Pencirian Xilanase Dari Xilanolitik Xj18 Yang Menghasilkan Xilobiosa Dari Xilan Tongkol Jagung

PENCIRIAN XILANASE DARI XILANOLITIK XJ18 YANG
MENGHASILKAN XILOBIOSA DARI XILAN TONGKOL
JAGUNG

KURRATAA’YUN

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Pencirian Xilanase dari
Xilanolitik XJ18 yang Menghasilkan Xilobiosa dari Xilan Tongkol Jagung adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Kurrataa’yun
NRP G351130376

RINGKASAN
KURRATAA’YUN. Pencirian Xilanase dari Xilanolitik XJ18 yang menghasilkan
Xilobiosa dari Xilan Tongkol Jagung. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan
YOPI.
Tongkol jagung merupakan limbah berlignoselulosa yang memiliki
kandungan xilan paling tinggi dibandingkan limbah pertanian lignoselulosa
lainnya seperti bagasse, tembakau, dan jerami. Degradasi sempurna xilan
membutuhkan kerja sinergis enzim keluarga xilanase. Xilanase telah banyak
digunakan untuk mendegradasi xilan menjadi produk komersial seperti gula
rendah kalori, prebiotik, dan biofuel. Berdasarkan aplikasinya yang luas, berbagai
variasi karakter xilanase dibutuhkan. Walaupun xilanase telah dipelajari lebih dari
33 tahun yang lalu, xilanase yang menghasilkan xilobiosa dari xilan masih sangat
sullit ditemukan.
Penelitian sebelumnya telah berhasil mengoleksi bakteri xilanolitik XJ18
dari TNBD, Jambi, Indonesia yang diharapkan dapat menghasilkan karakteristik

xilanase yang unik. Pada penelitian ini, isolat XJ18 diidentifikasi berdasarkan
analisis 16S rRNA. XJ18 ditemukan memiliki kesamaan 97% dengan
Paenibacillus terrae. Enzim yang diproduksi Paenibacillus terrae XJ18 dianalisis
menggunakan metode pewarnaan menggunakan reagen DNS. Aktivitas xilanase
Paenibacillus terrae XJ18 mengalami peningkatan 4.59 kali setelah dipekatkan
dengan 70% aseton (2.55 IU), sehingga diketahui enzim lebih bersifat asam dan
hidrofilik. Berdasarkan hasil kromatografi lapis tipis (KLT) didapatkan satu spot
produk yang nilai RFnya berbeda dengan xilosa maupun arabinosa dan mendekati
standar disakarida, sehingga Paeninbacillus terrae XJ18 diprediksi menghasilkan
xilobiosa dari xilan tongkol jagung 0.5%. Hasil tersebut mengindikasikan xilanase
dari Paenibacillus terrae XJ18 hanya mengenali dua unit xilosa dari ujung akhir
rantai utama xilan dan memediasi ikatan -1.4, sehingga memproduksi xilobiosa
dan intermediet yang lebih besar.
Kata kunci: ekstraksi xilan, karakter xilanase, Paenibacillus terrae, xilan tongkol
jagung, xilobiosa

SUMMARY
KURRATAA’YUN. Characterization of xylanase from xylanolytic XJ18 which
produce xylobiose from corncob xylan. Supervised by ANJA MERYANDINI and
YOPI.

Corncob is one of lignocellulose waste which has the highest xylan content
than bagasse, tobacco, and straw. Its complete breakdown requires the action of
xylanase. Xylanase has been used to breakdown xylan into commercial product as
low calories sugar, prebiotic, and biofuel. Due its wide of application, many
variation of xylanase’s characters are needed. Although xylanase have been
studied for more than 33 years, there is a paucity of information regarding a
xylanase that produces exclusively xylobiose from xylan.
The previous studies have collected XJ18 from TNBD forest, Jambi,
Indonesia to gain a unique enzyme characteristic. In this study, XJ18 was
identified by 16S rRNA analyzed and found has 97% similarity as Paenibacillus
terrae. Xylanase assay was done by DNS method. The xylanase activity was
increased about 4.59 times after being concentrated by acetone 70% (2.55 IU).
Based on thin layer chromatography (TLC) result, the product’s spot showed
different RF value from xylose and arabinose standard, thus xylanase from
Paenibacillus terrae XJ18 predicted produced xylobiose from 0.5% extracted
corncob xylan. These results indicated that the xylanase from Paenibacillus terrae
XJ18 recognizes only two xylose units from one of the ends of the xylan
backbone and mediates the hydrolysis of the adjacent -1.4-linkage, producing
xylobiose and bigger intermediates.
Keywords:

corncob xylan, Paenibacillus
characterization, xylan extraction

terrae,

xylobiose,

xylanase

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

PENCIRIAN XILANASE DARI XILANOLITIK XJ18 YANG
MENGHASILKAN XILOBIOSA DARI XILAN TONGKOL
JAGUNG

KURRATAA’YUN

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

Penguji luar komisi dalam Ujian Tesis: Dr. Laksmi Ambarsari, MS

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Karya
ilmiah ini merupakan salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Magister
Sains di Program Studi Mikrobiologi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian
Bogor. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan
Oktober 2013 hingga April 2014 ini ialah enzim, dengan judul ―Pencirian
Xilanase dari Xilanolitik XJ18 yang menghasilkan Xilobiosa dari Xilan
Tongkol Jagung‖.
Terima kasih yang mendalam penulis ucapkan kepada Prof Dr Anja
Meryandini, MS dan Dr Yopi selaku pembimbing atas bimbingan, ilmu
pengetahuan, saran, serta kesabarannya selama penyusunan tesis ini.
Penghargaan penulis sampaikan kepada Mba Nani dan Mba Lia yang telah
memberikan ilmu dan pengarahan praktek kerja di laboratorium LIPI
Cibinong; Ibu Dewi sebagai laboran Bioteknologi Hewan dan Biomedis Pusat
Antar Universitas, PPSHB dan Ibu Fitri yang telah banyak membantu dalam
proses penelitian secara teknik.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada teman seperjuangan,
rekan kerja di laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis (Mba Tini,
Mba Ira, Mba Novi, Mba Ami, Mba Anik, Mba Debby), rekan kerja di
laboratorium biokatalis dan fermentasti LIPI Cibinong (Kak Azizah, Kak

Wida, Kak Kholis, Kak Ari, dan Kak Gading), teman seperjuangan Fasttrack
(Ica, Feni, Ary, Hendri, dan Randi) yang telah banyak membantu dan
menemani selama proses penelitian; Ikra Nugraha atas semangat dan
dukungannya; keluarga MIK12, keluarga MIK13, keluarga Biologi 46; dan
keluarga asrama NTB atas kebersamaannya.
Ungkapan terima kasih terbesar penulis sampaikan kepada ayah dan ibu
atas do’a, kasih sayang, dan dukungannya hingga penulis dapat menyelesaikan
studi strata dua ini dengan baik. Tidak lupa terima kasih kepada abang Man,
Dela, dan Putri serta seluruh keluarga yang telah menghibur serta menemani
penulis selama melaksanakan penelitian. Akhir kata, penulis berharap tesis ini
bermanfaat untuk dunia sains dan pendidikan dimasa depan.
Bogor, Agustus 2014
Kurrataa’yun

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

1
1
2
2
2

TINJAUAN PUSTAKA

Jagung
Tongkol Jagung
Xilan
Xilanase

2
2
4
5
7

METODE
Tempat dan Waktu
Bahan
Alat
Ekstraksi Xilan dengan Metode Alkali
Identifikasi 16S rRNA Xilanolitik XJ18 Asal TNBD
Produksi Xilanase
Produksi dan Pemekatan Ekstrak Kasar Xilanase
Analisis Produk Hidrolisis secara Kualitatif

9
9
10
10
10
10
11
11
12

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan

13
13
16

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan
Saran

24
24
25

DAFTAR PUSTAKA

25

LAMPIRAN

33

RIWAYAT HIDUP

36

DAFTAR TABEL
1.
2.
3.
4.

Produksi Jagung di berbagai negara di dunia
Komposisi tongkol jagung
Neraca massa proses ekstraksi xilan dari tongkol jagung secara alkali
Perbandingan analisis proksimat tepung tongkol jagung pra dan
pasca delignifikasi (%)
5. Optimasi pemekatan xilanase dari Paenibacillus terrae XJ18 dengan
amonium sulfat dan aseton
6. Perhitungan nilai derajat polimerisasi (DP) produk hidrolisis xilan
tongkol jagung oleh xilanase XJ18.

4
5
13
14
15
15

DAFTAR GAMBAR
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Populasi penduduk dunia dan produksi jagung pada tahun 2001-2011
Tongkol jagung
Proses ekstraksi xilan dari tongkol jagung dengan metode Alkali
Situs kerja kompleks enzim xilanase terhadap struktur xilan
Elektroforegram DNA hasil PCR koloni
Produk hidrolisis tongkol jagung xilan 0.5% dengan xilanase XJ18
(1:1) dengan KLT pada plat silika gel
7. Proses siklus PCR
8. Struktur kimia xilan
9. Struktur unit penyusun xilan
10. Skema mekanisme kerja enzim xilanase Paenibacillus terrae XJ18
11. Mekanisme konversi xilosa menjadi xilitol dan turunannya

3
4
6
8
14
16
19
21
22
23
24

DAFTAR LAMPIRAN
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Media peremajaan kultur xilanolitik
Media produksi enzim
Komposisi reagen Dinitrosalicylic acid (DNS)
Komposisi larutan Bradford 5X pekat
Kondisi PCR yang digunakan dalam PCR koloni
Sekuens basa nukleotida isolat XJ18
Hasil Blast sekuens basa nukleotida isolat XJ18
Naskah artikel publikasi di HAYATI

33
33
33
33
33
34
34
35

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Limbah tongkol jagung merupakan limbah berlignoselulosa yang sulit
terdegradasi secara alami di alam. Jumlahnya semakin meningkat seiring dengan
peningkatan jagung sebagai salah satu komoditas pertanian pangan utama
Indonesia. Selama kurun waktu lima tahun terakhir, terjadi peningkatan produksi
jagung hampir mencapai 10% dengan jumlah produksi 18.8 juta ton dan
produktivitas 4.23 ton/Ha pada tahun 2013 (BPS 2013). Hal tersebut akan
berkorelasi terhadap peningkatan limbah jagung yang mencapai 54.2% dari
jumlah produksi total, salah satunya limbah tongkol jagung (Igathinathane et al.
2006). Limbah berlignoselulosa dapat dikonversi menjadi berbagai produk
komersial seperti biofuel, gula sederhana, dan xilitol (Jeevan et al. 2011; Kamat et
al. 2013; Li et al. 2013).
Tongkol jagung memiliki kandungan xilan paling tinggi dibandingkan
limbah pertanian lainnya. Menurut Yang et al. (2005), xilan yang terkandung
dalam limbah tongkol jagung mencapai 40 g/100 g dari bobot totalnya. Xilan
merupakan komponen utama hemiselulosa yang memiliki kerangka dasar residu
1.4-D-xilopiranosil yang rantai sampingnya tersubstitusi dengan gugus asetil,
asam 4-O-metil-D-glukuronosil dan α-arabinofuranosil. Hidrolisis xilan oleh
enzim xilanase akan menghasilkan gula sederhana, tergantung jenis enzim
xilanasenya. Jenis enzim xilanase yaitu Endo-1.4- -xilanase (E.C.3.2.18) yang
menghidrolisis rantai utama xilan; 1.4- -D-xilosidase (E.C.3.2.1.37) memutus
sebagian kecil oligosakarida; α-L-arabinofuranosidase (E.C.3.2.1.55), α-Dglukuronidase (E.C.3.2.1.139), galaktosidase (3.2.1.22) dan asetil xilan esterase
(E.C.3.1.1.72) menghidrolisis rantai samping xilan (Subramaniyan dan Prema
2002).
Hasil hidrolisis xilan dalam bentuk monomer terdiri atas xilosa, arabinosa,
dan asam glukuronik. Xilosa dan arabinosa telah diaplikasikan sebagai gula
rendah kalori yang baik digunakan untuk penderita diabetes. Mikkelsen-Krog et
al. (2011) melaporkan bahwa gula L-arabinosa menghambat aktivitas enzim
sukrase dalam saluran pencernaan sehingga dapat mencegah hiperglikemia
postprandial (pasca makan) pada penderita diabetes. Adapun oligosakaridanya,
seperti xilo-oligosakarida (XOS) telah digunakan untuk aplikasi dalam bidang
pangan dan kesehatan, khususnya sebagai prebiotik. Berbagai penelitian produksi
XOS dari tongkol jagung sebagai prebiotik telah dilakukan (Aachary dan Prapulla
2011). Aplikasi enzimnya sendiri dalam bidang industri kertas telah digunakan
sebagai substitusi klorin dalam pemutih pulp sehingga meningkatkan kekuatan
kertas dalam kondisi lembab.
Luasnya aplikasi xilanase mendorong penemuan karakter-karakter xilanase
yang beragam untuk digunakan sesuai dengan proses aplikasinya. Berdasarkan
penelitian sebelumnya (Kurrataa’yun β01γ), telah berhasil diisolasi bakteri
xilanolitik XJ18 dari Taman Nasional Bukit Duabelas (TNBD) Jambi yang
memiliki nilai indeks xilanolitik sebesar 4.25. Karakter xilanase tersebut unik,

2

yaitu memiliki aktivitas pada rentang suhu dan pH yang luas. Ekstrak kasar enzim
yang dihasilkan memiliki banyak puncak pada kondisi suhu ekstra panas dan
normal, maupun pada kondisi pH asam dan netral. Aktivitas tertingginya terjadi
pada kondisi ekstrem, yaitu pada suhu 90 oC dan pH 5.0. Salah satu puncak
aktivitas enzim juga terjadi pada kondisi normal, yaitu pada suhu 40 oC dan pH
6.0. Walaupun penelitian tentang xilanase telah dilakukan lebih dari 33 tahun
yang lalu (Reilly 1981), xilanase yang menghasilkan satu jenis produk hidrolisis
masih sulit ditemukan.

Perumusan Masalah
Xilanase merupakan enzim yang memiliki aplikasi sangat luas sehingga
dibutuhkan karakter yang bervariasi dan unik. Eksplorasi keragaman dan
keunikan karakter berbagai xilanase terus dilakukan untuk mendapatkan xilanase
yang sesuai dengan bidang aplikasinya. Walaupun xilanase telah lama dipelajari,
sangat jarang ditemukan xilanase yang menghasilkan hanya satu jenis produk
hidrolisis.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan pencirian terhadap xilanase XJ18
dan menganalisis produk hidrolisisnya dari xilan tongkol jagung.

Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat menemukan variasi karakter unik xilanase
dari bakteri tanah.

TINJAUAN PUSTAKA
Jagung
Jagung (Zea mays L.) merupakan tanaman semusim yang tergolong dalam
keluarga Poaceae (Iriany et al. 2007). Tanaman ini termasuk tanaman berumah satu
(monoecious), yaitu bunga jantan dan betinanya terletak di bunga yang berbeda pada
individu yang sama. Bunga jantan tumbuh sebagai pembungaan ujung (tassel),
sementara bunga betina tumbuh terpisah sebagai pembungaan samping (tongkol)
pada ketiak daun (Rubatzky dan Yamaguchi 1998). Tongkol jagung umumnya
berjumlah satu atau dua batang per tanaman tergantung varietas. Tongkol jagung
yang terletak pada bagian atas umumnya terbentuk lebih dahulu dan berukuran lebih
besar dibandingkan yang terletak di bawah. Setiap tongkol terdiri atas 10-16 baris biji
yang berjumlah genap (Subekti et al. 2007).

3

Produksi jagung
Populasi

Populasi penduduk dunia (Juta orang)

Produksi jagung dunia (Juta ton)

Jagung telah menjadi salah satu komoditas pangan utama dunia. Berbagai
penduduk benua Afrika, Asia, dan Amerika latin mengonsumsi jagung. Sementara di
Amerika Utara dan di Asia menggunakan jagung sebagai pakan ternak. Sebanyak
50% penduduk sub-Sahara Afrika menggantungkan hidupnya pada jagung sebagai
makanan pokoknya. Tanaman jagung menjadi komoditas penting bagi 70 juta
keluarga petani di seluruh dunia. Hal tersebut dikarenakan jagung mengandung gizi
yang cukup banyak. Kandungan gizi utama jagung adalah pati (72-73%), dengan
nisbah amilosa dan amilopektin 25-30%:70-75%. Kadar gula sederhana jagung
(glukosa, fruktosa, dan sukrosa) berkisar antara 1-3%. Protein jagung (8-11%) terdiri
atas lima fraksi, yaitu: albumin, globulin, prolamin, glutelin, dan nitrogen non-protein.
Asam lemak pada jagung meliputi asam lemak jenuh (palmitat dan stearat) serta asam
lemak tidak jenuh, yaitu oleat (omega-9) dan linoleat (omega-6). Vitamin yang
terkandung dalam jagung meliputi vitamin A dan E. Selain itu, jagung juga
mengandung berbagai mineral esensial seperti K, Na, P, Ca, dan Fe (Suarni dan
Widowati 2007). Oleh karena itu, selain sebagai bahan pangan dan pakan, jagung
menjadi sumber produk industri seperti pati (Zhang et al. 2012), vitamin (Warman
dan Harvard 1998), serat (Pandya dan Srinivisan 2012), minyak (Comin et al. 2012),
dan etanol.
Jagung merupakan tanaman yang mudah dibudidayakan. Hal tersebut
dikarenakan jagung berasal dari daerah tropis dan mudah beradaptasi dengan
lingkungan non-tropis. Tanaman jagung dapat tumbuh pada berbagai macam tanah,
seperti andosol (tanah berasal dari gunung merapi), latosol (tekstur lempung/liat),
grumosol (tekstur berat), bahkan tanah berpasir. Jagung masih dapat tumbuh pada
tanah yang kering dengan kisaran pH 5.6-7.5. Jagung dapat ditanami pada berbagai
ketinggian, yaitu dari dataran rendah hingga daerah pegunungan (1,000-1,800 m dpl).
Adapun kondisi pertumbuhan optimumnya pada ketinggian 0-600 m dpl dengan
penyinaran sinar matahari cukup. Pada fase pembungaan, jagung membutuhkan
pengairan yang cukup dengan curah hujan ideal yaitu sekitar 85-200 mm/bulan.

Tahun

Gambar 1 Populasi penduduk dunia dan produksi jagung pada tahun 2001-2011
(USDA 2011)
Aplikasinya yang luas ditunjang dengan kemudahan dalam budidayanya,
mendorong peningkatan produksi jagung dari tahun ke tahun. Peningkatan Produksi
jagung dunia mengalami peningkatan yang drastis melebihi kecepatan pertumbuhan

4

populasi dunia. Produksi jagung mengalami peningkatan sebesar 44.74% dari tahun
2001-2011, yaitu dengan jumlah produksi 599.35-867.52 juta ton (USDA 2011);
sementara populasi dunia hanya mengalami peningkatan sebesar 12.34%, yaitu
sebanyak 6.16-6.92 milyar penduduk selama periode yang sama. US merupakan
negara dengan produksi dan ekspor jagung tertinggi, yaitu sebanyak 313.92 juta
ton/tahun, sementara produksi jagung di Indonesia sebesar 8.10 juta ton/tahun.

Tabel 1 Produksi Jagung di berbagai negara di dunia (USDA 2011)
Produksi jagung
Negara
US
Cina
Brazil
Ukraina
Argentina
India
Meksiko
Afrika selatan
Kanada
Nigeria
Indonesia
Filipina
Rusia

Bobot
(Juta ton)
313.92
191.75
62.00
22.50
22.00
21.50
20.50
12.00
10.70
8.70
8.10
7.14
6.68

Persentase (%)

Yield (ton/Ha)

36.19
22.10
7.15
2.59
2.54
2.48
2.36
1.38
1.23
1.00
0.94
0.82
0.77

9.24
5.74
4.05
6.43
6.11
2.47
3.08
3.75
8.92
1.78
2.57
2.67
3.83

Per kapita
(ton/orang)
1.003
0.142
0.315
0.498
0.540
0.017
0.179
0.238
0.312
0.054
0.033
0.075
0.047

Tongkol Jagung
Tanaman jagung tersusun oleh 0.15% tongkol jagung (Sokhansanj et al.
2010). Tongkol jagung berbentuk tabung yang mengerucut pada ujungnya, dan
merupakan sebagai tempat bulir-bulir jagung melekat (Gambar 2). Jumlah tongkol
jagung yang dihasilkan dunia setiap tahunnya mencapai 130.13 juta ton. Tongkol
jagung merupakan limbah lignoselulosa yang mengandung 45% selulosa, 35%
hemiselulosa, dan 15% lignin (Howard et al. 2003).

Gambar 2 Tongkol jagung
Tongkol jagung telah diteliti dan memiliki kandungan xilan tertinggi
dibandingkan limbah pertanian berlignoselulosa lainnya. Menurut Kumar et al.
(2010) tongkol jagung mengandung selulosa yang tinggi dan 28.23% merupakan
hemiselulosa. Komponen-komponen tersebut berpotensi untuk dimanfaatkan

5

bahkan untuk skala industri, terlebih dikarenakan ketersediaannya yang
melimpah. Keberlimpahan limbah tongkol jagung yang tidak termanfaatkan dapat
menyebabkan kerusakan lingkungan. Hingga saat ini, tongkol jagung telah
digunakan oleh petani tradisional sebagai alas tidur ternak, landfill, dan substitusi
kertas toilet. Selain itu, tongkol jagung mulai diteliti untuk dikembangkan sebagai
material bangunan (Pinto et al. 2012), karbon aktif (Cao et al. 2006), etanol (Chen
et al. 2007), coating makanan (Li et al. 2011) dan obat dikarenakan sifatnya yang
meningkatkan aktivitas mitogenic dan comitogenic, efek antiphlogistic, dan
menghambat aktivitas mutagen (Oliveira et al. 2010).
Tabel 2 Komposisi tongkol jagung (Kumar et al. 2010)
Fraksi
Holoselulosa
a. α selulosa
b.
selulosa
c.
selulosa
Pentosan (xilan)
Total lignin
a. klason lignin (lignin tidak terlatur asam)
b. Lignin terlarut asam
Etanol benzena terlarut
Lainnya

Bobot (%)
73.04
34.45
18.73
19.84
28.23
16.03
14.01
2.02
4.33
6.64

Xilan
Hemiselulosa merupakan polimer hayati yang paling melimpah kedua
setelah selulosa. Komposisinya mencapai 40% dari total massa tanaman annual
maupun perennial. Polimer ini memiliki kekerabatan yang dekat dengan selulosa
dan lignin yang berfungsi sebagai pemberi kekuatan dan sifat rigid pada dinding
sel tanaman. Hemiselulosa memiliki komposisi gula yang bervariasi pada setiap
tanaman. Gula yang menjadi penyusun hemiselulosa diantaranya manan, arabinan,
galaktan, dan xilan (Belgacem dan Gandini 2008).
Xilan merupakan komposisi utama hemiselulosa pada tumbuhan berkayu.
Jumlahnya dapat mencapai 30% dari total penyusun dinding sel. Xilan memiliki
struktur yang bervariasi pada berbagai tumbuhan. Namun secara umum xilan
tersusun dari kerangka dasar residu 1.4-D-xilopiranosil (gula pereduksi dengan
lima atom karbon) yang rantai sampingnya tersubstitusi dengan gugus asetil, 4-Ometil-D-glukuronosil dan α-arabinofuranosil (Habibi dan Vignon 2005).
Xilan dapat diekstraksi dengan berbagai metode, diantaranya metode fisik
dan pemanasan (Nathalia 2011), gelombang suara (Yang et al. 2009), perlakuan
alkali (Yao 2011) serta gabungan metode alkali dan microwave (Panthapulakkal
dan Sain 2013). Adapun metode ekstraksi yang paling umum dilakukan adalah
perlakuan alkali. Beberapa perlakuan dalam metode tersebut dilakukan untuk
memutus ikatan kovalen yang terdapat antara xilan dan karbohidrat lainnya
(Wang dan Zhang 2006). Proses ekstraksi xilan dengan perlakuan alkali telah
dioptimasi dengan Richana et al. (2007). Metode alkali tersebut terdiri atas
penggilingan tongkol jagung menjadi tepung berukuran 40 mesh, kemudian

6

dilakukan ekstraksi dalam dua tahap, yaitu delignifikasi dengan NaOCl 0.5%,
ekstraksi dengan NaOH 10% selama 24 jam dengan suhu ruang, dan pengendapan
menggunakan etanol dengan perbandingan supernatan-etanol 1:3 (Gambar 3).
Konsentrasi NaOH mengimprovisasi efisiensi dari ekstraksi xilan. Ketika
konsentrasi NaOH lebih rendah, xilan yang terdapat di tongkol jagung tidak dapat
larut seutuhnya, sehingga efisiensi ekstraksi akan rendah. Optimasi lebih lanjut
dilakukan Yao (2011) yang menemukan konsentrasi ekstraksi optimum dengan
perendaman menggunakan NaOH 25% pada suhu 94 oC selama 3 jam.

Gambar 3 Proses ekstraksi xilan dari tongkol jagung dengan metode Alkali
(Richana et al. 2007)
Xilan bisa didapatkan dari berbagai limbah pertanian berlignoselulosa.
Beberapa sumber xilan yang paling berpotensial di antaranya jerami, sorgum, tebu,
sekam, batang, dan tongkol jagung. Struktur xilan pada berbagai tumbuhan

7

berbeda. Klasifikasi xilan sering dilakukan berdasarkan rantai substitusinya
(Ebringerová 2005, Sedlmeyer 2011), yaitu:
a. Homoxilan, yaitu polisakarida linier yang umumnya terdapat pada rumput
laut
b. Glukuronoxilan, yaitu xilan yang dapat terasetilasi sebagian dan memiliki
unit yang tersubstitusi dengan α-(12)-4-O-metil-D-glukopiranosil acid
uronic (MeGlcUA). Xilan tersebut banyak dijumpai pada tumbuhan berkulit
keras, tergantung dari perlakuan yang diberikan ketika proses ekstraksi xilan.
c. Arabino (glukuronoxilan) memiliki substitusi α-(13)-L-arabinofuranosil
(ArbF)uronic yang dekat MeGlcUA. Jenis ini terdapat pada tumbuhan yang
berkayu lunak (softwood).
d. Arabinoxilan dengan substitusi dengan kerangka -(14)-D-xilapiranosa
pada posisi karbon 2 atau 3; dan ArbF yang teresterisasi parsial dengan asam
fenolik. Tipe ini sering dijumpai pada endosperma berpati dan lapisan luar
kulit serealia.
e. (Glukurono) arabinoxilan dapat tersubstitusi dengan unit ArbF, terasetilasi
dan teresterisasi dengan asam ferulik. Tipe ini banyak dijumpai pada jaringan
berlignin rumput-rumputan dan serealia
f. Heteroxilan tersubstitusi dengan berbagai mono atau oligosakarida dan
dijumpai pada kulit padi, biji, dan getah.
Variasi struktur xilan dibutuhkan untuk penggunaan xilan yang bervariasi
pada berbagai aplikasinya. Berbagai aplikasi xilan telah digunakan sebagai
polimer kertas, bahan kosmetik, biofuel, dan telah digunakan pada bidang farmasi
dan bidang industri pangan. Lapisan pada xilan memiliki permeabilitas yang
rendah terhadap oksigen, sehingga xilan memiliki potensi aplikasi pada
pengemasan makanan dan bidang farmasi. Aplikasi tersebut dilakukan dengan
bantuan agen penghidrolisis xilan, yaitu xilanase (Yang et al. 2005; Oliveira et al.
2010).

Xilanase
Xilanase merupakan kompleks enzim hidrolitik yang bekerja secara
sinergis, yaitu endo-1.4- -xilanase, 1.4- -D-xilosidase, α-L-arabinofuranosidase,
α-glukuronidase dan asetil esterase. Endo-1.4- -xilanase menghidrolisis rantai
utama xilan; 1.4- -D-xilosidase memutus sebagian kecil oligosakarida menjadi
xilosa; sementara α-L-arabinofuranosidase, α-D-glukuronidase, galaktosidase dan
asetil xilan esterase menghidrolisis rantai samping xilan (Subramaniyan dan
Prema 2002) (Gambar 4).

8

Gambar 4 Situs kerja kompleks enzim xilanase terhadap struktur xilan (Shallom
dan Shoham 2003)
Xilanase diklasifikasikan setidaknya dari tiga sifat, yaitu berdasarkan bobot
molekul dan titik isolektriknya, struktur kristal, dan kinetikanya. Berdasarkan
database CAZy (http://www.cazy.org) xilanase (EC3.2.1.8) memiliki kekerabatan
yang dekat dengan glikosida hidrolase (GH) keluarga 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 26,
30, 43, 44, 51 dan 62. Xilanase dapat diproduksi oleh berbagai mikroorganisme
baik fungi maupun bakteri. Mikroorganisme xilanolitik yang paling berpotensial
diantaranya Aspergillus, Trichoderma, Streptomyces, Phanerochaetes,
Chytridiomycetes, Ruminococcus, Fibrobacteres, Clostridia dan Bacillus (Barry
dan Dillon 1940; Wong et al. 1988; Kulkarni et al. 1999).
Aplikasi xilanase secara komersial telah digunakan dalam industri makanan
dan pemanfaatan limbah pertanian untuk produksi xilosa. Xilosa merupakan gula
rendah kalori yang dapat dikonsumsi penderita diabetes. Xilanase dapat
menggantikan klorin yang digunakan dalam proses pemutihan bubur kertas pada
industri kertas (Ruiz-Arribas et al. 1995). Selain itu xilanase telah diketahui dapat
meningkatkan daya pembersih pada deterjen (Kumar et al. 2004); mengurangi
viskositas saluran pencernaan ternak sehingga meningkatkan pencapaian berat dan
efisiensi konversi makanannya (Adeola & Bedford 2004); serta meningkatkan
kekuatan kertas pada kelembaban tinggi (Wong et al. 1988).
Sebanyak 90% produksi xilanase dilakukan dengan metode fermentasi submerged. Walaupun begitu, produksi dengan fermentasi solid menghasilkan enzim
lebih tinggi (Agnihotri et al. 2010). Penggunaan metode sub-merged dipilih
dikarenakan bersifat ekonomis, memiliki teknik yang mudah sehingga resiko
kontaminasinya rendah, dan pengaturan kondisi fermentasi yang mudah (Pandey
et al. 1999; Beg et al. 2001). Adapun penggunaan teknik fermentasi solid
dilakukan untuk mendapatkan enzim yang lebih murni. Beberapa faktor yang
mempengaruhi produksi xilanase antara lain komposisi media nutrisi,
karakteristik substrat sebelum diberi perlakuan, dan kondisi fermentasi. Pemilihan
substrat dan komposisi nutrisi pada media merupakan faktor penting untuk
keberhasilan dalam memproduksi xilanase. Komponen substrat yang sangat
diperlukan adalah karbon dan sumber energi agar menghasilkan xilanase yang
tinggi (Velkova et al. 2007).
Pengujian aktivitas xilanase umumnya menggunakan jumlah gula pereduksi
yang dihasilkan selama proses hidrolisis. Pengujian umumnya dilakukan

9

menggunakan metode 3.5-dinitrosalicylic acid (DNS) atau Nelson-Somogyi
(Miller 1959) menggunakan substrat xilan umum. Peneliti lain menggunakan
substrat modifikasi 4-O-metilglukuronoxilan yang terikat secara kovalen dengan
reagen Remazol brilliant blue (RBB xilan) dan pengujian aktivitas xilannya
berdasarkan rilisnya fragmen dari pewarna (Biely et al. 1985). Selain itu juga
terdapat banyak metode pengujian aktivitas xilanase yang dijual secara komersil,
salah satunya berdasarkan metode fluorescence.

METODE
Kerangka Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan menggunakan isolat xilanolitik
yang telah dieksplorasi dan diisolasi berdasarkan penelitian sebelumnya
(Kurrataa’yun β01γ). Proses penelitian ini dilakukan dengan pengumpulan data
yang terdiri atas pengidentifikasian isolat XJ18 dan produksi enzim xilanasenya.
Enzim xilanase yang diproduksi dipekatkan dan direaksikan dengan xilan tongkol
jagung yang telah diekstraksi menggunakan metode alkali.

Gambar 5 Diagram alur penelitian
Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2013 - April 2014 di
Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis, PPSHB IPB dan Laboratorium
Biokatalis dan Fermentasi, Pusat Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu
Penelitian Indonesia (LIPI) Jalan Raya Bogor Km. 46 Cibinong, Bogor.

10

Bahan
Tongkol jagung yang digunakan berasal dari jagung varietas Dramaga
silangan 3. Isolat yang digunakan merupakan isolat xilanolitik XJ18 asal Taman
Nasional Bukit Duabelas (TNBD) Jambi, koleksi Laboratorium Bioteknologi
Hewan dan Biomedis, PPSHB, PAU. Identifikasi 16S rRNA menggunakan primer
9F
(5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG–γ’)
dan
1510R
(5’GGCTACCTTGTTACGA–γ’) (Govan et al. 1999), Taq DNA polimerase
Fermentas, agarosa 1%, bufer Tris-asetat-EDTA (TAE). Pengujian aktivitas
enzim dan gula pereduksi menggunakan reagen 3.5-dinitrosalicylic acid (DNS)
(Lampiran 3), bufer fosfat (50 mM, pH 6.0). Pengukuran kadar protein
menggunakan larutan Bradford (Lampiran 4). Pengujian total gula menggunakan
Asam sulfat (H2SO4) dan fenol 5%. Analisis produk hidrolisis menggunakan plat
silika gel dan eluen yang terdiri atas asam asetat, n-butanol, dan akuades.
Alat
Aktivitas enzim diukur menggunakan spektrofotometer UV-VIS.
Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA dilakukan menggunakan mesin Polymerase
Chain Reaction (PCR) dan visualisasi amplikonnya menggunakan perlengkapan
elektroforesis. Produk hidrolisis dianalisis menggunakan peralatan kromatografi
lapis tipis (KLT).
Ekstraksi Xilan dengan Metode Alkali (modifikasi dari Richana et al. 2007)
Tongkol jagung yang digunakan merupakan tongkol jagung yang telah
digiling hingga berukuran 40 mesh. Ekstraksi xilan diawali dengan perlakuan
delignifikasi. Delignifikasi dilakukan dengan merendam 2,500 g tepung tongkol
jagung ke dalam 25 L pelarut natrium hipoklorit (NaOCl) 0.5% pada suhu ruang
selama 5 jam. Setelah dicuci dengan air destilata, tepung tongkol jagung
disentrifugasi dengan kecepatan 800 x g selama 25 menit untuk memisahkan
lignin dari selulosa dan hemiselulosa. Ampas yang mengandung xilan dikeringkan
menggunakan oven bersuhu 60 oC selama 48 jam. Tongkol jagung sebelum dan
sesudah delignifikasi dilakukan uji proksimat meliputi serat kasar (hemiselulosa,
selulosa, dan lignin) (Van-Soest 1963), kadar air, kadar abu, lemak, dan protein
(AOAC 1990). Ampas hasil delignifikasi selanjutnya direndam dengan NaOH
10% pada suhu ruang selama 24 jam dan dilakukan penyaringan untuk
memisahkan ampas dengan supernatan. Supernatan yang mengandung xilan
dinetralkan terlebih dahulu dengan HCl 6 N dan disentrifugasi dengan kecepatan
600 x g selama 25 menit. Supernatan yang diperoleh ditambahkan etanol 95%
dengan perbandingan sampel dan etanol 1:3 (v/v). Xilan yang mengendap
dipisahkan dengan melakukan sentrifugasi pada kecepatan 300 x g selama 30
menit. Endapan dikeringkan untuk mendapatkan ekstrak kasar xilan tongkol
jagung.
Identifikasi 16S rRNA Xilanolitik XJ18 Asal TNBD
Isolat yang digunakan ditumbuhkan pada media xilan Beechwood 0.5%, pH
6.0 (Lampiran 1). Komposisi media tersebut terdiri atas xilan Beechwood 0.5%
(Sigma Chemical co.), ekstrak khamir 1% (Sigma Chemical co.), dan sukrosa

11

10.3% (Meryandini et al. 2009). Bakteri xilanolitik XJ18 asal TNBD Jambi
dikarakterisasi secara molekular menggunakan 16S rRNA dengan teknik
Polymerization Chain Reaction (PCR) koloni (Mirhendi et al. 2007). PCR
dilakukan sebanyak 30 siklus dengan suhu annealing 55 oC menggunakan primer
λF
(5’-GAGTTTGATCCTGGC
TCAG–γ’)
dan
1510R
(5’GGCTACCTTGTTACGA–γ’) (Govan et al. 1999). Kondisi PCR dilampirkan
pada Lampiran 1. Hasil PCR divisualisasi dengan metode elektroforesis pada gel
agarosa 1% dalam bufer TAE 1x (40 mM Tris-Asetat; 0.1 mM EDTA).
Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 50 V selama 45 menit. DNA hasil
amplifikasi disekuens oleh jasa sekuens 1st Base. Hasil sekuens basa DNA
kemudian disejajarkan dengan MEGA 5.0 dan dilakukan blast berdasarkan basis
data bank gen koleksi NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) untuk menentukan
spesies bakteri xilanolitik.
Produksi Xilanase
Produksi enzim dilakukan dengan menginokulasikan 1% inokulum (0.60.8A, 600 nm) (1.275 x 109 sel) ke dalam 100 mL media xilan tongkol jagung
0.5% pH 6.0 (Lampiran 2). Media produksi enzim diinkubasi pada inkubator
bergoyang dengan kecepatan 121 rpm selama 36 jam. Ekstrak kasar xilanase
diperoleh dengan cara mensentrifugasi kultur pada kecepatan 800 x g selama 15
menit pada suhu 4 oC. Ekstrak kasar xilanase yang didapatkan diuji aktivitasnya
dengan metode 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS) (Miller 1959). Nilai absorbansi
dikonversi ke dalam konsentrasi xilosa dengan kurva standar xilosa. Aktivitas
xilanase dikonversi ke dalam satuan U/mL ( mol/menit/mL) dengan formula di
bawah ini. Satu unit aktivitas xilanase (1 U/mL) didefinisikan sebagai jumlah
mol xilosa yang dihasilkan setiap volume mililiter enzim dalam waktu 1 menit.
Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan formula berikut:

Keterangan:
Xs = Konsentrasi xilosa pada sampel (mg/mL)
Xk = Konsentrasi xilosa pada kontrol (mg/mL)
FP = Faktor pengenceran

t = waktu inkubasi (menit)
BM xilosa = 150.3 (g/mol)

Produksi dan Pemekatan Ekstrak Kasar Xilanase
Pemekatan ekstrak kasar xilanase (0.55 U/mL) dilakukan dengan metode
pengendapan. Optimasi metode pengendapan dilakukan menggunakan garam
(NH4)2SO4 (amonium sulfat) dan aseton. Pengendapan menggunakan amonium
sulfat dilakukan berdasarkan metode Kamble dan Jadhav (2012) dengan
modifikasi. Pengendapan dilakukan dengan menambahkan 100 mL ekstrak kasar
xilanase dengan amonium sulfat dingin secara bertahap dengan tingkat kejenuhan
0-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, dan 70-80% (b/v). Penambahan
amonium sulfat dilakukan pada suhu 4 oC dalam kondisi tetap teraduk dengan
magnetic stirrer selama dua jam. Larutan kemudian diinkubasi selama satu malam
di ruang pendingin. Selanjutnya endapan dan supernatan yang terbentuk
dipisahkan dengan disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 600 x g pada

12

suhu 4 oC. Endapan yang didapatkan dilarutkan dengan 1 mL bufer fosfat 50 mM
pH 6.0 sebagai enzim pekat.
Pemekatan xilanase berdasarkan metode aseton dilakukan dengan
menambahkan aseton dingin ke dalam ekstrak kasar enzim pada berbagai
konsentrasi hingga didapatkan kondisi optimum pengendapan xilanase.
Konsentrasi aseton yang diujikan yaitu pada konsentrasi 60-90% (interval 10%).
Sebanyak 10 mL ekstrak kasar enzim ditambahkan dengan aseton dingin (4 oC)
dengan volume tertentu berdasarkan Sana et al. (2008) sambil diaduk dengan
magnetic stirrer. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 600
x g di suhu 4 oC. Endapan yang terbentuk dilarutkan dalam 1 mL bufer fosfat 50
mM pH 6.0 sebagai enzim pekat. Enzim hasil pemekatan setiap konsentrasi hasil
pengendapan dengan kedua metode tersebut diuji aktivitas enzimnya. Pengujian
aktivitas enzim dilakukan pada suhu 40 oC, pH 6.0 dengan masa inkubasi enzim
dan substrat selama 30 menit. Pengujian xilanase dilakukan dengan metode DNS
(Miller 1959).
Aktivitas spesifik enzim (U/mg) dihitung dengan membandingkan aktivitas
enzim terhadap kadar proteinnya. Setiap enzim hasil pemekatan pada berbagai
konsentrasi amonium sulfat maupun aseton diukur kadar proteinnya menggunakan
metode Bradford (1976). Sebanyak 50 L sampel enzim pekat dalam bufer fosfat
50 mM pH 6.0 direaksikan dengan β500 L larutan Bradford dalam tabung reaksi.
Larutan kemudian dikocok dengan pelan dan diinkubasi selama 20 menit.
Selanjutnya larutan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595
nm. Hasil pengukuran dimasukkan sebagai nilai y dalam persamaan regresi linier
yang didapatkan dari kurva standar bovine serum albumin (BSA) (Lampiran 9).
Selain itu, dihitung pula tingkat kemurnian serta yieldnya dengan formula sebagai
berikut:

Analisis Produk Hidrolisis secara Kualitatif
Xilan tongkol jagung hasil ekstraksi dikonversi secara enzimatis
menggunakan ekstrak kasar xilanase pekat isolat XJ18. Hidrolisis dilakukan
dengan menggunakan substrat xilan tongkol jagung 0.5% (w/v) dalam bufer fosfat
pH 6.0 0.05 M. Larutan substrat xilan direaksikan dengan ekstrak kasar xilanase
isolat XJ18 (2.55 U/mL) hasil pemekatan (1:1) dan diinkubasi pada suhu 40 oC
selama 5 jam. Setelah diinkubasi, reaksi enzim diinaktivasi dengan pemanasan
pada suhu 100 oC. Selanjutnya sampel disentrifugasi dengan kecepatan 2,800 x g
selama 20 menit. Produk hidrolisis yang terlarut dalam supernatan diidentifikasi
jenis senyawanya secara kualitatif menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT)
dengan plat silika yang direndam pada eluen jenuh asam asetat : n-butanol :
akuades (1:2:1). Standar yang digunakan adalah standar monosakarida (glukosa,
xilosa, arabinosa, manosa) dan disakarida (selobiosa, sukrosa, manobiosa, dan
maltosa) dengan konsentrasi masing-masing 10,000 ppm. Sebagai kontrol
ditotolkan ekstrak kasar xilanase pekat, substrat xilan tongkol jagung 0.5%, dan

13

bufer fosfat (50 mM, pH 6.0). Penotolan standar pada plat masing-masing
sebanyak 1 L, sementara kontrol, ekstrak kasar xilanase pekat, substrat xilan dan
bufer fosfat ditotol sebanyak 4 L. Adapun sampel produk hidrolisis ditotolkan
sebanyak 2 L. Produk hidrolisis juga dianalisis derajat polimerisasinya. Derajat
polimerisasi dihitung dengan membandingkan total gula terhadap gula
pereduksinya. Pengujian total gula dilakukan dengan menggunakan metode fenolsulfat (DuBois et al. 1956), sementara gula pereduksi menggunakan metode DNS
(Miller 1959).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil
Ekstraksi Xilan dengan Alkali (modifikasi dari Richana et al. 2007)
Ekstraksi xilan dengan metode alkali berhasil mendapatkan 10.82% ekstrak
kasar xilan dari 2,500 g tepung tongkol jagung (Tabel 3). Metode delignifikasi
dengan NaOCl 0.5% dapat mengurangi persentase lignin pada tepung tongkol
jagung. Lignin pada tepung tongkol jagung yang telah didelignifikasi sebesar
16.70%. Berdasarkan uji proksimat, tongkol jagung mengandung hemiselulosa
yang tinggi (37.92%), yang diduga sebagian besar sebagai xilan (Tabel 4).
Tabel 3 Neraca massa proses ekstraksi xilan dari tongkol jagung secara alkali.
Delignifikasi menggunakan NaOCl 0.5% pada suhu ruang selama 1 jam.
Ekstraksi menggunakan NaOH 10% pada suhu ruang selama 24 jam.
Pengendapan xilan terlarut (pH netral) menggunakan etanol 95% (1:3
v/v).
Proses
Penggilingan
Delignifikasi
Ekstraksi

Bahan
Tongkol jagung kering
Tepung tongkol jagung
(40 mesh)
Tepung tongkol jagung
hasil delignifikasi

Bobot awal
(g)
4,800 g

Bobot akhir
(g)
2,900 g

Rendemen
(%)
60.42

2,500 g

2,370 g

94.80

2,370 g

270.40 g

11.40

14

Tabel 4 Perbandingan analisis proksimat tepung tongkol jagung (40 mesh) pra dan
pasca delignifikasi (%). Analisis proksimat terdiri atas pengujian terhadap
kadar air, kadar abu, lemak, protein (AOAC 1990) dan serat kasar (vanSoest 1963).
Komposisi
Serat kasar
a. Lignin
b. Selulosa
c. Hemiselulosa
Kadar air
Kadar abu
Lemak
Protein

Pra
25.15
21.00
33.10
17.90
7.99
5.11
0.54
3.23

Delignifikasi
Pasca
26.09
16.70
34.07
37.92
5.11
1.46
1.53
2.00

Identifikasi 16S rRNA Xilanolitik XJ18 Asal TNBD
Hasil visualisasi gel agarosa 1% menunjukkan adanya amplikon pita DNA
dengan ukuran 1500 pb (marker 1 Kb) (Gambar 6). Berdasarkan hasil sekuens
basa nukleotida gen penyandi16S rRNA (Lampiran 6) didapatkan bahwa XJ18
merupakan Paenibacillus terrae (Max Ident: 97%; Query length: 1303 pb)
(Lampiran 3).
M

S

~1500 pb

Gambar 6 Elektroforegram DNA hasil PCR koloni dengan elektroforesis gel
agarosa 1% (45 menit, 50V). M: Marker 1 Kb; S: Sampel isolat XJ18.
Produksi dan Pemekatan Ekstrak Kasar Xilanase
Xilanase Paenibacillus terrae XJ18 hasil pemekatan dengan amonium sulfat
hanya menunjukkan aktivitas pada pengendapan menggunakan amonium sulfat
0-30% (5.6 10-2 U/mL) dengan aktivitas spesifik yang tidak mengalami
peningkatan secara signifikan (0.13 U/mg). Adapun pemekatan xilanase XJ18
menggunakan aseton 70% menunjukkan peningkatan aktivitas spesifik yang
meningkat hampir 5 kali (4.25 IU) dibandingkan ekstrak kasar enzim. Pemekatan
xilanase XJ18 dengan menggunakan aseton 70% menunjukkan kondisi yang
paling optimum dengan tingkat kemurnian yang paling tinggi dan nilai yield
sebesar 231.82% (Tabel 5).

15

Tabel 5 Optimasi pemekatan xilanase dari Paenibacillus terrae XJ18 dengan
amonium sulfat dan aseton. Aktivitas xilanase diukur menggunakan
metode DNS (pH 6.0, suhu 40 oC, waktu inkubasi 30 menit)
Tahapan
Pemekatan
Ekstrak kasar
enzim
Amonium
sulfat 0-30%
Amonium
sulfat 30-40%
Amonium
sulfat 40-50%
Amonium
sulfat 50-60%
Amonium
sulfat 60-70%
Amonium
sulfat 70-80%
Aseton 60%
Aseton 70%
Aseton 80%
Aseton 90%

Volume
total
(mL)

Aktivitas
enzim
total (IU)

Kadar
Protein
total
(mg)

Aktivitas
spesifik
(U/mg)

Kelipatan
kemurnian
(kali)

Yield
(%)

100

55

513

0.11

1.00

100

100

5.6

42.34

0.13

1.23

10.18

95

0.00

40.88

0.00

0.00

0.00

93

0.00

55.80

0.00

0.00

0.00

89

0.00

54.82

0.00

0.00

0.00

86

0.00

82.04

0.00

0.00

0.00

83

0.00

88.25

0.00

0.00

0.00

50
50
50
50

0.00
127.5
0.66
0.50

18.75
30.03
67.22
103.23

0.00
4.25
0.01
0.00

0.00
39.60
0.09
0.05

0.00
231.82
1.20
0.90

Analisis Produk Hidrolisis secara Kualitatif
Nilai DP xilan yang dihidrolisis menurun hingga mencapai 9 dari 74 sejak
hidrolisis jam pertama dan tidak mengalami penurunan nilai DP hingga masa
inkubasi jam ke-5 (Tabel 6).
Tabel 6 Perhitungan nilai derajat polimerisasi (DP) produk hidrolisis xilan tongkol
jagung oleh xilanase XJ18
Sampel
Xilan tongkol
jagung 0.5%
PH 1 jam
PH 2 jam
PH 3 jam
PH 4 jam
PH 5 jam

Total gula (mg/mL)

Gula pereduksi
(mg/mL)

Derajat
Polimerisasi*

362.43

4.945

73

201.242
201.242
201.242
201.242
201.242

22.444
22.444
22.500
22.508
22.513

9
9
9
9
9

Ket: PH merupakan Produk hidrolisis yang direaksikan dengan enzim dengan variasi waktu
inkubasi.
*Nilai merupakan hasil pembulatan

Hidrolisis xilanase dari Paenibacillus terrae XJ18 terhadap xilan tongkol
jagung 0.5% selama 5 jam menunjukkan terdapat sebuah spot pada plat silika.
Spot produk hidrolisis terlihat berada di antara spot standar monosakarida dan
disakarida dengan nilai RF 0.5143. Produk hidrolisis tersebut memiliki nilai RF

16

lebih rendah dibandingkan standar xilosa (RF: 0.6514) dan arabinosa (RF: 0.5829)
(Gambar 7), sehingga diduga produk berupa xilobiosa. Hanya satu spot produk
dan intermediet hasil pemotongan yang lebih besar muncul pada plat.
Monosakarida
Disakarida

a

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

l

Gambar 7 Produk hidrolisis tongkol jagung xilan 0.5% dengan xilanase XJ18
(1:1) dengan KLT pada plat silika gel a. Enzim ekstrak kasar hasil
pemekatan dengan aseton; b. bufer fosfat 50 mM pH 6.0; c. Substrat
xilan tongkol jagung 0.5% (dalam bufer fosfat pH 6); d. Glukosa; e.
Xilosa; f. Arabinosa; g. Manosa; h. Produk hidrolisis; i. Selobiosa; j.
Sukrosa; k. Manobiosa; l. Maltosa.
Pembahasan
Ekstraksi xilan dengan Alkali
Hemiselulosa telah diketahui merupakan fraksi penyusun dinding sel
tumbuhan. Hemiselulosa berasosiasi dengan selulosa dan lignin. Hemiselulosa
mencapai hampir 40% dari total bobot kering tanaman (Yang et al. 2005). Xilan
pada tongkol jagung terikat secara kovalen dengan lignin serta karbohidrat
lainnya, sehingga dibutuhkan perlakuan untuk membuka ikatan tersebut dan
mengekspos xilannya. Delignifikasi merupakan proses penghilangan lignin dari
kompleks lignoselulosa, sehingga selulosa ataupun hemiselulosa yang saling
terikat dapat terekspos dan dipisahkan. Delignifikasi dapat dilakukan dengan
berbagai metode yaitu seperti metode fisik menggunakan oksigen dan tekanan,
serta metode kimiawi. Metode kimiawi dapat dilakukan dengan asam klorin dan
asam parasetik (Kumar et al. 2013). Metode delignifikasi oksigen menggunakan

17

prinsip aktivasi oksigen untuk menghilangkan lignin. Metode ini menghilangkan
lignin mencapai 55%. Adapun metode kimiawi menggunakan asam klorin
maupun asam parasetik dapat menghilangkan lignin mencapai 95%.
Penghilangan lignin tidak dapat dilakukan dengan sempurna. Hasil
delignifikasi tongkol jagung varietas Dramaga silangan 3 menunjukkan masih
terdapat 16.70% lignin. Hasil yang sama didapatkan dari penelitian Meryandini et
al. (2009) yang masih menyisakan 21% lignin dari tepung tongkol jagung varietas
Bisma yang diekstrak menggunakan NaOCl. Lignin dan selulosa berikatan
kovalen sangat kuat, sehingga pemurnian salah satu dari bahan tersebut tidak
dapat dilakukan secara sempurna (Kumar 2009).
Asam klorin berfungsi melarutkan sebagian besar dari lignin (lignin tidak
larut asam). Pelepasan ikatan xilan dari lignin penting untuk mengakses xilan.
Namun, penghilangan lignin secara total akan menghilangkan semua xilan dari
sampel (Rowley et al. 2013). Ebringerová et al. (2005) menemukan bahwa
penggunaan asam klorin (NaOCl) untuk pemutihan sebagai metode delignifikasi
paling efektif, yaitu tidak menyebabkan de-asetilasi xilan secara berlebihan.
Sementara penggunaaan NaOCl 7.5% dapat melarutkan xilan yang berdampak
pada rendahnya tingkat ekstraksi xilan (Richana et al. 2007). Penggunaan asam
parasetik akan menghilangkan lignin lebih selektif dibandingkan asam klorin pada
sampel yang belum diberi perlakuan sebelumnya dan metode ini memiliki
pengaruh yang sedikit terhadap struktur selulosa pada sampel. Adapun
penggunaan asam klorin bersifat lebih selektif dalam menghilangkan lignin ketika
sampel telah diberi pra-perlakuan menggunakan SO2 (Kumar et al. 2013).
Kandungan hemiselulosa tongkol jagung Dramaga silangan 3 lebih tinggi
dibandingkan kandungan hemiselulosa tongkol jagung varietas Bisma maupun
Hawaii. Kandungan hemiselulosa tongkol jagung varietas Bisma setelah
didelignifikasi sebesar 30.38% dan tidak berbeda secara signifikan dengan
kandungan hemiselulosa pada tongkol jagung varietas Hawaii sebesar 30.18%.
Kedua varietas tongkol jagung tersebut memiliki kandungan selulosa yang tinggi
yaitu mencapai 40% (Meryandini et al. 2008), sementara kandungan tongkol
jagung Dramaga silangan 3 memiliki kandungan selulosa hanya sebesar 34.07%.
Ekstraksi xilan dari tongkol jagung telah diteliti menggunakan berbagai
metode. Garrote et al. (2001) berhasil mengekstrak 28% xilan tongkol jagung
secara fisik, yaitu menggunakan hydro-thermal dengan 6 pisau yang digerakkan
oleh turbin. Yang et al. (2005) mengembangkan metode preparasi menggunakan
asam sulfur terlarut untuk meningkatkan ekstraksi xilan. Hasilnya menunjukkan
ekstraksi xilan dengan suhu tinggi meningkatkan tingkat ekstraksi, namun juga
berdampak pada tingginya jumlah gula pereduksi yang dihasilkan. Selain itu,
ekstraksi xilan juga telah diinvestigasi menggunakan kekuatan suara ultra (Yang
et al. 2009) dan microwave (Wanitwattanaramulg et al. 2012). Panthapulakkal dan
Sain (2013) menggabungkan metode alkali dengan microwave dan mendapatkan
ekstrak xilan dari Birchwood sebesar 72.5%.
Persentase pentosa (xilan) yang didapatkan dengan metode alkali lebih
tinggi dibandingkan dengan penelitian Kumar et al. (2010). Ia mengekstraksi
xilan secara alkali dengan menggunakan NaOH 6% terlebih dahulu, kemudian
didelignifikasi menggunakan NaOCl dan mendapatkan persentase pentosa sebesar
28.89%. Adapun yield ekstrak xilan dengan metode ekstraksi terlebih dahulu yang
diikuti dengan delignifikasi lebih tinggi, yaitu sebesar 19.59%.

18

KOH dan NaOH sering digunakan untuk mengekstraksi xilan (Ebringerová
dan Heinze 2000). NaOH digunakan untuk melarutkan xilan dan menghilangkan
α-selulosa yang bersifat tidak larut dalam NaOH. Richana et al. (2007)
menemukan xilan lebih larut pada NaOH 10 % dibandingkan air panas. Xilan
memiliki kelarutan lebih rendah pada air dingin, dan xilan tidak larut sama sekali
pada asam (HCl 1N). Penelitian ekstraksi xilan dengan mengoptimasi konsentrasi
alkali yang digunakan telah dilakukan. Semakin meningkatnya konsentrasi alkali
yang digunakan akan menghasilkan tingkat ekstraksi yang tinggi. Richana et al.
(2007) berhasil mendapatkan rendemen xilan sebesar 12.95% dari tongkol jagung
dengan NaOH 10%, sementara Yao (2011) menggunakan NaOH 25% dan
mendapatkan rendemen xilan sebesar 24.39%. Rendemen xilan yang berhasil
diperoleh dari tepung tongkol jagung Dramaga silangan 3 (11.40%) lebih besar
dibandingkan rendemen yang didapatkan dari varietas Bisma (9.26%) dan varietas
Hawaii (9.94) menggunakan metode ekstraksi yang sama. Hal ini menunjukkan
terdapat variasi komposisi tongkol jagung pada ketiga varietas jagung tersebut.
Identifikasi 16S rRNA Xilanolitik XJ18 Asal TNBD
Ekstraksi xilanolitik XJ18 menggunakan teknik PCR koloni berhasil
dilakukan. Prinsip mesin PCR adalah menggunakan siklus pemanasan dan
pendinginan yang berulang untuk reaksi mendenaturasi DNA serta replikasi DNA
secara enzimatis. Campuran reaksi dalam PCR mengandung beberapa komponen,
yaitu DNA yang menjadi cetakan yang akan diamplifikasi; sepasang primer untuk
menginisiasi titik mulai sintesis DNA; deoxynucleoside triphosphates (dNTPs)
sebagai nukleotida yang akan digunakan dalam sintesis DNA baru; larutan bufer
untuk menjaga lingkungan reaksi optimum; serta kation monovalen dan divalen
sebagai kofaktor enzim yang digunakan dalam proses amplifikasi. Pada PCR
koloni, DNA yang menjadi cetakan langsung berasal dari dalam sel yang dilisis,
sehingga tidak dibutuhkan proses ekstraksi DNA. Cetakan DNA yang didapatkan
dari proses denaturasi sel bersifat tidak murni, namun penggunaan primer yang
bersifat spesifik untuk menempel pada daerah gen penyandi 16s rRNA akan
mampu mengamplifikasi gen target spesifik.
Proses PCR umumnya terdiri atas 30 – 40 siklus berulang (Lampiran 5- Seg
3). Setiap siklus terdiri atas 3 proses utama, yaitu denaturasi DNA, penempelan
primer (annealing), dan pemanjangan (elongasi) (Gambar 8). Denaturasi yaitu
proses menjadikan DNA menjadi utas tunggal menggunakan mekanisme
pemanasan mencapai 90 – 95 oC. Ketika proses pemanasan semua reaksi
enzimatis akan terhe