Produksi Xilooligosakarida dari Xilan Tongkol Jagung Menggunakan Enzim Bakteri Streptomyces costaricanus 451-3

! "

!
&
' ()
!
0&
#
!

#$

%
!
&

&
"

#&
#

!

&
%

"#

2

#

# %
% "&#
,( -. !
!
%
$
& 1&# # $
%
!

!#
% "&#

%
"&#

#$
"&#

#

&
/

#*

# !#

,( -./ "&#

!
$
# $
%

#$
"

%
!
!
!

$
$
$

+,
!
"# #$

%!
! $$ #
# !#
$
!#
%&
%
%

/ "&#

#$

/

EMMA MAUREN MOKO.
!"#
Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan TITI CANDRA SUNARTI.

Xilanase merupakan kelompok enzim ekstraseluler yang menghidrolisis

xilan atau polimer dari xilosa dan xilooligosakarida. Xilanase dapat
diklasifikasikan berdasarkan substrat yang dihidrolisis, yaitu β*xilosidase,
eksoxilanase, dan endoxilanase. Enzim xilanase dapat dihasilkan oleh
mikroorganisme dengan sumber makanan seperti limbah tongkol jagung, limbah
sekam padi, tandan kosong kelapa sawit dan kulit kedelai. Salah satu bakteri
penghasil enzim xilanase yaitu
45I*3
Hasil hidrolisis dari enzim xilanase menggunakan substrat dari limbah*
limbah pertanian menggunakan xilan tongkol jagung menghasilkan
xilooligosakarida yang dapat dimanfaatkan sebagai prebiotik. Tujuan dari
penelitian ini yaitu untuk memproduksi xilooligosakarida dari xilan tongkol
jagung dan memanfaatkan xilooligosakarida hasil hidrolisis sebagai prebiotik
untuk pertumbuhan
.
Penelitian ini terdiri atas lima tahap utama yaitu (1) penyiapan substrat
tumbuh dan ekstraksi xilan dari limbah pertanian yaitu tongkol jagung (2)
peremajaan isolat dan penyiapan inokulum (3) penentuan waktu produksi aktifitas
enzim xilanase tertinggi (4) hidrolisis xilan tongkol jagung menggunakan enzim
xilanase (5) analisis distribusi komposisi gula hasil hidrolisis dan (6) uji produk
hidrolisis sebagai prebiotik pada

Tongkol jagung didelignifikasi menggunakan natrium hipoklorit 1.5%
untuk mengurangi kandungan lignin, kemudian diekstraksi dengan menggunakan
natrium hidroksida untuk mendapatkan xilan dari tongkol jagung. Xilan tongkol
jagung dihidrolisis menggunakan enzim xilanase ekstrak kasar dari bakteri
45I*3 selama 24 jam untuk memproduksi
xilooligosakarida. Hasil hidrolisis kemudian dipisahkan berdasarkan berat
molekul dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel. Xilooligosakarida dengan
berat molekul yang lebih besar kemudian digunakan sebagai sumber karbon pada
media MRS untuk pertumbuhan
.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstraksi yang dilakukan dengan
menggunakan natrium hidroksida 15% menghasilkan xilan tongkol jagung dengan
rendemen sebesar 10.84%. Aktifitas enzim xilanase tertinggi dari isolat
45I*3 dicapai pada hari ke*6 yaitu sebesar 1.174
Unit/ml dan aktifitas spesifik xilanase sebesar 13.443 Unit/mg.
Hasil hidrolisis enzim xilanase selama 24 jam pada substrat xilan sebesar
0.5%, 1.0% dan 1.5% menghasilkan xilooligosakarida dan xilosa dengan total
gula tertinggi dihasilkan oleh hidrolisis pada media dengan konsentrasi 1.5% yaitu
1.98 mg/ml, gula pereduksi tertinggi dihasilkan oleh hidrolisis pada media xilan
tongkol jagung dengan konsentrasi 1.5% yaitu 1.87 mg/ml. Derajat polimerisasi

hasil hidrolisis xilan tongkol jagung menggunakan isolat
45I*3 menghasilkan nilai pada kisaran 1.02 hingga 2.59.
Dari hasil pemurnian menggunakan kromatografi filtrasi gel, total gula
xilan tongkol jagung 0.5%, fraksi dengan total gula tertinggi dihasilkan oleh fraksi
ke*33 dengan persentase sebesar 4.40% sedangkan total gula tertinggi untuk xilan
tongkol jagung 1.0% dihasilkan oleh fraksi ke*15 dengan persentase sebesar 4.92.
Derajat polimerisasi hidrolisis xilan tongkol jagung oleh enzim xilanase
dapat menghasilkan xilooligosakarida rantai pendek dengan derajat polimerisasi
untuk xilan tongkol jagung 0.5% berkisar antara 1.63 hingga 4.40 sedangkan
derajat polimerisasi untuk xilan tongkol jagung 1.0% berkisar antara 1.33 hingga
3.92.
Uji sebagai prebiotik dilakukan menggunakan xilooligosakarida hasil
hidrolisis xilan tongkol jagung fraksi ke*11 hingga fraksi ke*45. Dari hasil
perhitungan TPC (
) untuk
yang ditumbuhkan
pada media MRS dengan substitusi prebiotik sebagai sumber karbon adalah 1.5 x
106 cfu/ml sedangkan hitungan cawan untuk
yang ditumbuhkan pada

7
media MRS adalah 2 x 10 cfu/ml.

!
# $

% &

!

"

'

(

)
*

+

,

-

. !

! *

/

-

)

0

"
/
+

%

1

,

# +
3

2
!

!
!

$

'

"
1

1

#
(

# .
# .

(

$
2

!
*

*

*
5

%

4

4 4444

(
(

.

5

-

!

*

444444

6

2
*
7
#

8

444444444444

%

5

44

1

#/9 44444

$
6

! *

$

#/9 4444

%

"

%

%

!

!

5

44444

!

5

44444

(

*

#/9 4

: ' %

%

*

' %

%

*

#
#

6
4 444444

-

! *

,;.

!

!

-

! *

,;. 4444444444

6
:
:

$

(
27.
%

%

#:
4444444

44444444
#

9 *
+

%

*

%

6

%

5

#
#

444444

5

: #<

*
44444444444

5

:<

*
44444444444

"

#

#"

#(

:

Perkembangan jumlah penduduk yang semakin meningkat dari tahun ke
tahun mengakibatkan terjadinya peningkatan konsumsi pangan. Peningkatan
konsumsi pangan mendorong terjadinya kemajuan dalam bidang pertanian yang
berimplikasi peningkatan volume limbah limbah pertanian seperti limbah tongkol
jagung, limbah tandan kosong kelapa sawit, limbah jerami padi, limbah kulit
kedelai dan sebagainya.
Limbah hasil pertanian secara kimiawi mengandung lignin, hemiselulosa,
dan selulosa yang sering disebut sebagai limbah lignoselulosik.

Hemiselulosa

bersama sama dengan selulosa dan lignin merupakan komponen terbesar
penyusun struktur dinding sel tumbuhan (Saha 2003). Berdasarkan komposisi
gulanya, hemiselulosa diklasifikasikan sebagai xilan, manan, arabinogalaktan dan
arabinan. Xilan, suatu heteropolimer kompleks dengan rantai utama gugus xilosil
(ß 1,4 D xilosa) dan biasanya mengandung rantai samping berupa gugus asetil,
arabinosil, dan glukuronosil (Biely 1985).
Limbah limbah pertanian tersebut dapat dimanfaatkan sebagai media
pertumbuhan mikroorganisme yang mampu mendegradasi bahan berlignoselulosa.
Xilanase merupakan kelompok enzim ekstraseluler yang menghidrolisis xilan atau
polimer dari xilosa dan xilooligosakarida. Xilanase dapat diklasifikasikan
berdasarkan substrat yang dihidrolisis, yaitu β xilosidase, eksoxilanase, dan
endoxilanase (Beg

2001).

Enzim xilanase dapat dihasilkan oleh mikroorganisme dengan sumber
makanan seperti limbah tongkol jagung, limbah sekam padi, tandan kosong kelapa
sawit dan kulit kedelai. Salah satu bakteri penghasil enzim xilanase yaitu
sp
sp. merupakan bakteri Gram positif berasal dari tanah yang
dapat memproduksi sejumlah metabolit sekunder dan protein ekstraseluler
termasuk enzim hidrolase yang dapat mendegradasi polisakarida seperti xilan,
selulosa dan kitin (Tsujibo

. 2002).

2

Saat ini pemanfaatan mikroba sebagai agen bioteknologi makin
meningkat, karena beberapa keunggulannya antara lain perbanyakannya mudah
dan dapat dikendalikan, substrat pertumbuhan relatif murah, bahkan dapat
menggunakan limbah pertanian, dan dapat menghasilkan enzim yang cukup
banyak sehingga potensial dikembangkan untuk skala industri (Bachrudin

.

2000).
Hasil hidrolisis enzim xilanase menggunakan substrat dari limbah limbah
pertanian seperti tongkol jagung dapat berupa xilooligosakarida yang dapat
dimanfaatkan sebagai prebiotik. Prebiotik merupakan bahan makanan bersifat
(tidak dapat dicerna) yang memiliki efek menguntungkan dengan
menstimulasi pertumbuhan bakteri non patogen yang secara alami hidup di usus
Prebiotik yang banyak dikenal dan digunakan adalah oligosakarida dari kedelai
(yang terdiri atas rafinosa dan stakiosa), frukto oligosakarida (disebut juga
oligofruktosa), inulin, laktulosa dan laktosukrosa (Gibson dan Roberford 1995).
Penelitian terdahulu telah berhasil melakukan karakterisasi beberapa
bakteri

sp. yang potensial untuk menghasilkan enzim xilanase dan

menghasilkan xilooligosakarida dengan memanfaatkan xilan tongkol jagung
sebagai substrat (Meryandini
xilanase yang dihasilkan oleh

. 2007). Oleh karena itu penggunaan enzim
45I 3 dan xilan dari

tongkol jagung mempunyai peluang yang sangat besar untuk menghasilkan
xilooligosakarida yang nantinya akan dimanfaatkan sebagai prebiotik.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memproduksi xilooligosakarida
dari xilan tongkol jagung melalui hidrolisis enzim yang dihasilkan oleh
45I 3 dan memanfaatkan xilooligosakarida sebagai
prebiotik untuk pertumbuhan

3

Jagung adalah salah satu tanaman sektor pertanian yang cukup banyak
dikonsumsi oleh berbagai masyarakat di dunia dan merupakan salah satu produk
pertanian yang banyak dihasilkan di Indonesia. Tanaman jagung di Indonesia
merupakan tanaman pangan yang penting setelah tanaman padi. Jagung berasal
dari daerah tropis, tetapi karena banyak tipe tipe jagung dengan variasi sifat sifat
yang dipunyainya dan sifat adaptasi yang tinggi maka jagung dapat menyebar luas
dan dapat hidup baik di berbagai iklim.
Pada tahun 2004 produksi jagung nasional mencapai 11.225.243 ton dan
meningkat menjadi 12.523l.894 ton pada tahun 2005 (Anonim 2005). Produksi
jagung tahun 2008 sebesar 16.32 juta ton pipilan kering. Dibandingkan produksi
tahun 2007 terjadi kenaikan sebesar 3.04 juta ton (22.85%). Kenaikan produksi
terjadi karena peningkatan luas panen seluas 372.99 ribu hektar (10.27%) dan
produktivitas sebesar 4.18 kuintal/hektar (11.42%). Pemanfaatan jagung saat ini
sangat beraneka ragam mulai dari bahan pangan hingga bioenergi (Anonim 2008).
Buah jagung terdiri atas beberapa bagian yaitu kelobot (kulit), biji dan
tongkol. Buah jagung terdiri atas 30% limbah yang berupa tongkol jagung
sedangkan sisanya adalah kulit dan biji.

Tongkol jagung adalah tempat

pembentukan lembaga dan gudang penyimpanan makanan untuk pertumbuhan biji
serta merupakan modifikasi dari cabang dan mulai berkembang pada ruas ruas
batang (Koswara 1991).
Tongkol jagung merupakan bagian dari buah jagung yang telah diambil
bijinya sehingga merupakan limbah padat karena tongkol jagung tidak dapat
dikonsumsi. Menurut Maynard dan Loosli (1993) komposisi kimia tongkol jagung
terdiri atas 35.5% serat, 2.5% protein, 0.12% kalsium, 0.04% fosfor dan zat zat
lainnya sebesar 38.16%. Tongkol jagung mengandung lignoselulosa yang terdiri
atas lignin (16%), selulosa (40%), dan hemiselulosa (36%). Komponen penyusun
hemiselulosa terbesar adalah xilan yang memiliki ikatan rantai β 1,4 xilosida, dan
biasanya tersusun atas 150 200 monomer xilosa (Kulkarni

. 1999). Rantai

4

xilan dapat terdiri atas dua atau lebih jenis monomer penyusun (heteropolimer),
seperti 4 0 metilglukoronoxilosa, dan dapat pula terdiri atas satu jenis monomer,
seperti xilan yang merupakan polimer xilosa. Xilan dari serealia banyak
mengandung L arabinosa dan arabinoxilan, sedangkan xilan dari tanaman keras
mengandung glukuronoxilan yang dapat menghasilkan asam d glukoronik
(Kulkarni

. 1999).

Limbah tanaman pangan seperti tongkol jagung, bagas tebu, jerami padi,
dedak gandum, dan biji kapas mengandung xilan sebesar 16 40% (Jaeggle 1975).
Tongkol jagung memiliki kandungan xilan yang lebih tinggi dibanding sekam,
bekatul, ampas pati garut, dan onggok (Richana

. 2004).

sp. merupakan bakteri Gram positif yang berasal dari tanah
dan diketahui dapat mensekresikan protein dalam jumlah yang besar. Bakteri ini
membentuk filamen bercabang sebagai jaringan yang disebut miselium.
Komposisi basa berkisar pada 63 78% GC. Diameter filamen berukuran 0.5 1.0
;m dan pada fase vegetatif seringkali tidak berdinding melintang. Pertumbuhan
dari

sp. berlangsung pada ujung filamen diikuti dengan percabangan

(Sunatmo 2009). Sebagian besar sekresi proteinnya merupakan enzim yang dapat
menghidrolisis material organik kompleks untuk bertahan hidup (Hayakawa
2003).
Genus

termasuk ke dalam kelas

membentuk

spora yang menunjukkan sebuah perkembangan daur hidup kompleks dengan
cabang miselium vegetatif yang menyatu pada substrat dengan bentuk miselium
aerial yang memiliki hifa berdiameter lebih besar.
ditemukan dalam tanah terutama pada

dan jumlahnya semakin berkurang

dengan semakin dalamnya tanah. Genus
seperti tanah, laut, dan sungai (Lo

banyak

tersebar di berbagai habitat

2002).

hidup pada lingkungan dengan pH cukup tinggi (6.5 8.0)
dengan kondisi tanah setengah kering sampai kering. Pertumbuhan optimum
tercapai pada kondisi pH netral dengan suhu 25 350C, tetapi ada
juga yang dapat tumbuh pada kisaran suhu 45 550C.

umumnya

5

tergolong bakteri aerob yang bersifat saprofit, dorman dalam bentuk spora yang
akan berkembang menjadi miselium apabila nutrisi, suhu, kelembaban dan
kondisi lainnya sesuai dengan syarat tumbuhnya (Alexander 1961 ; Miyado
2003).
sp. memproduksi sejumlah metabolit sekunder dan protein
ekstraseluler, termasuk enzim hidrolase yang dapat mendegradasi polisakarida
seperti xilan, selulase dan kitin (Tsujibo
Genus

2002).

umumnya tumbuh subur, membentuk banyak sekali

hifa bercabang, miselium substrat jarang yang bersekat, miselium aerial cepat
matang membentuk spora dari pucuk belahannya dan membentuk rantai spora
panjang yang menggulung (Miyado 2003).
sp. sudah dikenal luas karena kemampuannya untuk
mensintesis senyawa senyawa yang dapat diproduksi dalam skala industri seperti
antibiotik dan enzim.

sp berperan penting dalam proses daur ulang

senyawa organik di alam dan diketahui dapat menghasilkan berbagai macam
enzim seperti selulase, xilanase, kitinase, amilase dan protease (Hayakawa 2003).
45I 3 merupakan isolat yang berasal dari
Kalimantan dan memiliki beberapa karakter yang menarik. Ekstrak kasar enzim
xilanase yang dihasilkan oleh

45I 3 memiliki aktifitas

yang cukup tinggi pada kondisi optimumnya yaitu pH 5.0 dan suhu 50 0C serta
tahan pada penyimpanan di

selama satu bulan. Pemurnian xilanase

menggunakan pengendapan dengan polimer anion Eudagrit S100 2% dan
kromatografi kolom menggunakan Sephadex G100 menghasilkan aktifitas
optimum pada pH dan suhu yang sama dan meningkat 25.84 kali dibandingkan
dengan enzim ekstrak kasarnya. Protein hasil pemurnian memiliki dua pita dengan
berat molekul 39.2 kDa dan 43.2 kDa dengan nilai Km dan Vmax berturut turut
sebesar 9057.971 IU/mg dan 7.429 mg/ml serta diduga memiliki aktifitas endo
xilanase, arabinofuranosidase dan β xilosidase (Meryandini

2007).

Pengukuran menggunakan HPLC terhadap produk hasil hidrolisis menunjukkan
bahwa produk dominan enzim xilanase dari
adalah xilosa (Hendarwin 2005).

45I 3

6

Enzim adalah molekul biopolimer yang tersusun dari serangkaian asam
amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim
memegang peranan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. Enzim bekerja
dengan urut urutan tertentu, mengkatalisis ratusan reaksi bertahap yang
menguraikan molekul nutrien, reaksi yang menyimpan dan mengubah energi
kimiawi dan membuat makromolekul sel dari prekusor sederhana (Lehninger
1982).
Penggunaan mikroorganisme untuk produksi enzim mempunyai beberapa
kelebihan, diantaranya mudah diproduksi dalam skala besar, waktu produksi
relatif pendek serta dapat diproduksi secara berkesinambungan dengan biaya yang
relatif rendah. Mikroorganisme relatif lebih mudah ditumbuhkan pada lingkungan
yang dapat dikontrol dan memungkinkan galur terpilih dapat hidup pada kondisi
mendekati ideal dan termonitor sehingga menghasilkan produk dengan
produktivitas yang tinggi dan konsisten (Irawadi 1990).
Xilanase merupakan enzim ekstraseluler yang dapat menghidrolisis xilan
menjadi xilooligosakarida dan xilosa. Xilanase dihasilkan oleh berbagai mikroba
seperti cendawan dan bakteri (Beg

. 2001). Salah satu bakteri penghasil

xilanase yang potensial yaitu

(Ruiz Arribas

. 1995). Aplikasi

xilanase untuk industri diantaranya pada industri pangan, pakan, dan pemutih
bubur kertas/pulp. Penggantian penggunaan klor dengan enzim xilanase untuk
pemutihan pulp telah memberikan peluang untuk aplikasi bioteknologi
(Bourbonnais

. 1997 ; Beg

. 2001).

Enzim yang digunakan untuk menghidrolisis substrat hemiselulosa kaya
xilan disebut kompleks enzim xilanase (xilanolitik). Hidrolisis sempurna xilan
memerlukan aktivitas sinergis kelompok enzim hemiselulosa di antaranya adalah
enzim

β

, β

, α

.

Enzim ini mengkatalisa proses hidrolisis ikatan 1,4 β D xilosidik pada xilan
untuk memproduksi D xilosa.
Xilanase dapat diklasifikasikan berdasarkan substrat yang dihidrolisis,
yaitu β xilosidase, eksoxilanase, dan endoxilanase. β xilosidase, yaitu xilanase
yang mampu menghidrolisis xilooligosakarida rantai pendek menjadi xilosa.

7

Aktivitas enzim akan menurun dengan meningkatnya rantai xilooligosakarida
(Reilly 1991; Dekker 1983). Mekanisme kerja enzim xilanase dalam
menghidrolisis substrat dapat dilihat pada Gambar 1.

Ikatan β 1,4 xilosida

α D glukoronidase

Eksoxilanase

Endo 1,4 β xilanase
α arabinofuranosidase
Gambar 1. Struktur xilan dan enzim yang terlibat dalam hidrolisis (Beg
2001)
Eksoxilanase mampu memutus rantai polimer xilosa (xilan) pada ujung
reduksi, sehingga menghasilkan xilosa sebagai produk utama dan sejumlah
oligosakarida rantai pendek. Endoxilanase mampu memutus ikatan β 1,4 pada
bagian dalam rantai xilan secara teratur. Ikatan yang diputus ditentukan
berdasarkan panjang rantai substrat, derajat percabangan, ada atau tidaknya gugus
substitusi, dan pola pemutusan dari enzim hidrolase tersebut. Hemiselulosa xilan
merupakan polimer xilosa yang berikatan β 1,4 dengan jumlah monomer 150 200
unit (Sunna dan Antraniklan 1997). Rantai xilan bercabang dan strukturnya tidak
berbentuk kristal sehingga lebih mudah dimasuki pelarut dibandingkan dengan

8

selulosa. Sebagian besar xilan terdiri atas ikatan 2 4 heteroglikan. Heteroglikan
yang umum dijumpai adalah arabino D xilan, L arabino D glukurono D xilan, 4
0 metil D glukorono D xilan, L arabino D xilan, D gluko D mannan, D galakto
D gluko D mannan, dan L arabino D galaktan (Beg

!"

#

. 2001).

! #

Prebiotik didefinisikan sebagai komponen yang tidak dapat dicerna yang
meng hasilkan pengaruh menguntungkan terhadap inang dengan cara menstimulir
secara selektif pertumbuhan satu atau lebih mikroba pada saluran pencernaan
sehingga dapat meningkatkan kesehatan inang. Suatu komponen pangan dapat
diklasifikasikan sebagai prebiotik bila memenuhi beberapa persyaratan yaitu tidak
terhidrolisis atau terserap pada saluran pencernaan bagian atas, secara selektif
dapat menstimulir pertumbuhan bakteri yang menguntungkan pada kolon, dapat
menekan pertumbuhan bakteri patogen sehingga secara sistemik dapat
meningkatkan kesehatan (Gibson dan Roberford 1995).
Prebiotik pada umumnya merupakan karbohidrat dengan bobot molekul
rendah yang tidak dapat diserap dan dicerna serta umumnya berbentuk
oligosakarida dan serat pangan (Silalahi dan Hutagalung 2002). Prebiotik dapat
diperoleh dengan beberapa cara, yaitu ekstraksi langsung polisakarida alami dari
tumbuhan, hidrolisis polisakarida alami, atau secara enzimatis dengan enzim
hidrolase atau glikosil transferase yang mengkatalisis reaksi transglikosilasi
hingga terbentuk oligosakarida sintetik dari mono serta disakarida (Grizard dan
Barthomeuf 1999).
Oligosakarida adalah karbohidrat berbobot molekul rendah, terdiri atas
tiga sampai 10 gugus gula sederhana (monosakarida). Oligosakarida adalah
sejenis karbohirat rantai pendek, yang berfungsi sebagai prebiotik atau zat
makanan yang tidak dicerna di dalam tubuh yang bermanfaat untuk menstimulasi
pertumbuhan bakteri non patogen di dalam usus sehingga meningkatkan
ketahanan sistem pencernaan. Sifat oligosakarida yang tidak dicerna ataupun
diserap oleh saluran pencernaan akan mencapai usus besar dalam keadaan utuh
dan digunakan sebagai makanan oleh bakteri non patogen di dalam usus besar
yaitu

dan

(Muchtadi 2009).

9

Prebiotik yang banyak dikenal dan digunakan adalah oligosakarida kedelai
(yang terdiri atas rafinosa dan stakiosa), fruktooligosakarida (disebut juga
oligofruktosa), Inulin, Laktulosa dan Laktosukrosa. Inulin dan oligofruktosa
memiliki

fungsi

(menyeimbangkan

penting

sebagai

mikroflora

kolon)

penyeimbang
dan

fungsi

modulasi

gastrointestinal

hormonal.

Dengan

mengkonsumsi oligosakarida (prebiotik) diharapkan akan terjadi fermentasi di
dalam usus besar oleh probiotik sehingga terbentuk asam lemak rantai pendek
(Gibson dan Roberford 1995).

$

!

! % & !

'

Pemurnian enzim secara umum dilakukan melalui kromatografi kolom dan
elektroforesis. Kromatografi kolom menggunakan prinsip sistem pengaliran suatu
fluida melalui kolom yang mengandung matriks bahan pengisi dan substansi yang
ingin dipisahkan menjadi beberapa komponen dengan adanya perbedaan daya ikat
terhadap bahan pengisi. Berbagai teknik kromatografi kolom untuk pemurnian
enzim antara lain kromatografi filtrasi gel, kromatografi pertukaran ion,
kromatografi interaksi hidrofobik dan kromatografi afinitas. Pemurnian enzim
dengan kromatografi kolom merupakan cara yang paling efektif dibandingkan
dengan semua cara pemisahan yang lain (Suhartono 1989). Analisis karbohidrat
dengan kromatografi dilakukan terutama untuk mengetahui jenis gula sederhana
yang menyusun suatu karbohidrat. Polisakarida harus dihidrolisis terlebih dahulu
menjadi gula sederhana yang dapat dikerjakan dengan asam atau enzim (Adnan
1997).
Kromatografi filtrasi gel merupakan metode pemisahan yang penting
dalam pemurnian enzim. Beberapa istilah lain juga digunakan untuk filtrasi gel
yaitu

dan
(Bollag

1996). Kromatografi filtrasi gel dalam pemurnian

enzim menggunakan prinsip perbedaan berat molekul atau ukuran antara protein
enzim target dengan gel penyaring dalam kolom.
Gel merupakan struktur jaringan tiga dimensi yang terbentuk karena
adanya ikatan silang yang terjadi dalam proses polimerisasi. Gel tersebut secara
selektif dapat mengeksklusikan molekul molekul yang besar dari lubang lubang

10

yang dimilikinya. Jadi molekul yang lebih besar dari ukuran pori akan mengalami
eksklusi sedangkan yang lebih kecil akan masuk melalui pori di dalam struktur gel
tersebut (Adnan 1997). Gel penyaring berupa dekstran yang akan memisahkan
protein berdasarkan berat molekulnya (Suhartono 1989). Beberapa matriks yang
digunakan dalam filtrasi gel adalah dekstran, akrilamid, agarosa dan polistiren.
Beberapa istilah juga digunakan untuk gel dari polimer yang berbeda, misalnya
sephadex (gel dekstran), superose (gel agarosa), bio gel (gel akrilamida), superdex
(gel agarosa/dekstran), sephacryl (dekstran/bis akrilamida) (Hedlund 2004).
Gel dekstran biasanya disebut juga dengan istilah sephadex yang bersifat
tahan terhadap garam atau basa pada konsentrasi tinggi, akan tetapi rusak oleh
asam di bawah pH 2.0 dan merupakan oksidator kuat (Suhartono 1989). Dekstran
merupakan polimer gula yang larut dalam air yang telah mengalami reaksi
dengan bantuan epikhlorhidrin. Hasil yang didapat adalah dekstran yang
tidak larut di dalam air, akan tetapi masih dapat menyerap molekul molekul air di
dalam molekulnya sendiri. Daya serap ini bergantung pada jumlah
atau ikatan silang yang terjadi. Filtrasi gel merupakan teknik pemurnian yang
efektif dalam pemisahan enzim dari pelarut penggumpal, larutan garam dan buffer
yang tidak dikehendaki (Ersson

1998).

Gel sephadex terdiri atas partikel kecil dari senyawa yang tidak larut,
bersifat hidrofilik, dibuat dengan ikatan silang polisakarida dekstran sehingga
terbentuk jala tiga dimensi dari rantai polisakarida tersebut. Molekul ini bersifat
sangat

polar

karena

kandungan

gugus

hidroksilnya

menggelembung cukup besar bila direndam dalam air.

yang

tinggi

dan

Keuntungan dalam

penggunaan sephadex adalah penggunaannya yang dapat berulang kali. Setelah
digunakan, kolom dapat dicuci menggunakan air dan disimpan dalam ruang
dingin (Nur

1992).

11

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Hewan dan
Biomedis, PPSHB IPB dari bulan Januari 2009 – Desember 2009.

Bahan"bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tongkol jagung
varietas Silangan Darmaga 3 (SD 3), isolat bakteri xilanolitik yaitu bakteri
45I"3, isolat bakteri

, isolat bakteri

patogen, natrium hipoklorit (NaOCl), asam klorida (HCl), natrium
hidroksida (NaOH), etanol 96%, aquades, media pertumbuhan bakteri, media
produksi xilanase, media MRS (

), larutan buffer sitrat pH

5.0, asam dinitrosalisilat (DNS), asam sulfat (H2SO4), gel Sephadex CL 6B,
natrium karbonat (Na2CO3), natrium hidrogen karbonat (NaHCO3), kalium sianida
(KCN), asam sulfat (H2SO4), fenol, potasium ferisianida (K3Fe(SCN)6) dan
natrium azida (NaN3).
Alat"alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah

dengan

saringan berukuran 40 dan 80 mesh, oven, inkubator bergoyang, penangas air,
sentrifuse, alat"alat gelas, pH meter, spektrofotometer, dan kolom kromatografi
dan

serta mikroskop cahaya.

Penelitian ini terdiri atas lima tahap utama yaitu (1) penyiapan substrat
tumbuh dan ekstraksi xilan dari limbah pertanian yaitu tongkol jagung (2)
peremajaan isolat dan penyiapan inokulum (3) penentuan waktu produksi aktifitas
enzim xilanase tertinggi (4) hidrolisis xilan tongkol jagung menggunakan enzim
xilanase (5) analisis distribusi komposisi gula hasil hidrolisis dan (6) uji produk
hidrolisis sebagai prebiotik pada
ini dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini.

Diagram alir dari penelitian

12

(2) Peremajaan Isolat
45I"3

(1) Penyiapan
Substrat Tumbuh

(3) Penentuan Waktu Produksi
Aktifitas Enzim Xilanase Tertinggi

Produksi Xilanase

(4) Hidrolisis
Xilan Tongkol
Jagung

(5) Analisis Distribusi
Komposisi Gula

XOs

Gambar 2. Diagram Alir Penelitian

(6) Uji Sebagai
Prebiotik

13

! "# $
Persiapan limbah pertanian yang akan digunakan sebagai substrat yaitu
tongkol jagung adalah sebagai berikut :
%%

%

Tongkol jagung dikeringkan kemudian digiling dengan
sehingga diperoleh bahan yang berupa tepung tongkol jagung dengan ukuran yang
lolos ayakan berukuran 40 mesh.
"

% &

#

Delignifikasi merupakan proses penghilangan lignin sebelum proses
ekstraksi. Tepung tongkol jagung tersebut didelignifikasi dengan perendaman
dalam larutan natrium hipoklorit (NaOCl) 1% untuk menghilangkan kandungan
lignin yang terdapat dalam limbah tersebut. Proses delignifikasi dilakukan selama
5 jam pada suhu ruang. Kondisi delignifikasi ini berdasarkan penelitian terdahulu
yang dilakukan oleh Yoshida

. (1994). Setelah proses perendaman dengan

natrium hipoklorit padatan dinetralkan melalui pencucian dengan air mengalir
kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari hingga kering.
'

#$

# (

Padatan hasil delignifikasi kemudian diekstraksi untuk mendapatkan xilan.
Metode ekstraksi xilan menggunakan metode dari Yoshida

. (1994). Padatan

tersebut direndam dalam larutan natrium hidroksida (NaOH) 15 % selama 24 jam
pada suhu 28 0C untuk mendapatkan ekstrak xilan. Setelah 24 jam dilakukan
penyaringan dengan menggunakan kain saring. Filtrat yang dihasilkan dari proses
ekstraksi diukur pHnya kemudian dinetralkan dengan menggunakan asam klorida
(HCl) 6 N sampai mendapatkan pH sekitar 4.5"5. Tahapan berikutnya adalah
proses sentrifugasi untuk memisahkan padatan dan cairan yang dilakukan selama
30 menit dengan kecepatan putaran 4000 rpm.

Endapan hasil sentrifugasi

mengandung ekstrak xilan. Xilan yang larut dalam air dipisahkan dengan
menambahkan etanol 95 %.

Etanol ditambahkan pada supernatan dengan

perbandingan supernatan"etanol adalah 1:3 kemudian dilakukan sentrifugasi
selama 30 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Hasil dari sentrifugasi ini adalah
endapan yang mengandung xilan dan supernatan.

14

##)

! $

Analisis komponen serat terdiri atas selulosa, hemiselulosa dan lignin
dilakukan sebelum dan sesudah delignifikasi untuk mengetahui kandungan
masing"masing komponen serat sebelum dan sesudah perlakuan delignifikasi.
Prosedur analisa komponen serat mengikuti metode dari Van Soest di dalam
Apriyantono (1989). Analisis komponen serat dilakukan di Laboratorium Ilmu
dan Teknologi Pakan, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas
Peternakan, Institut Pertanian Bogor.

$

*

#

Isolat

45I3 diremajakan dalam media xilan

birchwood (Lampiran 1) selama lima hari pada suhu ruang sampai isolat siap
digunakan sebagai inokulum.

&

#

+

Inokulum diinokulasikan sebanyak tiga

(

#
(diameter sekitar 0.5 cm)

koloni ke dalam 100 ml media cair xilan tongkol jagung (Lampiran 1) lalu
diinkubasi pada inkubator bergoyang pada suhu ruang selama delapan hari. Kultur
setiap hari diambil sebanyak 5 ml kemudian disentrifugasi selama 25 menit pada
kecepatan putar 3000 rpm untuk mendapatkan enzim ekstrak kasar. Supernatan
merupakan enzim ekstrak kasar xilanase kemudian dihitung aktifitasnya dengan
menggunakan

metode

DNS

(Miller

1959).

Absorbansi

spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.

dibaca

pada

Tahap ini dilakukan

selama delapan hari sehingga diketahui aktifitas enzim xilanase tertinggi.
Endapan yang dihasilkan dari hasil sentrifugasi digunakan untuk
menghitung bobot biomassa kering. Endapan yang berupa sel dari
45I"3 kemudian dikeringkan dalam oven 500C hingga kering dan
bobotnya konstan. Endapan yang telah kering kemudian ditimbang. Data bobot
biomassa kering kemudian diplotkan terhadap waktu inkubasi sehingga diperoleh
kurva pertumbuhan dari

45I"3.

Uji aktifitas enzim xilanase dilakukan dengan mengukur pembentukan
gula pereduksi hasil hidrolisis enzim xilanase yang ditentukan dengan

15

menggunakan metode DNS (Miller 1959) dapat dilihat pada Lampiran 2. Satu
unit aktifitas xilanase didefinisikan sebagai banyaknya satu Emol xilosa yang
dihasilkan dalam satu menit (Tsujibo

. 1992).

Uji aktifitas enzim xilanase pada sampel dilakukan dengan cara
mereaksikan enzim ekstrak kasar xilanase sebanyak 0.5 ml dengan 0.5 ml xilan
tongkol jagung 0.5% kemudian dihomogenisasi dengan vortex dan diinkubasi
pada suhu 50 0C selama 60 menit.

Larutan tersebut kemudian ditambahkan

dengan 1 ml pereaksi DNS, diaduk hingga homogen kemudian dipanaskan dalam
air mendidih selama 15 menit dan didinginkan dalam air. Uji aktifitas enzim
xilanase pada kontrol dilakukan dengan cara mencampurkan 0.5 ml xilan tongkol
jagung 0.5% dengan 1 ml pereaksi DNS dan 0.5 ml enzim ekstrak kasar xilanase,
dihomogenisasi dengan vortex kemudian dipanaskan pada air mendidih selama 15
menit kemudian didinginkan dalam air.

Blanko dibuat dengan cara

mencampurkan 0.5 ml substrat xilan tongkol jagung 0.5% dengan 0.5 ml aquades
steril kemudian ditambahkan dengan 1 ml pereaksi DNS, dihomogenisasi dengan
vortex kemudian dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit dan didinginkan
dalam air. Absorbansi ketiga larutan tersebut diukur dengan menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.
Kadar xilosa yang terkandung dalam masing"masing sampel dan kontrol
ditentukan berdasarkan kurva standar xilosa yang dihitung menggunakan regresi
linier. Aktifitas enzim xilanase dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut:

!

( /

)=

([

]− [

])
(150.13)

1000
(60
)

Ket : GP = gula pereduksi
FP = faktor pengenceran

Pengujian kadar protein dilakukan dengan metode Bradford (1976) dapat
dilihat pada Lampiran 4. Penentuan kadar protein dilakukan dengan cara
mereaksikan enzim ekstrak kasar sebanyak 400 Il ditambahkan dengan pereaksi
Bradford sebanyak 4 ml kemudian didiamkan selama kurang lebih 10 menit dan
diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Kadar

16

protein sampel ditentukan berdasarkan kurva standar BSA yang dihitung
menggunakan regresi linier.
Aktivitas spesifik xilanase dapat ditentukan dari nilai unit aktifitas
xilanase dibagi dengan kadar proteinnya.
!

, - $

##(

( /

%

. %

)=

%

(
"

%%

)
( )
+

(

#

Hidrolisis xilan tongkol jagung dilakukan dengan menggunakan enzim
ekstrak kasar xilanase yang diperoleh pada hari optimum xilanase. Substrat xilan
tongkol jagung pH 5.0 ditambahkan dengan enzim ekstrak kasar xilanase dengan
perbandingan 1:1 kemudian diinkubasi pada suhu optimum yaitu 500C selama 24
jam. Sebanyak 5 ml sampel hasil hidrolisis jam ke"1, jam ke"12 dan jam ke"24
diambil kemudian ditambahkan 1 ml pereaksi DNS untuk menghitung kadar gula
pereduksi, sedangkan total gula dihitung berdasarkan metode fenol sulfat (Dubois
1956) dapat dilihat pada Lampiran 3, dengan cara mereaksikan 1 ml enzim
ekstrak kasar dengan 0.5 ml larutan fenol dan 2.5 ml larutan asam sulfat.
Absorbansi untuk gula pereduksi dibaca pada panjang gelombang 540 nm
sedangkan absorbansi untuk total gula dibaca pada panjang gelombang 490 nm.
Derajat polimerisasi dihitung berdasarkan perbandingan antara total gula dengan
gula pereduksi hasil hidrolisis. Hasil hidrolisis xilan tongkol jagung dialirkan
pada kolom berisi gel Sepharose CL 6B untuk mendapatkan sebaran bobot
molekulnya.

/

##

#$" # )

##

- # - $

##

Hidrolisat sebanyak 2 ml dengan konsentrasi 0.2 mg/ml dimasukkan ke
dalam kolom kromatografi yang berukuran panjang 60 cm dan berdiameter 1.5
cm. Kolom berisi gel Sepharose CL 6B. Sampel dielusikan oleh larutan NaCl 50
mM (mengandung NaN3 0.01%) dan ditampung dalam

.

Volume setiap fraksi yaitu 2 ml. Pengamatan dilakukan terhadap kandungan total
gula (Dubois

1956) dan gula pereduksi dengan menggunakan metode Park"

Johnson dapat dilihat pada Lampiran 5 (Hizukuri 1981).

17

0 1* ! " %

$ "

Xilooligosakarida hasil proses hidrolisis tongkol jagung digunakan sebagai
sumber karbon pada media pertumbuhan bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat
yang digunakan adalah
(

yang ditumbuhkan pada media MRS
) dengan modifikasi yaitu sumber karbonnya diganti

dengan xilooligosakarida dari tongkol jagung sedangkan kriteria yang diamati
adalah ada tidaknya pertumbuhan bakteri asam laktat tersebut jika ditumbuhkan
pada media yang mengandung xilooligosakarida.

18

!"
Limbah hasil pertanian yang digunakan sebagai substrat tumbuh untuk
proses hidrolisis enzim xilanase adalah limbah tongkol jagung. Tongkol jagung
yang digunakan adalah tongkol jagung varietas Silangan Darmaga 3 (SD 3).
Pemotongan dan penggilingan akan mampu menghancurkan sebagian ikatan
jaringan serat kasar dengan memperluas permukaan dan membuka struktur
dinding sel dan memungkinkan bakteri menembus lapisan pelindung dinding sel
dan memperbanyak titik penetrasi enzim agar mudah dicerna. Perlakuan
pemotongan dan penggilingan lebih mengarah pada pemecahan karbohidrat
dibanding lignin (Murni

2008).

Tepung tongkol jagung kemudian didelignifikasi untuk mengurangi kadar
lignin yang terdapat dalam tongkol jagung. Lignin merupakan bahan organik
bukan karbohidrat yang berbentuk amorf dan tersusun atas satuan(satuan fenol
(Chang

. 1981). Proses delignifikasi merupakan perlakuan pendahuluan yang

biasa dilakukan terhadap bahan baku sehingga mempermudah mikroba dalam
mencernakan selulosa dan untuk membebaskan lignin (Suhartono 1989).
Kandungan lignin yang cukup tinggi akan mempengaruhi proses hidrolisis
enzimatik. Ikatan silang dari struktur aromatik lignin dapat memperlambat
penetrasi oleh enzim, Oleh karena itu diperlukan adanya preparasi mekanik
ataupun kimiawi untuk mempermudah kontak antara enzim dengan substrat (Sun
2002).
Pelarut yang digunakan dalam proses delignifikasi yaitu natrium hipoklorit
(NaOCl) 1%.

Perendaman dalam larutan natrium hipoklorit bertujuan untuk

memecahkan ikatan karbon dalam struktur lignin. Delignifikasi dengan natrium
hipoklorit akan menyebabkan ikatan yang terbentuk antara lignin dan polisakarida
menjadi terbuka dan mengurangi bentuk kristal dari lignin sehingga pemanfaatan
xilan oleh bakteri akan menjadi lebih mudah. Natrium hipoklorit merupakan
oksidator kuat yang mengandung ion(ion hipoklorit yang mampu memecah ikatan
karbon dalam struktur lignin (Lehninger 1982).

19

Perubahan

komposisi

serat

dari

tongkol

jagung

yang

meliputi

hemiselulosa, selulosa dan lignin juga dapat terjadi dengan adanya proses
delignifikasi. Kandungan hemiselulosa sebelum delignifikasi yaitu 3.40% naik
menjadi 10.30% setelah delignifikasi, kandungan selulosa sebelum delignifikasi
yaitu 63.84% turun menjadi 61.60% setelah delignifikasi sedangkan kandungan
lignin sebelum delignifikasi yaitu 18.95% turun menjadi 14.38%. Hal ini dapat
dilihat pada Tabel 1 di bawah ini.
Tabel 1. Komposisi serat tongkol jagung sebelum dan sesudah delignifikasi (%)
Komposisi

Sebelum Delignifikasi

Sesudah Delignifikasi

Hemiselullosa

3.40

10.30

Selullosa

63.84

61.60

Lignin

18.95

14.38

Irawadi (1999) menyebutkan bahwa tongkol jagung mengandung 40%
selulosa, 36% hemiselulosa dan 16% lignin. Selulosa merupakan struktur dasar
sel(sel tumbuhan dan merupakan komponen kayu terbesar. Hal ini sesuai dengan
hasil analisa komposisi serat tongkol jagung SD3 dimana komponen serat terbesar
dari tongkol jagung yaitu selulosa sebesar 63.84%.
Proses delignifikasi dengan natrium hipoklorit tidak dapat menghilangkan
semua kadar lignin yang terdapat pada tongkol jagung.

Agustine (2005)

menyebutkan bahwa mikrofibril selulosa dalam suatu matriks hidrofobik
dibungkus oleh lignin secara fisik dan lignin terikat secara kovalen baik pada
hemiselulosa maupun selulosa sehingga hal ini menyebabkan lignin tidak dapat
terpisah sempurna dari selulosa dan hemiselulosa. Penurunan juga terjadi pada
kadar selulosa yaitu dari 63.84% menjadi 61.60%. Hal ini menyebabkan selulosa
ikut terlarut bersama(sama dengan lignin yang larut (Agustine 2005).

Hal

sebaliknya terjadi pada komposisi hemiselulosa setelah proses delignifikasi
meningkat dari 3.40% menjadi 10.30%.

Hal ini disebabkan selama proses

delignifikasi selulosa terlarut oleh natrium hipoklorit sehingga komposisi dari
hemiselulosa meningkat.

Selama proses delignifikasi xilan ikut juga terlarut

dalam natrium hipoklorit namun jumlahnya lebih sedikit daripada selulosa karena

20

xilan relatif lebih tahan pada kondisi delignifikasi menggunakan natrium
hipoklorit (Eero 1995).
Proses terakhir dari delignifikasi adalah tepung tongkol jagung dicuci
dengan menggunakan air yang mengalir untuk menghilangkan sisa(sisa natrium
hipoklorit kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari selama lebih kurang dua
hari. Tepung tongkol jagung hasil delignifikasi yang telah kering kemudian
diekstraksi untuk mendapatkan xilan dari tongkol jagung.
Hespell (1998) menyebutkan bahwa ekstraksi xilan dapat dilakukan
dengan menggunakan beberapa pelarut seperti natrium hidroksida (NaOH),
ammonium hidroksida (NH4OH) dan kalium hidroksida (KOH). Diantara ketiga
pelarut tersebut, yang paling baik digunakan adalah natrium hidroksida karena
xilan yang dihasilkan relatif bersih dari pengotor, mempunyai warna relatif lebih
putih dibandingkan dengan pelarut(pelarut lainnya dan mudah larut dalam air.
Natrium hidroksida merupakan alkali yang paling kuat dalam mendegradasi
struktur dinding sel selain itu perlakuan dengan alkali dapat meningkatkan
kelarutan hemiselulosa. Prinsip kerja dari alkali adalah memutuskan sebagian
ikatan antara selulosa dan hemiselulosa dengan lignin, esterifikasi gugus asetil
dengan membentuk asam uronat dan merombak struktur dinding sel melalui
pengembangan jaringan serat dan memudahkan penetrasi molekul enzim
mikroorganisme (Murni

2008).

Konsentrasi natrium hidroksida yang digunakan dalam proses ekstraksi
yaitu 15%. Hal ini berdasarkan sifat xilan yang larut dalam larutan alkali dengan
konsentrasi 2(15%, selain itu konsentrasi 15% tidak menyebabkan terekstraknya
arabinogalaktan dan glukomanan yang merupakan polimer hemiselulosa selain
xilan, karena arabinogalaktan dan glukomanan hanya dapat larut pada pelarut
alkali yang lebih tinggi yaitu 17.5% (Fengel dan Wegener 1995).
Selama proses ekstraksi terjadi pemutusan ikatan karbon yang ada pada
hemiselulosa dan pelarutan selulosa.

Selama proses ekstraksi xilan sebagian

selulosa ada yang larut bersama dengan xilan Ada tiga jenis selulosa yaitu α(
selulosa, β(selulosa dan γ(selulosa. Fraksi α(selulosa adalah bagian yang tidak
larut dalam alkali, β(selulosa adalah bagian yang larut dalam alkali dan dapat
mengendap jika ditambahkan dengan asam, sedangkan γ(selulosa adalah bagian

21

yang larut dalam alkali dan tetap larut walaupun ditambahkan asam (Fengel dan
Wegener 1995).
Proses penyaringan dilakukan untuk memisahkan filtrat dan endapan.
Filtrat yang dihasilkan selama proses ekstraksi sangat kental dan berwarna
kecoklatan dengan pH yang sangat basa yaitu sekitar 12 kemudian filtrat
dinetralkan hingga mencapai pH 5.0. Metode asidifikasi ini berdasarkan sifat
xilan yang tidak dapat larut dalam asam (Vasquez

. 2001 ; Yang

2005).

Proses sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan filtrat yang mengandung
hemiselulosa dan selulosa yang larut dan endapan yang mengandung xilan. Xilan
yang bersifat dapat larut dalam air kemudian dipisahkan dengan menambahkan
etanol. Proses sentrifugasi dilakukan lagi untuk memisahkan endapan dan
supernatan. Hasil dari sentrifugasi berupa endapan yang merupakan xilan dari
tongkol jagung.

Proses delignifikasi dan ekstraksi xilan tongkol jagung

menghasilkan serbuk xilan yang berwarna kecoklatan seperti yang disajikan pada
Gambar 3.
Proses ekstraksi tongkol jagung hasil delignifikasi menghasilkan xilan
tongkol jagung kering dengan rendemen xilan yang dihasilkan dari proses
ekstraksi ini adalah 10.84%. Hasil ini hampir sesuai dengan hasil penelitian
sebelumnya dari Meryandini

. (2008) dimana rendemen ekstraksi xilan

tongkol jagung varietas Hawaii sebesar 7.5% dan rendemen ekstraksi xilan
tongkol jagung varietas Bisma sebesar 10.9% sedangkan penelitian yang
dilakukan oleh Richana

(2007) rendemen untuk tongkol jagung varietas

Bisma adalah sebesar 12%. Hal ini juga sesuai dengan yang dilaporkan oleh
Subramiyan & Prema (2002) bahwa kandungan xilan pada kayu lunak (
seperti tongkol jagung sekitar 7(12% bobot kering kayu.

)

22

Gambar 3. Xilan tongkol jagung hasil ekstraksi

Neraca massa dari proses delignifikasi dan ekstraksi tongkol jagung dapat
dilihat pada Gambar 4 di bawah ini.

Bubuk tongkol jagung
40 mesh (1100 g)

NaOCl 1%
10 l

Perendaman pada NaOCl 1%
(5 jam, suhu 280C)

Penyaringan

A

Lignin

23

A

Pengeringan di bawah sinar
matahari (48 jam)

Bubuk tongkol jagung
kering (1000 g)

NaOH 15% 6 l

Ekstraksi

Ampas
(fraksi
selulosa)

Xilan basah

Pengeringan
dengan oven (12
jam, suhu 50 0C)

Air +
etanol

(

Xilan tongkol jagung
(108.42 g)
Gambar 4. Neraca massa delignifikasi dan ekstraksi xilan tongkol jagung

24

#

$

%"

%

"

Isolat diremajakan pada media agar(agar xilan birchwood selama lebih
kurang 3 hari pada suhu ruang sehingga menghasilkan koloni yang berwarna putih
keabu(abuan seperti tampak pada Gambar 5 di bawah ini.

Gambar 5. Hasil peremajaan isolat

45I(3

Spora yang dihasilkan oleh isolat

45I(3

merupakan filamen aerial sporofor yang tegak pada permukaan dan disebut
konidia. Konidia dihasilkan melalui pembentukan dinding melintang pada
sporofor multinukleat yang diikuti dengan pemisahan sel langsung menjadi spora.
45I(3 menimbulkan bau

Spora yang dihasilkan oleh

yang sangat khas seperti bau khas tanah yang disebabkan oleh adanya senyawa
yang disebut geosmin (Paul & Clark 1996). Geosmin (trans(1, 10(dimethyl(trans(
9(decalol) merupakan senyawa metabolit yang berbau tanah, disintesa oleh
Actinomycetes

dan

Alga

hijau

biru

(Lelana

1987).

Geosmin,

suatu

sesquiterpenoid berupa cincin karbon tidak jenuh berasosiasi dengan oksigen dan
hidrogen (Sunatmo 2009).

25

&

'

(

)

*

!"

Kemampuan xilanolitik dapat dilihat dari pertumbuhan koloni isolat
45I(3 pada media substrat xilan tongkol jagung.
Pertumbuhan bakteri xilanolitik pada media cair dapat dilihat dari perubahan
warna media xilan tongkol jagung yang berubah menjadi keruh.
Kurva pertumbuhan dari

45I(3 dan kadar

protein dapat dilihat pada Gambar 6 sedangkan aktifitas harian enzim xilanase dan
aktifitas spesifik dari

45I(3 dapat dilihat pada Gambar

0.1

-1.3

0.09

-1.4
-1.5

mg/ml

0.08

-1.6
0.07
-1.7
0.06

Kadar Protein
Biomassa Kering

0.05

-1.8
-1.9
-2

0.04
0

1

2

3

4

5

Hari ke(
Gambar 6. Kurva pertumbuhan dan kadar protein dari
45I(3 pada media cair xilan tongkol jagung

6

7

8

log bobot biomassa kering

7 di bawah ini.

26

1.4

16

1.2

14
12

1

8
0.6

Aktiftas Enzim

6

Aktifitas Spesifik

4

0.4
0.2

2

0

0
0

1

2

3

4

5

6

7

Unit/mg

Unit/ml

10
0.8

8

Hari ke(
Gambar 7. Kurva aktifitas dan aktifitas spesifik enzim xilanase dari
45I(3 pada media cair xilan tongkol jagung
Kurva pertumbuhan
45I(3 adalah kurva yang
memberikan informasi mengenai fase(fase pertumbuhan yang terjadi pada
45I(3. Pertumbuhan pada bakteri mengacu pada
perubahan populasi total, bukan hanya pada suatu individu organisme saja
(Pelczar dan Chan 1986). Pola peningkatan atau penggandaan populasi selama
interval waktu tertentu atau dalam waktu beraturan akan membentuk pertumbuhan
eksponensial dan membentuk tahapan atau fase. Fase(fase tersebut adalah fase
lag, fase eksponensial, fase stasioner dan fase kematian (Sunatmo 2009).
Dari Gambar 6 di atas dapat dilihat bahwa 24 jam pertama merupakan fase
adaptasi atau fase lag dimana

45I(3 yang dipindahkan

ke media cair xilan tongkol jagung akan mengalami adaptasi terlebih dahulu pada
kondisi media cair xilan tongkol jagung. Fase pertumbuhan awal adalah hari ke(1
hingga hari ke(2. Pada fase ini ditandai dengan pertambahan biomassa dari
45I(3 yang tidak terlalu besar. Hal tersebut
mengindikasikan bahwa pada kisaran waktu tersebut
45I(3 masih beradaptasi dengan media pertumbuhan sehingga pertumbuhannya
belum optimal. Hari ke(2 sampai dengan hari ke(4 merupakan fase pertumbuhan
atau fase eksponensial yang terlihat dari kenaikan biomassa yang sangat besar.
Hal tersebut mengindikasikan bahwa pada kisaran waktu tersebut pembentukan

27

spora dari

45I(3 sangat cepat dan saat itu merupakan

waktu pertumbuhan yang paling optimal. Hari ke(4 hingga hari ke(5 merupakan
fase pertumbuhan lambat yang ditandai dengan kenaikan bobot biomassa kering
yang tidak terlalu besar. Pada hari ke(5 sampai hari ke(6 merupakan fase
stasioner. Kondisi ini juga disebut sebagai pertumbuhan seimbang karena terjadi
laju pertumbuhan dan aktifitas metabolik yang konstan. Kondisi ini berlanjut
hingga sumber karbon dan energi di media telah habis (Pelczar dan Chan 1986).
Pada hari ke(7 sampai hari ke(8 merupakan fase kematian yang terlihat dari
berkurangnya biomassa selama kisaran waktu tersebut. Hal ini mengindikasikan
bahwa sudah ada

45I(3 yang mati dikarenakan

kekurangan nutrisi serta dihasilkannya metabolit sekunder yang bersifat toksik.
Kondisi nutrisi media yang semakin berkurang serta mulai jenuhnya kondisi
lingkungan dengan metabolit sekunder yang bersifat toksik membuat sel baru
yang tumbuh menjadi sebanding dengan banyaknya sel yang mati, sehingga
jumlah sel hidup menjadi tetap.
Dari grafik pada Gambar 6 dan Gambar 7 terlihat bahwa pembentukan
enzim xilanase berasosiasi dengan pertumbuhan dari bakteri
45I(3 dimana produksi enzim xilanase merupakan metabolit primer
dari isolat

45I(3 sehingga pembentukan gula(gula

sederhana dapat terukur menjadi aktifitas enzim.
Dari grafik pada Gambar 7 terlihat bahwa aktifitas enzim xilanase yang
dihasilkan dari isolat

45I(3 mencapai optimum pada

hari ke(6 sesuai dengan kurva pertumbuhannya dengan aktifitas sebesar 1.174
Unit/ml dan aktifitas spesifik xilanase sebesar 13.443 Unit/mg (Lampiran 6).
Kadar protein diukur dengan menggunakan metode Bradford dimana protein
enzim akan bereaksi dengan pereaksi

G(250 yang akan

berikatan secara spesifik pada protein yang memiliki gugus asam amino arginin,
tirosin, histidin dan fenilalanin. Aktivitas xilanase ditentukan oleh dua faktor, yaitu
unit aktivitas dan kadar protein. Enzim merupakan protein, sehingga dengan
mengetahui kadar protein keseluruhan maka dapat diketahui besarnya protein yang
berfungsi sebagai enzim melalui kemampuannya dalam mengubah substrat menjadi
produk yang diinginkan. Dari grafik pada Gambar 6 terlihat bahwa peningkatan

kadar protein yang terukur melalui aktifitas spesifik enzim xilanase menunjukkan

28

pola kurva yang hampir sama dengan pola kurva dari bobot biomassa kering dan
aktifitas enzim xilanase dari

45I(3 dimana aktifitas

spesifik meningkat pada fase eksponensial dimana produksi enzim xilanase
dengan jumlah yang besar terjadi pada fase ini. Fenomena ini menunjukkan
bahwa enzim xilanase merupakan produk metabolit primer yang berasosiasi
dengan pertumbuhan sel yang menggunakan substrat xilan tongkol jagung untuk
kelangsungan hidup

45I(3.

Xilan dari tongkol jagung dapat digunakan sebagai media penginduksi
xilanase karena xilanase dapat diinduksi oleh media yang mengandung residu
xilan murni, xilooligosakarida, xilosa dan residu lignoselulosa (Beg

2001).

Menurut Irawadi (1991) limbah berserat dapat juga digunakan untuk menginduksi
xilanase. Peningkatan aktifitas enzim xilanase selama inkubasi menunjukkan telah
terjadi induksi enzim xilanase oleh xilan tongkol jagung hingga mencapai waktu
optimumnya. Enzim memiliki spesifitas yang amat tinggi terhadap substratnya.
Penggunaan media yang berbeda dapat menyebabkan perbedaan produksi enzim
(White 1995).
Setelah hari ke(6 aktifitas enzim xilanase mulai menurun namun stabil
hingga hari ke(8. Penurunan unit aktifitas xilanase seiring dengan meningkatnya
waktu inkubasi pada suhu optimum berkaitan dengan berubahnya struktur tiga
dimensi protein enzim yang akan menyebabkan turunnya aktifitas katalitik.
Penurunan aktifitas enzim xilanase terjadi akibat menurunnya jumlah substrat
yang tersedia di dalam kultur sehingga mengakibatkan kompetisi penggunaan
substrat oleh jumlah sel yang semakin bertambah. Penurunan aktifitas enzim
xilanase juga diakibatkan oleh adanya aktifitas proteolitik yang dihasilkan oleh
protease indigenus yang lepas ke dalam media akibat pecahnya sel yang telah mati
(Kansoh & Nagieb 2004).
Faktor(faktor

utama

yang

mempengaruhi

aktifitas

enzim

adalah

konsentrasi enzim, substrat, produk, senyawa inhibitor dan aktivator, pH dan jenis
pelarut yang terdapat pada lingkungan serta suhu (Suhartono 1989).

%"

!"

% + %" , +

+

++

*

!"

29

Enzim xilanase yang dihasilkan oleh

45I(3

akan menginduksi sekresi enzim pada media yang mengandung xilan murni atau
residu yang kaya akan xilan.

menggunakan substrat dalam hal ini

xilan tongkol jagung dalam proses metabolismenya dan dapat menggunakan
hampir semua komponen termasuk gula, alkohol, asam amino, asam organik dan
komponen aromatik dengan memproduksi enzim hidrolitik ekstraseluler (Richana
2002).
Aktifitas xilanase mengakibatkan terjadinya hidrolisis xilan tongkol
jagung oleh
gula pereduksi.

45I(3. Hidrolisis xilan akan menghasilkan
Banyaknya gula pereduksi yang dihasilkan selama w