kandungan tembaga rendah (Stanley et
al. 1983).
Laboratorium Mikrobiologi FMIPA IPB,
telah mengoleksi beberapa isolat bakteri
metanotrof yang berasal dari lumpur sawah di
Bogor dan Sukabumi. Beberapa isolat telah
diidentifikasi
secara
molekular
dan
dikarakterisasi secara terbatas reaksi fisiologis
dan biokimianya. BGM 1 merupakan isolat
yang mampu mengakumulasi amonium lebih
tinggi dibandingkan isolat lainnya, sedangkan
SKM 14 merupakan isolat yang memiliki nilai
oksidasi metan tertinggi (Hapsari 2008). Hasil
analisis gen 16S rRNA yang dilakukan oleh
Astuti (2009) memperlihatkan bahwa BGM 1
memiliki tingkat kemiripan 74% dengan
Methylocystis rosea strain SV97T dan SKM 14
memiliki tingkat kemiripan 65% dengan
Methylobacter sp. Clone GASP-OKA-565E11. Kedua isolat tersebut memiliki enzim
pMMO namun belum dilakukan karakterisasi
gennya. Informasi mengenai karakterisasi gen
pMMO dari isolat BGM 1 dan SKM 14 dapat
digunakan landasan ilmiah untuk pemanfaatan
bakteri tersebut di lahan pertanian.
Tujuan
Penelitian
ini
bertujuan
untuk
mengkarakterisasi gen particulate methane
monooxygenase (pMMO) pada metanotrof asal
sawah Bogor dan Sukabumi.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan
Desember 2011 sampai Agustus 2012 di
Laboratorium Mikrobiologi,
Departemen
Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan
Bakteri yang digunakan dalam penelitian
ini adalah isolat bakteri metanotrof BGM 1 dan
SKM 14. Kedua bakteri ini diisolasi dari
lumpur sawah asal Bogor dan Sukabumi
(Hapsari 2008).
Metode
Peremajaan dan Pengkulturan Bakteri
Metanotrof. Kultur bakteri metanotrof
diremajakan dan dikulturkan pada media agar
NMS + 1% metanol (Lampiran 1) dengan
teknik gores kuadran. Inkubasi dilakukan pada
suhu ruang selama 3-14 hari.
Isolasi DNA Genom, Amplifikasi Gen
pMMO, dan Visualisasi Amplikon. DNA
genom diisolasi dari kultur padat bakteri
metanotrof yang ditumbuhkan dengan cara
sebagaimana disebutkan diatas. Isolasi DNA
genom dilakukan menurut metode Lazo (Lazo
et al. 1987). Amplifikasi gen penyandi pMMO
dilakukan menggunakan primer spesifik, yaitu
A189F (GGNGACTGGGACTTCTGG) dan
2
A682r
CNGAGAAGA
AASGC)
(GAASGC
(Bourne et al. 2001). Tootal volume caampuran
reaksi PCR sebanyak 50 μl dengan koomposisi
μ ddH2O, 5 µl 10x
sebagai berrikut: 31,5 μl
Buffer KOD
D Hot Start, 3 μl 25mM MgSO
M
4, 5
µl dNTPs, 1,5
1 μl masing--masing primeer, 1,5 μl
DNA templaate, dan 1 μl KOD Hot Staart DNA
Polymerase (1U/μl). Amplifikasi
A
d
dilakukan
selama 30 siklus mengggunakan messin PCR
(Perkin Ellmer Biosysttem, USA) dengan
kondisi reaaksi PCR seebagai berikuut: pradenaturasi (94ºC, 5 menitt), denaturasi (94ºC, 1
C, 1 menit), elongasi
menit), annnealing (54ºC
(72ºC, 1 menit),
m
dan poost-elongasi (75ºC,
(
7
menit). Am
mplikon dilarrikan pada 1% gel
agarosa kem
mudian diwarrnai dengan Ethidium
E
Bromide (EtBr).
(
Visuualisasi pitaa DNA
dilakukan menggunakaan perangkaat UVTransluminaator.
Analisis
utan
DNA
A
dan
Perunu
Bioinformaatika. Perunuutan nukleotidda pada
DNA hasill amplifikasii dilakukan dengan
memanfaatkkan jasa perussahaan sekuennsing 1st
Base di Siingapura. Sekkuen yang diperoleh
d
dibandingkaan dengan data sekuenn yang
terdapat padda GenBank menggunakan
m
program
Blast-N dann Blast-X dari situs NCBI (N
National
Center for Biotechnology
gy Informationn) untuk
MO dari
mengetahui tingkat kemirripan gen pMM
formatika
isolat yang dianalisa. Annalisis bioinfo
S
menggunakaan software Bioedit Sequence
Alignment Editor
E
dan MEGA
M
5.0 (Taamura et
al. 2011).
Tabel
T
1
M
Morfologi
koloni isolat bakteri
b
metanotrof BG
m
GM 1 dan SK
KM 14
paada media NM
MS
Isolat
M
Morfologi
kolooni
BGM 1
Putih, licin,
cembung
Krem jingga,,
l
licin,
cembunng
SKM
S
14
Kecepatan
buh
tumb
12 haari
10 haari
(A
A)
HASIL
n dan Pen
ngkulturan Bakteri
Peremajaan
Metanotroff
Isolat bakteri metaanotrof BGM
M 1 dan
SKM 14 yaang ditumbuhkkan pada meddia NMS
+ 1% metaanol selama 14
1 hari menuunjukkan
morfologi koloni
k
yang berbeda
b
(Tabeel 1 dan
Gambar 1). Koloni isolat BGM 1 berwarna
b
KM 14 berwarrna krem
putih dan kooloni isolat SK
jingga. Keccepatan pertum
mbuhan kolonni kedua
isolat juga berbeda. Isoolat BGM 1 tumbuh
d
lebih cepat dibandingkan
isolat SKM 14.
(B
B)
Gambar
G
1 K
Koloni isolat bakteri metaanotrof
yaang ditumbuuhkan pada media
N
NMS
+ 1% m
metanol. (A) Koloni
K
BGM 1 berw
rwarna putih
h. (B)
K
Koloni
SKM 14 berwarnaa krem
jinngga.
Gen pMMO
Amplifikasi
A
O dan Visu
ualisasi
Amplikon
A
DNA
hasil
ampllifikasi
Visualisasii
menggunakan
m
n primer A
A189f dan A682r
menunjukkan
m
pita DNA bberukuran ~3
300 bp
untuk
u
isolat BGM
B
1 dan ~
~500 bp untuk
k isolat
SKM
S
14 (Gam
mbar 2).
3
M
1
Tabel
T
2
2
Hassil analisis seekuen ampliko
on gen
pMM
MMO
dengaan
menggu
unakan
program BLAST
T-N
%
Sekueen bakteri
yang homolog
iidentitas
BGM
B
Gen acyl-coA
a
87%a
dehyddrogenase
1
p
pada
Xanthhobacter
autottrophicus
Py2
SKM
S
Gen subunit
s
B
84%b
cytoochrome
14
bc1 pada
Sinorrhizobium
fredii HH103
a
245/281 nuklleotida overlap
ap
b
135/160 nukkleotida overlaap
Isolat
I
~ 500
5 bp
~ 3000 bp
h
amplifikkasi gen
Gambar 2 Pita DNA hasil
pMMO
daari
isolat
bakteri
metanotrof BGM
B
1 dan SKM
S
14.
(Keterangan M = markker 1 kb
S
14,
DNA ladder,, Sumur 1 = SKM
Sumur 2 = BG
GM 1).
dan
Analisis
DNA
Perunutan
Bioinformaatika
Hasil analisis sekuuen amplikon pMMO
program
2 BGM 1 menggunakan
m
(Lampiran 2)
BLAST-N menunjukkann tingkat keemiripan
87% (245/2281 nukleotiida overlap) dengan
sekuen genn acyl-coA dehydrogenasse pada
Xanthobacteer autotrophiicus Py2. Seedangkan
sekuen
a
amplikon
p
pMMO
SKM
M
14
menunjukkaan tingkat kem
miripan 84% (135/160
(
nukleotida overlap)
o
dengaan sekuen genn subunit
B cytochrom
me bc1 pada Sinorhizobiuum fredii
HH103 (Taabel 2 dan Lampiran
L
3). Analisis
menggunakaan program BLAST-X terhadap
sekuen amplikon BGM 1 menunjukkann tingkat
d
dengan
A
Acyl-CoA
kemiripan
71%
m album
dehydrogenaase pada Methhylomicrobium
BG8. Sedanngkan sekuenn amplikon SKM
S
14
menunjukkaan tingkat kemiripan 62%
% dengan
Cytochromee b pada Methylocystis
M
s SC2
sp.
(Tabel 3 dann Lampiran 3)).
No.
N
ak
kses
CP00
C
07
781.
1
HE61
H
68
890.
1
Table
T
3 Hassil analisis sekkuen ampliko
on gen
pMM
MMO
dengaan
menggu
unakan
program BLAST
T-X
Isolat
I
BGM
B
1
SKM
S
14
Sekueen bakteri
yang homolog
Acyyl-CoA
dehyddrogenase
p
pada
Methyylomicro
bium
m album
B
BG8
Cytocchrome b
p
pada
Methhylocystis
spp. SC2
%
identitas
71%
No.
N
ak
kses
ZP
P_0
98
865
56
66.1
62%
YP
P_0
06
659
02
200.
1
PEMBAH
HASAN
b
mettanotrof BG
GM 1
Isolat bakteri
memiliki
m
moorfologi kolooni yang berbeda
dengan
d
SKM 14. Kolonii BGM 1 berrwarna
putih
p
sedangkan SKM 114 berwarna krem
jingga (Tabeel 1). Warnna koloni bakteri
b
dipengaruhi
d
o
oleh
pigmen yyang diproduk
ksinya.
Bakteri
B
metannotrof menghhasilkan berm
macammacam
m
pigmeen terlarut dann tak larut. Pigmen
P
terlarut
t
sepertti putih, krem
m, dan oranyee lebih
sering
s
ditemuukan (Murrelll & Dalton 1992).
Selain
S
itu, beberapa peeneliti melap
porkan
produksi
p
piggmen kuningg atau keco
oklatan
(Hanson
(
& Haanson 1996), pink muda (E
Eller &
Frenzel
F
2001), serta pigmenn oranye kemerahan
dan
d karotenoiid (Holt et al. 1994). Pigm
mentasi
dipengaruhi
d
o
oleh
faktor geenetis, faktorr umur
4
biakan, dan tahapan fisiologis bakteri (Murrell
& Dalton 1992).
Oksidasi metan pada bakteri metanotrof
diinisiasi oleh enzim methane monooxygenase
(MMO) yang mampu menambahkan satu atom
oksigen ke dalam molekul metan untuk
membentuk
senyawa
metanol.
Selain
mengkatalisis reaksi oksidasi metan, enzim
MMO terikat membran (pMMO) juga berperan
dalam proses degradasi senyawa hidrokarbon
terhalogenasi seperti trikloroetilen (Dispirito et
al. 1992). Enzim pMMO tersusun atas tiga
subunit yaitu α, , dan yang masing-masing
disandikan oleh gen pmoA, pmoB, dan pmoC
(Semrau et al. 1995).
Amplifikasi gen pMMO menggunakan
primer A189f dan A682r menghasilkan pita
DNA dengan ukuran ~500 bp dan ~300 bp
berturut-turut untuk isolat BGM 1 dan SKM
14. Analisis sekuen amplikon dari BGM 1
menggunakan program BLAST-N dan
BLAST-X
berturut-turut
menunjukkan
kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (87%)
dan asam amino pada protein (71%) acyl-coA
dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus
Py2. Sedangkan analisis sekuen amplikon dari
SKM 14 menggunakan program BLAST-N
dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan
kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (84%)
dan asam amino pada protein (62%) subunit B
cytochrome bc1 Sinorhizobium fredii HH103.
Hasil analisis kedua sekuen amplikon
tersebut tidak sesuai dengan gen target (pMMO
pada bakteri metanotrof).
Ketidaksesuaian
hasil analisis tersebut diduga disebabkan
antara lain oleh spesifitas primer yang rendah,
sekuen yang dianalisis terlalu pendek, atau
keterbatasan data base pada GeneBank.
Primer A189F/A682r diduga kurang
spesifik untuk mengamplifikasi gen pMMO
bakteri tropis walaupun primer ini berhasil
diaplikasikan
untuk
mendeteksi
serta
menganalisis keragaman gen pMMOA
metanotrof di padang rumput dan oaks di
Denmark (Bourne et al. 2001). Holmes et al.
(1995)
melaporkan
bahwa
primer
A189F/A682r juga dapat mengamplifikasi gen
Ammonium Mono-oxygenase (AMO) yang
terdapat pada bakteri pengoksidasi amonium.
Selain primer tersebut, gen pMMO juga dapat
diamplifikasi
menggunakan
primer
A189f/mb661 yang lebih spesifik untuk
mendeteksi gen pMMO bakteri metanotrof
(Bourne et al. 2001).
Ketepatan dan nilai tingkat kemiripan
pada hasil
analisis kesejajaran sekuen
menggunakan program BLAST-N dan
BLAST-X juga sangat dipengaruhi oleh
panjang sekuen DNA yang dianalisis dan
kelengkapan data base yang terdapat pada
GeneBank. Semakin panjang sekuen yang
dianalisis dan semakin banyak data base yang
terdapat pada GeneBank, maka semakin tinggi
tingkat ketepatan dan nilai tingkat kemiripan
yang akan diperoleh. Sebagian besar data yang
terdapat pada GenBank berasal dari sampel
daerah temperate. Sedangkan sekuen DNA
yang dianalisis pada penelitian ini berasal dari
bakteri tropis. Oleh karena itu, hasil analisis
sekuen amplikon gen pMMO yang diperoleh
dalam penelitian ini tidak sesuai dengan gen
target.
SIMPULAN
Morfologi isolat BGM 1 dan SKM 14
memperlihatkan perbedaan warna koloni,
tepian, dan elevasi. BGM 1 memperlihatkan
warna koloni putih, tepian licin, dan elevasi
cembung, sedangkan SKM 14 memperlihatkan
warna koloni krem jingga, tepian licin, dan
elevasi cembung. Analisis sekuen amplikon
dari BGM 1 menggunakan program BLAST-N
dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan
kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (87%)
dan asam amino pada protein (71%) acyl-coA
dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus
Py2. Sedangkan analisis sekuen amplikon dari
SKM 14 menggunakan program BLAST-N
dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan
kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (84%)
dan asam amino pada protein (62%) subunit B
cytochrome bc1 Sinorhizobium fredii HH103.
Ketidaksesuaian hasil analisis tersebut diduga
disebabkan antara lain oleh spesifitas primer
yang rendah, sekuen yang dianalisis terlalu
pendek, atau keterbatasan data base pada
GeneBank.
SARAN
Perlu dilakukan lebih lanjut penelitian
terhadap gen pMMO BGM 1 dan SKM 14
dengan menggunakan primer yang lebih
spesifik.
DAFTAR PUSTAKA
Astuti DD. 2009. Karakterisasi Fisiologi dan
Identifikasi
Molekuler
Isolat-Isolat
Bakteri Metanotrof Asal Sawah Wilayah
Bogor dan Sukabumi [skripsi]. Bogor:
Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor.
5
Bourne DG, McDonald IR, Murrell JC. 2001.
Comparison of pmoA PCR primer sets as
tools for investigating methanotroph
diversity in three Danish soils. Appl
Environ Microbiol 67:3802-3809.
Conrad R and Rothfus F. 1991. Methane
oxidation in the soil surface layer of
aflooded rice field and the effect of
ammonium. Biol Fertil Soil 12:28-32.
Dispirito AA et al. 1992. Trichloroethylene
oxidation by the membrane associated
methane monooxygenase in type I, type II
and
type
X
methanotrophs.
Biodegradation 2:151–164.
Eller G, Frenzel P. 2001. Changes in activity
and community structure of methaneoxidizing bacteria over the growth period
of rice. Appl Environ Microbiol 67:23952403.
Graham DW, Korich DG, Leblanc RP, Sinclair
NA, Arnold RG. 1992. Application of a
colorimetric plate assay for soluble
methane monooxygenase activity. Appl
Environ Microbiol 58:2231-2236.
Hanson R, Hanson TE. 1996. Metanotropic
bacteria. J Microbial Rev 60:439-471.
related. FEMS Microbiol Lett 132:203–
208.
Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT,
Williams ST. 1994. Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology. Ed ke-9.
Lippincott William & Wilkins: a Wolter
Kluwer Co.
Lazo GR, Roffey R, Gabriel DW. 1987.
Conservation of plasmid DNA sequences
and pathovar identification of strain
Xantholomonas
campestris.
Pytopathology 77: 1461-1467.
Murrell JC, Dalton H. 1992. Methane and
Methanol Utilizers. New York: SpringerVerlag.
Semrau et al. 1995. Particulate methane
monooxygenase genes in methanotrophs.
J Bacteriol 177:3071-3079.
Stanley SH, Prior SD, Leak DJ, Dalton H.
1983. Copper stress underlies the
fundamental change in intracellular
location of methane monooxygenase in
methane-oxidizing organisms: studies in
batch and continuous culture. Biotechnol
Lett 5:487-492.
Hapsari W. 2008. Isolasi dan karakterisasi
bakteri metanotrof asal sawah di Bogor
dan Sukabumi [skripsi]. Bogor : Institut
Pertanian Bogor.
Tamura K et al. 2011. MEGA5: Molecular
evolutionary genetics analysis using
maximum
likelihood,
evolutionary
distance, and maximum parsimony
methods. Mol Biol Evol 28:2731-2739.
Holmes AJ, Costello A, Lidstrom ME, Murrell
JC. 1995. Evidence that particulate
methane monooxygenase and ammonia
monooxygenase may be evolutionarily
Whittenburry RKC, Phillips, Wilkinson JG.
1970. Enrichment, isolation and some
properties of methane utilizing bacteria. J
Gen Microbiol 61:205-218.
LAMPIRAN
7
Lampiran 1 Komposisi media Nitrate Mineral Salt (NMS) 300 ml + 1% metanol
1.
120 µl NH4Cl
2.
1200 µl CaCl2
3.
0.3 g MgSO4
4.
150 µl Trace Element
5.
1632 µl KH2PO4
6.
0.3 gr NaNO3
7.
2151 µl Na2HPO4
8.
6 g agar
9.
300 ml akuades
10. 1% metanol
8
Lampiran 2 Sekuen pita DNA isolat BGM 1 dan SKM 14
BGM 1
SKM 14
9
10
Lampiran 3 Hasil sekuen gen pMMO, BLAST-N, dan BLAST-X isolat BGM 1 dan SKM 14
A. Urutan nukleotida gen pMMO isolat BGM 1
ACGACACCGTGAGGAAGAAGGGGTCCACCACCTCGTCGTTGGACTTGTCG
CCGTCGACGATGGGGCCCACGAGAGCCTCCTTGGACATCACCTCCTTTTC
CACCACGATGGGCCCCGACTGGTTGCCGCGGAGGCCCAGGCCGTCCCACT
CGGAGGGGTTGGCCTTCACCTCGTCCTTGGTGACGAGGAAGGGGAAAGGT
CGGAATAGTCACCAGAGAATCCGGGGCTGGTGGTCTGCACTATGTACCAG
TCTCAAAAGCCTCCGGAGGTGGTCCAGGAGGCCTTCTTCTCCGCCT
B. Hasil BLAST-N sekuen gen pMMO isolat BGM 1 dengan data GenBank
C. Hasil BLAST-X sekuen gen pMMO isolat BGM 1 dengan data GenBank
11
D. Urutan nukleotida gen pMMO isolat SKM 14
CAACCTGTTCTCGTCTCTGAACGAGATCATCCCGGGTGTCGGCACCGCCATCGTCG
AATGGCTGTGGGGCGGCTACTCCGTCTCCGGCACGACGCTGAACCGCTTCTTCTCG
CTCCACTACCTGCTGCCGTTCGTGCTTGCCGGCCTGGTCGTCCTGCACATCTGGGC
GCTGCACGTCGCGGGTCAGAACAATCCGACGGGTCTCGACATCAAGACCAAGGCC
GACGCCGTGCCGATGTTCCCGTTTGCGGTTGCCAAGGACGCAGTCGGCCTGTTCGC
GTTCCTGCTGCTGTTCGCCT
E. Hasil BLAST-N sekuen gen pMMO isolat SKM 14 dengan data GenBank
12
F. Hasil BLAST-X sekuen gen pMMO isolat SKM 14 dengan data GenBank
KARAKTERISASI GEN PARTICULATE METHANE
MONOOXYGENASE (pMMO) BAKTERI METANOTROF
ASAL SAWAH
ANNISA RETNO FITRIANI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ii
ABSTRAK
ANNISA RETNO FITRIANI. Karakterisasi Gen Particulate Methane Monooxygenase (pMMO)
Bakteri Metanotrof Asal Sawah. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA AKHDIYA.
Bakteri metanotrof adalah bakteri pengoksidasi metan yang memiliki enzim yang
spesifik yaitu enzim metan monooksigenase (MMO). Aplikasi bakteri metanotrof dapat
mengurangi emisi metan di lahan sawah. Terdapat dua jenis enzim MMO, yaitu soluble MMO
(sMMO) dan particulate MMO (pMMO). Enzim pMMO adalah enzim terikat membran yang
dimiliki oleh seluruh bakteri metanotrof. Isolat BGM 1 dan SKM 14 menunjukkan morfologi
koloni yang berbeda ketika ditumbuhkan pada media Nitrate Mineral Salt (NMS) + 1% metanol.
Amplifikasi gen pMMO dengan menggunakan primer A189f dan A682r menunjukkan pita DNA
berukuran ~300 bp untuk isolat BGM 1 dan ~500 bp untuk isolat SKM 14. Sekuen yang
diperoleh dianalisis menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X. Analisis sekuen amplikon
dari BGM 1 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan
kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (87%) dan asam amino pada protein (71%) acyl-coA
dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus Py2. Sedangkan analisis sekuen amplikon dari SKM
14 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan kemiripan
tertinggi dengan sekuen gen (84%) dan asam amino pada protein (62%) subunit B cytochrome bc1
Sinorhizobium fredii HH103.
Kata kunci: Metan, Bakteri metanotrof, Enzim pMMO
ABSTRACT
ANNISA RETNO FITRIANI. Characterization of Particulate Methane Monooxygenase (pMMO)
Gene of Methanotrophs from the Rice Field. Under direction of IMAN RUSMANA and ALINA
AKHDIYA.
Metanotrophic bacteria are a methane oxidizing bacteria that have specific enzyme called
methane monooxygenase (MMO). Application of metanotrophic bacteria can reduce emission of
methane in rice fields. There are two types of MMO enzymes, i.e. soluble MMO (sMMO) and
particulate MMO (pMMO). The pMMO enzyme is a membrane-bound enzyme that is present in
all metanotrophic bacteria. BGM 1 and SKM 14 isolates showed a different colony morphology
when grown on Nitrate Mineral Salt (NMS) medium + 1% methanol. The pMMO gene
amplification using A189f and A682r primer showed a ~300 bp and ~500 bp of DNA band for
BGM 1 and SKM 14 isolates respectively. The sequences were analyzed using BLAST-N and
BLAST-X program. Analysis of amplicon sequence from BGM 1 using BLAST-N and BLAST-X
program showed highest similarity with sequence of gene (87%) and amino acid in protein (71%)
acyl-coA dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus Py2 respectively. Whereas analysis of
amplicon sequence from SKM 14 using BLAST-N and BLAST-X program showed highest
similarity with sequence of gene (84%) and amino acid in protein (62%) subunit B cytochrome
bc1 Sinorhizobium fredii HH103 respectively.
Keywords: Methane, Methanotrophic bacteria, pMMO enzyme
iii
KARAKTERISASI GEN PARTICULATE METHANE
MONOOXYGENASE (pMMO) BAKTERI METANOTROF
ASAL SAWAH
ANNISA RETNO FITRIANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
iv
Judul
Nama
NIM
: Karakterisasi Gen Particulate Methane Monooxygenase (pMMO)
Bakteri Metanotrof Asal Sawah
: Annisa Retno Fitriani
: G34080114
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si
NIP 196507201990021002
Alina Akhdiya, M.Si
NIP 196812082001122001
Mengetahui:
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Sc
NIP 196410021989031002
Tanggal Lulus:
v
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya,
sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang
dilaksanakan sejak bulan Desember 2011 sampai 2012 ini ialah Karakterisasi Gen Particulate
Methane Monooxygenase (pMMO) Bakteri Metanotrof Asal Sawah.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Ibu Alina
Akhdiya, M.Si atas bimbingan, bantuan pendanaan, dan pengarahan yang diberikan selama
penelitian dan penyusunan skripsi ini. Terima kasih kepada Bapak Dr. Tri Atmowidi, M.Si. atas
saran dan masukan yang telah diberikan sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Terima kasih juga
kepada Papa, Mama, Teh Fifi, Kak Beny, Aziz, dan Tika atas segala doa, dukungan, dan kasih
sayangnya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Hadi Rakhmanto, Tri Lugina, Retno,
Ayang, Raya, Rima, Rizqi Ammar, Nida, Rini, Tata, Tya, dan Desti atas dukungan dan bantuan
yang diberikan. Terima kasih juga kepada keluarga besar laboratorium Mikrobiologi, Whendi,
Citra, Andri, Azizah, Ai, Dita, Issanto, Aida, Prima, Putri, Kak Sipri, Mbak Lena, Pak Jaka, Bu
Heni, Mas Aldian, serta teman-teman Biologi 45 atas segala doa, dukungan, dan perhatiannya.
Serta pihak-pihak yang secara tidak langsung telah membantu dalam pengumpulan data karya
ilmiah ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, November 2012
Annisa Retno Fitriani
vi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pekalongan pada tanggal 15 April 1991 dari ayah Joni Aliando dan
Ibu Henny. Penulis merupakan anak kedua dari empat bersaudara.
Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 5 Bogor dan pada tahun yang sama lulus seleksi
masuk IPB melalui Seleksi Masuk Perguruan Tinggi Negeri. Penulis memilih program studi
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif menjadi anggota Divisi Pengembangan
Sumber Daya Manusia (PSDM) Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) pada tahun 2009-2010,
Ketua Divisi Kesekretariatan Grand Biodiversity Biologi IPB tahun 2010, Sekretaris Masa
Pengenalan Departemen (MPD) Biologi tahun 2010, Divisi Acara Workshop dan Diskusi Artikel
Ilmiah Populer Biologi tahun 2010. Penulis menjadi peserta lomba Pekan Ilmiah Mahasiswa
FMIPA tahun 2010 dengan judul “Ragam Cendawan Entomopatogen di Wahana Wisata
Cangkuang”.
Penulis melakukan studi lapang di Taman Wisata dan Cagar Alam Pangandaran dengan judul
makalah “Keragaman Kapang dan Khamir yang Berasosiasi dengan Serangga dan Sarang
Serangga di Taman Wisata Alam Pangandaran”. Penulis juga melakukan Praktik Lapang di
Perusahaan Daerah Air Minum (PDAM) Tirta Pakuan Kota Bogor pada bulan Juli 2011, dengan
judul makalah “Manajemen Pengolahan Air di Perusahaan Daerah Air Minum Tirta Pakuan Kota
Bogor”. Penulis juga menerima beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik (PPA) pada tahun ajaran
2011-2012.
vii
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..................................................................................................................... iv
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................. iv
DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................................................. iv
PENDAHULUAN....................................................................................................................... 1
Latar belakang ....................................................................................................................... 1
Tujuan ................................................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE ........................................................................................................... 1
Waktu dan Tempat ................................................................................................................ 1
Bahan......... ............................................................................................................................ 1
Metode Penelitian .................................................................................................................. 1
Peremajaan dan Pengkulturan Bakteri Metanotrof..................... ................................... 1
Isolasi Genom, Amplifikasi Gen pMMO, dan Visualisasi Amplikon ........................... 1
Perunutan DNA dan Analisis Bioinformatika ............................................................... 2
HASIL ......................................................................................................................................... 2
Peremajaan dan Pengkulturan Bakteri Metanotrof ................................................................ 2
Amplifikasi Gen pMMO dan Visualisasi Amplikon .............................................................. 2
Perunutan DNA dan Analisis Bioinformatika ....................................................................... 3
PEMBAHASAN ......................................................................................................................... 3
SIMPULAN ................................................................................................................................ 4
SARAN ...................................................................................................................................... 4
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................. 4
LAMPIRAN ................................................................................................................................ 6
viii
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Morfologi koloni isolat bakteri metanotrof BGM 1 dan SKM 14 pada media NMS .............. 2
2. Hasil analisis sekuen amplikon gen pMMO dengan menggunakan program BLAST-N...... . 3
3. Hasil analisis sekuen amplikon gen pMMO dengan menggunakan program BLAST-X ....... 3
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Koloni isolat bakteri metanotrof yang ditumbuhkan pada media NMS + 1% metanol.
(A) Koloni BGM 1 berwarna putih. (B) Koloni SKM 14 berwarna krem jingga ................... 2
2. Pita DNA hasil amplifikasi gen pMMO dari isolat bakteri metanotrof BGM 1 dan
SKM 14.......... ......................................................................................................................... 3
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Komposisi media Nitrate Mineral Salt (NMS) 300 ml + 1% metanol .................................... 7
2. Sekuen pita DNA isolat BGM 1 dan SKM 14......................................................................... 8
3. Hasil sekuen gen pMMO, BLAST-N, dan BLAST-X isolat BGM 1 dan SKM 14 ............... 10
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Suasana anaerob pada bagian bawah
sedimen sawah merupakan habitat yang sesuai
untuk bakteri penghasil metan (metanogen).
Bakteri metanogen menggunakan CO2, metil,
dan asetat sebagai sumber karbon yang
kemudian diubah menjadi metan melalui
proses metanogenesis. Sebaliknya pada
permukaan sedimen terdapat oksigen terlarut
sehingga suasananya menjadi aerob dan sangat
cocok untuk pertumbuhan bakteri metanotrof.
Bakteri metanotrof adalah bakteri Gram
negatif yang menggunakan metan sebagai
sumber karbon untuk menghasilkan energinya.
Whittenburry et al. (1970) menggolongkan
bakteri metanotrof ke dalam lima genus
berdasarkan perbedaan morfologi, tipe bentuk
fase
istirahat,
struktur
membran
intrasitoplasma, dan beberapa karakter
fisiologis. Kelima genus tersebut ialah
Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus,
Methylosistis, dan Methylosinus. Sedangkan
berdasarkan perbedaan jalur biosintesisnya
(jalur RuMP dan Serin), bakteri metanotrof
digolongkan menjadi tiga tipe, yaitu
metanotrof tipe I (Methylomonas dan
Methylobacter), tipe II (Methylosistis dan
Methylosinus), dan tipe X (Methylococcus
capsulatus) (Hanson & Hanson 1996).
Karakteristik penting dari metanotrof
ialah memiliki enzim metan monooksigenase
(MMO) yang dapat mengkatalisis metan
menjadi metanol. Oksidasi metan oleh bakteri
metanotrof di lahan sawah dapat mencapai
80% dari total metan yang diproduksi oleh
bakteri metanogen (Conrad & Rothfus 1991).
Selain dapat mengoksidasi metan, enzim
MMO juga berperan dalam degradasi berbagai
senyawa polutan seperti trikloroetilen, isomerisomer dari dikloroetilen, vinil klorida, dan
kloroform (Graham et al. 1992). Terdapat dua
tipe MMO, yaitu soluble MMO (sMMO) dan
particulate MMO (pMMO) (Hanson &
Hanson 1996). Enzim pMMO merupakan
enzim terikat membran yang dimiliki oleh
seluruh bakteri metanotrof dan dapat
terekspresi dalam media dengan kandungan
tembaga yang tinggi. Sedangkan enzim sMMO
hanya dimiliki oleh beberapa bakteri
metanotrof dan dapat terekspresi dalam media
dengan kandungan tembaga rendah (Stanley et
al. 1983).
Laboratorium Mikrobiologi FMIPA IPB,
telah mengoleksi beberapa isolat bakteri
metanotrof yang berasal dari lumpur sawah di
Bogor dan Sukabumi. Beberapa isolat telah
diidentifikasi
secara
molekular
dan
dikarakterisasi secara terbatas reaksi fisiologis
dan biokimianya. BGM 1 merupakan isolat
yang mampu mengakumulasi amonium lebih
tinggi dibandingkan isolat lainnya, sedangkan
SKM 14 merupakan isolat yang memiliki nilai
oksidasi metan tertinggi (Hapsari 2008). Hasil
analisis gen 16S rRNA yang dilakukan oleh
Astuti (2009) memperlihatkan bahwa BGM 1
memiliki tingkat kemiripan 74% dengan
Methylocystis rosea strain SV97T dan SKM 14
memiliki tingkat kemiripan 65% dengan
Methylobacter sp. Clone GASP-OKA-565E11. Kedua isolat tersebut memiliki enzim
pMMO namun belum dilakukan karakterisasi
gennya. Informasi mengenai karakterisasi gen
pMMO dari isolat BGM 1 dan SKM 14 dapat
digunakan landasan ilmiah untuk pemanfaatan
bakteri tersebut di lahan pertanian.
Tujuan
Penelitian
ini
bertujuan
untuk
mengkarakterisasi gen particulate methane
monooxygenase (pMMO) pada metanotrof asal
sawah Bogor dan Sukabumi.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan
Desember 2011 sampai Agustus 2012 di
Laboratorium Mikrobiologi,
Departemen
Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan
Bakteri yang digunakan dalam penelitian
ini adalah isolat bakteri metanotrof BGM 1 dan
SKM 14. Kedua bakteri ini diisolasi dari
lumpur sawah asal Bogor dan Sukabumi
(Hapsari 2008).
Metode
Peremajaan dan Pengkulturan Bakteri
Metanotrof. Kultur bakteri metanotrof
diremajakan dan dikulturkan pada media agar
NMS + 1% metanol (Lampiran 1) dengan
teknik gores kuadran. Inkubasi dilakukan pada
suhu ruang selama 3-14 hari.
Isolasi DNA Genom, Amplifikasi Gen
pMMO, dan Visualisasi Amplikon. DNA
genom diisolasi dari kultur padat bakteri
metanotrof yang ditumbuhkan dengan cara
sebagaimana disebutkan diatas. Isolasi DNA
genom dilakukan menurut metode Lazo (Lazo
et al. 1987). Amplifikasi gen penyandi pMMO
dilakukan menggunakan primer spesifik, yaitu
A189F (GGNGACTGGGACTTCTGG) dan
2
A682r
CNGAGAAGA
AASGC)
(GAASGC
(Bourne et al. 2001). Tootal volume caampuran
reaksi PCR sebanyak 50 μl dengan koomposisi
μ ddH2O, 5 µl 10x
sebagai berrikut: 31,5 μl
Buffer KOD
D Hot Start, 3 μl 25mM MgSO
M
4, 5
µl dNTPs, 1,5
1 μl masing--masing primeer, 1,5 μl
DNA templaate, dan 1 μl KOD Hot Staart DNA
Polymerase (1U/μl). Amplifikasi
A
d
dilakukan
selama 30 siklus mengggunakan messin PCR
(Perkin Ellmer Biosysttem, USA) dengan
kondisi reaaksi PCR seebagai berikuut: pradenaturasi (94ºC, 5 menitt), denaturasi (94ºC, 1
C, 1 menit), elongasi
menit), annnealing (54ºC
(72ºC, 1 menit),
m
dan poost-elongasi (75ºC,
(
7
menit). Am
mplikon dilarrikan pada 1% gel
agarosa kem
mudian diwarrnai dengan Ethidium
E
Bromide (EtBr).
(
Visuualisasi pitaa DNA
dilakukan menggunakaan perangkaat UVTransluminaator.
Analisis
utan
DNA
A
dan
Perunu
Bioinformaatika. Perunuutan nukleotidda pada
DNA hasill amplifikasii dilakukan dengan
memanfaatkkan jasa perussahaan sekuennsing 1st
Base di Siingapura. Sekkuen yang diperoleh
d
dibandingkaan dengan data sekuenn yang
terdapat padda GenBank menggunakan
m
program
Blast-N dann Blast-X dari situs NCBI (N
National
Center for Biotechnology
gy Informationn) untuk
MO dari
mengetahui tingkat kemirripan gen pMM
formatika
isolat yang dianalisa. Annalisis bioinfo
S
menggunakaan software Bioedit Sequence
Alignment Editor
E
dan MEGA
M
5.0 (Taamura et
al. 2011).
Tabel
T
1
M
Morfologi
koloni isolat bakteri
b
metanotrof BG
m
GM 1 dan SK
KM 14
paada media NM
MS
Isolat
M
Morfologi
kolooni
BGM 1
Putih, licin,
cembung
Krem jingga,,
l
licin,
cembunng
SKM
S
14
Kecepatan
buh
tumb
12 haari
10 haari
(A
A)
HASIL
n dan Pen
ngkulturan Bakteri
Peremajaan
Metanotroff
Isolat bakteri metaanotrof BGM
M 1 dan
SKM 14 yaang ditumbuhkkan pada meddia NMS
+ 1% metaanol selama 14
1 hari menuunjukkan
morfologi koloni
k
yang berbeda
b
(Tabeel 1 dan
Gambar 1). Koloni isolat BGM 1 berwarna
b
KM 14 berwarrna krem
putih dan kooloni isolat SK
jingga. Keccepatan pertum
mbuhan kolonni kedua
isolat juga berbeda. Isoolat BGM 1 tumbuh
d
lebih cepat dibandingkan
isolat SKM 14.
(B
B)
Gambar
G
1 K
Koloni isolat bakteri metaanotrof
yaang ditumbuuhkan pada media
N
NMS
+ 1% m
metanol. (A) Koloni
K
BGM 1 berw
rwarna putih
h. (B)
K
Koloni
SKM 14 berwarnaa krem
jinngga.
Gen pMMO
Amplifikasi
A
O dan Visu
ualisasi
Amplikon
A
DNA
hasil
ampllifikasi
Visualisasii
menggunakan
m
n primer A
A189f dan A682r
menunjukkan
m
pita DNA bberukuran ~3
300 bp
untuk
u
isolat BGM
B
1 dan ~
~500 bp untuk
k isolat
SKM
S
14 (Gam
mbar 2).
3
M
1
Tabel
T
2
2
Hassil analisis seekuen ampliko
on gen
pMM
MMO
dengaan
menggu
unakan
program BLAST
T-N
%
Sekueen bakteri
yang homolog
iidentitas
BGM
B
Gen acyl-coA
a
87%a
dehyddrogenase
1
p
pada
Xanthhobacter
autottrophicus
Py2
SKM
S
Gen subunit
s
B
84%b
cytoochrome
14
bc1 pada
Sinorrhizobium
fredii HH103
a
245/281 nuklleotida overlap
ap
b
135/160 nukkleotida overlaap
Isolat
I
~ 500
5 bp
~ 3000 bp
h
amplifikkasi gen
Gambar 2 Pita DNA hasil
pMMO
daari
isolat
bakteri
metanotrof BGM
B
1 dan SKM
S
14.
(Keterangan M = markker 1 kb
S
14,
DNA ladder,, Sumur 1 = SKM
Sumur 2 = BG
GM 1).
dan
Analisis
DNA
Perunutan
Bioinformaatika
Hasil analisis sekuuen amplikon pMMO
program
2 BGM 1 menggunakan
m
(Lampiran 2)
BLAST-N menunjukkann tingkat keemiripan
87% (245/2281 nukleotiida overlap) dengan
sekuen genn acyl-coA dehydrogenasse pada
Xanthobacteer autotrophiicus Py2. Seedangkan
sekuen
a
amplikon
p
pMMO
SKM
M
14
menunjukkaan tingkat kem
miripan 84% (135/160
(
nukleotida overlap)
o
dengaan sekuen genn subunit
B cytochrom
me bc1 pada Sinorhizobiuum fredii
HH103 (Taabel 2 dan Lampiran
L
3). Analisis
menggunakaan program BLAST-X terhadap
sekuen amplikon BGM 1 menunjukkann tingkat
d
dengan
A
Acyl-CoA
kemiripan
71%
m album
dehydrogenaase pada Methhylomicrobium
BG8. Sedanngkan sekuenn amplikon SKM
S
14
menunjukkaan tingkat kemiripan 62%
% dengan
Cytochromee b pada Methylocystis
M
s SC2
sp.
(Tabel 3 dann Lampiran 3)).
No.
N
ak
kses
CP00
C
07
781.
1
HE61
H
68
890.
1
Table
T
3 Hassil analisis sekkuen ampliko
on gen
pMM
MMO
dengaan
menggu
unakan
program BLAST
T-X
Isolat
I
BGM
B
1
SKM
S
14
Sekueen bakteri
yang homolog
Acyyl-CoA
dehyddrogenase
p
pada
Methyylomicro
bium
m album
B
BG8
Cytocchrome b
p
pada
Methhylocystis
spp. SC2
%
identitas
71%
No.
N
ak
kses
ZP
P_0
98
865
56
66.1
62%
YP
P_0
06
659
02
200.
1
PEMBAH
HASAN
b
mettanotrof BG
GM 1
Isolat bakteri
memiliki
m
moorfologi kolooni yang berbeda
dengan
d
SKM 14. Kolonii BGM 1 berrwarna
putih
p
sedangkan SKM 114 berwarna krem
jingga (Tabeel 1). Warnna koloni bakteri
b
dipengaruhi
d
o
oleh
pigmen yyang diproduk
ksinya.
Bakteri
B
metannotrof menghhasilkan berm
macammacam
m
pigmeen terlarut dann tak larut. Pigmen
P
terlarut
t
sepertti putih, krem
m, dan oranyee lebih
sering
s
ditemuukan (Murrelll & Dalton 1992).
Selain
S
itu, beberapa peeneliti melap
porkan
produksi
p
piggmen kuningg atau keco
oklatan
(Hanson
(
& Haanson 1996), pink muda (E
Eller &
Frenzel
F
2001), serta pigmenn oranye kemerahan
dan
d karotenoiid (Holt et al. 1994). Pigm
mentasi
dipengaruhi
d
o
oleh
faktor geenetis, faktorr umur
4
biakan, dan tahapan fisiologis bakteri (Murrell
& Dalton 1992).
Oksidasi metan pada bakteri metanotrof
diinisiasi oleh enzim methane monooxygenase
(MMO) yang mampu menambahkan satu atom
oksigen ke dalam molekul metan untuk
membentuk
senyawa
metanol.
Selain
mengkatalisis reaksi oksidasi metan, enzim
MMO terikat membran (pMMO) juga berperan
dalam proses degradasi senyawa hidrokarbon
terhalogenasi seperti trikloroetilen (Dispirito et
al. 1992). Enzim pMMO tersusun atas tiga
subunit yaitu α, , dan yang masing-masing
disandikan oleh gen pmoA, pmoB, dan pmoC
(Semrau et al. 1995).
Amplifikasi gen pMMO menggunakan
primer A189f dan A682r menghasilkan pita
DNA dengan ukuran ~500 bp dan ~300 bp
berturut-turut untuk isolat BGM 1 dan SKM
14. Analisis sekuen amplikon dari BGM 1
menggunakan program BLAST-N dan
BLAST-X
berturut-turut
menunjukkan
kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (87%)
dan asam amino pada protein (71%) acyl-coA
dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus
Py2. Sedangkan analisis sekuen amplikon dari
SKM 14 menggunakan program BLAST-N
dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan
kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (84%)
dan asam amino pada protein (62%) subunit B
cytochrome bc1 Sinorhizobium fredii HH103.
Hasil analisis kedua sekuen amplikon
tersebut tidak sesuai dengan gen target (pMMO
pada bakteri metanotrof).
Ketidaksesuaian
hasil analisis tersebut diduga disebabkan
antara lain oleh spesifitas primer yang rendah,
sekuen yang dianalisis terlalu pendek, atau
keterbatasan data base pada GeneBank.
Primer A189F/A682r diduga kurang
spesifik untuk mengamplifikasi gen pMMO
bakteri tropis walaupun primer ini berhasil
diaplikasikan
untuk
mendeteksi
serta
menganalisis keragaman gen pMMOA
metanotrof di padang rumput dan oaks di
Denmark (Bourne et al. 2001). Holmes et al.
(1995)
melaporkan
bahwa
primer
A189F/A682r juga dapat mengamplifikasi gen
Ammonium Mono-oxygenase (AMO) yang
terdapat pada bakteri pengoksidasi amonium.
Selain primer tersebut, gen pMMO juga dapat
diamplifikasi
menggunakan
primer
A189f/mb661 yang lebih spesifik untuk
mendeteksi gen pMMO bakteri metanotrof
(Bourne et al. 2001).
Ketepatan dan nilai tingkat kemiripan
pada hasil
analisis kesejajaran sekuen
menggunakan program BLAST-N dan
BLAST-X juga sangat dipengaruhi oleh
panjang sekuen DNA yang dianalisis dan
kelengkapan data base yang terdapat pada
GeneBank. Semakin panjang sekuen yang
dianalisis dan semakin banyak data base yang
terdapat pada GeneBank, maka semakin tinggi
tingkat ketepatan dan nilai tingkat kemiripan
yang akan diperoleh. Sebagian besar data yang
terdapat pada GenBank berasal dari sampel
daerah temperate. Sedangkan sekuen DNA
yang dianalisis pada penelitian ini berasal dari
bakteri tropis. Oleh karena itu, hasil analisis
sekuen amplikon gen pMMO yang diperoleh
dalam penelitian ini tidak sesuai dengan gen
target.
SIMPULAN
Morfologi isolat BGM 1 dan SKM 14
memperlihatkan perbedaan warna koloni,
tepian, dan elevasi. BGM 1 memperlihatkan
warna koloni putih, tepian licin, dan elevasi
cembung, sedangkan SKM 14 memperlihatkan
warna koloni krem jingga, tepian licin, dan
elevasi cembung. Analisis sekuen amplikon
dari BGM 1 menggunakan program BLAST-N
dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan
kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (87%)
dan asam amino pada protein (71%) acyl-coA
dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus
Py2. Sedangkan analisis sekuen amplikon dari
SKM 14 menggunakan program BLAST-N
dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan
kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (84%)
dan asam amino pada protein (62%) subunit B
cytochrome bc1 Sinorhizobium fredii HH103.
Ketidaksesuaian hasil analisis tersebut diduga
disebabkan antara lain oleh spesifitas primer
yang rendah, sekuen yang dianalisis terlalu
pendek, atau keterbatasan data base pada
GeneBank.
SARAN
Perlu dilakukan lebih lanjut penelitian
terhadap gen pMMO BGM 1 dan SKM 14
dengan menggunakan primer yang lebih
spesifik.
DAFTAR PUSTAKA
Astuti DD. 2009. Karakterisasi Fisiologi dan
Identifikasi
Molekuler
Isolat-Isolat
Bakteri Metanotrof Asal Sawah Wilayah
Bogor dan Sukabumi [skripsi]. Bogor:
Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor.
5
Bourne DG, McDonald IR, Murrell JC. 2001.
Comparison of pmoA PCR primer sets as
tools for investigating methanotroph
diversity in three Danish soils. Appl
Environ Microbiol 67:3802-3809.
Conrad R and Rothfus F. 1991. Methane
oxidation in the soil surface layer of
aflooded rice field and the effect of
ammonium. Biol Fertil Soil 12:28-32.
Dispirito AA et al. 1992. Trichloroethylene
oxidation by the membrane associated
methane monooxygenase in type I, type II
and
type
X
methanotrophs.
Biodegradation 2:151–164.
Eller G, Frenzel P. 2001. Changes in activity
and community structure of methaneoxidizing bacteria over the growth period
of rice. Appl Environ Microbiol 67:23952403.
Graham DW, Korich DG, Leblanc RP, Sinclair
NA, Arnold RG. 1992. Application of a
colorimetric plate assay for soluble
methane monooxygenase activity. Appl
Environ Microbiol 58:2231-2236.
Hanson R, Hanson TE. 1996. Metanotropic
bacteria. J Microbial Rev 60:439-471.
related. FEMS Microbiol Lett 132:203–
208.
Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT,
Williams ST. 1994. Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology. Ed ke-9.
Lippincott William & Wilkins: a Wolter
Kluwer Co.
Lazo GR, Roffey R, Gabriel DW. 1987.
Conservation of plasmid DNA sequences
and pathovar identification of strain
Xantholomonas
campestris.
Pytopathology 77: 1461-1467.
Murrell JC, Dalton H. 1992. Methane and
Methanol Utilizers. New York: SpringerVerlag.
Semrau et al. 1995. Particulate methane
monooxygenase genes in methanotrophs.
J Bacteriol 177:3071-3079.
Stanley SH, Prior SD, Leak DJ, Dalton H.
1983. Copper stress underlies the
fundamental change in intracellular
location of methane monooxygenase in
methane-oxidizing organisms: studies in
batch and continuous culture. Biotechnol
Lett 5:487-492.
Hapsari W. 2008. Isolasi dan karakterisasi
bakteri metanotrof asal sawah di Bogor
dan Sukabumi [skripsi]. Bogor : Institut
Pertanian Bogor.
Tamura K et al. 2011. MEGA5: Molecular
evolutionary genetics analysis using
maximum
likelihood,
evolutionary
distance, and maximum parsimony
methods. Mol Biol Evol 28:2731-2739.
Holmes AJ, Costello A, Lidstrom ME, Murrell
JC. 1995. Evidence that particulate
methane monooxygenase and ammonia
monooxygenase may be evolutionarily
Whittenburry RKC, Phillips, Wilkinson JG.
1970. Enrichment, isolation and some
properties of methane utilizing bacteria. J
Gen Microbiol 61:205-218.
LAMPIRAN
7
Lampiran 1 Komposisi media Nitrate Mineral Salt (NMS) 300 ml + 1% metanol
1.
120 µl NH4Cl
2.
1200 µl CaCl2
3.
0.3 g MgSO4
4.
150 µl Trace Element
5.
1632 µl KH2PO4
6.
0.3 gr NaNO3
7.
2151 µl Na2HPO4
8.
6 g agar
9.
300 ml akuades
10. 1% metanol
8
Lampiran 2 Sekuen pita DNA isolat BGM 1 dan SKM 14
BGM 1
SKM 14
9
10
Lampiran 3 Hasil sekuen gen pMMO, BLAST-N, dan BLAST-X isolat BGM 1 dan SKM 14
A. Urutan nukleotida gen pMMO isolat BGM 1
ACGACACCGTGAGGAAGAAGGGGTCCACCACCTCGTCGTTGGACTTGTCG
CCGTCGACGATGGGGCCCACGAGAGCCTCCTTGGACATCACCTCCTTTTC
CACCACGATGGGCCCCGACTGGTTGCCGCGGAGGCCCAGGCCGTCCCACT
CGGAGGGGTTGGCCTTCACCTCGTCCTTGGTGACGAGGAAGGGGAAAGGT
CGGAATAGTCACCAGAGAATCCGGGGCTGGTGGTCTGCACTATGTACCAG
TCTCAAAAGCCTCCGGAGGTGGTCCAGGAGGCCTTCTTCTCCGCCT
B. Hasil BLAST-N sekuen gen pMMO isolat BGM 1 dengan data GenBank
C. Hasil BLAST-X sekuen gen pMMO isolat BGM 1 dengan data GenBank
11
D. Urutan nukleotida gen pMMO isolat SKM 14
CAACCTGTTCTCGTCTCTGAACGAGATCATCCCGGGTGTCGGCACCGCCATCGTCG
AATGGCTGTGGGGCGGCTACTCCGTCTCCGGCACGACGCTGAACCGCTTCTTCTCG
CTCCACTACCTGCTGCCGTTCGTGCTTGCCGGCCTGGTCGTCCTGCACATCTGGGC
GCTGCACGTCGCGGGTCAGAACAATCCGACGGGTCTCGACATCAAGACCAAGGCC
GACGCCGTGCCGATGTTCCCGTTTGCGGTTGCCAAGGACGCAGTCGGCCTGTTCGC
GTTCCTGCTGCTGTTCGCCT
E. Hasil BLAST-N sekuen gen pMMO isolat SKM 14 dengan data GenBank
12
F. Hasil BLAST-X sekuen gen pMMO isolat SKM 14 dengan data GenBank