Induksi Embrio Somatik Kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner) dengan Penambahan Auksin serta Sitokinin secara in Vitro.

INDUKSI EMBRIO SOMATIK KOPI ROBUSTA (Coffea
canephora Piere ex Froehner) DENGAN PENAMBAHAN
AUKSIN DAN SITOKININ SECARA IN VITRO

DWI FITRIA ASTARI LUBIS

DEPARTEMEN AGRONOMI DAN HORTIKULTURA
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Induksi Embrio
Somatik Kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner) dengan
Penambahan Auksin serta Sitokinin secara in Vitro adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir

penelitian ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2013
Dwi Fitria Astari Lubis
NIM A24080036

ABSTRAK
DWI FITRIA ASTARI LUBIS. Induksi Embrio Somatik Kopi Robusta (Coffea
canephora Piere ex Froehner) dengan Penambahan Auksin dan Sitokinin secara In Vitro.
Dibimbing oleh NI MADE ARMINI WIENDI

Kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner) merupakan komoditas
penting yang mempengaruhi perekonomian nasional Indonesia. Tujuan penelitian
ini adalah memperoleh media terbaik untuk menginduksi embrio somatik kopi
Robusta untuk produksi benih. Eksplan yang digunakan adalah daun kopi Robusta
varietas BP 42 x BP 358 dan diinduksi dengan 2,4-D sebagai auksin serta BA atau
2iP sebagai sitokinin. Zat pengatur tumbuh auksin 2,4-D dan sitokinin BA atau
2iP serta interaksinya tidak berpengaruh nyata terhadap pembentukan kalus.
Persentase eksplan berkalus tertinggi 86.7 % pada media kombinasi 5 µM 2,4-D

dan 20 µM BA. Interaksi antara auksin 2,4-D dan sitokinin BA atau 2iP tidak
berpengaruh nyata terhadap pembentukan proembrio. Persentese kalus
membentuk proembrio tertinggi adalah 81.04 % pada media konsentrasi sitokinin
20 µM BA. Media induksi embrio serta interaksi antara media asal proembrio dan
media induksi embrio tidak berpangaruh terhadap pembentukan embrio. Media
asal proembrio berpengaruh nyata pada 19 MSP dan berpengaruh sangat nyata
pada 20 dan 21 MSP terhadap pembentukan embrio. Persentase proembrio
membentuk embrio somatik tertinggi adalah 33.3% pada kombinasi media
0 mg l-1 2,4-D dan 4 mg l-1 BA. Persentase embrio somatik berkecambah tertinggi
adalah 82 % dengan menggunakan media 5 µM GA3. Jumlah kecambah tertinggi
diperoleh pada media dengan GA3 10 µM dari proembrio yang berasal dari media
kombinasi 1 µM 2,4-D dan 20 µM BA sebesar 14.8 embrio per 5 clump.
Kata kunci: 2iP, BA, embrio somatik, GA3, Robusta
ABSTRACT
DWI FITRIA ASTARI LUBIS. Somatic Embryos Induction of Robusta Coffee (Coffea
canephora Piere ex Froehner) by addition of auxin and cytokinin In Vitro. Supervised by
NI MADE ARMINI WIENDI

Robusta coffee (Coffea canephora Piere ex Froehner) is an essential
commodity in Indonesia. The objective of this research was to obtain the best

media to induce somatic embryos of Robusta coffee for seedlings production. The
explants were Robusta coffee (Coffea canephora Piere ex Froehner) variety
BP 358 x BP 42 and induced by 2,4-D as auxin and BA or 2iP as cytokinins.
Auxin and cytokinin as plant growth regulator and the interaction itself have no
significant difference to induce callus from leaves explant. The highest persentage
of callus from leaves explant is 86.7% in the medium with 5 µM 2,4-D and 20 µM
BA. The interaction between 2,4-D as the auxin and BA or 2iP cytokinin has no
significant difference to induce proembryo to become cotiledinary embryo. The
highest persentage of proembryo was 81.04% in the medium with addition of 20
µM BA as cytokinin concentration. Embryo induction medium and also the

interaction embryo induction medium with proembryo medium have no
significant difference to induce proembryo become cotiledinary embryos. The
effect of proembryo medium was significant difference the embryo growth at
19 week-after-treatment and also the embryo growth in 20 and 21 week-aftertreatment. The highest persentage of proembryo become cotiledonary embryo is
33.3% in combination medium 0 mg l-1 2,4-D and in ½ MS medium with
4 mg l-1 BA. The highest persentage of germination is 82 % using 5 µM GA3. The
highest number of embryo germination is 14.8 per 5 clumps in medium with
10 µM GA3 from proembryo which came from combination medium added with
1 µM 2,4-D dan 20 µM BA

Keywords: 2iP, BA, GA3, Robusta, somatic embyo

INDUKSI EMBRIO SOMATIK KOPI ROBUSTA (Coffea
canephora Piere ex Froehner) DENGAN PENAMBAHAN
AUKSIN SERTA SITOKININ SECARA IN VITRO

DWI FITRIA ASTARI LUBIS
A24080036
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Pertanian
pada
Departemen Agronomi dan Hortikultura

DEPARTEMEN AGRONOMI DAN HORTIKULTURA
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Judul Skripsi : Induksi Embrio Somatik Kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex
Froehner) dengan Penambahan Auksin serta Sitokinin secara in
Vitro.
Nama
: Dwi Fitria Astari Lubis
NIM
: A24080036

Disetujui oleh

Dr Ir Ni Made Armini Wiendi, MS
Pembimbing

Diketahui oleh

Dr Ir Agus Purwito, MSc.Agr
Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

]lIdlll Skripsi: Induksi Embrio Somatik Kopi Robusta (CoJJea canephora Piere ex
Froehner) dengan Penambahan Auksin serta Sitokinin seeara in
Vitro.
Nama
: Dwi Fitria Astari Lubis

NIM

: A24080036

Disetujui oleh

ｾ＠

c..../

Dr lr Ni Made Arrnini Wiendi, MS
Pembimbing

Tanggal Lulus:

'2 5 (.r

r'I

'

PRAKATA
Puji syukur penulis ucapkan kepada Allah SAW yang telah memberikan
kemudahan dan kelancaran dalam penelitian ini. Penelitian dengan judul Induksi
Embrio Somatik Kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner) dengan
Penambahan Auksin serta Sitokinin secara In Vitro ini dilakukan di Laboratorium
Tissue Culture 2, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian,
Institut Pertanian Bogor.
Penulis berterima kasih kepada keluarga dan kerabat yang telah
mendukung sepenuhnya kegiatan penulis. Selain itu, Dr. Ir. Ni Made Armini
Wiendi, MS. sebagai dosen pembimbing skripsi dan Dr. Ir. Eny Widajati, MS
sebagai dosen pembimbing akademik yang telah membimbing dan mengarahkan
penulis selama menjalankan penulisan ilmiah ini.
Semoga penelitian ini bermanfaat.

Bogor, September 2013
Dwi Fitria Astari Lubis

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

PENDAHULUAN

2

Latar Belakang

1

Tujuan

2

Hipotesis

2

TINJAUAN PUSTAKA

2

Kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner)

2

Zat Pengatur Tumbuh

3

Embriogenesis Sel Somatik

4

BAHAN DAN METODE

4

Tempat dan Waktu

4

Bahan dan Alat

4

Metode Penelitian

5

HASIL DAN PEMBAHASAN

11

Percobaan I. Induksi Kalus dari Eksplan Daun Kopi Robusta Varietas BP 42 x
BP 358
Percobaan II. Induksi Embrio Somatik Kopi Robusta Varietas BP 42 x BP 358

12
17

Percobaan III. Perkecambahan Embrio Somatik Kopi Robusta Varietas BP 42 x
BP 358

19

KESIMPULAN

21

DAFTAR PUSTAKA

21

LAMPIRAN

23

RIWAYAT HIDUP

25

DAFTAR TABEL
1

Eksplan yang hidup dan terkontaminasi dari eksplan daun kopi Robusta
varietas BP 42 x BP 358
2 Rataan waktu pembentukan kalus dan proembrio dari eksplan daun
kopi Robusta varietas BP 42 x BP 358 pada media induksi kalus
3 Rataan persentase kalus kopi Robusta varietas BP 42 x BP 358
berwarna kuning pada 12-14 MSP
4 Rekapitulasi analisis ragam pengaruh media perlakuan terhadap
pembentukan kalus kopi Robusta varietas BP 42 x BP 358
5 Rekapitulasi analisis ragam pengaruh komposisi media terhadap
persentase eksplan yang membentuk proembrio kopi Robusta varietas
BP 42 x BP 358
6 Pengaruh sitokinin terhadap persentase eksplan yang membentu
proembrio kopi Robusta varietas BP 42 x BP 358
7 Rekapitulasi analisis ragam pengaruh media induksi embrio dan media
asal proembrio terhadap pembentukan kotiledonari kopi Robusta
varietas BP 42 x BP 358
8 Pengaruh media asal proembrio terhadap pembentukan kotiledonari
kopi Robusta varietas BP 42 xBP 358 dari inokulum proembrio
9 Rata-rata jumlah embrio berkecambah dari inokulum embrio kopi
Robusta varietas BP 42 x BP 358 pada media dengan GA3
10 Persentase eksplan daun kopi Robusta varietas BP 42 x BP 358 yang
membentuk planlet melalui proses embriogenesis sel somatik

12
13
14
15

16
17

18
19
20
20

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6

Skema bagan alir percobaan induksi embriogenesis somatik kopi
Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner) varietas BP 42 x BP 358
Ekplan daun kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner) yang
ditanam pada media prekondisi
Rata-rata persentase kalus berwarna cokelat pada 2-14 MSP dari
eksplan daun kopi Robusta varietas BP 42 x BP 358
Pembentukan kalus dari ekspan daun kopi Robusta varietas BP 42 x BP
358 pada media induksi kalus, 4 MSP
Diferensiasi kalus membentuk sel proembrio pada eksplan daun kopi
Robusta varietas BP 42 x BP 358
Fase perkembangan embriogenesis sel somatik daun kopi
Robusta varietas BP 42 x BP 358

8
11
14
15
16
19

DAFTAR LAMPIRAN
1
2

Komposisi Murashige dan Skoog (MS) 1962
Persentase eksplan daun kopi Robusta varietas BP 42 x BP 358 yang
membentuk planlet melalui proses embriogenesis sel somatik

23
24

2

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Peranan kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner) dalam
perekonomian nasional cukup penting sebagai salah satu komoditas perkebunan di
Indonesia. Kopi juga memberikan sumbangan devisa negara yang berperan
sebagai komoditi ekspor. Total ekspor kopi Robusta tahun 2010 sebesar 360 600
ton, menurun 26 % menjadi 265 368 ton tahun 2011. Namun, pendapatan yang
didapat meningkat dari US$571 977 000 pada tahun 2010 menjadi US$580 266
000. Ini membuktikan bahwa pasar kopi Robusta potensial. Total ekspor kopi
Robusta juga lebih besar empat kali lipat dari kopi Arabika pada tahun 2010 dan
3.5 kali lipat pada tahun 2011 (AEKI 2012). Rata-rata persentase peningkatan
konsumsi kopi dari masyarakat di benua Asia sebesar 5-8% setiap tahun. Hal ini
juga didukung dengan peningkatan konsumsi masyarakat di benua Amerika dan
Eropa naik hingga 8% per tahun (Panggabean 2011).
Permintaan kopi Robusta harus dipenuhi melalui peningkatan produksi.
Cara peningkatan produksi yakni intensifikasi dengan meningkatkan kualitas bibit
yang ada. Selain itu, kuantitas bibit juga dibutuhkan tetapi persediaan bibit
berkualitas sulit diperoleh. Solusi secara konvensional adalah stek, tetapi hasil
stek dapat memberikan dimorfisme dari sumbu vegetatif, jumlah stek ortotrop
yang sangat membatasi produksi bibit kopi untuk skala besar, perbanyak hasil
stek butuh waktu lama untuk diproduksi dan butuh ketersediaan lahan yang
memadai untuk menyimpan bibit stek (Berthouly dan Etienne 2000). Pemecahan
masalah ini adalah dengan cara kultur jaringan.
Upaya perbanyakan kopi melalui kultur jaringan sudah mulai berkembang
di Indonesia. Hal ini didukung oleh pemerintah melalui Pusat Penelitilian Kopi
dan Kakao sehingga bibit kopi berjumlah besar tersedia dalam jangka waktu
singkat. Perbanyakan tanaman melalui in vitro diharapkan juga dapat membantu
penyediaan bibit kopi bebas patogen berbahaya, dan seragam secara genetik untuk
penanaman dalam skala luas tanpa meninggalkan jaminan kualitasnya. Salah satu
teknik paling banyak digunakan dalam perbanyakan tanaman secara in vitro
adalah embriogenesis sel somatik.
Embriogenesis sel somatik merupakan suatu proses pembentukan embrio
dari sel-sel somatik yang berkembang menjadi tumbuhan baru melalui tahapan
embrio yang spesifik tanpa melalui proses fertilisasi alami. Proses embriogenesis
somatik dapat terjadi secara langsung maupun tidak langsung. Proses secara
langsung terjadi pembentukan proembrio atau embrioid pada potongan eksplan,
sedangkan proses tidak langsung diawali dengan pembentukan kalus terlebih
dahulu (Wattimena et al. 1992). Keuntungan perbanyakan secara embriogenesis
sel somatik memberikan banyak keuntungan antara lain perbanyakan lebih cepat,
waktu pembiakan lebih pendek, dan jumlah bibit yang dihasilkan tidak terbatas
jumlahnya (Mariska 1996). Penelitian tentang embrio somatik kopi Robusta sudah
ada di Indonesia tetapi masih belum optimal oleh karena itu penelitian ini perlu
dikembangkan lagi.
Media dasar dan zat pengatur tumbuh sangat dibutuhkan dalam
perbanyakan melalui embriogenesis. Faktor penting dalam induksi dan
perkembangan embriogenesis sel somatik adalah komposisi nutrisi pada media

2

kultur (Santos-Briones dan Hernández-Sotomayor 2006). Penelitian ini
menggunakan media dasar dan konsentrasi zat pengatur tumbuh auksin dan
sitokinin. Media dasar yang digunakan adalah setengah konsentrasi garam makro
dan mikro MS (Murashige dan Skoog 1962) yang dilengkapi dengan vitamin B5
dengan auksin 2,4-D (asam 2,4-Diklorophenoksiasetat), dan sitokinin 2iP
(6-t,t-dimethyl allyl amino purine) dan BA (6-benzyl adenine), serta PVP untuk
menyerap senyawa fenolik.
Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan protokol perbanyakan bibit
kopi Robusta unggul dan bermutu sehingga produksi kopi Robusta di Indonesia
tidak menurun. Disamping itu, penelitian ini diharapkan membantu dunia
pengetahuan dalam menemukan solusi untuk perbanyakan kopi Robusta secara
optimum.
Tujuan
1. Mempelajari pengaruh interaksi antara konsentrasi auksin dan sitokinin terbaik
dalam induksi kalus kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner)
varietas BP 42 x BP 358.
2. Mempelajari pengaruh interaksi antara auksin 2,4-D dan sitokinin BA terhadap
perkembangan embrio somatik pada kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex
Froehner) varietas BP 42 x BP 358.
3. Mempelajari pengaruh konsentrasi GA3 terhadap perkecambahan embrio
somatik kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner) varietas BP 42 x
BP 358.
Hipotesis
1. Konsentrasi auksin dan sitokinin maupun interaksinya berpengaruh nyata
dalam induksi kalus kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner)
varietas BP 42 x BP 358.
2. Konsentrasi auksin 2,4-D dan sitokinin BA maupun interaksinya berpengaruh
nyata dalam perkembangan embrio somatik kopi Robusta (Coffea canephora
Piere ex Froehner) varietas BP 42 x BP 358.
3. Konsentrasi GA3 berpengaruh nyata dalam perkecambahan embrio somatik
kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner) varietas BP 42 x
BP
358.
TINJAUAN PUSTAKA
Kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner)
Secara agronomi pertumbuhan dan produksi tanaman kopi sangat
tergantung pada keadaan iklim dan tanah. Faktor lain adalah mencari bibit unggul
yang produksinya tinggi dan tahan terhadap hama dan penyakit. Setelah
persyaratan tersebut dapat dipenuhi, suatu hal yang juga penting adalah
pemeliharaan, seperti: pemupukan, pemangkasan, pohon peneduh, dan
pemberantasan hama dan penyakit (Wintgen 2009).

3

Persyaratan iklim kopi Robusta adalah ketinggian tempat , yaitu 300-600m
diatas permukaan laut. Curah hujan 1 500 – 3000 mm/tahun. Bulan kering (curah
hujan < 60 mm/bulan) 1 ‐ 3 bulan. Suhu udara rata‐rata 24‐30°C. Pada umumnya
kopi tidak menyukai sinar matahari langsung dalam jumlah banyak, tetapi
menghendaki sinar matahari teratur. Angin berpengaruh besar terhadap jenis kopi
yang bersifat self-steril. Hal ini untuk membantu penyerbukan yang berbeda klon.
Kopi Robusta dapat hidup di tanah agak masam, yaitu pH 5.5 - 6.5 dan tanaman
kopi tidak menghendaki tanah bersifat basa (Badan Penelitian dan Pengembangan
Pertanian 2008)
Menurut Migro (2009) perbanyakan kopi secara in vitro dapat digunakan
potongan daun kopi muda yang masih berwarna hijau kemerahan atau hijau segar.
Daun tersebut dipotong kecil berukuran kurang lebih 5 mm berbentuk segi empat.
Potongan daun tadi ditanam di dalam botol dengan media yang berisi berbagai zat
hara tertentu. Potongan daun tersebut akan membentuk gumpalan - gumpalan
yang berwarna putih-kekuningan, berbentuk bulat atau lonjong yang disebut
sebagai kalus. Selanjutnya kalus ini akan tumbuh dan berkembang menjadi calon
atau bakal bibit yang disebut embrio. Dalam beberapa percobaan, ada juga dari
potongan daun langsung membentuk embrio. Embrio inilah yang akan tumbuh
dan berkembang menjadi bibit yang ukurannya kecil. Selanjutnya, bibit dipindah
ke dalam botol yang sesuai dengan ukuran bibit agar tumbuh dan berkembang
lebih jauh menjadi tanaman yang lebih besar.
Zat Pengatur Tumbuh
. Embriogenesis sel somatik dengan menggunakan daun kopi Arabika
sebagai eksplan dapat diinduksi dengan menggunakan sitokinin BAP (SantosBriones dan Hernandez-Sotomayor 2006). Kumar et al. (2006) menjelaskan dalam
penelitiannya penggunaan BA 1 mg l-1 berhasil menginduksi embriogenesis sel
somatik dari eksplan daun kopi Arabika selama 5 bulan sebesar 76%.
Peneliti Indonesia sudah banyak melakukan penelitian embriogenesis sel
somatik dengan mengkombinasikan zat pengatur tumbuh. Kombinasi adenine
sulfat dan 2iP berhasil memproduksi embrio somatik tanpa melalui tahap induksi
kalus (Priyono et al. 1991). Oktavia et al (2003) melaporkan induksi embrio
somatik primer per eksplan terbaik diperoleh pada medium kombinasi
0.221 mg l-1 2,4-D dan 3.049 mg l-1 2iP Selanjutnya, Riyadi et al. (2004)
melaporkan penggandaan embrio somatik kopi melalui eksplan daun varietas
Kartika berhasil diperoleh dengan perlakuan kombinasi 2 mg l-1 2,4-D dan 0.1 mg
l-1 kinetin dalam waktu 6 minggu setelah disubkultur. Penelitian terbaru yaitu
kombinasi terbaik untuk pembentukan embriogenesis sel somatik pada daun kopi
Arabika dengan perlakuan kombinasi 1.105 mg l-1 2,4-D dan 1.016 mg l-1 2iP
(Arimarsetiawati 2011). Zat pengatur tumbuh giberelin pada 1.73 mg l-1 GA3
menghasilkan persentase perkecambahan Embrio somatik sebesar 40 % pada
minggu ketiga dan 90.1 % pada minggu ke enam setelah disubkultur ke medium
perkecambahan (Oktavia et al. 2003).

4

Embriogenesis Sel Somatik
Proses terbentuknya embrio ada dua macam yaitu embrio yang terbentuk
secara langsung dari sel atau jaringan tanpa melalui pembentukan kalus dan
embrio yang terbentuk secara tidak langsung yaitu melalui tahapan pembentukan
kalus (Yuwono 2008). Umumnya, metode embriogenesis sel somatik langsung
sulit untuk mendapatkan embrio. Jaringan yang mengalami browning disebabkan
oleh akumulasi senyawa fenolik banyak ditemukan pada proses embrigenesis
somatik pada kopi (Santos-Briones dan Hernandes-Sotomayor 2006). Media perlu
ditambah PVP (Polyvinylpyrrilidone) untuk menyerap senyawa fenolik pada kopi.
Pertama kali Carneiro (1997) berhasil menginduksi embriogenesis sel
somatik Robusta yang berasal dari ruas batang yang lunak. Santos-Briones dan
Hernandes-Sotomayor(2006) didalam penelitiannya menggunakan kultur anther,
daun, dan biji pada kopi Arabika var. Mundo Novo dan Bourbon Amanelo,
melaporkan induksi kalus yang baik di tempat gelap bersuhu 28 °C.
Penelitian embrio somatik menggunakan daun muda sudah dilakukan
sebelumnya. Priyono (2010) melakukan penelitian dengan menggunakan daun
ketiga dan keempat dari pucuk dari kopi Robusta dengan media MS dengan
penambahan vit B5, 1.125 mg l-1 BAP, 30 mg l-1 gula dan 8 g l-1 bacto agar untuk
induksi kalus. Produksi embrio somatik dengan menggunakan media MS dengan
penambahan vit B5, 30 g l-1 gula, dan 3 mg l-1 gelrite. Hasilnya untuk induksi
kalus 98% dari klon BP 409 dan klon FRT 31 selama 7 bulan, sementara itu, 91%
dari klon BP 409 dan 99% dari klon FRT 31 untuk produksi embrio somatik.
Penelitian dilakukan di ruang gelap dengan suhu 25 °C selama 3 bulan.
Oktavia (2003) melaporkan bahwa pada kultur embriogenesis kopi Arabika
klon BP 426A dengan membandingkan eksplan daun, epikotil, hipokotil, dan akar
tanaman menunjukkan bahwa persentase induksi embrio somatik dengan daun
muda palng tinggi yaitu 77.2% dengan menggunakan setengah konsentrasi MS,
vit B5, 250 mg l-1 PVP dan 20 g l-1 sukrosa ditambah zat pengatur tumbuh
kombinasi 0.221 mg l-1 2,4-D dan 3.05 mg l-1 2iP kultur diinkubasi dalam ruang
gelap dengan suhu 28 °C.

BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen
Agronomi dan Hortikultura IPB Darmaga. Penelitian berlangsung dari bulan Juli
2012 sampai Februari 2013.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian meliputi bahan tanaman, bahan
media, dan bahan sterilan. Bahan tanaman yang digunakan untuk menginduksi
proembrio adalah daun yang berada pada posisi ketiga dan kedua dari pucuk, serta
daun dipucuk kopi Robusta Varietas BP 42 x BP 358. Menurut Wachjar (2002)
tanaman varietas BP 42 x BP 358 berasal dari Pusat Penelitian Kopi dan Kakao
Jember, Jawa Timur. Tanaman berumur 7 bulan setelah semai ditanam pada Juli

5

2000 di Kebun Percobaan IPB, Cikabayan, Dramaga. Tinggi tempat 250 meter di
atas permukaan laut dan jenis tanah latosol.Bahan sterilan adalah fungisida,
bakterisida, NaClO, dan alkohol 70% dan air filter steril. Bahan lain yang
diperlukan di dalam proses pengkulturan eksplan adalah alkohol 70% dan spiritus.
Bahan media terdiri atas media prekondisi, media induksi kalus, media
induksi embrio somatik, dan media perkecambahan. Media prekondisi adalah
media MS dengan penambahan 30 g l-1 gula dan 7 g l-1 agar. Media induksi kalus
adalah media setengah konsentrasi garam makro dan mikro MS yang ditambahkan
dengan vitamin B5, 100 mg l-1 asparagine, 30 g l-1 gula, 7g l-1 agar, dan
500 mg l-1 arang aktif dengan pH 5.8 sebelum diautoklaf. Zat pengatur tumbuh
yang ditambahkan terdiri atas 2,4-D yang dikombinasikan dengan dua sitokinin
yaitu BA dan 2iP. Media induksi embriogenesis sel somatik adalah media
setengah konsentrasi garam makro MS dengan penambahan 100 mg l-1
asparagine, 200 mg l-1 tryptone, 800 mg l-1 yeast extract, 20 mg l-1 thiamine,
20 mg l-1 glycine, 3 mg l-1 adenine hemisulphate, 200 mg l-1 myo-inositol, 30g l-1
gula, 7 g l-1 agar, dan 500 mg l-1 arang aktif dengan pH 5.8 sebelum autoklaf. Zat
pengatur tumbuh yang ditambahkan terdiri dari 2,4-D dan BA. Media maturasi
(pendewasaan) yaitu media MS yang ditambahkan 30 g l-1 gula dan 7 g l-1 agar.
Media perkecambahan adalah media MS dengan penambahan 30 g l-1 gula dan 7 g
l-1 agar. Zat pengatur tumbuh yang ditambahan adalah 2 perlakuan yaitu
1.73 mg l-1 GA3 dan 3.46 mg l-1 GA3 dan di pH 5.7 sebelum autoklaf.
Alat yang digunakan terdiri atas alat untuk sterilisasi, alat untuk membuat
media, dan alat tanam. Alat sterilisasi terdiri atas autoclave dan oven. Alat untuk
membuat media adalah botol kultur, gelas ukur, gelas piala besar, corong, plastik
gulung, pH meter, kompor, dan karet gelang. Alat untuk menanam adalah laminar
airflow cabinet, pinset, gunting, scalpel, lampu spiritus, dan korek.
Metode Penelitian
Penelitian ini terdiri atas tiga percobaan yang berkesinambungan.
Percobaan pertama adalah percobaan induksi kalus, percobaan kedua adalah
induksi embrio somatik, dan percobaan ketiga adalah perkecambahan.
Percobaan I. Induksi Kalus dari Eksplan Daun Kopi Robusta Varietas
BP 42 x BP 358
Percobaan ini menggunakan rancangan acak lengkap dua faktor. Faktor
pertama adalah auksin dengan dua taraf, yaitu 1 µM (0.221mg l-1) 2,4-D dan 5 µM
(1.105 mg l-1) 2,4-D. Faktor kedua adalah sitokinin dengan 8 taraf yaitu 5 µM
(1,016 mg l-1), 10 µM (2.033 mg l-1), 15 µM (3.049 mg l-1), 20 µM (4.066 mg l-1)
2iP dan 5 µM (1.126 mg l-1), 10 µM (2.252 mg l-1),15µM (3.378 mg l-1), 20 µM
(4.504 mg l-1) BA. Ada 16 kombinasi perlakuan dan setiap perlakuan diulang
3 kali berdasarkan hasil penanaman, sehingga diperoleh 48 satuan percobaan.
Setiap satuan percobaan terdiri atas 3 botol dan 1 botol terdiri atas 5 eksplan
sebagai satuan amatan. Total yang diamati adalah 720 eksplan. Model linear dari
percobaan ini adalah :
Y ij = µ + α i + β j + (αβ) ij + ε ij

6

Keterangan :
Y ijk
= Nilai pengamatan faktor auksin dan faktor konsentrasi sitokinin
taraf ke-j dan dari ulangan ke-k (k = 1,2,3)
µ
= Rataan umum
αi
= Pengaruh konsentrasi auksin taraf ke-i ( i = 1,2)
βi
= Pengaruh konsentrasi sitokinin ke-j ( j = 1,2,3,...,8)
(αβ) ij
= Interaksi antara perlakuan auksin taraf ke-i dengan konsentrasi
konsentrasi sitokinin ke-j
ε ij
= Galat percobaan pada konsentrasi auksin ke –i, sitokinin ke –j,
dan ulangan ke -k
Peubah yang diamati adalah persentase kultur yang membentuk kalus dan
warnanya, persentase kultur yang membentuk proembrio, serta waktu
terbentuknya kalus dan proembrio serta persentase kultur terkontaminasi. Data
pengamatan diuji menggunakan uji F pada taraf 5%. Apabila pengaruh perlakuan
berbeda nyata, maka dilakukan uji lanjut menggunakan DMRT (Duncan Multiple
Range Test) pada taraf 5%.
Percobaan II. Induksi Embrio Somatik Kopi Robusta Varietas BP 42 x BP
358
Penelitian induksi embrio somatik menggunakan rancangan acak lengkap
dua faktor. Faktor pertama adalah media embrio somatik dengan dua taraf, yaitu
0 mg l-1 2,4-D ditambah 4 mg l-1 BA dan 0.97 mg l-1 2,4-D ditambah 4 mg l-1 BA.
Faktor kedua adalah media asal proembrio. Sumber inokulum adalah clump
(proembrio dan kalus) yang berasal dari media induksi kalus. Media induksi kalus
terdiri atas 14 media. Ada 28 kombinasi perlakuan dan setiap perlakuan diulang
berdasarkan sumber inokulum yang ada , sehingga diperoleh 82 satuan percobaan.
Setiap satuan percobaan terdiri dari 5 inokulum. Total yang diamati adalah
410 inokulum. Model linear dari percobaan ini adalah :
Y ijk = µ + α i + β j + (αβ) ij + ε ijk
Keterangan :
Y ij
= Nilai pengamatan faktor komposisi media induksi embrio
somatik ke –i, faktor asal proembrio taraf ke-j, dari ulangan ke –k
( k = 1,2,3)
µ
= Rataan umum
αi
= Pengaruh perlakuan komposisi media induksi embrio somatik
taraf ke-i ( i = 1,2)
βi
= Pengaruh asal proembrio ke-j ( j = 1,2,3,..., 16)
(αβ) ij
= Interaksi antara perlakuan komposisi media induksi embrio
somatik taraf ke-i dengan asal proembrio ke-j
ε ij
= Galat percobaan faktor komposisi media induksi embrio
somatik ke –i, faktor asal proembrio taraf ke-j, dari ulangan ke –k
( k = 1,2,3)

7

Peubah yang diamati adalah persentase embrio membentuk kotiledonariri
dan proses perkembangan sel dari kalus hingga membentuk embrio somatik
secara mikroskopik. Data pengamatan diuji menggunakan uji F pada taraf 5%.
Apabila pengaruh perlakuan berbeda nyata, maka dilakukan uji lanjut
menggunakan DMRT (Duncan Multiple Range Test) pada taraf 5%.
Percobaan III. Perkecambahan Embrio Somatik Kopi Robusta Varietas
BP 42 x BP 358
Percobaan ini menggunakan rata-rata eksplan berkecambah. Faktornya
adalah GA3 dengan dua taraf, yaitu 5 µM (1.73 mg l-1) GA3 dan 10 µM
(3.46 mg l-1) GA3. Sumber eksplan adalah inokulum clump yang berasal dari
media induksi embrio somatik. Ada 4 media perlakuan yang menghasilkan
kotiledonari. Media ini terdiri atas kombinasi 1 µM 2,4-D dan 5 µM BA, 1 µM
2,4-D dan 10 µM BA, 1 µM 2,4-D dan 20 µM BA serta kombinasi 1 µM 2,4-D
dan 5 µM 2iP. Kriteria yang diamati adalah persentase embrio berkecambah.
�����ℎ ������ ����������ℎ

Persentase embrio berkecambah = �����ℎ ������������ ���� ������� × 100%

Bagan alir percobaan secara keseluruhan untuk percobaan induksi
embriosomatik kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner) varietas
BP 42 x BP 358 disajikan pada gambar 1.

8

Percobaan Prekondisi
Media : MS, Eksplan potongan daun
Waktu : 1-5 hari setelah tanam
Frekuensi subkultur : Ruang inkubasi kultur : gelap ; Suhu : 27±2°C; RH : 46±2%
Hasil yang diharapkan: Eksplan aseptik

Percobaan Induksi Kalus dan Proembrio
Media : ½MS+Kombinasi auksin 1 dan 5µM 2,4-D dan sitokinin
5,10,15, 20µM BA atau 2-ip, eksplan daun aseptik
Waktu : 1 – 14 Minggu setelah tanam
Frekuensi subkultur : setiap 4 minggu
Ruang inkubasi kultur : gelap ; Suhu : 27±2°C; RH : 46±2%
Hasil yang diharapkan : Kalus dan proembrio

Percobaan Induksi Embrio Somatik
Media : - ½MS + kombinasi 0 µM 2,4-D dengan 17.8µM BA
- ½MS + kombinasi 4.4 µM 2,4-D dengan 17.8 µM BA,
eksplan inokulum kalus / proembrio
Waktu : 15-25 Minggu setelah tanam
Frekuensi subkultur : setiap 4 minggu
Ruang inkubasi kultur: gelap ; Suhu : 27±2°C; RH : 46±2%
Hasil yang diharapkan: embrio

Percobaan Maturasi Embrio
Media : MS
Waktu : 26-29 Minggu setelah tanam
Frekuensi subkultur : Ruang inkubasi kultur : gelap ; Suhu : 27±2°C; RH : 46±2%
Hasil yang diharapkan: Embrio dewasa fase kotiledonari

Percobaan Kecambah
Media : MS + 5µM GA3 dan MS +10µM GA3
Waktu : 30-33 Minggu
setelah tanam
Pelaksanaan
Penelitian
Frekuensi subkultur : Ruang inkubasi kultur : terang ; Suhu : 27±2°C; RH : 57±2%
Hasil yang diharapkan : Kecambah

Gambar 1 Skema bagan alir percobaan induksi embriogenesis somatik kopi
Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner) varietas BP 42 x BP 358

9

Pelaksanaan Penelitian
Persiapan dan Sterilisasi Alat
Dalam kegiatan ini, seluruh alat yang digunakan harus dalam keadaan
streril. Seluruh alat dicuci bersih kemudian dikeringkan, kemudian disterilkan
dengan menggunakan autoklaf pada temperatur 121°C dengan tekanan 1.1 kgcm2
selama 1 jam.
Pembuatan Larutan Stok
Pembuatan larutan stok berfungsi untuk memudahkan pembuatan media.
Larutan stok dibuat sesuai dengan komposisi media yang dibutuhkan dan
disimpan dalam konsentrasi yang lebih pekat dalam suhu kamar.
Pembuatan Media Kultur
a. Media Induksi Kalus
Media dasar yang digunakan adalah ½ konsentrasi hara makro dan mikro
MS. Penambahan zat pengatur tumbuh auksin (2,4-D) dan sitokinin (BA dan 2iP)
sesuai dengan konsentrasi perlakuan. Pada saat pembuatan ditambahkan auksin
dan sitokinin sesuai dengan konsentrasi perlakuan. Proses membuat 1 liter ½ MS,
pertama 30 g gula dilarutkan ke dalam 100 ml aquades, larutan gula dipindahkan
ke dalam labu takar 1 liter. Kemudian 10 ml masing-masing larutan stok A dan B
ditambahkan, 2,5 ml masing-masing larutan stok C, stok D, dan stok E
ditambahkan. Setelah itu, 5 ml masing-masing larutan stok F dan 10 ml vitamin
B5 dan myo ditambahkan. Penambahan lainnya adalah asparagine 100 mg l-1,
setelah itu diaduk dengan magnetic stirer agar larutan homogen dan pH media
ditera dengan penambahan HCl 1 N atau KOH 1 N hingga mencapai 5.8, lalu
7-8 gram agar-agar dan 500 mg l-1 arang aktif ditambahkan. Media dipanaskan
sampai agar-agar larut (sambil diaduk), lalu dituang ke dalam botol kultur steril.
Selanjutnya, media disterilisasi selama 15-20 menit pada suhu 121 °C tekanan
17.5 psi.
b. Media Embrio Somatik
Media dasar yang digunakan adalah ½ konsentrasi hara makro dan mikro
MS. Penambahan zat pengatur tumbuh auksin (2,4-D) dan sitokinin (BA) sesuai
dengan konsentrasi perlakuan. Pada saat pembuatan ditambahkan auksin dan
sitokinin sesuai dengan konsentrasi perlakuan. Proses pembuatan media 1 liter ½
MS dibuat sama dengan media induksi kalus. Penambahan lainnya adalah 100 mg
l-1 asparagine, 200 mg l-1 tryptone, 800 mg l-1 yeast, 20 mg l-1 thiamine,
20 mg l-1 glycine, 3 mg l-1 adenine hemisulphate, dan 200 mg l-1 myo-inositol.
Setelah itu, larutan diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer agar larutan
homogen, kemasaman (pH) media diatur dengan menambahkan HCl 1 N atau
KOH 1 N hingga mencapai 5.8, lalu ditambahkan 7-8 gram agar-agar dan 500 mg
l-1 arang aktif.

10

c. Media Perkecambahan
. Media dasar yang digunakan adalah MS. Penambahan zat pengatur tumbuh
GA3 ke dalam media perkecambahan sesuai dengan konsentrasi perlakuan. Pada
saat pembuatan ditambahkan auksin dan sitokinin sesuai dengan konsentrasi
perlakuan. Proses 1 liter MS dibuat sama dengan media induksi kalus dengan 30
gram gula ditambahkan. Setelah itu, diaduk dengan magnetic stirrer agar larutan
homogen dan pH media ditera dengan penambahkan HCl 1 N atau KOH 1 N
hingga mencapai 5.8, lalu 7-8 gram agar-agar ditambahkan.
c. Pemilihan Eksplan
Eksplan yang digunakan adalah daun kopi yang berada pada posisi ketiga,
kedua, dan pertama dari pucuk berwarna hijau segar dan sehat. Pohon
berpenampilan baik dan sehat secara keseluruhan dan daun kopi berpenampilan
baik dan utuh.
d. Sterilisasi Eksplan
Daun kopi terlebih dahulu disterilkan dengan cara dibersihkan
menggunakan detergen dan dibilas sampai bersih. Daun direndam dalam larutan
Agrept dan Dithane M-45 sebanyak 2 g l-1 selama 2 jam, kemudian dibilas sekali
di dalam air steril. Setelah itu daun direndam di dalam NaClO 10% selama
10 menit dan NaClO selama 40 menit, kemudian dibilas sekali di dalam air steril.
Daun direndam di dalam alkohol 70% selama 1 menit, kemudian dibilas sekali di
dalam air steril. Setelah itu, daun direndam di NaClO 10% selama 10 menit
kemudian daun diletakkan di cawan petri steril kemudian dipotong dengan tulang
daun dihilangkan. Penghilangan tulang daun bertujuan untuk menghindari
kontaminasi bakteri. Daun direndam kembali dalam NaClO 5% selama 5 menit.
Selanjutnya, daun dipotong ±0.5 cm x ±0.5 cm. Daun dicelupkan sebentar ke
dalam cefotaxim dengan dosis 4 mg ml-1. Seluruh pengerjaan dilakukan di dalam
Laminar Air Flow Cabinet.
e. Penanaman Eksplan
Penanaman eksplan dilakukan dalam laminar air flow cabinet yang sudah
dibersihkan dengan alkohol 70% sebelum penanaman. Semua alat juga
disterilisasi dengan alkohol 70% agar tidak terjadi kontaminasi eksplan. Kultur
disimpan dalam ruang kultur yang gelap dan bertemperatur 26-28°C.
Penanaman eksplan dibagi beberapa tahap, antara lain:
a. Penanaman eksplan pada tahap prekondisi
b. Penanaman eksplan pada tahap perlakuan induksi embriogenik
c. Penanaman inokulum pada tahap perlakuan induksi embrio
d. Penanaman inokulum pada tahap pendewasaan
e. Penanaman inokulum pada tahap perkecambahan

11

HASIL DAN PEMBAHASAN
Kondisi Umum
Penelitian ini bertujuan untuk mencari media terbaik untuk embrio
somatik kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner). Kopi Robusta yang
digunakan adalah varietas BP 42 x BP 358. Bahan tanaman yang diambil sebagai
eksplan adalah daun pertama hingga daun ketiga dari pucuk. Daun dipotong
dengan ukuran 0.5 cm x 0.5 cm dengan tulang daun dihilangkan. Penghilangan
tulang daun bertujuan untuk menghindari kontaminasi bakteri. Seluruh pengerjaan
dilakukan di dalam Laminar Air Flow.

Gambar 2 Ekplan daun kopi Robusta (Coffea canephora Piere ex Froehner) yang
ditanam pada media prekondisi
Daun dikulturkan ke media prekondisi selama 5 hari seperti pada gambar 2.
Tujuannya adalah untuk menyeleksi eksplan aseptik sebelum dikulturkan ke
dalam media perlakuan. Setelah itu, daun dimasukkan ke media perlakuan. Media
perlakuan untuk menginduksi proembrio adalah media MS setengah konsentrasi
hara makro dan mikro dengan penambahan auksin dan sitokinin. Zat Pengatur
Tumbuh yang digunakan untuk menginduksi proembrio adalah 2,4-D sebagai
auksin serta BA dan 2iP sebagai sitokinin. Eksplan disubkultur setiap bulan. Pada
tahap awal kalus yang terbentuk berwarna putih dan kompak, selanjutnya berubah
warna menjadi kuning dan bentuknya remah serta berdiferensisasi membentuk
proembrio. Proembrio yang terbentuk disubkultur ke media induksi untuk
menginduksi embrio yaitu media MS setengah konsentrasi hara makro dengan
penambahan 2,4-D sebagai auksin dan BA sebagai sitokinin. Proembrio
berkembang membentuk menjadi embrio pada media ini, dengan perkembangan
mulai dari fase globular sampai kotiledonari.
Embrio fase kotiledonari disubkultur ke media maturasi selama 1 bulan.
Tujuannya adalah untuk membuat kotiledonari menjadi siap untuk
perkecambahan. Medianya adalah media MS tanpa zat pengatur tumbuh.Setelah
satu bulan, embrio disubkultur ke media perkecambahan untuk menghasilkan
planlet. Embrio diamati selama 1 bulan.

12

Percobaan I. Induksi Kalus dari Eksplan Daun Kopi Robusta Varietas
BP 42 x BP 358
Eksplan yang ditumbuhkan pada media prekondisi yaitu MS tanpa zat
pengatur tumbuh tidak menunjukkan perubahan selama 5 hari sejak dikulturkan.
Eksplan yang aseptik di media prekondisi selanjutnya disubkultur ke media
perlakuan induksi proembrio.
Tabel 1 Eksplan yang hidup dan terkontaminasi dari eksplan daun kopi Robusta
varietas BP 42 x BP 358
Auksin
(µM)
2,4-D
1
1
1
1
5
5
5
5
1
1
1
1
5
5
5
5

Sitokinin
(µM)
BA
5
10
15
20
5
10
15
20
2iP
5
10
15
20
5
10
15
20
Rata-rata

∑ Eksplan
/perlakuan

Eksplan
aseptik
hidup (%)

Eksplan
aseptik mati
(%)

Kontaminasi
(%)

45
45
45
45
45
45
45
45

64.4
82.2
55.5
73.3
80.0
62.2
46.7
86.7

8.9
11.1
37.8
24.4
8.9
15.6
13.3
8.9

26.7
6.7
6.7
2.2
11.1
22.2
40.0
4.4

45
45
45
45
45
45
45
45

20.0
42.2
11.1
17.8
26.7
20.0
53.3
37.8
48.7

57.8
22.2
31.1
24.4
40.0
73.3
31.1
28.9
27.3

22.2
35.6
57.8
57.8
33.3
6.7
15.6
33.3
23.9

Data Tabel 1 menyajikan persentase eksplan hidup berkisar antara 11.11 86.67 %. Persentase eksplan terkontaminasi adalah berkisar antara 2.22-57.78 %.
Secara umum tingkat kontaminasi sangat tinggi. Hal ini disebabkan eksplan yang
digunakan adalah daun dari tanaman di lapangan. Organ daun dalam tanaman
merupakan organ luar yang langsung berhubungan dengan berbagai
mikroorganisme sebagai sumber kontaminan.
Eksplan aseptik yang mati adalah eksplan aseptik yang tidak menghasilkan
kalus dan tetap aseptik hingga akhir pengamatan. Persentase eksplan aseptik
berkisar antara 8.9-73.3 %. Media yang mempunyai eksplan aseptik tertinggi
adalah media dengan kombinasi 5 µM 2,4-D dan 10 µM 2iP. Hal ini diduga
respon eksplan daun kopi Robusta varietas BP 42 x BP 358 rendah di dalam
pembentukan kalus. Penyebab lain adalah daun lebih tipis dan zat lilin lebih tipis
sehingga ketika terkena bahan sterilan, sel lebih mudah rusak dan mati. Faktor
lain adalah kesalahan dalam penanaman eksplan daun kopi Robusta. Alat tanam
masih dalam keadaan panas saat menyentuh eksplan daun ketika ditanam ke
dalam media perlakuan.
Data pada Tabel 2 menunjukkan bahwa waktu inisiasi kalus terjadi antara
2 hingga 5 minggu setelah perlakuan (MSP). Rata-rata pembentukan kalus secara

13

keseluruhan adalah 2.8 MSP. Pada media perlakuan induksi kalus juga
menghasilkan proembrio, hasil dari proses diferensiasi kalus. Waktu untuk
membentuk proembrio dari kalus adalah 12.4 MSP. Menurut Priyono et al. (2010)
pada eksplan daun dari tanaman kopi Robusta klon FRT 80 penambahan kinetin
5 mg l-1 berinisiasi kalus pada 4 minggu setelah perlakuan. Penelitian Gatica et al.
(2007) menyatakan bahwa dengan menggunakan 1 mg l-1 BA, inisiasi kalus kopi
Arabika cv. Caturra dan Catuai pertama kali pada 2 minggu setelah perlakuan.
Pada penelitian ini waktu pembentukan kalus dan proembrio cukup seragam
dengan rata eksplan hidup 48.7% dan kalus membentuk proembrio 21.9%.
Perlakuan yang berbeda adalah perlakuan 1 µM 2,4-D dan 15 µM 2iP. Hal ini
diduga respon eksplan daun kopi Robusta varietas BP 42 x BP 358 rendah dalam
menginduksi kalus dan tidak dapat menginduksi proembrio.Indikator sel
dikatakan sebagai proembrio adalah kalus menjadi remah dan berwarna kuning.
Tabel 2 Rataan waktu pembentukan kalus dan proembrio dari eksplan daun kopi
Robusta varietas BP 42 x BP 358 pada media induksi kalus
Auksin
(µM)
2,4-D
1
1
1
1
5
5
5
5
1
1
1
1
5
5
5
5

Sitokinin
(µM)

∑Eksplan
membentuk
kalus (%)

Waktu terbentuk
kalus (MSP)

BA
64.4
2.7
5
82.2
3.0
10
55.6
3.5
15
73.3
3.8
20
80.0
2.3
5
62.2
2.3
10
46.7
2.6
15
86.7
2.0
20
2iP
20.0
2.0
5
42.2
2.5
10
11.1
5.2
15
17.8
3.3
20
26.7
2.2
5
20.0
2.0
10
53.3
3.6
15
37.8
2.5
20
48.7
2.8
Rata-rata
Keterangan : MSP = Minggu setelah perlakuan

∑Eksplan
membentuk
proembrio (%)

`Waktu
membentuk
proembrio (MSP)

50.0
41.7
21.5
15.0
16.7
23.3
27.8
44.4

12.7
12.3
12.0
12.2
13.0
12.3
13.5
12.0

10.8
33.3
0.0
4.8
10.3
3.3
22.2
25.0
21.9

12.4
12.5
0.0
12.0
12.5
13.0
12.2
12.1
12.4

14

Warna Kalus dari Eksplan Daun Kopi Robusta Varietas BP 42 x BP 358
Kalus memiliki warna putih saat pertama kali terbentuk, secara berangsurangsur kalus berwarna krem dan kuning. Ada kalus yang berwarna kecokelatan
setelah berwarna krem. Warna cokelat ini terjadi karena proses browning. Proses
ini terjadi karena kalus menjadi tua. Kalus yang berwarna cokelat terjadi pada
sebagian sel-sel pada clump. Pada gambar 3 dapat dilihat bahwa kalus membentuk
warna cokelat meningkat dari 2.1% sampai 75.3% pada minggu ke-2 sampai ke10 setelah perlakuan, tetapi kalus membentuk warna cokelat ini menurun 43.4%
pada minggu ke-14. Hal ini karena ada pembentukan kalus baru.

Kalus berwarna cokelat (%)

120
75.3

100
80

43.4

40.8
60
40
2.1
20
0
2 MSP

6 MSP

10 MSP

14 MSP

Minggu setelah perlakuan

Gambar 3 Rata-rata persentase kalus berwarna cokelat pada 2-14 MSP dari
eksplan daun kopi Robusta varietas BP 42 x BP 358
Tabel 3 Rataan persentase kalus kopi Robusta varietas BP 42 x BP 358 berwarna
kuning pada 12-14 MSP
Auksin (µM)
2,4-D
1
1
1
1
5
5
5
5

Sitokinin (µM)
12 MSP
BA
5
8.3
10
15.3
15
32.5
20
24.6
5
0.0
10
14.8
15
9.7
20
27.2
2iP
1
5
27.8
1
10
0.0
1
15
0.0
1
20
8.3
5
5
16.7
5
10
0.0
5
15
19.6
5
20
23.3
Rata-rata
14.3
Keterangan : MSP = Minggu setelah perlakuan

13 MSP

14 MSP

66.7
70.8
48.6
48.6
14.3
48.1
50.0
28.5

66.7
75.0
58.1
33.3
14.3
48.1
58.3
35.1

44.4
0.0
0.0
16.7
16.7
33.3
90.5
60.0
39.8

61.1
33.3
0.0
16.7
27.8
33.3
86.1
60.0
42.1

15

Kalus yang diharapkan terbentuk dari proses induksi kalus pada daun kopi
Robusta varietas BP 42 x BP 358 ini adalah kalus yang berwarna kuning dan
memiliki struktur remah. Kalus berwarna kuning adalah kalus yang berpotensi
membentuk proembrio. Tabel 3 menunjukkan bahwa persentase rata-rata ekplan
membentuk kalus berwarna kuning sampai 14 MSP adalah meningkat dari 14.3%
menjadi 42.1 %. Persentase tertinggi diperoleh dari media dengan kombinasi 5
µM 2,4-D dan 15 µM 2iP yaitu 86.1 %. Hal ini menunjukkan respon eksplan
terhadap zat pengatur tumbuh dalam pembentukan warna kalus berbeda-beda.
Menurut Wattimena (1988) selain konsentrasi, jenis zat pengatur tumbuh juga
mempengaruhi respon eksplan tanaman. Pada eksplan daun kopi Robusta varietas
BP 42 x BP 359 kombinasi 1 µM 2,4-D dengan peningkatan konsentrasi sitokinin
BA dan 2iP cenderung menurun persentase kalus berwarna kuning, namun terjadi
respon terbalik dengan kombinasi 5 µM 2,4-D dengan peningkatan konsentrasi
sitokinin BA dan 2iP cenderung meningkatkan persentase kalus berwarna kuning.
Kalus
Respon awal yang terjadi adalah eksplan mulai menggulung ke dalam dan
warna daun berubah menjadi hitam pada minggu pertama setelah disubkultur.
Kalus sebagian besar muncul pada minggu kedua dan satu media muncul pada
minggu kelima setelah disubkultur. Kalus dini seperti yang ditunjukkan pada
gambar 4 muncul pada pinggiran daun eksplan (bekas luka sayatan).

B
A

Gambar 4 Pembentukan kalus dari ekspan daun kopi Robusta varietas BP 42 x BP 358
pada media induksi kalus, 4 MSP. (A) Ekplan awal, (B) Kalus

Tabel 4 Rekapitulasi analisis ragam pengaruh media perlakuan terhadap
pembentukan kalus kopi Robusta varietas BP 42 x BP 358
Umur(MSP)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Auksin (A)
tn
tn
tn
tn
tn
tn
tn
tn
tn
tn

Sitokinin (S)
tn
tn
tn
tn
tn
tn
tn
tn
tn
tn

Interaksi
tn
tn
tn
tn
tn
tn
tn
tn
tn
tn

KK (%) (%
32.48
29.02
34.01
33.99
32.52
31.45
30.98
41.00
30.97
30.97

Keterangan: tn=tidak nyata KK (%)= koefisien keragaman; data di transformasi (x+4) ½ sebelum
diolah menggunakan SAS. MST= Minggu setelah tanam

16

Pengamatan kalus dilakukan dari 2 MSP hingga 11 MSP. Eksplan
berumur 1 MSP belum mengalami pembentukan kalus. Tabel 4 menunjukkan
bahwa auksin dan sitokinin tidak memberikan pengaruh nyata terhadap
pembentukan kalus Robusta varietas BP 42 x BP 358. Hasil diatas menunjukkan
bahwa kombinasi auksin dan sitokinin dengan dosis rendah memberikan pengaruh
sama dengan auksin dan sitokinin dengan dosis tinggi berdasarkan uji statistik.
Namun, hal ini belum tentu terjadi pada genotipe kopi Robusta lain. Oktavia et al.
(2003) menyatakan setiap genotipe atau jaringan mempunyai respons yang
berbeda dalam penyerapan zat pengatur tumbuh dalam medium dan memiliki
kandungan zat pengatur tumbuh endogen yang berbeda.
Kalus proembrio
Tahap selanjutnya dari kalus adalah proembrio. Proembrio ini mempunyai
potensi untuk menjadi embrio. Proembrio terbentuk dari kalus pada 12 MSP.
Proembrio seperti gambar 5 berwarna kuning memiliki struktur nodul dan remah.
Kalus proembrio bersifat lunak dan mengeluarkan cairan. Tidak semua media
perlakuan berpotensi menginduksi embrio.

B
A
`
Gambar 5 Diferensiasi kalus membentuk sel proembrio pada eksplan daun kopi
Robusta varietas BP 42 x BP 358. A) Kalus B) Proembrio
Tabel 5 Rekapitulasi analisis ragam pengaruh komposisi media terhadap
persentase eksplan yang membentuk proembrio kopi Robusta varietas
BP 42 x BP 358
Umur (MSP)
12
13
14

Auksin (A)
tn
tn
tn

Sitokinin (S)
tn
*
tn

Interaksi (A x S)
tn
tn
tn

KK (%)
14.3
17.7
17.8

Keterangan: *) berpengaruh nyata p≤0.05; tn=tidak nyata. KK (%)= koefisien keragaman; data di
transformasi (x+0.5) ½ sebelum diolah menggunakan SAS.
MSP= Minggu setelah perlakuan

Tabel 5 menunjukkan bahwa perlakuan auksin tidak berpengaruh nyata
terhadap pembentukan proembrio. Interaksi auksin dan sitokinin juga tidak
memberikan pengaruh nyata terhadap pembentukan proembrio. Perlakuan

17

sitokinin memberikan pengaruh nyata terhadap pembentukan proembrio pada
13 MSP.
Data Tabel 6 diatas menunjukkan bahwa sitokinin 10 µM BA memiliki
persentase membentuk proembrio terbesar yaitu 81.06 % pada 13 MSP. Namun,
10 µM BA tidak berbeda dengan 5 µM BA, 15 µM BA, 20 µM BA, 15 µM
2iP ,dan 20 µM 2iP secara statistik. Konsentrasi sitokinin 10 µM BA berbeda
nyata dengan 5 µM 2iP dan 10 µM 2iP.
Hasil percobaan ini menunjukkan bahwa konsentrasi BA dengan dosis
rendah lebih baik digunakan yaitu 5-10 µM dibandingkan konsentrasi yang lebih
tinggi . Sitokinin memiliki peran penting dalam pembentukan proembrio. Tabel 6
juga menunjukkan bahwa sitokinin BA lebih baik digunakan daripada sitokinin
2iP untuk membentuk proembrio kopi Robusta varietas BP 42 x BP 358.
Tabel 6 Pengaruh sitokinin terhadap persentase eksplan yang membentuk
proembrio kopi Robusta varietas BP 42 x BP 358
Sitokinin
BA (µM)
5
10
15
20
Rataan
2-ip(µM)
5
10
15
20
Rataan
KK (%)

Proembrio (%)
13 MSP
73.15ab
81.06a
55.30 abc
81.04a
72.6
50.74bc
38.64 c
61.03abc
55.64abc
51.5
17.7

Keterangan: angka yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada uji DMRT α=0.05. Data
di transformasi (x+0.5) ½ sebelum diolah menggunakan SAS

Menurut Santos-Briones dan Hernandes-Sotomayor (2006) menyatakan
induksi embriogenesis dengan menggunakan eksplan daun kopi Arabika dapat
dilakukan hanya menggunakan BAP. Mereka melaporkan bahwa sitokinin juga
berperan penting dalam induksi embrio somatik.
Percobaan II. Induksi Embrio Somatik Kopi Robusta Varietas
BP 42 x BP 358
Menurut Santos-Briones dan Hernandes-Sotomayor (2006) dengan
penelitian menggunakan ekspan daun kopi Arabika, proses induksi embrio
somatik itu ada dua, yaitu single-step procedure dan double-step procedure.
Single-step procedure berperan untuk menghasilkan kalus embriogenik hingga
embrio kotiledonari dalam satu media. Double-step procedure berperan untuk
menghasilkan pembentukan kalus dan pembentukan embrio dengan media yang
berbeda. Oleh karena itu, pemindahan kalus ke media induksi sangat penting agar
menghasilkan embrio dengan cepat.

18

Pada percobaan ini embrio somatik diinduksi melalui metode double-step
procedure. Subkultur proembrio ke dalam media pembentukan embrio pada
14 minggu setelah perlakuan. Sumber inokulum yang dipindahkan adalah
proembrio. Sumber inokulum dipecah menjadi inokulum proembrio berukuran
diameter ±5 mm untuk proses induksi embrio somatik.
Proembrio yang dikulturkan pada media induksi embrio somatik diamati
selama 11 minggu. Proembrio berubah fase menjadi globular berwarna putih
jantung, torpedo hingga terbentuk kotiledonari. Hasil pengamatan menunjukkan
proembrio mulai membentuk fase globular pada tiga minggu setelah disubkultur.
Perubahan fase globular menjadi embrio fase kotiledonari embrio pada
4-8 minggu setelah perlakuan. Perkembangan proembrio membentuk embrio
somatik tidak terjadi serempak pada satu inokulum.
Rekapitulasi analisis ragam pada Tabel 7 menunjukkan bahwa media induksi
embrio tidak memberikan pengaruh nyata terhadap pembentukan embrio. Media
asal proembrio berpengaruh nyata pada 19 MSP dan berpengaruh sangat nyata
pada 20-21 MSP. Media asal proembrio tidak berpengaruh nyata pada 18 MSP
dan 22-25 MSP. Interaksi antara media embrio dan media asal proembrio tidak
memberikan pengaruh nyata dari awal hingga akhir pengamatan.
Tabel 7 Rekapitulasi analisis ragam pengaruh media induksi embrio dan media
asal proembrio terhadap pembentukan kotiledonari kopi Robusta varietas
BP 42 x BP 358
Umur
Media induksi
Media asal
Interaksi antara media induksi embrio
(MSP)
embrio
proembrio
dengan media asal proembrio
18
tn
tn
tn
19
tn
*
tn
20
tn
**
tn
21
tn
**
tn
22
tn
tn
tn
23
tn
tn
tn
24
tn
tn
tn
25
tn
tn
tn
Keterangan: **) berpengaruh sangat nyata p≤0.01; *) berpengaruh nyata p≤0.05; tn=tidak nyata
MSP = Minggu setelah perlakuan

Data Tabel 8 menunjukkan bahwa pembentukan kotiledonari tidak serempak.
Media dengan kombinasi 1 µM 2,4-D dan 10 µM 2iP membentuk kotiledonari
pada 21 MSP. Media kombinasi 1 µM 2,4-D dan 10 µM BA membentuk
kotiledonari pada 20 MSP sementara media kombinasi 1 µM 2,4-D dan 15 µM
belum membentuk sama sekali hingga 21 MSP. Persentase rata-rata pembentukan
kotiledonari tertinggi adalah media dengan kombinasi 1µM 2,4-D dan 5µM BA
yaitu 100 % pada 21 MSP.

19

Tabel 8 Pengaruh media asal proembrio terhadap pembentukan kotiledonari kopi
Robusta varietas BP 42 xBP 358 dari inokulum proembrio
Media asal
proembrio (µM)

∑ inokulum
proembrio

Proembrio membentuk embrio fase kotiledonari (%)
19
20
21
Umur (Minggu setelah perlakuan)

2,4-D

BA
5
15
20.0a
80.0a
100.0a
10
20
0.0b
5.0b
5.0b
15
50
0.0b
0.0b
0.0b
1
20
30
3.3b
10.0b
23.3b
2iP
10
45
0.0b
0.0b
2.5b
KK (%)
29.18
40.39
34.45
Keterangan: angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata pada
uji DMRT α=0.05. Data di transformasi (x+5) ½ sebelum diolah menggunakan SAS

Percobaan III. Perkecambahan Embrio Somatik Kopi Robusta Varietas
BP 42 x BP 358
Perlakuan yang digunakan dalam perkecambahan adalah media dasar MS
dengan penambahan 5µM GA3 dan 10 µM GA3. Embrio somatik yang
dikecambahkan adalah embrio somatik yang diperoleh dari media pendewasaan
sebelumnya. Pertumbuhan kecambah diamati sela