Mutasi Gen xyncmu dan Pengaruhnya terhadap Stabilitas Enzim Xilanase CMU dari Bacillus halodurans

MUTASI GEN xyncmu DAN PENGARUHNYA TERHADAP
STABILITAS ENZIM XILANASE CMU DARI Bacillus
halodurans

DAHMAYANTI SARIDEWI

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Mutasi Gen xyncmu
dan Pengaruhnya terhadap Stabilitas Enzim Xilanase CMU dari Bacillus
halodurans yang dilakukan di laboratorium Teknologi Bioindustri LAPTIABBPPT adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan sebagian hak cipta dari karya tulis saya
kepada Laboratorium Pengembangan Teknologi Agroindustri dan Biomedika,
Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (LAPTIAB-BPPT) dan Institut
Pertanian Bogor (IPB).

Bogor, Juli 2013
Dahmayanti Saridewi
NIM G84090065

ABSTRAK
DAHMAYANTI SARIDEWI. Mutasi Gen xyncmu dan Pengaruhnya terhadap
Stabilitas Enzim Xilanase CMU dari Bacillus halodurans. Dibimbing oleh
SURYANI dan NIKNIK NURHAYATI.
Aplikasi enzim xilanase dalam industri kertas memerlukan enzim dengan
karakteristik yang tahan terhadap pH dan suhu tinggi. Salah satu alternatif agar
dapat mengubah karakteristik enzim tersebut yaitu pendekatan melalui mutasi
pada titik yang diarahkan atau site directed mutagenesis PCR sehingga
mengubah beberapa titik asam amino pada klon tetua (Klon M3) yang akan
berpengaruh pada uji stabilitas enzim. Penelitian ini bertujuan mengubah stabilitas
xilanase CMU dan membandingkan karakter antara xilanase CMU mutan dan

normal. Langkah awal dari penelitian ini melibatkan plasmid dengan klon M3
yang dimutasi dengan dua pasang primer mutagenik yaitu Q53K dan T194I.
Amplikon plasmid mutan
pGEMalkxynaq1cmu M3 ditransformasi ke
Escherichia coli DH5α dan diseleksi dengan media ampisilin. Hasil seleksi
dengan ampisilin dan analisis restriksi mengonfirmasi dua klon mutan yaitu Klon
4 dan Klon 7 positif membawa gen xyncmu. Mutasi gen yang telah berhasil
dilakukan sehingga didapatkan Klon 7 yang memiliki karakteristik enzim yang
tahan terhadap pH dan suhu tinggi.
Kata kunci: mutagenesis situs terarah (site directed mutagenesis), gen xyncmu,
xilanase CMU, stabilitas enzim
ABSTRACT
DAHMAYANTI SARIDEWI. xyncmu Gene Mutation and the Effect of Enzyme
Stability Xylanase CMU from Bacillus halodurans. Supervised by SURYANI and
NIKNIK NURHAYATI.
Applications of xylanase enzyme on paper industry requires an enzyme
characteristic through pH and resistant to high temperatures. A directed point
mutations in site directed mutagenesis PCR which being the alternative to
changing the enzyme’s characteristic and a several of amino acid on parental clon
(M3) which effected with enzyme stability. This study aims to alter the stability of

xylanase CMU and comparing the characters between CMU xylanase’s mutant
and normal. The first step involves a plasmid with parental clones (Clone M3)
which transferred to two pairs of mutagenic primers that Q53K and T194I. The
amplicons from mutant plasmid pGEMalkxynaq1cmu M3 were transformed into
Escherichia coli DH5α and selected with ampicillin media. Results of selection
with ampicillin and restriction analysis were confirmed two positive mutant
clones are Clone 4 and Clone 7 which brought of xyncmu gene. Gene mutation
has succeeded to done as the result was Clone 7 which had enzyme’s
characteristic through pH and resistant to high temperatures.
Keywords: Site directed mutagenesis, xyncmu gene, CMU xylanase, enzyme
stability

MUTASI GEN xyncmu DAN PENGARUHNYA TERHADAP
STABILITAS ENZIM XILANASE CMU DARI Bacillus
halodurans

DAHMAYANTI SARIDEWI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains
Pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Judul
Nama
NIM

: Mutasi Oen xyncmu dan Pengaruhnya terhadap Stabilitas Enzim
Xilanase eMU dari Bacillus halodurans
: Dahmayanti Saridewi
: 084090065

Menyetujui

s .
su:Ls

Dr

c

Pembimbing I

Tanggal Lulus:

'21 OC T 2013

ｄｲｾｴｩ＠

Pembimbing II

Judul
Nama

NIM

: Mutasi Gen xyncmu dan Pengaruhnya terhadap Stabilitas Enzim
Xilanase CMU dari Bacillus halodurans
: Dahmayanti Saridewi
: G84090065

Menyetujui

Dr.Suryani S.P.,M Sc.
Pembimbing I

Dr. Niknik Nurhayati
Pembimbing II

Mengetahui
Ketua Departemen Biokimia

Dr. Ir. I Made Artika, M.App. Sc
Ketua Departemen Biokimia

Tanggal Lulus :

i

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas segala
berkat, nikmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya
ilmiah ini. Penelitian ini mempunyai tema Biologi Molekuler dan telah dikerjakan
sejak Januari 2013 hingga bulan Juli 2013. Penelitian ini berjudul Mutasi Gen
xyncmu dan Pengaruhnya terhadap Stabilitas Enzim Xilanase CMU dari Bacillus
halodurans.
Penulis mengucapkan terima kasih ibu Dr. Suryani S.P., M Sc. dan ibu Dr.
Niknik Nurhayati selaku pembimbing yang selalu memberikan masukan selama
penelitian dan karya ilmiah ini, para staf Labotarium Biologi Molekuler non
Virus, Bioseparasi, dan Analisis LAPTIAB-BPPT, kepada keluarga penulis:
Bapak Dahrizal, Ibu Sri Rusiana, Ibu Nurasiah, Dahvia Nursriyanti, Dharmasetya,
Muadzimmahmud, dan Muhtiaistiqamah.
Semoga karya ilmiah ini memberikan nilai tambah bagi perkembangan ilmu
pengethuan khususnya bidang Biologi Molekuler.

Bogor, Juli 2013

Dahmayanti Saridewi

ii

DAFTAR ISI
PRAKATA

i

DAFTAR ISI

ii

DAFTAR GAMBAR

iii

DAFTAR LAMPIRAN

iii

PENDAHULUAN

1

BAHAN DAN METODE

2

Alat

2

Bahan

2

Metode

3

HASIL

5

Mutan Plasmid pGEMalkxynaq1cmu M3

5

Urutan Nukleotida Klon Mutan Plasmid pGEMalkxynaq1cmu M3

6

Sifat Mutan Xilanase CMU Rekombinan

7

Stabilitas Enzim Xilanase CMU

8

PEMBAHASAN

9

MutanPlasmid Mutan pGEMalkxynaq1cmu M3

9

Urutan Nukleotida Klon Mutan Plasmid pGEMalkxynaq1cmu M3

10

Sifat Mutan Xilanase CMU Rekombinan

11

Stabilitas Enzim Xilanase CMU

11

SIMPULAN DAN SARAN

12

Simpulan

12

Saran

12

DAFTAR PUSTAKA

12

LAMPIRAN

15

RIWAYAT HIDUP

20

iii

DAFTAR GAMBAR
1 Analisis fragmen menggunakan elektroforesis gel agarosa hasil SDMPCR plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu M3 dan hasil restriksi
dengan DpnI
2 Hasil analisis restriksi plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu M3
yang dimutasi
3 Hasil alignment dari klon tetua M3, galur liarnya yaitu klon P39, dan
klon mutannya (klon 4 dan 7) dengan menggunakan ClustalW
4 Hasil pengukuran aktivitas spesifik enzim (U/mg) dengan pengaruh pH
dan suhu yang berbeda
5 Hasil uji termostabilitas klon mutasi 7 pada suhu 60˚C, pH 9 dan 10
pada menit ke 0, 10, dan 20

5

5
6
6
6

DAFTAR LAMPIRAN
1 Strategi penelitian
2 Alignment gen alkxynaq1cmu M3 dengan program ClustalW
(www.genome.jp)
3 Alignment mutasi gen pGEMalkxynaq1cmu M3 dengan klon 4 dan 7

13
14
16

PENDAHULUAN
Salah satu enzim yang dipakai dalam proses pemutihan kertas adalah enzim
xilanase. Enzim ini sedang dikembangkan agar dapat membantu pemutihan kertas
dengan efektif dan ramah lingkungan. Sebagian besar negara berkembang telah
menggunakan enzim ini, namun di Indonesia belum terlalu banyak diaplikasikan
dengan kendala biaya dan sebagainya (Batubara 2006).
Produksi kertas dengan bantuan enzim xilanase akan memiliki tingkat
keputihan yang tinggi, lebih lentur, dan permukaan lebih halus (Rifaat et al.
2005). Enzim xilanase yang digunakan dalam industri kertas bersifat termostabil
dan tahan pada pH basa. Suasana basa dapat membantu degradasi lignin oleh
hidrolisis glukosa pada pulp. Xilanase termostabil dapat mengurangi kontaminasi
mikroorganisme. Perbaikan suhu xilanase untuk mencapai termostabil dapat
dilakukan dengan mutagenesis situs terarah (site-directed mutagenesis (SDM))
yaitu salah satu program dalam reaksi berantai polymerase (polymeraze chain
reaction (PCR)) (Zhang et al 2010).
Program ini ditemukan oleh Charles Weissman pada tahun 1973 dengan
analog nukleotida N4-hidroksisitidina yang mengubah transisi basa nitrogen GC
menjadi AT. Program SDM pada PCR disingkat menjadi SDM-PCR. Metode
biologi molekuler ini digunakan untuk membuat perubahan spesifik maupun
intensional pada urutan nukleotida pada gen. Metode ini juga dilakukan untuk
meneliti struktur dan aktivitas biologi pada DNA, RNA, dan molekul protein.
Awalnya metode ini menggunakan radiasi yang kurang spesifik atau mutagen
kimia (Schaffner dan Weissmann 1973).
Kelebihan spesifik penggunaan SDM-PCR adalah dapat meminimalisir
adanya kontaminan selain amplikon dari cetakan dan primer yang digunakan,
hanya memerlukan jumlah primer yang sedikit, serta mudah memperlihatkan
fragmen besar pada DNA. Ukuran fragmen yang terpecah dari proses insersi
maupun substitusi dari fragmen lainnya bergantung pada panjang urutan basa
nukleotida yang terdapat pada primer (Zheng et al. 2004). Manipulasi genom
yang dilakukan oleh Storici dan Resnick pada tahun 2006 dapat mengurangi
kesulitan dalam menemukan titik mutasi yang diinginkan dan menghilangkan
urutan asam amino heterolog pada gen yang diinginkan.
Penggunaan enzim xilanase sebagai alternatif mengurangi penggunaan klor
serta lebih ramah lingkungan memerlukan karakter enzim yang stabil terhadap
suhu tinggi dan pH basa. Hal ini disebabkan produksi kertas berlangsung pada pH
yang lebih besar dari 8 dan suhu tinggi yaitu lebih dari 65. Mikroba sebagai
sumber potensial penghasil enzim ini selain arkaea jarang ditemui yang dapat
hidup dalam kondisi ekstrim. Umumnya enzim ini dihasilkan kurang stabil
terhadap kondisi ekstrim. Contohnya enzim xilanase Aq1 yang dihasilkan bakteri
mesofilik Bacillus subtilis Aq1 memiliki pH 7 dan suhu optimum 55˚C
(Wahyuntari et al 2009).
Tim peneliti di Pusat Teknologi Bioindustri BPPT telah memiliki beberapa
galur mikroba potensial penghasil xilanase, salah satunya Bacillus halodurans
CMU yang didapatkan dari Cimanggu (Ulfah et al 2011). Xilanase dari B.
halodurans CMU tersebut telah berhasil diklon dan diekspresikan pada sel E. coli
DH5α menghasilkan xilanase rekombinan yang aktif pada kisaran pH 8 – 10, dan
suhu 60 - 70˚C (Noer 2011). Upaya untuk meningkatkan stabilitas enzim terhadap

2

pH dan suhu tinggi telah banyak dilaporkan. Salah satunya peningkatan
thermostabilitas xilanase dari Geobacillus stearothermophilus dengan pendekatan
Site Directed Mutagenesis-PCR (Zhang et al 2010). Berdasarkan laporan tersebut
tim peneliti Bioindustri-BPPT telah merancang mutasi beberapa titik asam amino
pada xilanase CMU dan mensintesis beberapa pasang primer mutagenik pada
titik-titik asam amino dimaksud. Lima klon mutan tunggal dan satu klon mutan
ganda telah berhasil diperoleh melalui SDM-PCR menggunakan beberapa pasang
primer mutagenik pada gen xilanase CMU (Pratiwi 2013).
Penelitian ini bertujuan untuk mengubah asam amino glutamina pada posisi
53 menjadi lisina (Q53K) dan treonina pada posisi 156 menjadi isoleusina (T194I)
masing-masing pada deret asam amino mutan ganda M3 menjadi 2 mutan dengan
mutasi 3 titik dengan pendekatan SDM-PCR. Pengaruh mutasi tiga titik terhadap
karakter enzim xilanase CMU dianalisa serta dibandingkan dengan xilanase CMU
mutan ganda (M3) dan normal. Manfaat dari penelitian ini adalah dengan
menemukan ketahanan enzim xilanase yang lebih tinggi, enzim tersebut dapat
digunakan di dalam industri kertas yang relatif menggunakan suhu dan pH tinggi
dalam proses pembuatan kertas.

BAHAN DAN METODE
Alat
Alat-alat yang digunakan adalah mikropipet, alat-alat gelas, jarum ose,
elektroforesis (Mupid-exu), Mini Spin (Eppendorf), thermal cycler PCR
(Eppendorf), sentrifus dingin (Sorvale Fresco), konsentrator (Eppendorf),
dokumentasi gel kodak, thermomixer (Eppendorf), shaker incubator (Kuhner),
water purification system (Millipore), laminar air flow class II BSC (ESCO),
freezer -85°C (NUAIRE), microwave, autoklaf (IWAKI), alat pengaduk (vortex
mixer), spektrofotometer UV-Fis (Hitachi U-2001), pH meter digital (WTW series
inolab), neraca analitik (Radwag), dan inkubator (Memert).
Bahan
Bahan-bahan media yang digunakan yaitu media Luria bertani (LB), super
optimal broth (SOB), dan super optimal broth with catabolite repression (SOC).
Klon yang akan dijadikan perbandingan dengan klon mutan (Klon 4 dan 7) saat
diuji aktivitas dan stabilitasnya adalah klon tetua (M3) dan galur liar (P39).
Primer yang digunakan adalah dua pasang primer mutagenik Q53K dan T194I.
Bahan yang digunakan untuk SDM yaitu Phusion high-fidelity DNA polymerase
(Thermo), 5× bufer HF, enzim restriksi DpnI, EcoRI, dan XbaI, dan sel kompeten
Escherichia coli DH5α. Bahan kimia yang digunakan adalah ampisilin, asam
dinitro salisilat (DNS) Miller, bufer TrisCl pH 8 dan 9, bufer glisin + NaOH pH
10 dan 11, xilan Beechwood, kit untuk ekstraksi DNA (Fermentas).
Metode Penelitian
Penelitian ini dimulai dengan melakukan PCR mutagenesis situs terarah
(SDM-PCR) pada plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu M3 yang diperoleh

3

dari penelitian sebelumnya
(Pratiwi 2013).
Plasmid rekombinan
pGEMalkxynaq1cmu M3 merupakan mutan ganda yang 2 asam aminonya
dimutasi menggunakan primer mutagenik Q62L dan E146V dengan pendekatan
SDM – PCR. Penelitian ini akan menambahkan mutasi ke-3 pada plasmid mutan
ganda M3 menggunakan pasangan primer mutagenik Q53K atau T194I sehingga
didapatkan 2 mutan dengan tiga titik (M3+Q53K dan M3+T194I) yang
diharapkan memiliki termostabilitas yang tinggi.
Mutasi Plasmid Rekombinan pGEMalkxynaq1cmu M3 dengan Metode
SDM-PCR (Zheng et al. 2004). Plasmid pGEMalkxynaq1cmu M3 dimutasi
menggunakan metode SDM-PCR. Komposisi reaksi SDM-PCR sebagai berikut:
5× bufer HF 5 µl, 10 mM dNTP mix 0.5 µl, DMSO 0.75 µl, 2.5 U/µl Phusion
high-fidelity DNA polymerase (Thermo), 0.5 µl primer forward, 0.5 µl primer
revers, plasmid pGEMalkxynaq1cmu M3 0.5 µl, dan ddH2O 17 µl. Kondisi SDMPCR sebagai berikut: program denaturasi (hot start) selama 2 menit pada suhu
98°C dan dilanjutkan 26 siklus. Setiap siklus SDM-PCR terdiri dari tahapan:
denaturasi DNA cetakan selama 30 detik pada suhu 98°C, penempelan primer
selama 30 detik pada suhu annealing (bergantung primernya), dan pemanjangan
primer selama 1 menit 30 detik pada suhu 72°C. Suhu annealing masing-masing
primer sama yakni Q53K dan T194I adalah 64.6°C. Pasca SDM-PCR dilakukan
selama 5 menit pada suhu 72°C. Hasil amplifikasi kemudian dipotong dengan
enzim restriksi DpnI.
Pemotongan Plasmid Mutan pGEMalkxynaq1cmu M3 dengan Enzim
Restriksi DpnI (Zheng et al. 2004). Mutan plasmid pGEMalkxynaq1cmu M3
yang telah didapatkan dari hasil SDM-PCR dipotong dengan enzim restriksi DpnI
yang hanya akan memotong DNA yang termetilasi, yaitu plasmid M3 yang
diisolasi dari E. coli DH5α yang dijadikan sebagai DNA cetakan pada reaksi
SDM-PCR. Komposisi reaksinya sebagai berikut: 17.8 µl produk PCR, 0.2 µl
enzim restriksi DpnI 20 U/ µl, dan 2 µl bufer 4 dicampurkan dan diinkubasi pada
suhu 37°C selama tiga jam, kemudian diinkubasi pada suhu 80°C selama 20 menit
untuk menginaktifasi enzim restriksi. Hasil restriksi dengan enzim restriksi DpnI
lalu ditransformasi ke dalam sel kompeten E. coli DH5α untuk perbanyakan dan
diisolasi plasmidnya. Transformasi mengikuti metode heat shock (Zheng et al.
2004).
Produksi
Enzim
Xilanase
CMU
dari
Plasmid
Mutan
pGEMalkxynaq1cmu M3 (Huang et al. 2006). Sebanyak satu ose koloni
transforman plasmid mutan pGEMalkxynaq1cmu M3 ditumbuhkan lebih kurang
18 jam dalam media LB-ampisilin. Setelah itu dilakukan kultivasi koloni mutan
dalam 100 ml media LB-ampisilin. Kultur tersebut disentrifugasi selama 15 menit
pada 6000 rpm 4°C. Bagian supernatan dibuang dan pada bagian pelet
ditambahkan bufer natrium phosphat 20 mM, pH 7 yang mengandung
merkaptoetanol 1 mM sebanyak 5 ml. Pelet diresuspensi dengan vortex, kemudian
dilisis dengan sonikator tiap 20 detik selama 3 menit. Proses lisis sel dilakukan
dalam keadaan dingin dan hasil sonikasi disentrifugasi pada 6000 rpm 4°C,
selama 10 menit. Supernatan diambil dan dilakukan uji aktivitas.

4

Uji Aktivitas Xilanase CMU secara Kuantitatif (Bailey 1992). Sebanyak
400 µl larutan bufer pH yang sudah ditentukan dimasukkan ke dalam masingmasing tabung mikro dan ditambahkan 50 µl substrat beech wood xylan 10%, lalu
diinkubasi pada suhu yang telah ditentukan selama 2 menit. Ke dalam setiap
tabung mikro dimasukkan 50 µl enzim kasar, kemudian diinkubasi dilanjutkan
selama 5 menit. Setelah itu, dimasukkan 750 µl asam dinitro salisilat (DNS),
dipanaskan pada suhu 100°C selama 5 menit dan didinginkan. Sampel diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Blanko dibuat dengan cara yang
sama kecuali penambahan enzim dilakukan setelah penambahan DNS. Nilai
absorbansi sampel dan blanko diukur pada panjang gelombang 540 nm.
Nilai absorban ini dimasukkan ke dalam kurva standar xilosa. Aktivitas
volumetrik enzim dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Aktivitas enzim (U/ml) =

konsentrasi enzim × 1000 × faktor pengenceran

Bobot molekul xilosa × Volume enzim × waktu reaksi
Setiap satu unit aktivitas xilanase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang
diperlukan untuk menghidrolisis xilan menjadi 1 µmol xilosa per menit pada suhu
dan pH telah dtentukan. Data kadar protein ditentukan dengan menggunakan
persamaan dari kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin). Nilai kadar protein
total diperlukan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim yang dihitung dengan
cara membagi aktivitas volumetrik enzim dengan berat total protein dan
dinyatakan dalam satuan U/mg.
Analisis Restriksi Plasmid Mutan pGEMalkxynaq1cmu M3 (New England
Biolabs 2005).
Plasmid mutan yang telah diekstrak lalu dipotong dengan enzim restriksi.
Komposisi restriksi sebagai berikut: 2 µl plasmid alkxynaq1cmu rekombinan, 0.1
µl enzim restriksi EcoRI, 0.2 µl XbaI, 10× NEBuffer react 2 dan 2.2 µl ddH2O
diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam. Hasil restriksi dapat dilihat dari
potongan fragmennya dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa.
Analisis Urutan Nukleotida (sequencing)
Plasmid yang membawa gen mutan dari plasmid rekombinan
pGEMalkxynaq1cmu M3 kemudian dianalisis urutan nukleotidanya untuk
mengetahui basa yang terdapat pada gen tersebut. Prosedur analisis urutan
nukleotida (sequencing) melalui Genetika Science.
Urutan asam amino deduksi ditentukan menggunakan program BLASTn
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) dan ClustalW (http://www.genome.jp),
serta perangkat lunak Chromas Lite untuk melihat hasil sequencing dan
kromatogramnya , dan Clone Manager untuk melihat simulasi kloning, operasi
enzim, serta gambar peta grafik dari kloning mutan.
Hasil analisis urutan nukleotida dari Genetica Science, dianalisis kembali
menggunakan perangkat lunak BLAST, Chromas Lite, dan Clone Manager.
Analisis menggunakan perangkat tersebut dapat menunjukkan urutan nukleotida
yang termutasi.

5

Optimasi suhu dan pH reaksi xilanase (Bailey 1992)
Optimasi reaksi dilaukan dengan mengukur aktivitas enzim ada suhu 60˚C
dan 65°C serta pH 9 (bufer Tris-HCl) dan pH 10 (bufer glisin).
Uji Stabilitas Mutan Xilanase (Bailey 1992)
Ketahanan mutan xilanase terhadap suhu dan pH dilakukan dengan cara
menginkubasi enzim tanpa substrat pada suhu 60°C selama periode waktu 0, 10,
dan 20 menit pada pH 9 dan 10. Aktivitas enzim setelah pemanasan pada masingmasing periode waktu diukur dengan melakukan pengukuran aktivitas xilanase
dengan metode Bailey (1992) seperti diuraikan diatas.
HASIL
Mutan Plasmid pGEMalkxynaq1cmu M3
Penelitian sebelumnya (Pratiwi 2013) telah menghasilkan plasmid
rekombinan pGEMalkxynaq1cmu M3 yang merupakan mutan ganda yang
mengandung 2 titik mutasi asam amino. Plasmid ini dimutasi kembali dengan dua
pasang primer melalui SDM-PCR untuk mendapatkan mutan ketiga yang
mengandung 3 titik mutasi asam amino. Hasil analisis pada elektroforesis gel
agarosa (Gambar 1) menunjukkan proses SDM-PCR berhasil mengamplifikasi
plasmid rekombinan M3 dan menghasilkan pita DNA berukuran 4300 pb. Plasmid
berukuran 4300 pb terdiri atas vektor pGEMT-Easy yang berukuran 3000 pb dan
gen xyncmu yang berukuran 1300 pb. Gen xyncmu terdiri atas sejumlah basa
nukleotida berukuran 1100 pb dari klon tetua yaitu Bacillus halodurans dan
promotor xynaq1 yang berjumlah 200 pb.
M 1

4000 pb

2
±4300 pb
(plasmid
rekombinan
pGEMalkxy
naq1cmu
M3)

M 1

2

±4300pb
(plasmid
rekombinan
pGEMalkxy
naq1cmu
M3)

Gambar 1 Analisis elektroforesis gel agarosa produk SDM-PCR plasmid
pGEMalkxynaq1cmu M3 (kiri) menggunakan primer Q53K (1), dan
primer T194I (2) serta hasil pemotongan dengan enzim restriksi DpnI
(kanan) produk SDM-PCR dengan primer Q53K (1), dan primer
T194I (2). M: 1 kb DNA Ladder (Fermentas), pb = pasang basa.
Hasil transformasi produk SDM-PCR diperoleh sejumlah koloni
transforman. Masing – masing 5 koloni transforman dari mutan Q53K dan mutan
T194I diisolasi plasmidnya untuk kemudian diseleksi menggunakan enzim
restriksi EcoRI dan XbaI. Enzim restriksi EcoRI memotong plasmid pada daerah

6

multiple cloning site yang mengapit gen xilanase cmu, sedangkan XbaI memotong
gen xilanase cmu pada sekitar basa ke 300 dari kodon awal. Gambar 2
menunjukkan beberapa klon hanya terpotong oleh enzim EcoRI menghasilkan
fragmen DNA berukuran 1300 pb (xilanase CMU) dan 3000 pb (vektor pGEMT)
dan beberapa klon lainnya terpotong oleh kedua enzim restriksi menghasilkan
fragmen DNA berukuran 300 pb, 1000 pb dan 3000 pb. Selanjutnya dipilih klon
positif yang membawa gen xyncmu yaitu Klon 4 dan Klon 7 dikultivasi untuk
disekuensing dan dianalisis aktivitas xilanasenya.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

4000 pb
3000 pb
klon positif (Klon 4
dan Klon 7)
1000 pb
300 pb
Gambar 2 Hasil analisis enzim restriksi plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu
M3 yang dimutasi dengan primer Q53K (1-5) dan primer T194I (6-10)
M: 1 kb DNA Ladder (Fermentas).
Urutan Nukleotida Mutan Plasmid pGEMalkxynaq1cmu M3
Hasil analisis urutan nukleotida menunjukkan adanya mutasi yang terjadi
pada Klon 4 dan Klon 7. Klon 4 merupakan klon dari plasmid rekombinan
pGEMalkxynaq1cmu M3 yang dimutasi dengan primer Q53K mengalami
perubahan asam amino urutan 53 yaitu asam amino glutamina dengan kodon
CAA termutasi menjadi asam amino lisina dengan kodon AAA. Klon 7
merupakan klon dari plasmid yang sama (M3) namun dimutasi dengan primer
T194I mengalami perubahan asam amino urutan 156 yaitu asam amino treonina
dengan kodon ACA termutasi menjadi asam amino isoleusina dengan kodon ATA
(Gambar 3).
Hasil pensejajaran memperlihatkan adanya mutasi pada klon normal
mengalami perubahan asam amino urutan 62 yaitu asam amino glutamina dengan
kodon CAA termutasi menjadi asam amino leusina dengan kodon CTA. Mutasi
dari klon normal lainnya yang terbawa pada klon normal dan mutannya
mengalami perubahan asam amino urutan 108 yaitu glutamat dengan kodon GAG
menjadi valina dengan kodon GTG.

7

Gambar 3 Hasil pensejajaran (alignment) dari klon tetua M3, galur liarnya yaitu
klon P39, dan klon mutannya (Klon 4 dan Klon 7) dengan
menggunakan ClustalW, 1: Klon 4 dengan perubahan asam amino
glutamina (CAA) menjadi lisina (AAA), 2: terjadi perubahan asam
amino glutamina (CAA) menjadi leusina (CTA) pada Klon P39, 3:
terjadi perubahan asam amino glutamat (GAG) menjadi valina (GTG)
pada Klon P39, 4: Klon 7 dengan perubahan asam amino treonina
(ACA) menjadi isoleusina (ATA)
Plasmid yang telah mengandung gen xyncmu dan promotor xilanase Aq1
diekspresikan pada vektor pGEMT-Easy. Penggunaan vektor tersebut dapat
menghasilkan produktivitas tinggi.
Sifat Mutan Xilanase CMU Rekombinan
Mutasi xilanase tiga titik yang positif yaitu dari Klon 4 dan Klon 7 serta
xilanase mutan ganda dari Klon M3 dan xilanase normal dari Klon P39 masingmasing diukur aktivitasnya pada suhu 60˚C dan 65˚C dan pH 9 dan 10. Klon yang
memiliki nilai aktivitas tertinggi adalah Klon 7 yaitu klon mutan dari plasmid
yang dimutasi dengan primer T194I pada suhu 60˚C untuk pH 9 sebesar 7.191
U/mg dan pH 10 sebesar 25.441 U/mg; pada suhu 65˚C untuk pH 9 sebesar
10.278 U/mg dan pH 10 sebesar 4.646 U/mg seperti yang ditunjukkan pada
Gambar 4. Klon mutan yang memiliki nilai aktivitas terendah adalah Klon 4 yaitu
klon mutan dari plasmid yang dimutasi dengan primer Q53K pada suhu 60˚C
untuk pH 9 sebesar 0.943 U/mg dan pH 10 sebesar 3.906 U/mg; pada suhu 65˚C
untuk pH 9 sebesar 2.400 U/mg dan pH 10 sebesar 2.714 U/mg. Nilai aktivitas
yang dibandingkan dengan klon mutan yaitu Klon P39 dan Klon M3 memiliki
aktivitas enzim xilanase CMU rendah. Klon P39 yang merupakan galur liar
memiliki nilai aktivitas pada suhu 60˚C untuk pH 9 sebesar 2.527 U/mg dan pH
10 sebesar 6.168 U/mg; pada suhu 65˚C untuk pH 9 sebesar 3.078 U/mg dan pH
10 sebesar 4.347 U/mg. Klon M3 yang merupakan klon tetua memiliki nilai

8

aktivitas pada suhu 60˚C untuk pH 9 sebesar 4.513 U/mg dan pH 10 sebesar 5.965
U/mg; pada suhu 65˚C untuk pH 9 sebesar 4.122 U/mg dan pH 10 sebesar 2.223
U/mg.
Pengaruh mutasi terhadap sifat enzim dapat dilihat dengan menentukan
aktivitas relatif enzim yang dihitung dengan cara membandingkan aktivitas enzim
xilanase normal terhadap masing-masing aktivitas mutan xilanase seperti tampak
pada Gambar 4. Aktivitas relatif didapatkan dari perbandingan antara klon tetua
(Klon M3) dan kedua klon mutannya (Klon 4 dan Klon 7) dengan klon normal
(Klon P39). Aktivitas relatif tertinggi pada Klon 7 pada suhu 60˚C dan pH 10.

Gambar 4 Hasil pengukuran aktivitas spesifik enzim (U/mg) dengan pengaruh pH
dan suhu yang berbeda, yaitu pada pH 9 dan 10,
pH 9
pH 10
Stabilitas Enzim Xilanase CMU
Hasil analisis pengaruh suhu dan pH terhadap aktivitas enzim xilanase
CMU mutan plasmid pGEMalkxynaq1cmu M3 (Klon 4 dan Klon 7) yang
dibandingkan dengan klon tetua (Klon M3) dan galur liar (Klon P39)
menunjukkan Klon 7 memiliki aktivitas tertinggi. Berdasarkan data tersebut
pengujian stabilitas dilakukan pada mutan xilanase Klon 7. Stabilitas diuji pada
suhu 60˚C dengan pH 9 dan 10 yang dipanaskan selama 0, 10, dan 20 menit.
Stabilitas enzim dinyatakan dalam persentase aktivitas tersisa (%) dari enzim yang
merupakan perbandingan antara nilai aktivitas enzim pada waktu tertentu (dalam
percobaan ini 10 dan 20 menit) dengan aktivitas enzim awal (waktu 0 menit),
seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5. Aktivitas tersisa ensim setelah
pemanasan pada suhu 60˚C selama 10 menit dengan pH 9 tampak masih tinggi
hingga mencapai 91%, kemudian menurun hingga mencapai 39% ketika
pemanasan diperpanjang hingga 20 menit.

9

Aktivitas menurun drastis hingga 21% setelah pemanasan pada suhu 60˚C pH 10
selama 10 menit.

Gambar 5 Hasil uji termostabilitas klon mutasi 7 pada suhu 60˚C, pH 9 dan 10
pada menit ke 0, 10, dan 20
pH 9
pH 10
PEMBAHASAN
Mutan Plasmid pGEMalkxynaq1cmu M3
Proses amplifikasi dengan SDM-PCR umumnya sama seperti PCR biasa
yaitu mengamplifikasi cetakan dengan primer oligonukleotida spesifik. Cetakan
yang digunakan adalah Klon M3, sedangkan primer oligonukleotida spesifiknya
adalah Q53K dan T194I. Metode ini menggunakan enzim polimerase yang
bersifat termostabil seperti Phusion high-fidelity DNA polymerase (Thermo)
karena terdapat langkah awal yang melibatkan suhu tinggi yaitu 98˚C. Proses
SDM-PCR digunakan pada penelitian sebelumnya (Zhang et al 2010)
memperlihatkan pengaruhnya terhada aktivitas enzim dan termostabilitas yang
diuji dengan ekstrak kasar enzim. Pemakaian metode ini juga bertujuan agar saat
plasmid mutan pGEMalkxynaq1cmu M3 rekombinan ditransformasi, parentalnya
tidak tercampur sehingga didegradasi oleh DpnI (Zhang et al 2010).
Proses amplifikasi bermula pada denaturasi cetakan dari klon tetua (Klon
M3) serta mengubah bentuk dari untai ganda menjadi untai tunggal. Proses
selanjutnya adalah annealing yaitu proses penempelan antara primer dengan
cetakannya. Proses akhir dari langkah ini adalah tahapan pemanjangan
(elongation) yaitu pemanjangan hasil untai tunggal yang merupakan gabungan
antara primer dan cetakan yang diamplifikasi. Penambahan enzim polimerase
pada awal langkah SDM-PCR ini bertujuan mensintesis untai baru DNA yang
komplementer terhadap cetakannya (Schaffner dan Weissmann 1973).
Pemakaian plasmid pGEMalkxynaq1cmu M3 bertujuan menghasilkan
produktivitas dan di dalam plasmid tersebut terdapat promoter xynAq1 yang dapat
meningkatkan ketahanan enzim terhadap suhu dan pH yang tinggi. Pemotongan
plasmid mutan pGEMalkxynaq1cmu M3 dengan enzim restriksi DpnI bertujuan
memotong DNA yang termetilasi. Plasmid M3 rekombinan yang diisolasi dari sel

10

kompeten Escherichia coli DH5α kemudian dijadikan sebagai DNA cetakan pada
reaksi SDM-PCR. Sel kompeten Escherichia coli DH5α merupakan sel kompeten
yang sering digunakan pada aplikasi kloning. Sel kompeten jenis DH5α juga
dapat digunakan untuk melakukan seleksi biru dan putih, meningkatkan stabilitas
insert atau gen yang akan ditransformasi, serta dapat meningkatkan kualitas
plasmid DNA yang akan diekstraksi dengan cara minipreps (Molecular Cloning
Laboratories 2010).
Proses inkubasi pada suhu 37˚C selama 3 jam bertujuan memisahkan
cetakan dari klon normal (Klon P39) dari klon tetua (Klon M3), sedangkan
inaktivasi enzim ini dilakukan pada suhu 80˚C selama 20 menit. Fragmen hasil
pemotongan terbentuk bayang atau smear karena proses degradasi cetakan dari
klon normal (P39), sehingga fragmen yang terbentuk pada 4300 pb merupakan
produk SDM-PCR yang juga merupakan plasmid rekombinan dari klon tetua
(Klon M3) (Zheng et al 2010).
Tahapan selanjutnya merupakan transformasi dengan heat shock. Tahap ini
merupakan tahap perbanyakan sel pada E. coli DH5α dan menggunakan
selectable marker antibiotik ampisilin. Transforman yang ditumbuhi pada media
LB (Luria Bertani) yang ditambahkan ampisilin akan menumbuhkan bakteri yang
membawa gen resistensi terhadap ampisilin, sehingga hanya E. coli dengan
plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu M3 yang tumbuh pada media dengan
antibiotik pada dosis toksik (Brown 1991). Transforman yang tumbuh pada media
selektif kemudian diisolasi plasmidnya oleh kit ekstraksi DNA (Fermentas) untuk
dianalisis nukleotida dan analisis restriksi. Analisis nukleotida bertujuan
mengetahui urutan asam amino yang telah termutasi dan disejajarkan dengan klon
normal dan tetuanya, sedangkan analisis restriksi bertujuan mengetahui ukuran
plasmid yang menjadi target berukuran 4300 pb dengan enzim restriksi EcoRI dan
XbaI. Enzim restriksi EcoRI memotong plasmid pada daerah multi cloning site
yang mengapit gen xilanase CMU, sedangkan XbaI memotong gen xilanase CMU
pada sekitar basa ke-300 dari kodon awal (Meijer et al 1986).
Transforman yang didapat dari media selektif kemudian diproduksi untuk
diuji aktivitasnya. Pelet hasil produksi transforman kemudian ditambahkan
dengan bufer natrium fosfat 20 mM pH 7 yang mengandung merkaptoetanol 1
mM sebanyak 5 ml dan disonikator tiap 20 detik selama 3 menit. Hal ini dapat
melisis sel yang mengandung plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu M3
sehingga dapat diuji aktivitas enzimnya yang merupakan supernatan dari hasil
sonikasi dan pelisisan tersebut (European Molecular Biology Laboratory 2009).
Urutan Nukleotida Klon Mutan Plasmid pGEMalkxynaq1cmu M3 (klon 4
dan 7)
Hasil analisis urutan asam amino Klon 4 dengan pasangan primer Q53K
terbukti berhasil mensubtitusi asam amino glutamina (CAA) pada posisi 53 pada
Klon M3 menjadi lisina (AAA), sementara pada Klon 7 dengan pasangan primer
T194I terbukti berhasil mensubstitusi asam amino treonina (ACA) pada posisi 156
pada Klon M3 menjadi isoleusina (ATA). Hasil pensejajaran (alignment) galur
liar (Klon P39), klon tetua (Klon M3), dan kedua klon mutan (Klon 4 dan Klon 7)
menunjukkan adanya 2 perubahan urutan asam amino lain yang terdeteksi pada
posisi 62 yaitu perubahan asam amino glutamina (CAA) menjadi leusina (CTA).

11

Perubahan ini disebabkan mutasi sebelumnya pada klon tetua (Klon M3)
dengan primer Q62L. Perubahan lain urutan asam amino terdapat pada posisi 108
yaitu asam amino glutamat (GAG) menjadi valina (GTG) yang disebabkan
mutasi klon M3 dengan primer E146V seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5
(Pratiwi 2013). Asam amino glutamina merupakan asam amino yang bersifat
conserve atau memiliki kesamaan dengan asam amino posisi ke-53 pada urutan
asam amino pada klon normal (Klon P39) dan urutan basa nukleotida pada
Bacillus halodurans yang menghasilkan xilanase termostabil (Wahyuntari et al
2009).
Sifat Mutan Xilanase Rekombinan
Parameter pH berpengaruh terhadap kecepatan aktivitas enzim dalam
mengatalis suatu reaksi. Konsentrasi ion hidrogen pada larutan bufer dengan pH
tertentu mempengaruhi aktivitasnya. Setiap enzim memiliki pH optimum agar
membentuk struktur yang kondusif dalam mengikat substrat. Jika konsentrasi ion
hidrogen berubah dari titik optimal, aktivitas enzim menjadi tidak fungsional.
Aktivitas enzim yang menurun saat perubahan pH disebabkan perubahan keadaan
ion substrat dan enzim (Lehninger et al. 2008).
Peningkatan suhu lebih lanjut menurunkan aktivitas enzim karena enzim
telah mengalami denaturasi dan perubahan konformasi pada suhu yang terlalu
tinggi. Hal ini menyebabkan substrat terhambat dalam memasuki sisi aktif enzim.
Pengukuran uji aktivitas enzim xilanase bertujuan mengukur produk hasil
hidrolisis substrat xilan yang diubah menjadi 1 µmol gula pereduksi xilosa
permenit pada suhu dan pH yang telah ditentukan (U/ml) (Yusriah dan Nengah
2013).
Data kadar protein didapatkan dari kurva standar BSA (Bovine Serum
Albumin). Nilai kadar protein total bertujuan menentukan aktivitas spesifik enzim
yang terukur dengan membagi aktivitas volumetrik enzim dengan berat total
protein dan dinyatakan dalam satuan U/mg. Penambahan asam dinitro salisilat
pada campuran substrat dan enzim bertujuan menghentikan aktivitas enzim pada
suhu dan waktu yang telah ditentukan (Bailey 1992).
Stabilitas Enzim Xilanase CMU
Salah satu penyebab sifat stabilitas enzim tersebut adalah ketahanan dari
denaturasi protein karena pengaruh panas (Muawanah 2006). Penggunaan mutasi
dengan bertahap yang menghasilkan 3 titik mutasi pada protein dapat
meningkatkan perbedaan termostabilitas pada klon mutan terhadap klon
normalnya (Miyazaki et al. 2006). Adapun pendapat lain tentang penelitian
termostabilitas enzim xilanase yang diekspresikan dengan Escherichia coli
mempunyai aktivitas xilanase yang tinggi pada tingkat fraksi periplasmitnya
(Huang J et al. 2006).
Perbandingan dari protein homolog menunjukkan kecenderungan frekuensi
asam amino yang dihubungkan dengan kondisi ekstrim. Hubungan antara
kandungan asam amino dengan pH terhadap enzim telah banyak menjadi topik
penelitian. Adanya beberapa asam amino seperti Lys, Arg, Asn, His, Glu dan Asp
dapat menjadikan enzim menjadikan tahan dalam kondisi alkali. Banyaknya
residu Arg dan His adalah struktur protein dari suatu enzim dilaporkan oleh

12

Dubnovitsky et al. pada tahun 2005 dapat meningkatkan stabilitas dari suatu
enzim.
Kisaran pH (9-10) dan suhu (60-65˚C) pada penelitian ini dipilih
berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Zheng et al 2010 yang
telah menghasilkan xilanase XT6 yang tahan pada kisaran suhu hingga 75˚C.
Penelitian lainnya yang dilakukan oleh Helianti et al 2010 menghasilkan xilanase
CMU yang diisolasi dari bakteri dengan genus Bacillus dan diperbanyak dengan
sel kompeten Escherichia coli DH5α dengan ketahanan pH 6-7 dan suhu 55-60˚C.
Berdasarkan dari uji aktivitas enzim terhadap pH dan suhu, enzim yang dihasilkan
dari klon 7 memiliki ketahanan pada pH 9 dan suhu 60˚C.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Mutasi glutamina menjadi lisina pada posisi 53 menggunakan pasangan
primer (Q53K) dan threonina menjadi isoleusina pada posisi 156 menggunakan
pasangan primer T194I
telah berhasil dilakukan pada plasmid
pGEMalkxynaq1cmu M3 dengan melalui pendekatan mutasi terarah atau PCR site
directed mutagenesis dan prinsipnya mensubtitusi beberapa asam amino yang
dapat mempengaruhi stabilitas enzim. Aktivitas relatif pada suhu 60 dan 65°C
xilanase mutan tiga titik dari Klon 7 memiliki nilai paling tinggi di antara xilanase
normal maupun mutan lainnya baik pada pH 9 maupun 10. Aktivitas relatif
xilanase mutan tiga titik dari Klon 4 pada kondisi pH dan suhu tersebut memiliki
aktivitas relatif yang lebih rendah baik dibandingkan dengan xilanase normal klon
P39 maupun mutan ganda klon M3. Hasil pengujian stabilitas enzim pada suhu
60°C, pH 9 dan 10 mengindikasikan mutan xilanase Klon 7 relatif stabil pada pH
9.
Saran
Perlu dilakukan mutasi lebih lanjut pada mutan plasmid
pGEMalkxynaq1cmu Klon 7 dengan primer mutagenik lainnya. Stabilitas klon
mutan yang mengandung gen xyncmu diharapkan meningkat apabila terjadi
perubahan asam amino yang bersifat polar menjadi non-polar sehingga memiliki
banyak residu yang berperan dalam peningkatan stabilitas enzim.
DAFTAR PUSTAKA
Bailey MJ, Biely P, Poutanen K. 1992. Interlaboratory testing of methods for
assay of xylanase activity. J Biotechnol. 23:257-270.
Balaa BA, Brijz K, Gebruers K, Vandenhaute J, Wouters J, Housen I. 2009.
Xylanase XYL1p from Soytalidium acidophilum: site directed mutagenesis
and acidophilic adaptation. Bioresource Technology. 100: 6465-6471.
Batubara R. 2006. Teknologi bleaching ramah lingkungan [tesis]. Medan:
Program Pascasarjana, Universitas Sumatera Utara.
Brown TA. 1991. Pengantar Kloning Gena [terjemahan]. Soemiati Ahmad
Muhammad, penerjemah. Yogyakarta

13

Chen H, Rangasamy M, Tan SY, Wang H, Siegfried BD. 2010. Evaluation of five
methods for total DNA extraction from Western Corn Rootworm Beetles.
Plos ONE 5.
Dubnovitsky AP, Kapetaniou EG, Papageorgiou AC. 2005. Enzyme adaptation to
alkaline pH : atomic resolution (1.08Ả) structure of phosphoserine aminotransferase from Bacillus alcalophillus. Protein Sci 14: 97-110.
[EMBL] European Molecular Biology Laboratory. 2009. Protein purification
extraction and clarification: Preparation of cell lysates from E.coli [internet].
[diunduh pada 23 September 2013]. Tersedia pada: http://www.embl.de/
pepcore/pepcore_service/protein_purification/extract_clarification/cell_lysates_from_E.coli/.
Helianti et al. 2010. Constitutive high level expression of an endoxylanase gene
from the newly isolated Bacillus subtilis AQ1 in Escherichia coli. Journal
of Biomedical and Biotechnology. Page 1-12.
Huang J, Wang G, Xiao L. 2006. Cloning, sequencing, and expression of the
xylanase gene from a Bacillus subtilis strain B10 in Escherichia coli.
Bioresource Technology. 97(6): 802-806.
Inoue H, Nojima H, Okayama H. 1990. High efficiency transformation of
Escherichia coli with plasmids. Gene. 96: 23-28.
Jeong MY, Kim S, Yun CW, Choi YJ, Cho S. 2007. Engineering a de novo
internal disulfide bridge to improve the thermal stability of xylanase from
Bacillus stearothermophilus No. 236. Journal of Biotechnology. 127: 300309.
Lehninger AL, David LN, Michael MC. 2008. Principles of Biochemistry. New
York: Academic Press.
Liu L, Zeng L, Wang S, Cheng J, Li X, Song A, Wu K, Chen H. 2012. Activity
and thermostability increase of xylanase following transplantation with
modules sub-divided from hyper-thermophilic CBM9 1-2. Process
Biochemistry. 47: 853-857.
Meijer H, Dreesen JC, Van Boven CP. 1986. Molecular cloning and restriction
endonuclease mapping of the rat cytomegalovirus genome. J Gen Virol. 67:
1327-42.
Miyazaki K, Takenouchi M, Kondo H, Noro N, Suzuki M, Truda S. 2006.
Thermal stabilization of Bacillus subtilis family-11 xylanase by directed
evolution. Journal of Biological Chemistry. 281(15): 10236-10242.
[MCL] Molecular Cloning Laboratories. 2010. DH5-Alpha competent
Escherichia coli [internet]. [diunduh pada 23 September 2013]. Tersedia
pada: www.mclab.com/DH5-Alpha-Competent-E.-Coli.html
Muawanah A. 2006. Produksi enzim xilanase termostabil dari Thermomyces
lanuginosus ifo 150 [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
New England Biolabs, 2005. Catalog and Technical Reference. Jakarta: Gene
Craft Labs.
Pratiwi, Nadia A. 2013. Peningkatan termostabilitas enzim alkalifilik xilanase
dengan site directed mutagenesis [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian
Bogor.
Promega. 2010. pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems. Promega
Corporation, Madison

14

Promega Corporation. 1997. Site-directed mutagenesis. Promega Notes
Magazine. P.12
Rapley R. 2000. Recombinant DNA technology. In: Walker JM, Rapley R (eds).
Molecular Biology and Biotechnology. Cambridge: The Royal Society of
Chemistry.
Rifaat HM, Nagieb ZA, Ahmed YM. 2005. Productions of xylanases by
Streptomyces sp. and their bleaching effect on rice straw pulp. Environ. 4:
151-160.
Schaffner W, Weissmann C. 1973. A rapid, sensitive, and specific method for the
determination protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. Vol (56):
502-514
Sriprapundh D, Vieille C, Zeikus JG. 2000. Molecular determinants of xylose
isomerase thermal stability and activity: analysis of thermozymes by sitedirected mutagenesis. Protein Engineering. Vol (13): 259-265.
Storici F, Resnick MA. 2006. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed
mutagenesis
and
chromosome
rearrangements
with
synthetic
oligonucleotides in yeast. Methods Enzymol. 409:329-345.
Ulfah M, Nurcholis M, Nurhayati N, Helianti I, Wahyuntari B, Wardani AK.
2012. Cloning of α-L-arabinofuranosidase Genes and Its Expression in
Escherichia
coli:
A
Comparative
Study
of
Recombinant
Arabinofuranosidase Originatingin Bacillus subtilis DB104 and Newly
Isolated Bacillus licheniformis CW1. Microbiology Indonesia. Vol. 6 No.1
Wahyuntari B, Mubarik NR, Setyahadi S. 2009. Effect of pH, temperature and
medium composition on xylanase production by Bacillus sp. AQ-1 and
partial characterization of the crude enzyme. Microbiol Indonesia Vol. 3,
No. 1.
Yusriah, Nengah DK. 2013. Pengaruh pH dan suhu terhadap aktivitas protease
Penicillium sp. Jurnal Sains dan Seni Pomits. Vol 2: 2337-2340.
Zhang et al. 2010. Improving the thermostability of Geobacillus
stearothermophilius xylanase XT6 by directed evolution and site-directed
mutagenesis. Biosource Technology. 101: 9272-78.
Zheng L, Baumann U, Reymond JL. 2004. An efficient one-step site-directed and
site-saturation mutagenesis protocol. Nucleic Acids Res. 21, el15.
[WBC] Worthington Biochemical Corporation. 2013. Pectinase. WBC [Internet].
[diunduh 2013 Juli 19]. Tersedia pada : http://www.worthingtonbiochem.com/PASE/.

15

Lampiran 1 Strategi Penelitian
Primer mutagenik
Mutagenesis situs terarah mutan tunggal plasmid pGEMalkxynaq1cmu M3 dengan
Phusion high-fidelity DNA polymerase (Thermo)

Pemotongan klon mutan plasmid pGEMalkynaq1cmu M3
Transformasi mutan pGEMalkxynaq1cmu M3 ke dalam E. coli DH5α kompeten

Ekstraksi plasmid rekombinan
pGEMalkxynaq1cmu M3
(Minipreps)

Uji aktivitas xilanase rekombinan
dengan metode Bailey

Analisis enzim restriksi mutan plasmid pGEMalkxynaq1cmu M3

Sequencing mutan plasmid pGEMalkxyna1cmu M3 rekombinan

Klon mutan

Ekstraksi xilanase rekombinan dengan metode sonikasi

Analisa aktivitas mutan
pGEMalkxynaq1cmu M3
rekombinan pada suhu 60 dan
65ºC

Analisa aktivitas mutan
pGEMalkxynaq1cmu M3
rekombinan pada pH 9 dan 10

Studi thermostabilitas enzim xilanase CMU rekombinan
pada pH optimal dan suhu optimal ± suhu 5ºC selama 0,
10, dan 20 menit

16

Lampiran 2 Alignment Gen alkynaq1cmu M3 dengan program ClustalW
(www.genome.jp)

1

2

Keterangan:
1. Perubahan asam amino glutamina (CAA) menjadi lisina (AAA) pada urutan
asam amino posisi 53 yang disebabkan mutasi klon tetua (M3) dengan primer
Q53K
2. Perubahan asam amino glutamina (CAA) menjadi leusina (CTA) pada urutan
asam amino posisi 62 yang disebabkan mutasi klon tetua (M3) dengan primer
Q62L

17

Lampiran 2 (lanjutan)

1

2

Keterangan:
1.

2.

Perubahan asam amino glutamat (GAG) menjadi valina (GTG) pada urutan
asam amino posisi 108 yang disebabkan mutasi klon tetua (M3) dengan
primer E146V
Perubahan asam amino treonina (ACA) menjadi isoleusina (ATA) pada
urutan asam amino posisi 156 yang disebabkan mutasi klon tetua (M3)
dengan primer T194I

18

Lampiran 3 Alignment mutasi gen pGEMalkxynaq1cmu M3 dengan klon 4
dan 7

M3

Klon 4

Klon 7

Keterangan:
Perubahan asam amino terlihat dengan menggunakan software Chromas Lite.
Perubahan terlihat dari perbandingan kromatogram yang terdeteksi pada software
tersebut. Perubahan asam amino terdapat di posisi 53.

19

Lampiran 3 (lanjutan)

M3

Klon 4

Klon 7

Keterangan:
Perubahan asam amino terlihat dengan menggunakan software Chromas Lite.
Perubahan terlihat dari perbandingan kromatogram yang terdeteksi pada software
tersebut. Perubahan asam amino terdapat di posisi 156.

20

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di DKI Jakarta pada tanggal 15 Juli 1991 dari ayah
Dahrizal dan ibu Sri Rusiana. Penulis adalah putri kedua dari lima bersaudara.
Tahum 2009 penulis lulus dari SMA Sekolah Indonesia Kuala Lumpur dan pada
tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB)
melalui Ujian Talenta Mandiri IPB dan diterima di Departemen Biokimia,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis mengikuti kursus bahasa Jerman di
dalam lingkungan perkuliahan dan lulus dengan nilai yang memuaskan pada tahap
Einsfuhrung atau pemula. Selain bidang akademis, penulis pernah aktif dalam
Himpunan Profesi CREBs (Community of Research and Education in
Biochemistry) pada departemen Biokimia dan memegang divisi Wakil Bendahara
umum pada tahun ajaran 2010/2011 dan mengikuti kepanitiaan (MPF) Masa
Perkenalan Fakultas dan (MPD) Masa Perkenalan Departemen dengan menjabat
sebagai anggota divisi MOD ( Master of Discipline) pada tahun ajaran 2011/2012.
Penulis pernah mengikuti praktik lapang di Laboratorium Biotek-BPPT di
Serpong, Tangerang Selatan selama 2 bulan.
Selain di bidang organisasi dan perkuliahan, penulis juga aktif dalam
mengikuti cabang olahraga basket putri dan pernah mengikuti pertandingan antar
fakultas dalam OMI (Olimpiade Mahasiswa IPB) pada tahun ajaran 2011/2012
dan pernah mengikuti perlombaan cabang seni drama musikal dalam acara-acara
seminar kesehatan yang diadakan oleh Departemen Biokimia maupun antar
departemen pada tahun 2010/2011.