Konstruksi Vektor Ekspresi Dari Gen Plnw Dari Lactobacillus Plantarum U10 Dan Ekspresinya Di Lactococcus Lactis
KONSTRUKSI VEKTOR EKSPRESI DARI GEN plnW DARI
Lactobacillus plantarum U10 DAN EKSPRESINYA DI
Lactococcus lactis
AKSAR CHAIR LAGES
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Konstruksi Vektor
Ekspresi dari Gen plnW dari Lactobacillus plantarum U10 dan Ekspresinya di
Lactococcus lactis adalah benar karya saya bersama komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor dan Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia.
Bogor,
September 2015
Aksar Chair Lages
NIM P051124021
RINGKASAN
AKSAR CHAIR LAGES. Konstruksi Vektor Ekspresi dari Gen plnW dari
Lactobacillus plantarum U10 dan Ekspresinya di Lactococcus lactis. Dibimbing
oleh SUHARSONO dan APON ZAENAL MUSTOPA.
Lactobacillus plantarum U10 yang diisolasi dari Tempoyak menghasilkan
bakteriosin jenis plantarisin (disandikan oleh gen pln) yang memiliki aktivitas
penghambatan terhadap beberapa bakteri patogen. Gen-gen plantarisin tersebar ke
beberapa operon yang masing-masing memiliki fungsi tersendiri dalam sistem
biosintesis plantarisin. Terdapat lima operon yang terdiri dari plnABCD, plnEFI,
plnJKLR, plnMNOP dan plnGHSTUVW. Operon plnGHSTUVW menyandikan
protein yang berperan sebagai ATP-binding cassette (ABC) transporter dan
beberapa protein membran yang belum diketahui fungsinya, termasuk plnW.
Hasil-hasil studi terdahulu menunjukkan bahwa beberapa lokus bakteriosin
(termasuk plantarisin) menyandikan protein yang tergolong dalam protein Abi (no.
aksesi Pfam PF02517) jenis CAAX protease. Beberapa protein Abi dalam lokus
ini (PlnI, PlnL, SkkI, PncO dan SagE) diketahui berperan membentuk imunitas
terhadap aktivitas bakteriosin. Selain itu, protein-protein tersebut memiliki motifmotif terkonservasi yang mirip dengan plantarisin W (PlnW). Penelitian ini
bertujuan untuk mengkarakterisasi gen plnW asal L. plantarum U10 dan
mengklonnya ke dalam vektor ekspresi dan mengekspresikannya dalam L. lactis,
serta untuk mengetahui aktivitas PlnW dalam menghambat aktivitas bakteriosin.
Penelitian ini dimulai dari amplifikasi gen plnW dari DNA kromosom
L. plantarum U10, kemudian mengklonnya ke dalam vektor pengklonan pGEM-T
Easy dan vektor ekspresi pNZ8148. Vektor ekspresi yang telah membawa gen
plnW diintroduksikan ke inang L. lactis NZ3900 menggunakan teknik
elektroporasi. Analisis tingkat ekspresi PlnW dilihat melalui pengaruh dosis nisin
dalam menginduksi L. lactis. Sifat resisten bakteriosin dilihat dari kemampuan
pertumbuhan L. lactis pembawa gen plnW ketika dipaparkan bakteriosin.
Fragmen DNA berukurun 1033 bp yang mengandung plnW berhasil
diamplifikasi dari DNA kromosom L. plantarum U10. Hasil PCR dengan ukuran
1033 bp tersebut mengandung 687 bp plnW yang menyandikan protein PlnW
berukuran 25.08 kDa. PlnW L. plantarum U10 asal pangan Tempoyak memiliki
rata-rata tingkat kemiripan sebesar 98.32% terhadap PlnW L. plantarum dari
sumber lain. Terdapat dua perbedaan asam amino pada posisi ke-77 (arginin
triptofan) dan posisi ke-160 (asam aspartat glisin). Hasil analisis lokasi PlnW
menunjukkan bahwa PlnW terdapat pada daerah transmembran yaitu pada daerah
urutan asam amino ke-14 sampai 37, 42 sampai 59, 84 sampai 100, 186 sampai
205, serta 212 sampai 228. Gen plnW berukuran 687 bp telah teramplifikasi dari
pGplnWU10 menggunakan pasang primer plnW-NcoI_F dan plnW-HindIII_R.
Gen tersebut berhasil disisipkan ke daerah multiple cloning site (MCS) pada
vektor ekspresi pNZ8148 sehingga terbentuk pNZ8148-WU10, dan
pNZ8148-WU10 telah berhasil diintroduksikan ke dalam E. coli MC1061. Vektor
pNZ8148-WU10 berhasil diperbanyak di E. coli transforman, dan telah
diintroduksikan ke L. lactis NZ3900. Efisiensi transformasi meningkat seiring
dengan meningkatnya kadar vektor yang diintroduksikan ke L. lactis. Efisiensi
tertinggi sebesar (7.2 x 103) ± 100 CFU/µg DNA dicapai ketika kadar
vektor/plasmid sebesar 1 µg. L. lactis yang membawa vektor pNZ8148-WU10
berhasil mengekspresikan plnW. Protein PlnW berukuran 25.3 kDa, terlihat pada
bagian sampel rekombinan. Konsentrasi protein meningkat secara cukup
signifikan ketika diinduksi nisin. Konsentrasi protein tertinggi (1.55 ± 0.04
mg/mL) dicapai ketika diinduksi 10 ng/mL nisin. Selain itu, PlnW mempunyai
aktivitas protease sebesar 2.22 ± 0.05 U/mL dengan aktivitas spesifik sebesar
1.65 ± 0.03 U/mg protein ketika diiduksi dengan 50 ng/mL nisin. PlnW
mempunyai aktivitas imunitas terhadap plantarisin dan imunitas silang terhadap
jenis bakteriosin lain yaitu pediosin, fermentsin dan acidosin. Hilangnya
sensitivitas L. lactis transforman yang mengandung PlnW terhadap bakteriosin
mengindikasikan bahwa PlnW merupakan protein imunitas. Berdasarkan analisis
lokasi protein, situs aktif dominan terletak pada bagian luar/permukaan sel. Hal ini
menjelaskan bahwa mekanisme imunitas bakteriosin diduga terjadi pada daerah
tersebut.
Kata kunci: Plantarisin, PlnW, pNZ8148, L. lactis, imunitas
SUMMARY
AKSAR CHAIR LAGES. Construction of Expression Vector of plnW gene from
Lactobacillus plantarum U10 and Its Expression in Lactococcus lactis.
Supervised by SUHARSONO and APON ZAENAL MUSTOPA.
Lactobacillus plantarum U10 isolated from Tempoyak could produce
bacteriocin called plantaricin (encoded by pln gene) which has the activity against
several pathogenic bacteria. Plantaricin genes are spreaded into several operons
which have different functions in biosynthesis system. There are five operons in
plantaricin loci called plnABCD, plnEFI, plnJKLR, plnMNOP, and
plnGHSTUVW. plnGHSTUVW operon encode the ATP-binding cassette (ABC)
transporter and suggesting a putative membrane protein with unknown function,
including plnW. Recent studies shown that several bacteriocin loci (include
plantaricin) encode proteins that belong to Abi protein family (Pfam accession no.
PF02517) CAAX proteases. Some of Abi protein encoded in these loci (PlnI,
PlnL, SkkI, PncO and SagE) showed an important role in maintaining immunity
against bacteriocin itself based on gene knockout studies. In addition, these
proteins contained similar conserved motif with plantaricin W (PlnW). This study
aims to characterize plnW gene from L. plantarum U10, clone this gene into an
expression vector, then expressed in L. lactis. This study also aims to look
forward PlnW activity in order to against bacteriocin activity.
This study started from amplification of plnW gene from chromosomal
DNA of L. plantarum U10, and then cloned to cloning vector pGEM-T Easy and
expression vector pNZ8148. Expression vector harboring plnW gene was
introduced into bacterial host L. lactis NZ3900 by electroporation technique.
Analyzing of PlnW‟s expression level could be seen trough influence of nisin
dose in order to inducing L. lactis. Bacteriocin resistance characteristic could be
seen trough growth ability of L. lactis harboring plnW since present of bacteriocin.
Fragment DNA containing plnW gene with size approximately 1033 bp was
amplified from chromosomal DNA of L. plantarum U10. The 1033 bp of PCR
result contained 687 bp of plnW gene encoding 25.08 kDa plantarisin W peptide
(PlnW). The peptide similarity of PlnW from L. plantarum U10 (Tempoyak
origin) was approximately 98.32% with the other PlnW of L. plantarum from
another sources. Based on peptide similarity result, PlnW was differed by two
amino acids substitution at position 77 (Arginine Tryptophan) and position 160
(Aspartate Glycine). The location analyzes of PlnW protein shown that PlnW
was located in transmembrane regions, comprising amino acids 14 to 37, 42 to 59,
84 to 100, 186 to 205 and 212 to 228. Specific 687 bp plnW gene was amplified
from pGplnWU10 using primer pair plnW-NcoI_F and plnW-HindIII_R. The
gene was inserted into MCS of pNZ8148 expression vector to create pNZ8148WU10 and introduced into E. coli MC1061. The pNZ8148-WU10 vector was
successfully both multiplied in E. coli transformant and then introduced into an
L. lactis NZ3900. The transformation efficiency increased along the increase of
amount of vector. The highest transformation efficiency of (7.2 x 103) ± 100
CFU/µ g DNA was achieved at 1 µg of amount of plasmid. L. lactis harboring
pNZ8148-WU10 was used to express plnW. PlnW protein was 25.3 kDa in size,
and it was appeared on recombinant samples. The concentration of expressed
protein significantly increased by nisin induction. the maximum concentration of
total protein (1.55 ± 0.04 mg/mL) was achieved at the concentration of inducer
was 10 ng/mL. Furthermore, PlnW exhibited protease activity with value of 2.22
± 0.05 U/mL and specific activity about 1.65 ± 0.03 U/mg protein with 50 ng/mL
nisin induction. The PlnW has activity of immunity to plantaricin and cross
immunity to other bacteriocins such as pediocin, fermentcin, and acidocin. Loss of
sensitivity by L. lactis PlnW containing-transformant to the bacteriocin indicates
that PlnW is an immunity protein. Based on location analyze, majority active
domains were located at outside of the cell. This explains that the mechanism of
bacteriocin immunity is occurring in this region.
Keywords: Plantaricin, PlnW, pNZ8148, L. lactis, immunity
© Hak Cipta Milik IPB dan LIPI, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB dan LIPI
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB dan LIPI
KONSTRUKSI VEKTOR EKSPRESI DARI GEN plnW DARI
Lactobacillus plantarum U10 DAN EKSPRESINYA DI
Lactococcus lactis
AKSAR CHAIR LAGES
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Iman Rusmana, MSi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian ini adalah “Konstruksi Vektor Ekspresi dari Gen plnW
dari Lactobacillus plantarum U10 dan Ekspresinya di Lactococcus lactis”.
Sebagian dari hasil penelitian ini dipublikasikan di jurnal Applied Biochemistry
and Biotechnology dengan judul “Cloning and Expression of Plantaricin W
Produced by Lactobacillus plantarum U10 Isolate from ‘Tempoyak’ Indonesian
Fermented Food as Immunity Protein in Lactococcus lactis”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Ir Suharsono, DEA
dan Bapak Dr Apon Zaenal Mustopa, MSi selaku komisi pembimbing, serta
Bapak Dr Ir Iman Rusmana, MSi selaku penguji luar komisi yang telah
memberikan kritik dan saran yang bersifat membangun untuk menyempurnakan
tesis ini. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Dr Ir
Bambang Sunarko selaku Kepala Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI yang telah
mengizinkan penulis untuk melakukan penelitian di Laboratorium Rekayasa
Genetika Terapan dan Disain Protein, Puslit Bioteknologi LIPI.
Terima kasih kepada Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia atas bantuan
Program Riset Kompetitif 2014 yang telah membantu membiayai penelitian ini
atas nama Dr Apon Zaenal Mustopa, MSi. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada keluarga, para rekan se-laboratorium, teman kuliah dan
seluruh pihak yang membantu atas segala doa dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2015
Aksar Chair Lages
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
xii
DAFTAR GAMBAR
xii
DAFTAR LAMPIRAN
xii
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
1
2
2 TINJAUAN PUSTAKA
Lactobacillus plantarum
Bakteriosin
Imunitas Bakteriosin
Ekspresi Protein Heterolog di Lactococcus lactis
3
4
6
7
3 METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Bahan
Prosedur Kerja
8
8
9
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengklonan dan Karakterisasi plnW Asal L. plantarum U10
Vektor Ekspresi Rekombinan
Transformasi L. lactis NZ3900
Ekspresi Plantarisin W di L. lactis NZ3900
Imunitas Plantarisin W terhadap Bakteriosin
13
16
18
19
21
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
23
23
DAFTAR PUSTAKA
24
LAMPIRAN
29
RIWAYAT HIDUP
36
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
Karakteristik genetik beberapa strain L. plantarum
Klasifikasi bakteriosin
Jenis-jenis protein yang telah diekspresikan di L. lactis
Primer yang digunakan
Homologi urutan nukleotida plnW
Optimasi transformasi L. lactis NZ3900
Konsentrasi protein dan aktivitas proteolitik PlnW
4
5
7
9
13
18
20
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Scanning Electron Micrograph dari Lactobacillus plantarum WCFS1
Lokus-lokus plantarisin pada beberapa strain L. plantarum
Pensejajaran urutan asam amino yang memiliki motif CAAX
protease
Peta vektor pengklonan (a) dan vektor ekspresi (b)
Fragmen DNA pembawa gen plnW (a) dan peta vektor pengklonan
rekombinan (b)
Urutan nukleotida plnW dari genom L. plantarum U10
Homologi asam amino PlnW asal L. plantarum U10 dengan PlnW
dari beberapa strain L. plantarum
Analisis lokasi PlnW pada membran sel
(a) Amplifikasi gen plnW; (b) konfirmasi pemotongan vektor
rekombinan dengan enzim NcoI dan HindIII; (c) peta vektor
rekombinan
Transformasi E. coli MC1061 (a), beserta konfirmasi transforman
menggunakan PCR koloni (b), isolasi vektor rekombinan (c) dan
PCR vektor rekombinan (d)
Analisis urutan gen plnW pada vektor pNZ8148-WU10
Koloni transforman L. lactis NZ3900 ketika diintroduksi vektor
sebanyak 0.5 µg (a), 0.7 µg (b) dan 1 µg (c). PCR koloni transforman
yang positif membawa vektor ekspresi pNZ8148-WU10 (d)
Profil SDS-PAGE dan zimogram protease dari plantarisin W
Imunitas Plantarisin W dalam menghadapi aktivitas bakteriosin
3
5
6
8
13
14
15
15
16
17
18
19
20
22
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
Komposisi media pertumbuhan de Man, Rogosa, Sharpe (MRS)
Komposisi media pertumbuhan Luria-Bertani (LB)
Komposisi media pertumbuhan M17
Komposisi larutan dalam SDS-PAGE
Kurva standar BSA
Kurva standar tirosin
Skor hydrophaty dari asam amino
Kromatogram pengurutan gen plnW di pNZ8148
30
30
30
31
32
32
33
34
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bakteriosin merupakan protein antimikroba yang dihasilkan oleh bakteri.
Sebagian besar bakteriosin yang dihasilkan oleh Bakteri Asam Laktat (BAL) telah
diketahui peranannya sebagai bahan pengawet pangan alami dan bahan substitusi
antibiotik (Richard et al. 2006). Pangan fermentasi merupakan lingkungan hidup
yang sangat cocok bagi BAL dikarenakan melimpahnya nutrisi yang menunjang
pertumbuhan BAL tersebut. Pada penelitian sebelumnya, Lactobacillus plantarum
U10 berhasil diisolasi dari Tempoyak (pangan fermentasi asal Pulau Sumatera dan
Kalimantan) dan diketahui menghasilkan plantarisin yang dapat menghambat
pertumbuhan beberapa bakteri patogen (Urnemi et al. 2010).
Bakteriosin umumnya dibagi menjadi tiga atau empat kelas. Kelas satu
biasa disebut dengan lanbiotik yang tersusun atas 19 sampai 50 asam amino yang
termodifikasi seperti lantionin, metil-lantionin, dehidrobutirin, dan dehidroalanin.
Bakteriosin kelas dua merupakan peptida kecil, stabil terhadap panas, dan tidak
memiliki peptida termodifikasi (Cleveland et al. 2001; Holo et al. 2001). Kelas
tiga merupakan golongan peptida berukuran besar (> 30 kDa), serta tidak stabil
terhadap panas. Bakteriosin kelas empat yang merupakan protein kompleks yang
mengandung tambahan lipid esensial atau karbohidrat pada protein (Jack et al.
1995). Sistem biosintesis plantarisin terdiri atas lima operon yaitu plnABCD,
plnEFI, plnJKLR, plnMNOP, dan plnGHSTUVW. Operon plnABCD diketahui
peranannya dalam proses regulasi sistem biosintesis, sedangkan tiga operon
lainnya (plnEFI, plnJKLR, dan plnMNOP) memiliki peranan dalam menghasilkan
bakteriosin beserta protein imunitasnya. Operon plnGHSTUVW menghasilkan
protein-protein yang berperan dalam translokasi bakteriosin, serta beberapa
protein membran yang belum diketahui fungsinya, yang salah satunya adalah
protein plantarisin W (PlnW) (Diep et al. 1996; Tsapieva et al. 2011).
Lokus-lokus bakteriosin (termasuk plantarisin) memiliki beberapa gen
yang menyandikan protein golongan abortive infection (Abi) CAAX protease
seperti PlnI, PlnL, SkkI, PncO dan SagE yang memiliki peran imunitas dalam
menghambat aktivitas bakteriosin. Protein Abi CAAX protease memiliki tiga
motif/domain aktif yang terkonservasi yaitu Glu-Glu-xxx-Arg („x‟ merupakan
jenis asam amino lainnya), Phe-xxx-His dan His dimana ketiga motif tersebut juga
terdapat pada susunan asam amino penyusun PlnW (Kjos et al. 2010). Bakteri
penghasil bakteriosin mengekspresikan gen penyandi bakteriosin berikut dengan
gen imunitasnya sebagai upaya dalam memproteksi diri dari bakteriosin yang
dihasilkannya (Drider et al. 2006). Hal ini merupakan salah satu upaya dalam
meningkatkan produksi bakteriosin yaitu dengan menggabungkannya dengan gen
imunitas dan mengekspresikannya secara heterolog pada bakteri inang yang lain
dengan teknologi DNA rekombinan.
Dalam lokus plantarisin, PlnI dan PlnL membentuk sifat resisten terhadap
plantarisin. Namun dalam perkembangannya, hanya PlnI yang terkonservasi pada
berbagai macam strain L. plantarum (Diep et al. 1996; Kjos et al. 2010). PlnW
berpotensi sebagai kandidat protein imunitas yang dapat digabungkan dengan
bakteriosin rekombinan sehingga dapat meningkatkan produksi dari bakteriosin
2
tersebut. Namun, belum ada penelitian yang mempelajari aktivitas dari PlnW
dalam membentuk sifat resisten terhadap plantarisin.
Beberapa peptida plantarisin telah berhasil diekspresikan secara heterolog
pada Saccharomyces cerevisiae (van Reenen et al. 2002), Lactobacillus sakei
(Straume et al. 2006) dan Escherichia coli (Pal dan Sheela 2014; Kusdianawati et
al. 2015). Strain BAL dipilih sebagai inang karena merupakan mikroorganisme
yang telah diketahui aman secara umum, baik dalam aspek pangan maupun
biomedis. Selain itu, menurut Kunji et al. (2003) struktur dinding sel yang
dimiliki BAL memungkinkan optimalisasi dari ekspresi protein membran
dikarenakan hanya memiliki satu lapisan membran.
Produksi bakteriosin dapat ditingkatkan dengan menggunakan teknik
rekayasa genetik, dimana bakteriosin rekombinan diekspresikan pada bakteri
inang secara inducible. Namun, ekspresi bakteriosin rekombinan tersebut
berpotensi menghambat pertumbuhan bakteri inang dikarenakan sensitivitasnya
terhadap aktivitas bakteriosin. Ko-ekspresi bakteriosin rekombinan dengan protein
imunitas merupakan salah satu cara meningkatkan produksi bakteriosin tanpa
menghambat pertumbuhan bakteri inang. Skema ini telah digunakan pada
penelitian Martin et al. (2007) dengan mengekspresikan enterocin A (entA)
bersamaan dengan protein imunitasnya (entiA), namun masih belum menghasilkan
tingkat produksi yang optimum dikarenakan ketidakcocokan dengan inang yang
digunakan. Oleh sebab itu studi pendahuluan terkait kompatibilitas gen penyandi
protein imunitas yang akan diekspresikan pada kandidat bakteri inang perlu
dilakukan. Pada penelitian ini, gen plnW asal L. plantarum U10 diekspresikan
pada inang BAL jenis Lactococcus lactis, serta dievaluasi aktivitasnya dalam
membentuk sifat resisten terhadap bakteriosin.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat dijadikan acuan dalam pengembangan
sistem ko-ekspresi ataupun hibridisasi protein antara bakteriosin rekombinan
dengan Plantarisin W sebagai protein imunitasnya, sehingga dapat
mengoptimalkan produksi bakteriosin rekombinan tersebut. Selain itu, penelitian
ini menghasilkan produk berupa strain bakteri inang yang dapat mengekspresikan
plantarisin W.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi gen plnW asal L.
plantarum U10 yang diisolasi dari pangan fermentasi tempoyak, dan mengklon
gen tersebut ke dalam vektor ekspresi serta mengekspresikannya dalam strain
BAL jenis L. lactis NZ3900. Penelitian ini juga bertujuan untuk mengetahui
aktivitas imunitas plantarisin dari PlnW, serta potensinya dalam menghambat
aktivitas bakteriosin jenis lain.
2 TINJAUAN PUSTAKA
Lactobacillus plantarum
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri gram positif yang tumbuh
secara anaerobik, tidak bersporula, serta dapat memproduksi asam laktat sebagai
produk dari proses fermentasi. BAL telah banyak dimanfaatkan sejak ribuan tahun
dalam proses produksi pangan fermentasi dimana BAL berkontribusi terhadap cita
rasa, kualitas, tekstur dan keamanan produk tersebut. Lactobacillus plantarum
(Gambar 1) merupakan bakteri gram positif yang tidak menghasikan spora dan
katalase, resisten terhadap kondisi lingkungan yang asam, tumbuh optimum secara
anaerobik aerotoleran pada suhu 30 °C (mesofilik) atau 42 °C (termofilik) dengan
kisaran pH optimum 4.0-4.5. L. plantarum bersifat heterofermentatif fakultatif,
dimana proses fermentasi karbohidrat pada umumnya melalui jalur sintesa
fosfoketolase. Fermentasi pentosa (xylosa dan ribosa) akan menghasilkan piruvat
dan asetil fosfat yang nantinya akan dikonversi menjadi laktat dan asetat. Selain
itu, heksosa (glukosa, fruktosa dan mannosa) juga akan dikonversi menjadi laktat,
CO2 dan etanol (Mayo et al. 2010; Todorov dan Franco 2010; Hammes dan Vogel
1995).
Gambar 1 Scanning Electron Micrograph dari Lactobacillus plantarum WCFS1
[Gambar direproduksi dari Bron et al. (2004) dengan seizin penerbit
American Society for Microbiology].
Sebagai spesies heterogenus, L. plantarum diketahui memiliki tingkat
kekerabatan yang cukup dekat dengan Lactobacillus pentosus, Lactobacillus
paraplantarum dan Lactobacillus fabifermentans melalui homologi urutan
nukletida 16s rRNA. DNA genom dari beberapa strain L. plantarum juga telah
berhasil diurutkan sehingga dapat diketahui karakteristik genetik yang dimilikinya
(Tabel 1) (Parente et al. 2010; Siezen dan van Hylckama Vlieg 2011). L.
plantarum merupakan bakteri yang sangat adaptif, dapat ditemukan di berbagai
macam kondisi ekologis lingkungan, bahkan pada saluran pencernaan hewan dan
manusai. Kemampuan hidup di berbagai tipe habitat ini dikarenakan L. plantarum
mampu memanfaatkan karbon dari berbagai sumber (Siezen et al. 2010; Prins et
al. 2010). L. plantarum banyak digunakan sebagai kultur starter dalam proses
pembuatan pangan fermentasi. Selain itu pula, L. plantarum juga telah
dikembangkan sebagai produk probiotik, salah satu strain yang telah
dikomersialkan adalah L. plantarum 299v (Siezen dan van Hylckama Vlieg 2011).
4
Konsorsium bakteri ini dapat meningkatkan nilai organoleptik pangan fermentasi
dengan cara mensekresikan enzim-enzim glikolitik, lipolitik dan proteolitik yang
akan mempengaruhi struktur, aroma dan cita rasa produk tersebut (Todorov et al.
2012).
Tabel 1 Karakteristik genetik beberapa strain L. plantarum
Strain
WCFS1
JDM1
ST-III
ATCC14917
NC8
KCA1
Sumber isolat
Saliva manusia
Silase rumput
Pangan fermentasi „kimchi‟
Acar fermentasi
Silase rumput
Vagina manusia
Ukuran
genom (mb)
3.31
3.20
3.25
~3.2
~3.2
~3.4
Jumlah
protein
3007
2948
2996
3154
~3000
~3200
Jumlah
plasmid
3
2
1
?
?
0
GC
(%)
44.5
44.7
44.6
44.0
45.0
45.3
Sumber : Siezen dan van Hylckama Vlieg (2011)
Kemampuan BAL, termasuk L. plantarum dalam menghasilkan substansi
antimikrobial seringkali dimanfaatkan pada bidang industri pangan dalam
mengurangi kontaminasi bakteri pembusuk maupun patogen (Martinez et al.
2013). L. plantarum U10 berhasil diisolasi dari „tempoyak‟, pangan fermentasi
asal Sumatera Selatan (Urnemi et al. 2010). Pangan fermentasi merupakan
lingkungan hidup yang cocok bagi BAL karena menyediakan kompleks nutrisi
yang mendukung pertumbuhan BAL. Kelimpahan jenis mikroorganisme BAL
pada pangan tempoyak diantaranya adalah L. plantarum, L. sakei dan L.
corynebacterium (Yuliana dan Garcia 2009).
Bakteriosin
Beberapa strain BAL diketahui dapat memproduksi peptida antimikroba
dalam bentuk protein berukuran kecil yang disebut bakteriosin. Bakteriosin
disintesis oleh ribosom dengan sifat antagonis terhadap beberapa bakteri gram
positif maupun negatif. Penerapan bakteriosin dalam preservasi pangan
memberikan beberapa maanfaat diantaranya yaitu menurunkan resiko toksik dan
kontaminasi silang terhadap pangan, meningkatkan umur simpan produk pangan,
menekan kerugian ekonomi akibat kemunduran mutu pangan, serta dapat
mengurangi tingkat penggunaan bahan kimia sintetik pada pangan. (Calo-Mata et
al. 2005; Cotter et al. 2005). Pengelompokan bakteriosin disajikan pada Tabel 2.
Bakteriosin kelas I umumnya dikenal sebagai lantibiotik, terdiri atas
peptida linier (tipe A) dan globular (tipe B) dengan bobot molekul yang rendah
(
Lactobacillus plantarum U10 DAN EKSPRESINYA DI
Lactococcus lactis
AKSAR CHAIR LAGES
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Konstruksi Vektor
Ekspresi dari Gen plnW dari Lactobacillus plantarum U10 dan Ekspresinya di
Lactococcus lactis adalah benar karya saya bersama komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor dan Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia.
Bogor,
September 2015
Aksar Chair Lages
NIM P051124021
RINGKASAN
AKSAR CHAIR LAGES. Konstruksi Vektor Ekspresi dari Gen plnW dari
Lactobacillus plantarum U10 dan Ekspresinya di Lactococcus lactis. Dibimbing
oleh SUHARSONO dan APON ZAENAL MUSTOPA.
Lactobacillus plantarum U10 yang diisolasi dari Tempoyak menghasilkan
bakteriosin jenis plantarisin (disandikan oleh gen pln) yang memiliki aktivitas
penghambatan terhadap beberapa bakteri patogen. Gen-gen plantarisin tersebar ke
beberapa operon yang masing-masing memiliki fungsi tersendiri dalam sistem
biosintesis plantarisin. Terdapat lima operon yang terdiri dari plnABCD, plnEFI,
plnJKLR, plnMNOP dan plnGHSTUVW. Operon plnGHSTUVW menyandikan
protein yang berperan sebagai ATP-binding cassette (ABC) transporter dan
beberapa protein membran yang belum diketahui fungsinya, termasuk plnW.
Hasil-hasil studi terdahulu menunjukkan bahwa beberapa lokus bakteriosin
(termasuk plantarisin) menyandikan protein yang tergolong dalam protein Abi (no.
aksesi Pfam PF02517) jenis CAAX protease. Beberapa protein Abi dalam lokus
ini (PlnI, PlnL, SkkI, PncO dan SagE) diketahui berperan membentuk imunitas
terhadap aktivitas bakteriosin. Selain itu, protein-protein tersebut memiliki motifmotif terkonservasi yang mirip dengan plantarisin W (PlnW). Penelitian ini
bertujuan untuk mengkarakterisasi gen plnW asal L. plantarum U10 dan
mengklonnya ke dalam vektor ekspresi dan mengekspresikannya dalam L. lactis,
serta untuk mengetahui aktivitas PlnW dalam menghambat aktivitas bakteriosin.
Penelitian ini dimulai dari amplifikasi gen plnW dari DNA kromosom
L. plantarum U10, kemudian mengklonnya ke dalam vektor pengklonan pGEM-T
Easy dan vektor ekspresi pNZ8148. Vektor ekspresi yang telah membawa gen
plnW diintroduksikan ke inang L. lactis NZ3900 menggunakan teknik
elektroporasi. Analisis tingkat ekspresi PlnW dilihat melalui pengaruh dosis nisin
dalam menginduksi L. lactis. Sifat resisten bakteriosin dilihat dari kemampuan
pertumbuhan L. lactis pembawa gen plnW ketika dipaparkan bakteriosin.
Fragmen DNA berukurun 1033 bp yang mengandung plnW berhasil
diamplifikasi dari DNA kromosom L. plantarum U10. Hasil PCR dengan ukuran
1033 bp tersebut mengandung 687 bp plnW yang menyandikan protein PlnW
berukuran 25.08 kDa. PlnW L. plantarum U10 asal pangan Tempoyak memiliki
rata-rata tingkat kemiripan sebesar 98.32% terhadap PlnW L. plantarum dari
sumber lain. Terdapat dua perbedaan asam amino pada posisi ke-77 (arginin
triptofan) dan posisi ke-160 (asam aspartat glisin). Hasil analisis lokasi PlnW
menunjukkan bahwa PlnW terdapat pada daerah transmembran yaitu pada daerah
urutan asam amino ke-14 sampai 37, 42 sampai 59, 84 sampai 100, 186 sampai
205, serta 212 sampai 228. Gen plnW berukuran 687 bp telah teramplifikasi dari
pGplnWU10 menggunakan pasang primer plnW-NcoI_F dan plnW-HindIII_R.
Gen tersebut berhasil disisipkan ke daerah multiple cloning site (MCS) pada
vektor ekspresi pNZ8148 sehingga terbentuk pNZ8148-WU10, dan
pNZ8148-WU10 telah berhasil diintroduksikan ke dalam E. coli MC1061. Vektor
pNZ8148-WU10 berhasil diperbanyak di E. coli transforman, dan telah
diintroduksikan ke L. lactis NZ3900. Efisiensi transformasi meningkat seiring
dengan meningkatnya kadar vektor yang diintroduksikan ke L. lactis. Efisiensi
tertinggi sebesar (7.2 x 103) ± 100 CFU/µg DNA dicapai ketika kadar
vektor/plasmid sebesar 1 µg. L. lactis yang membawa vektor pNZ8148-WU10
berhasil mengekspresikan plnW. Protein PlnW berukuran 25.3 kDa, terlihat pada
bagian sampel rekombinan. Konsentrasi protein meningkat secara cukup
signifikan ketika diinduksi nisin. Konsentrasi protein tertinggi (1.55 ± 0.04
mg/mL) dicapai ketika diinduksi 10 ng/mL nisin. Selain itu, PlnW mempunyai
aktivitas protease sebesar 2.22 ± 0.05 U/mL dengan aktivitas spesifik sebesar
1.65 ± 0.03 U/mg protein ketika diiduksi dengan 50 ng/mL nisin. PlnW
mempunyai aktivitas imunitas terhadap plantarisin dan imunitas silang terhadap
jenis bakteriosin lain yaitu pediosin, fermentsin dan acidosin. Hilangnya
sensitivitas L. lactis transforman yang mengandung PlnW terhadap bakteriosin
mengindikasikan bahwa PlnW merupakan protein imunitas. Berdasarkan analisis
lokasi protein, situs aktif dominan terletak pada bagian luar/permukaan sel. Hal ini
menjelaskan bahwa mekanisme imunitas bakteriosin diduga terjadi pada daerah
tersebut.
Kata kunci: Plantarisin, PlnW, pNZ8148, L. lactis, imunitas
SUMMARY
AKSAR CHAIR LAGES. Construction of Expression Vector of plnW gene from
Lactobacillus plantarum U10 and Its Expression in Lactococcus lactis.
Supervised by SUHARSONO and APON ZAENAL MUSTOPA.
Lactobacillus plantarum U10 isolated from Tempoyak could produce
bacteriocin called plantaricin (encoded by pln gene) which has the activity against
several pathogenic bacteria. Plantaricin genes are spreaded into several operons
which have different functions in biosynthesis system. There are five operons in
plantaricin loci called plnABCD, plnEFI, plnJKLR, plnMNOP, and
plnGHSTUVW. plnGHSTUVW operon encode the ATP-binding cassette (ABC)
transporter and suggesting a putative membrane protein with unknown function,
including plnW. Recent studies shown that several bacteriocin loci (include
plantaricin) encode proteins that belong to Abi protein family (Pfam accession no.
PF02517) CAAX proteases. Some of Abi protein encoded in these loci (PlnI,
PlnL, SkkI, PncO and SagE) showed an important role in maintaining immunity
against bacteriocin itself based on gene knockout studies. In addition, these
proteins contained similar conserved motif with plantaricin W (PlnW). This study
aims to characterize plnW gene from L. plantarum U10, clone this gene into an
expression vector, then expressed in L. lactis. This study also aims to look
forward PlnW activity in order to against bacteriocin activity.
This study started from amplification of plnW gene from chromosomal
DNA of L. plantarum U10, and then cloned to cloning vector pGEM-T Easy and
expression vector pNZ8148. Expression vector harboring plnW gene was
introduced into bacterial host L. lactis NZ3900 by electroporation technique.
Analyzing of PlnW‟s expression level could be seen trough influence of nisin
dose in order to inducing L. lactis. Bacteriocin resistance characteristic could be
seen trough growth ability of L. lactis harboring plnW since present of bacteriocin.
Fragment DNA containing plnW gene with size approximately 1033 bp was
amplified from chromosomal DNA of L. plantarum U10. The 1033 bp of PCR
result contained 687 bp of plnW gene encoding 25.08 kDa plantarisin W peptide
(PlnW). The peptide similarity of PlnW from L. plantarum U10 (Tempoyak
origin) was approximately 98.32% with the other PlnW of L. plantarum from
another sources. Based on peptide similarity result, PlnW was differed by two
amino acids substitution at position 77 (Arginine Tryptophan) and position 160
(Aspartate Glycine). The location analyzes of PlnW protein shown that PlnW
was located in transmembrane regions, comprising amino acids 14 to 37, 42 to 59,
84 to 100, 186 to 205 and 212 to 228. Specific 687 bp plnW gene was amplified
from pGplnWU10 using primer pair plnW-NcoI_F and plnW-HindIII_R. The
gene was inserted into MCS of pNZ8148 expression vector to create pNZ8148WU10 and introduced into E. coli MC1061. The pNZ8148-WU10 vector was
successfully both multiplied in E. coli transformant and then introduced into an
L. lactis NZ3900. The transformation efficiency increased along the increase of
amount of vector. The highest transformation efficiency of (7.2 x 103) ± 100
CFU/µ g DNA was achieved at 1 µg of amount of plasmid. L. lactis harboring
pNZ8148-WU10 was used to express plnW. PlnW protein was 25.3 kDa in size,
and it was appeared on recombinant samples. The concentration of expressed
protein significantly increased by nisin induction. the maximum concentration of
total protein (1.55 ± 0.04 mg/mL) was achieved at the concentration of inducer
was 10 ng/mL. Furthermore, PlnW exhibited protease activity with value of 2.22
± 0.05 U/mL and specific activity about 1.65 ± 0.03 U/mg protein with 50 ng/mL
nisin induction. The PlnW has activity of immunity to plantaricin and cross
immunity to other bacteriocins such as pediocin, fermentcin, and acidocin. Loss of
sensitivity by L. lactis PlnW containing-transformant to the bacteriocin indicates
that PlnW is an immunity protein. Based on location analyze, majority active
domains were located at outside of the cell. This explains that the mechanism of
bacteriocin immunity is occurring in this region.
Keywords: Plantaricin, PlnW, pNZ8148, L. lactis, immunity
© Hak Cipta Milik IPB dan LIPI, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB dan LIPI
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB dan LIPI
KONSTRUKSI VEKTOR EKSPRESI DARI GEN plnW DARI
Lactobacillus plantarum U10 DAN EKSPRESINYA DI
Lactococcus lactis
AKSAR CHAIR LAGES
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Iman Rusmana, MSi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian ini adalah “Konstruksi Vektor Ekspresi dari Gen plnW
dari Lactobacillus plantarum U10 dan Ekspresinya di Lactococcus lactis”.
Sebagian dari hasil penelitian ini dipublikasikan di jurnal Applied Biochemistry
and Biotechnology dengan judul “Cloning and Expression of Plantaricin W
Produced by Lactobacillus plantarum U10 Isolate from ‘Tempoyak’ Indonesian
Fermented Food as Immunity Protein in Lactococcus lactis”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Ir Suharsono, DEA
dan Bapak Dr Apon Zaenal Mustopa, MSi selaku komisi pembimbing, serta
Bapak Dr Ir Iman Rusmana, MSi selaku penguji luar komisi yang telah
memberikan kritik dan saran yang bersifat membangun untuk menyempurnakan
tesis ini. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Dr Ir
Bambang Sunarko selaku Kepala Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI yang telah
mengizinkan penulis untuk melakukan penelitian di Laboratorium Rekayasa
Genetika Terapan dan Disain Protein, Puslit Bioteknologi LIPI.
Terima kasih kepada Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia atas bantuan
Program Riset Kompetitif 2014 yang telah membantu membiayai penelitian ini
atas nama Dr Apon Zaenal Mustopa, MSi. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada keluarga, para rekan se-laboratorium, teman kuliah dan
seluruh pihak yang membantu atas segala doa dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2015
Aksar Chair Lages
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
xii
DAFTAR GAMBAR
xii
DAFTAR LAMPIRAN
xii
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
1
2
2 TINJAUAN PUSTAKA
Lactobacillus plantarum
Bakteriosin
Imunitas Bakteriosin
Ekspresi Protein Heterolog di Lactococcus lactis
3
4
6
7
3 METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Bahan
Prosedur Kerja
8
8
9
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengklonan dan Karakterisasi plnW Asal L. plantarum U10
Vektor Ekspresi Rekombinan
Transformasi L. lactis NZ3900
Ekspresi Plantarisin W di L. lactis NZ3900
Imunitas Plantarisin W terhadap Bakteriosin
13
16
18
19
21
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
23
23
DAFTAR PUSTAKA
24
LAMPIRAN
29
RIWAYAT HIDUP
36
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
Karakteristik genetik beberapa strain L. plantarum
Klasifikasi bakteriosin
Jenis-jenis protein yang telah diekspresikan di L. lactis
Primer yang digunakan
Homologi urutan nukleotida plnW
Optimasi transformasi L. lactis NZ3900
Konsentrasi protein dan aktivitas proteolitik PlnW
4
5
7
9
13
18
20
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Scanning Electron Micrograph dari Lactobacillus plantarum WCFS1
Lokus-lokus plantarisin pada beberapa strain L. plantarum
Pensejajaran urutan asam amino yang memiliki motif CAAX
protease
Peta vektor pengklonan (a) dan vektor ekspresi (b)
Fragmen DNA pembawa gen plnW (a) dan peta vektor pengklonan
rekombinan (b)
Urutan nukleotida plnW dari genom L. plantarum U10
Homologi asam amino PlnW asal L. plantarum U10 dengan PlnW
dari beberapa strain L. plantarum
Analisis lokasi PlnW pada membran sel
(a) Amplifikasi gen plnW; (b) konfirmasi pemotongan vektor
rekombinan dengan enzim NcoI dan HindIII; (c) peta vektor
rekombinan
Transformasi E. coli MC1061 (a), beserta konfirmasi transforman
menggunakan PCR koloni (b), isolasi vektor rekombinan (c) dan
PCR vektor rekombinan (d)
Analisis urutan gen plnW pada vektor pNZ8148-WU10
Koloni transforman L. lactis NZ3900 ketika diintroduksi vektor
sebanyak 0.5 µg (a), 0.7 µg (b) dan 1 µg (c). PCR koloni transforman
yang positif membawa vektor ekspresi pNZ8148-WU10 (d)
Profil SDS-PAGE dan zimogram protease dari plantarisin W
Imunitas Plantarisin W dalam menghadapi aktivitas bakteriosin
3
5
6
8
13
14
15
15
16
17
18
19
20
22
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
Komposisi media pertumbuhan de Man, Rogosa, Sharpe (MRS)
Komposisi media pertumbuhan Luria-Bertani (LB)
Komposisi media pertumbuhan M17
Komposisi larutan dalam SDS-PAGE
Kurva standar BSA
Kurva standar tirosin
Skor hydrophaty dari asam amino
Kromatogram pengurutan gen plnW di pNZ8148
30
30
30
31
32
32
33
34
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bakteriosin merupakan protein antimikroba yang dihasilkan oleh bakteri.
Sebagian besar bakteriosin yang dihasilkan oleh Bakteri Asam Laktat (BAL) telah
diketahui peranannya sebagai bahan pengawet pangan alami dan bahan substitusi
antibiotik (Richard et al. 2006). Pangan fermentasi merupakan lingkungan hidup
yang sangat cocok bagi BAL dikarenakan melimpahnya nutrisi yang menunjang
pertumbuhan BAL tersebut. Pada penelitian sebelumnya, Lactobacillus plantarum
U10 berhasil diisolasi dari Tempoyak (pangan fermentasi asal Pulau Sumatera dan
Kalimantan) dan diketahui menghasilkan plantarisin yang dapat menghambat
pertumbuhan beberapa bakteri patogen (Urnemi et al. 2010).
Bakteriosin umumnya dibagi menjadi tiga atau empat kelas. Kelas satu
biasa disebut dengan lanbiotik yang tersusun atas 19 sampai 50 asam amino yang
termodifikasi seperti lantionin, metil-lantionin, dehidrobutirin, dan dehidroalanin.
Bakteriosin kelas dua merupakan peptida kecil, stabil terhadap panas, dan tidak
memiliki peptida termodifikasi (Cleveland et al. 2001; Holo et al. 2001). Kelas
tiga merupakan golongan peptida berukuran besar (> 30 kDa), serta tidak stabil
terhadap panas. Bakteriosin kelas empat yang merupakan protein kompleks yang
mengandung tambahan lipid esensial atau karbohidrat pada protein (Jack et al.
1995). Sistem biosintesis plantarisin terdiri atas lima operon yaitu plnABCD,
plnEFI, plnJKLR, plnMNOP, dan plnGHSTUVW. Operon plnABCD diketahui
peranannya dalam proses regulasi sistem biosintesis, sedangkan tiga operon
lainnya (plnEFI, plnJKLR, dan plnMNOP) memiliki peranan dalam menghasilkan
bakteriosin beserta protein imunitasnya. Operon plnGHSTUVW menghasilkan
protein-protein yang berperan dalam translokasi bakteriosin, serta beberapa
protein membran yang belum diketahui fungsinya, yang salah satunya adalah
protein plantarisin W (PlnW) (Diep et al. 1996; Tsapieva et al. 2011).
Lokus-lokus bakteriosin (termasuk plantarisin) memiliki beberapa gen
yang menyandikan protein golongan abortive infection (Abi) CAAX protease
seperti PlnI, PlnL, SkkI, PncO dan SagE yang memiliki peran imunitas dalam
menghambat aktivitas bakteriosin. Protein Abi CAAX protease memiliki tiga
motif/domain aktif yang terkonservasi yaitu Glu-Glu-xxx-Arg („x‟ merupakan
jenis asam amino lainnya), Phe-xxx-His dan His dimana ketiga motif tersebut juga
terdapat pada susunan asam amino penyusun PlnW (Kjos et al. 2010). Bakteri
penghasil bakteriosin mengekspresikan gen penyandi bakteriosin berikut dengan
gen imunitasnya sebagai upaya dalam memproteksi diri dari bakteriosin yang
dihasilkannya (Drider et al. 2006). Hal ini merupakan salah satu upaya dalam
meningkatkan produksi bakteriosin yaitu dengan menggabungkannya dengan gen
imunitas dan mengekspresikannya secara heterolog pada bakteri inang yang lain
dengan teknologi DNA rekombinan.
Dalam lokus plantarisin, PlnI dan PlnL membentuk sifat resisten terhadap
plantarisin. Namun dalam perkembangannya, hanya PlnI yang terkonservasi pada
berbagai macam strain L. plantarum (Diep et al. 1996; Kjos et al. 2010). PlnW
berpotensi sebagai kandidat protein imunitas yang dapat digabungkan dengan
bakteriosin rekombinan sehingga dapat meningkatkan produksi dari bakteriosin
2
tersebut. Namun, belum ada penelitian yang mempelajari aktivitas dari PlnW
dalam membentuk sifat resisten terhadap plantarisin.
Beberapa peptida plantarisin telah berhasil diekspresikan secara heterolog
pada Saccharomyces cerevisiae (van Reenen et al. 2002), Lactobacillus sakei
(Straume et al. 2006) dan Escherichia coli (Pal dan Sheela 2014; Kusdianawati et
al. 2015). Strain BAL dipilih sebagai inang karena merupakan mikroorganisme
yang telah diketahui aman secara umum, baik dalam aspek pangan maupun
biomedis. Selain itu, menurut Kunji et al. (2003) struktur dinding sel yang
dimiliki BAL memungkinkan optimalisasi dari ekspresi protein membran
dikarenakan hanya memiliki satu lapisan membran.
Produksi bakteriosin dapat ditingkatkan dengan menggunakan teknik
rekayasa genetik, dimana bakteriosin rekombinan diekspresikan pada bakteri
inang secara inducible. Namun, ekspresi bakteriosin rekombinan tersebut
berpotensi menghambat pertumbuhan bakteri inang dikarenakan sensitivitasnya
terhadap aktivitas bakteriosin. Ko-ekspresi bakteriosin rekombinan dengan protein
imunitas merupakan salah satu cara meningkatkan produksi bakteriosin tanpa
menghambat pertumbuhan bakteri inang. Skema ini telah digunakan pada
penelitian Martin et al. (2007) dengan mengekspresikan enterocin A (entA)
bersamaan dengan protein imunitasnya (entiA), namun masih belum menghasilkan
tingkat produksi yang optimum dikarenakan ketidakcocokan dengan inang yang
digunakan. Oleh sebab itu studi pendahuluan terkait kompatibilitas gen penyandi
protein imunitas yang akan diekspresikan pada kandidat bakteri inang perlu
dilakukan. Pada penelitian ini, gen plnW asal L. plantarum U10 diekspresikan
pada inang BAL jenis Lactococcus lactis, serta dievaluasi aktivitasnya dalam
membentuk sifat resisten terhadap bakteriosin.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat dijadikan acuan dalam pengembangan
sistem ko-ekspresi ataupun hibridisasi protein antara bakteriosin rekombinan
dengan Plantarisin W sebagai protein imunitasnya, sehingga dapat
mengoptimalkan produksi bakteriosin rekombinan tersebut. Selain itu, penelitian
ini menghasilkan produk berupa strain bakteri inang yang dapat mengekspresikan
plantarisin W.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi gen plnW asal L.
plantarum U10 yang diisolasi dari pangan fermentasi tempoyak, dan mengklon
gen tersebut ke dalam vektor ekspresi serta mengekspresikannya dalam strain
BAL jenis L. lactis NZ3900. Penelitian ini juga bertujuan untuk mengetahui
aktivitas imunitas plantarisin dari PlnW, serta potensinya dalam menghambat
aktivitas bakteriosin jenis lain.
2 TINJAUAN PUSTAKA
Lactobacillus plantarum
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri gram positif yang tumbuh
secara anaerobik, tidak bersporula, serta dapat memproduksi asam laktat sebagai
produk dari proses fermentasi. BAL telah banyak dimanfaatkan sejak ribuan tahun
dalam proses produksi pangan fermentasi dimana BAL berkontribusi terhadap cita
rasa, kualitas, tekstur dan keamanan produk tersebut. Lactobacillus plantarum
(Gambar 1) merupakan bakteri gram positif yang tidak menghasikan spora dan
katalase, resisten terhadap kondisi lingkungan yang asam, tumbuh optimum secara
anaerobik aerotoleran pada suhu 30 °C (mesofilik) atau 42 °C (termofilik) dengan
kisaran pH optimum 4.0-4.5. L. plantarum bersifat heterofermentatif fakultatif,
dimana proses fermentasi karbohidrat pada umumnya melalui jalur sintesa
fosfoketolase. Fermentasi pentosa (xylosa dan ribosa) akan menghasilkan piruvat
dan asetil fosfat yang nantinya akan dikonversi menjadi laktat dan asetat. Selain
itu, heksosa (glukosa, fruktosa dan mannosa) juga akan dikonversi menjadi laktat,
CO2 dan etanol (Mayo et al. 2010; Todorov dan Franco 2010; Hammes dan Vogel
1995).
Gambar 1 Scanning Electron Micrograph dari Lactobacillus plantarum WCFS1
[Gambar direproduksi dari Bron et al. (2004) dengan seizin penerbit
American Society for Microbiology].
Sebagai spesies heterogenus, L. plantarum diketahui memiliki tingkat
kekerabatan yang cukup dekat dengan Lactobacillus pentosus, Lactobacillus
paraplantarum dan Lactobacillus fabifermentans melalui homologi urutan
nukletida 16s rRNA. DNA genom dari beberapa strain L. plantarum juga telah
berhasil diurutkan sehingga dapat diketahui karakteristik genetik yang dimilikinya
(Tabel 1) (Parente et al. 2010; Siezen dan van Hylckama Vlieg 2011). L.
plantarum merupakan bakteri yang sangat adaptif, dapat ditemukan di berbagai
macam kondisi ekologis lingkungan, bahkan pada saluran pencernaan hewan dan
manusai. Kemampuan hidup di berbagai tipe habitat ini dikarenakan L. plantarum
mampu memanfaatkan karbon dari berbagai sumber (Siezen et al. 2010; Prins et
al. 2010). L. plantarum banyak digunakan sebagai kultur starter dalam proses
pembuatan pangan fermentasi. Selain itu pula, L. plantarum juga telah
dikembangkan sebagai produk probiotik, salah satu strain yang telah
dikomersialkan adalah L. plantarum 299v (Siezen dan van Hylckama Vlieg 2011).
4
Konsorsium bakteri ini dapat meningkatkan nilai organoleptik pangan fermentasi
dengan cara mensekresikan enzim-enzim glikolitik, lipolitik dan proteolitik yang
akan mempengaruhi struktur, aroma dan cita rasa produk tersebut (Todorov et al.
2012).
Tabel 1 Karakteristik genetik beberapa strain L. plantarum
Strain
WCFS1
JDM1
ST-III
ATCC14917
NC8
KCA1
Sumber isolat
Saliva manusia
Silase rumput
Pangan fermentasi „kimchi‟
Acar fermentasi
Silase rumput
Vagina manusia
Ukuran
genom (mb)
3.31
3.20
3.25
~3.2
~3.2
~3.4
Jumlah
protein
3007
2948
2996
3154
~3000
~3200
Jumlah
plasmid
3
2
1
?
?
0
GC
(%)
44.5
44.7
44.6
44.0
45.0
45.3
Sumber : Siezen dan van Hylckama Vlieg (2011)
Kemampuan BAL, termasuk L. plantarum dalam menghasilkan substansi
antimikrobial seringkali dimanfaatkan pada bidang industri pangan dalam
mengurangi kontaminasi bakteri pembusuk maupun patogen (Martinez et al.
2013). L. plantarum U10 berhasil diisolasi dari „tempoyak‟, pangan fermentasi
asal Sumatera Selatan (Urnemi et al. 2010). Pangan fermentasi merupakan
lingkungan hidup yang cocok bagi BAL karena menyediakan kompleks nutrisi
yang mendukung pertumbuhan BAL. Kelimpahan jenis mikroorganisme BAL
pada pangan tempoyak diantaranya adalah L. plantarum, L. sakei dan L.
corynebacterium (Yuliana dan Garcia 2009).
Bakteriosin
Beberapa strain BAL diketahui dapat memproduksi peptida antimikroba
dalam bentuk protein berukuran kecil yang disebut bakteriosin. Bakteriosin
disintesis oleh ribosom dengan sifat antagonis terhadap beberapa bakteri gram
positif maupun negatif. Penerapan bakteriosin dalam preservasi pangan
memberikan beberapa maanfaat diantaranya yaitu menurunkan resiko toksik dan
kontaminasi silang terhadap pangan, meningkatkan umur simpan produk pangan,
menekan kerugian ekonomi akibat kemunduran mutu pangan, serta dapat
mengurangi tingkat penggunaan bahan kimia sintetik pada pangan. (Calo-Mata et
al. 2005; Cotter et al. 2005). Pengelompokan bakteriosin disajikan pada Tabel 2.
Bakteriosin kelas I umumnya dikenal sebagai lantibiotik, terdiri atas
peptida linier (tipe A) dan globular (tipe B) dengan bobot molekul yang rendah
(