Screening of Probiotic Bacteria for Biocuntrol of Vibriosis in Tiger Shrimp Larvae: Construction of Molecular Marker and Adherence Assay.
PENAPlSAN B M E R I PROBXOTIK UNTUK
BIQKONTROL,VtBRlQSXS PADA U R V A UDANG WINDU:
KQNSTRUKSX PENANDA MOLEKULER
DAN ESEI PELEKATAN
SEKOWH PASCASARJANA
XNSTXTUT PERTANlAN BQGOR
2004
WDANARNI, Penapisan BaMeri Probatik untuk Biokontrol Vibriosis pada Larva
Udang Windu: Konstruksi Penanda Malekuler dan Esei Pelekatan. Dibimbing
aleh AMTONIUS SUWAMTO, SUKENDA, dan BLSlANA WiDLYATI M Y .
BaMeri prubiatik untuk biokantrol vibriasis pada larva udang windu telah
diisatasi dari larva udang windu dan lingkungan perneliharaannya. fjampir
sernua isalat yang diperaleh dapat rnengharnbat pertumbuhan V. harveyi
patogen. lsolat SKT-b yang diisotasi dari Skeletonema efektif rnengharnbat
perturnbuhan V. harveyi dan secara signifikan dapat rneningkatkan kelangsungan
hidup larva udang windu. fsalat tersebut pada kunsentrasi 10~-10*
CFUlml tidak
bersifat patogen pada lawa udang. Masil karakterisasi rnenunjukkan bahwa
isalat SKT-b adalah blcteri Gram negatif, bersifat motil, brbentuir batang
pendek, kalaninya berwarna kuning pada media TCBS, dan bersifat menyebar
pada media SWC-agar. fsafat tersebut dapat rnenggunakan glukosa dan
sukrasa sekgai surnbr kart>on tetapi tidak dapat mqgunakan IaMusa,
rnenghasilkan enzim protease dan arnilase tetapi tidak rnenghagilkan kiiinase.
Hasil analisis sekuen sebaghan gen 1GS-rRNA msnunjukkan bahwa SKT-b
termasuk spesies Vibrio alginalytr'cus. Untuk mempelajari rnekanisrne kerja
SKT-b dalarn menekart serangan V. harvayi, khususnya brhadap komptisi
tempat pelekatan, dikonskuksi V. haweyi rekornbinan yang rnembawa gen gfp
sebagai pnanda rnobkuler. Koloni dan sel V. hanreyi yang rnembawa gfp pada
plasmid brinang fuas (pWGU1) rnenghasilkan pendaran berwarna hijau karma
produksi GFP. Keberadaan plasmid tersebut tidak rnempengaruhi prtumbuhan
dan patugenisitas V hanreyi,
Narnun dernikian, pWGOl tidak dapat
dipertahanitan V. harveyi pada media tanpa antibiotik dalam jangka waktu lama.
Oleh karena %u, dikonstfuksi tfansposan mini-Tn5 dan Tnf0 untuk menyisipkan
gen gfp Iangsuq pada genam V. h w o y i untuk mendapatkan V* haweyi gfp'
yang stabit.
Transposisi ke V haweyi rnenggunakan mini-Tn5 tidak
met~ghasil
kan transkanjugan walaupun dengan Tn70 diperoleh dengan frekwensi
yang retatif tinggi (lag). Satu transkonjugan hasil transposisi Tn10 dari
V. haweyi G3 yaitu GSTn#@fpdapat rnengekspresikan gfp dengan baik yang
selanjutnya digunakan daQm esei pebkt;an, Sel G3-Tnl@fp dapat diamati
lafigsung pada =furan wnwmaan larva udang dan populasinya pada pertahan
dengan pnambat~ariSKT-b lebih rendah dibanding tanpa SKT-t). Hat ini
menunjukiran kernungkinan adanya komgetisi tempat pieitatan atau sumber
nutrisi antara V. harvayi dan SKT-b, Aplikasi SKT-b pada larva udang rnelalui
Adernia yang diperiraya dengan SKT-b rnenghasilkan perturnbuhan yang lebih
tinggi dibanding kontral.
ABSTRACT
WIDANARNI, Screening of Probiotic Bacteria for Biocuntrol of Vibriosis in Tiger
Shrimp Larvae: Construction of Molecular Marker and Adherence Assay. Under
the direction of ANTONlUS SUWANTO, SUKENDA, and BIBIANA WIDIYATI
MY.
Probiotic ba&eria far biocuntrol of vibriosis were isolated from tiger shrimp
larvae and hatchery environment. Almost all probiotic isolates wuld inhibit the
growth of pathogenic Vibn'o haweyi. SST-b isolate from SkeIetonema was very
effective in inhibiting V, harveyi and significantly reduced larval mortaltty in
pathogen challenge assays.
These prospective probiotic bacteria, at
concentration 10'-10~ CFUfml, did not show pathogenicity to shrimp larvae.
SKT-b was Gram negative, short rod shape, exhibited yellow colonies an TCBS
and swarming an SWC-agar media, motile, utilized glucose and sucrose but not
lactose; produced extmcellular protease ancl amylase, but did not produce
&itinasen Partial sequencing of 16s-rRMA gene showed that SKT-b was similar
to Vib* algindyticus. To analyse mechanism of tiisease suppression by SKT-b,
especially on their competition for adhesion sites, we constructed recombinant
V. herveyi carrying gfp gene as a rnokufar marker. V. harvayi carrying gfp
don& in a broad-host range plasmid (pWGO1) resulted in green-fluarescent
colonies and cells due to the production of GFP, Growth cuwe analysis and
pathogenicity assays showed that the recombinant V. h a ~ e y exhibited
i
similar
growth profiles as the wild type parental strain and did not show alteration in their
pathogenicity. However, under nun selective long-term experiments without
antibiotic pressure, pWGO? was not staMy maintained in any V. harveyi strains
used in this study. Therefore we canstructed a mini Tn5 and TnIO transpuson
containing gfp gene to be inserted into V. hatveyfs genamic DNA to yield stable
transcanjugants. Tn5 transposition in V. harvejli strains did nut yield any
transcanjugants, although we could obtain relatively trigti ( 1 0 ~ transmjugans
)
employing Tn10. One uf Tn 10 derived isolate of V, harvoyi G3 ((33-Tnf Ogfp)
showed gfp expression and was further employed for adherence assay.
Fluorescent G3-TnPOgfp cells could be obwwed inside the digestive tract of
shrimp lanrae and fts population with SKT-b treatment was lower than without
pmbiatic, demonstrating possible cornpetitiun for adherence sites or nutrition
between V. harvsyi and SKY-b. ltrtroduction of S W b into shrimp tame through
SKT-Mnriched Ademr'a resulted in higher growth rate than the mtrol.
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya rnenyatakan bahwa disertasi yang berjudui:
PENAPISAN BAKTERI PROBlOTlK UNTUK 810KQWTR01, VIBRIOSIS
PADA LARVA UDANG WIHDU: KONSTRUKSI
PENANDA MOLEKULER
DAN ESEl PEEKATAN
Adalah benar merupakan hasil karya sendiri dan belum p m a h dipublikasikan
orang lain. Semua surnber data dan infwmasi yang digunakan ielah dinyatakan
secara jalas datr ciapat diperiksa kebnarannya.
Bogor, Mei 2004
PENAPlSAN W R I PROBIOTIK UNTUK
BIOKOMTRUL VlBRlQSIS PADA U R V A UDANG WXIYDU:
KUNSTRUKSI PEWNDA MOLEKULER
DAM ESEl PELEKATAN
OLEEI:
WIDANARNI
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memptofeh gelar
Ooktar pada
Program Studi Biobgi
SEKOUH PASCASAWANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2004
Judul Uisertasi
: Penapisarr
untuk
bakteri probiotik
biakuntrai
vibriosis pada larva udang windu: konstruksi
penanda rnolekuler dan esei pelelcatan
Narna
: Widanarni
NRP
: P17600007
Program Studi
: Biologi
Prof. Dr. ir. Antonius Suwanto, MSc
Ketua
_C_C.''
Prof. Dr. Dh. Bibiana W. Lay. MSc
Anggota
2. Ketua Program Studi Biaiagi
A D e k a n !Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Dedy Duwadi S., DEA
7
Tanggal lulus:
MSc
Penulis dilahirkan di Blitar pada tanggal 27 September 1967 dari ayah
Goded Nistamar dan ibu 5ri Muharti. Pendidikan sarjana di tampuh di Program
Studi Budidaya Perairan, Fakuttas Perikanan dan llmu Kelautan (PB, lutus pads
tahun 1991.
Pada tahun 1992-1993 penulis mengikuti research student di
Laboratory of Fish Phydogy, Depattment of Fisheries, Facufiy of Agricuftum/,
University of Tokyo, Jepang. Pada tahun 1996, penutis diterima di Program Studi
Bialagi pada Program Pascasarjana 1P8 dan rnenamatkannya pada tahun 1999.
Kewmpatan untuk rnelanjutkan ke program doktar pada program studi dan pada
perguruan tinggi yang sama diperoleh pada tahun ZQOO. Beasiswa pendidikan
pascasarjana diperoleh dad Departemen Pendidikan Nasional.
Penulis k k e j a sebagai stat pengajar di Departemen Budiiaya Perairan,
Fakultas Perikanan dan llmu Kelautan, IPB sejak tahun 1994. Pada tahun 19961998 penulis rnenjadi peneliti utama pada Riset Unggulan Terpadu (RUT IV)
bidang Teknolugi Hasii Pertanian dan Rise! Dasar pada tahun 7999-2000.
Selarna mengikuti program 53, penulis rnenjadi anggata Perhimpunan
Mikrubialogi Indonesia. Bebrapa b r y a ilrniah yang telah dihasilkan selama
pnulis mangiituti program 53 antam lain: (9) Genetic diver*
of ampicifIin
resistant Vibm isoiated fmm various stages d shrimp larvae devefopmeni, telah
diterbitkan pada jurnal Biotropia (15:3647) )add tahun 2WU,(2) Skrining isalat-
isolat Vibrio untuk biakontrat vibriosis pada larva udang windu, telah disajikan
pada Seminar Nasional Crustitacea ke-2 di Bugor, pada bulan Agustus 2002,(3)
Construction of recombinant Vibriu harveyt to study its adherence and
pathogenic@ in shrimp larvae, trttah disajikan pada 9 Symposium on Diseases
in Asian Aquaculture di Queensland, Australia, pada bulan Desamber 2002 dan
selanjutnya akan diterbititan pada jurnal Diseases in Asian Aquaculturn, (4)
P&cy
of Vibrio isdates for biocontrol of vibn'osis in tiger shdmp (Penaeus
monodon) lawae, telah diterbitkan pada jurnal Biotropia (20:11-23) pada tahun
2003 dan (5) Mo/ecu/aranalysis of pmbiatic bacteria fur bimnfrof of vibn'asis in
shrimp larvae, telah disajikan pada Marine Biotechrtology Conference di Chiba,
Jepang, pada bulan September 2003.
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, atas rahrnat dan
hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan peneliian dan penulisan disertasi
dengan judul: Psnapisan balrteit probiotik untuk biokontral vibriosis pada
larva urfang wtndu: konstruksi penanda malekufer dan emi pelekatan,
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis
sarnpaikan kepada Prof. Dr. Ir. Antonius Swanto, M Sc sebagai gum dan
pernbirnbing, atas bimbingan clan arahan yang diberikan sejak kuliah,
penyusunan proposal, pelaksanaan pmalitian, dan penulisan d i r t a s i ini. Beliau
jugs telah memberi kesemgatan cian kepercayaan kepada penufis untuk
mernbantu dalarn proyek penetitian rnengenai "frubiotik untuk Udang" yang
didanai ofeh DlP SEAMEO-BIOTRQP dan Intemasionaf Foundation for Science
(IFS), Sweden, sejak tahun 2001 hingga 2003.
Atas birnbingan yang sangat
intensif dari bliau pula sehingga bebrapa bagian dari dimrtasi ini dapat
disajikan pada seminar internasbnal serta dipublikasikan pada jurnai
internasional.
Penuiis juga rnenyarnpaikant&ma kasih dan penghargaan yang setinggi-
tingginya kepada: Dr. lr. Sukenda, MSc dan Prof. Dr. Dh. Bibiana W.Lay, MSc
sebagai guru dan pernbimbing, am birnbingan dan saran yang dibtiiran sejak
kuliah, penyusunan proposal, pelaksanaan penelitian, dan penulsan disehsi ini.
Kepada Dr. Ir. b d y Duryadi S., 0€A sebagai W u a Program Studi Wiologi
penulis juga menyampaikan tetirna kasih atas birnbingan dan nasihat yang
dikrikan. Ucapan terirna kasih juga penuiis sampaikan kepada Prof, Dr, Takashi
Aoki,
Or. lkuo Hirona, Dr. Tsuyushi Ohira, dan Ryasuke Yasawa, Laboratmy of
Genetics and Biachemistrj,l Tu&o Unive*
of F:ish@n"Bs,atas bimbingan dan
fasilitas yang diberikan untuk keperluan dakurnentasi fluoresensi,
Ucapan terima kasih yang sebsar-besamya juga penulis sampaikan
kepada: Rektar lnstitut Pertanian Bogor dan Dekan Sekolah Pascasarjana lP8
atas kesernpatan yang dibrikan untuk rnengikuti pendidikan di Sekolah
Pascasarjana IPB; Direktorat Jenderai Pendidikan Tinggi rnelaiui BPPS yang
telah rnernbrikan biaya pndidikan; DIP SEAMEO-BfOTROP dan IFS yang telah
menanggung sernua biaya penelitian; dan Direktur SEAMEO-BIOTROP yang
blah rnenyediakan fasifitas pranelitian pada Labaratorlurn Biologi Malekuler.
Kepada ternan-teman mahasiswa: Bu Nyurnan, Bu Selly, Mbak Ella,
Mbak Etty, lrawan, Yogi, Pak Hem, Pak Mardi, Yusuf, Peter, Nana, Cecil, Bu hi,
Esti, Wiwit, dan adik-adik mahasiswa S-1 serta teknisi Pak Huwn dan Pak
Ran&, penulis rnengucapkan terirna kasih yang sebesar-besamya atas banban
clan kerjasarnzt yang baik selarna pelaksanaan penelitian di Laboratorium Biologi
Molekuler, SHMEG1310"FROP dan Laboratoriurn Kesehatan Ikan, Fakultas
Perikanan dan ltmu Kelautan, 1PB.
Ucapan terima kasih penutis sampaikan pula kepada Dr. Ir. Ketut
Sugama, MSc dan Dr. !r. I Wayan Teguh Wibawan, MSi sabagai penguji tuar
kornisi yang telah rnemkrikan krifik dan saran &mi perbaikan disertasi ini.
Terima kasih yang tulus pnulis sampaikan kepada Ayah, Ibu, Nenek,
dan adik-adik atas daa dan kasih sayang yang dihrikan demi kesuksesan studi
penulk. Ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis
sarnpaikan kepada suami tercinta Prof, Dr. Ir. Muhammad Zairin Jr, MSc yang
dengan setia dan sangat sabar rnendarnpingi penulis dan rnernbimbing anak
anak kami tercinta Gentiga Muhammad Zairin dan Dwiputra Muhammad Zairin.
Kepada sernua pihak yang tefah rnembantu dan tidak dapat disebutkan
satu prsatu penulis msngucapkan terima kasih atas segata bantuannya,
sernoga Affah SWT akan rnernberikan balasan yang setimpal, Amin.
Penulis
Patogenisitas Vibn'u Kandidat Probiutik ............................................................ 37
Uji fn V h V i r i o Kandidat Prabiutik ................................................................. 39
Konstruksi dan Esei Penggunaan Penanda gfp pada V. harvtayi ......................43
Konstfuksi Plasmid Pernbawa DsRed untuk Vibrio SKT-b ............................. 53
Esei Pelekatan V. harveyj dart Vibrio SKT-b pada Larva Udang ...................... 54
Aplikasi Vibrio SKT-b pad# Lawa Udang Melatui Pengkayaan Artemia ........... 60
a. Pengkayaan Artemia dengan Vjbria SKT-b .........................................60
b. Patogenisitas Vibrio SKTb pada Artemia .............................................61
c. Pertumbuhan dan Kelangsungan Hidup Larva Udang Windu
dengan Pengkayaan Artemia ..................................................................... 62
.........
............64
KaraMerisasi dan Identifikasi Vibrio SKT-b ...................
.
.
.
KESIMPUIAN DAN SARAN
............................................................................ 66
Kesirnpulan ...................................................................................................... 66
Saran ............................................................................................................. 67
DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................
68
No.
Teks
Halaman
.1. Galur baMeri dan plasmid yang digunakan pad#
penelitian ini ...............................................................................................
17
2. Sandi dan asal isoiat VibriQ kandidat probiotik yang
digunakan dalam penelitian ini ..........................
.
.
.............................31
3, Patogenisitas V. harveyi R ~ Rdart tipe liarnya ............................................ 35
4. Uelangsungan hidup larva udang windu pada uji
patoganisitas Vibrio kandidat probiotik .....................................
... . . . . . . . . . .38
5. Patoganisitas V. hatveyi (pWGOl) dan tipe liarnya .....................................
6. Transposisi pWGU3 dad E. d i S 17-3Apir ke V. haw@
dan R. sphaemides2.4.1
........................................................................
47
50
'7. Transposisi pLOFKmgfp dari E. cofi ShRIQ,kpir ke
V. harveyidan SKT-b ............................................................................... 51
8. Perturnbuhan b
u
m dan prnnjartg larva udang windu
pada pedakuan kontral dan Vibrio SKT-b selarna dust
minggu pemeliharaan,................................................................................. 62
9. Jurnlah Vibrio SKT-b di air media pemeliharaan clan
lama udang windu pada awal dan akhir percobaan.................................... 63
No.
Halaman
Teks
1 . Diagram seleksi bakteri grabiotik untuk perneliharaan larva hewan
akuatik (Garnez-Gil dan Raque, 1998) ....................................................... 14
2. Konstntksi plasmid parnbawa gfp (pWGO1) untuk ekspresi
ekstrakromosorn pada V. h a a ~ y .........................
i
.
.
.................................21
3. Konstruksi plasmid perantara pembawer gfp (pWG02)
...............................
23
4. Konstruksi ptasrnid pernbawa gfp untuk transposisi berdasar Tn5 .............. 24
5. Konstruksi plasmid pembawa &Red (pM0-3)...........................................
26
6. PenampiIan Vibna kandidat probiotik pads media TCBS-agar (A)
dan SWC-agar (8).....................
.,.,.
.......................................................... 32
7. Profil DNA genorn V. hanreyi G3,G?,dan MR5339 berdasarkan
hasil pmotangan dengan endm restriksi Notf. M adalah DNA
genom Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 yang dipotong dengan
enzim restriksi Aset sebagai marker............................................................32
8. PenampiIan V. harveyi pada media TCBS-agar yang diamati
pada kandisi twang (A) dan gefap (B) ........................................................
33
9. Perbandingan perturnbuhan V. fiarveyi @ dan t i p liarnya (wt) ................. 34
10. Pewhambatan
V. haarvyyi MR5339 RP oleh Vfbria kandidat
. .
probrotrk pada uji in vitro ...........................................................................
36
lI.
Ketangsungan hidup larva udang windu pada uji patogenisitas
dengan berbgai tingkat konsentrad Vibrio SKT-b ..................................... 38
12. Ketangsungan hidup larva udang windu pada uji h vivo Vibrio
kandidat probiotik ............................ ,
......................................................... 39
13. Jurnlah sel Vib* sp. dan V. harveyi MR5339 RP pada air media
pernefiharaan larva udang ................... ,
.
...................................................41
14, Jurntah sel Vi6rio sp. dan V. harveyi MR 5339 W s e ~ t a
akurnutasi larva mati pada uji in vivo ..............................
................. 42
l 5 . Plasmid rekornbinan pWGO'I. M: marker l kb Ladder,
1: pSKLU1-EmRf 2: pBBR1MCS2-EcoR t 3: pWGOt -EmRI ..................... 44
.
.
16. PenampiIan kafani (A) dan sel(8) E. cdi OU5a (pWEO1) yang
diamati dengan rnikroskop fluaresen ...........................
. , . .................... 44
17. PenampiIan set V. haweyi (pWGO1) yang diamati dengan mikroskap
fluwesen ................................................................................................
45
18. Perbandingan perturnbuhan V. harveyi (pWGO?)dan tipe liarnya
.................................................................................................................. 46
19. Stabititas plasmid pWGO4 pada V. harveyi MR5339,G3, clan G7
....................................................................................................................
47
20. Plasmid rekarnbinan pWG02 dan pWG03. An: marker 1 kb Ladder,
I:gSKL0.t-EcoRI, 2: pUC'l8Rl~i-€coRl,3: ~ W G U ~ - E C O R ~ ,
4: pWGO2-Notl, 5: pUTminiTnSSplSm-NO&6: pWE03-#dl ...................... 48
21. Penampilan kulani (A) dan sel(8) E coli DHSa (pWGO2) yang
diarnati dengan rnikroskop ftuaresen ........................................................ 49
22. Penampitan koloni (A) dan el (8)E. cdiS17--11pir (pWG03)
yang diamati dengan rnikraskop fluaresen .......................................~......... 49
23.Penarnpilan kolafii (A) dan sel(0) V. harveyi G3-Tn 1C)gfpyang
diamati dengan rnikroskup fluoresen ..........................................................
24. Konstruksi gfp pada pLOFUmgfp (Stretton et a/..,1998)
51
............................. 53
25. Prafil DNA genorn bebrapa mutan V. harveyf G3 (M: marker
R. sphaemides 2.4.1 yang dipatong den an endm restti ksi Asef ,
1 dan 8: G3 tipe liar, 2: G%Tnl@fp (Km dan mengekspresikan
........-,.......
............................. 52
gfp), 37:mutan G3 (KrnR) ...................,
.
W
26.Kelangsungan hidup larva udang windu pada uji patogenisitas
V. harveyiG3 tipe liar dan G3-TnfOgfp ......................................................
52
27.Stabifitas gfp pada V. harveyiG3-Tn f Ugfp dan G3 f pWGO1) ................... 53
28, Penarnpilan sei E, &/ DHficx (pWRO1) yang diamati dengan
rnikroskop fluoresen ..................................................................................
54
29.Usus l a m udang wincju pada bebrapa perlakuan-inokutasi
V. harveyiG3-TnfqXfp ................................................................................
55
30.Usus larva udang w i d u yang dikolonisasi dengan V. harveyi
G3-Tn f Qgfp ................................................................................................ 56
31. Poputasi V. harveyi G3 RPdi air media perneliharaan, larva
hidup, dan larva mati pada perlakuan dengan penambahan
SKT-b ~ f f dan
f tanpa SKT-b R ~ R..................................................................
57
32. Poputasi V. Aarvayj G3 RPdi air media pernelihara-dan,larva
hidup, dan larva mati pada prlakuan dengan penarnbahan
SKT-b RPdan tanpa $KT-b RPselama 5 hari pengarnatan ...................... 58
33.Jumfah Vibrio SKT-b pada Artemia selarna 6 jam masa
pengkayaan ...........................................................................................
60
34. Kelangsungan hidup Arfemia pada uji patogenisitas
Vibrio SKT-b ........................................................................................... 61
35.Kalangsungan hidup fawa udang windu pada perlakuan bntrol
dan Vibrio SKT-b selarna dua rninggu pemeliharaan ...................
.
.
.
...
64
PENDAHULUAN
Udang windu (Penaeus monadon), rnerupakan salah satu kornoditas
ekspor unggulan Rasil perikanan. Pemerintah, rnelalui Program Peningkatan
10.19 milyar dari perikanan, Dari jurntah tersebut sebagian besar digantungkan
kepada budidaya udang yang diharapkan rnarnpu menyumbangkan devisa
sebanyak US $6.79 rnifyar (Basoeki 2000).
penunman k u a l h lingkungan budidaya masih rnerupakan icendala utama untuk
rnencapai tujuan tersebut. %rangan penyakit bairterial pada tingkat pemknihan
yang paling &us
dan sering rnenyebabiran tetjadinya kematian massal pada larva
ltdang windu adalah serangan b a k t d bwpmiar yang diideiWikasi -ai
Vibh
harveyi (Lavilla-Pitogo et a/. 11990;Karunasagar ef a/. I994; Ruangpan et a!. 1998).
Baktwi ini p d a umurnnya menyerang larva udang pada sMia zma, m p i s dan
awal pascalanra (Lavilla-Pitogo ei a!. 1990) sehingga rnerupakan kendala dalarn
pnyediaan bmih udang yew sehat dahm jurnlah b a r yang diperlukan untuit
tenrs-menerus dengan dosis suboptimat tefah naengakibatican
harveyi menjadi
resisten (Karunasagar et a/. 1994; Tjahjadi et a/. 1994; Teo et a!, 2000).
Penggunaan vaksin juga suli diterapkan karma galur V. hwveyj yang menyerang
larva uclang sangat kmriasi (Suwanto ef
at/.
41998). *lain
iki, degradasi vaksin
yang diserap rnerupakan masatah lain disamping beragamnya galur V. haweyi
patogen (Alabi et a/, 1999).
Dengan adanya kehmahan-itelmahan dad brbagai upaya yang telah
dilakukan, pmggunaan bkteri prubiik sebagai agen biontrctl pada pembenihn
udang menawatltan atternatif p r n m h a n untuk menanggulangi pernasalahan
Dasar penclekatan ini adalah dengan rnenggunakan aldivitas
tersebut.
rnikroorganisrne yang dapat rnenekan atau rnengtrarnbat prturnbuhan V, haw8yi
tanpa menirnbulkan darnpak bumk terhdap sistem keseimbangttnekolqis rnikrob.
Cam ini tefah terbuMi brhasil dan banyak cjigunzrlran pada usaha hewan tsrnak
(Fuller 1992; Ohhim et al. 11996), narnun k r u akhir-akhir ini diteliti untuk
ciiapliicasikan pada sistern hdidayia perairan, rnisalnya gada bucfiaya ikan
(Skjemo dan Vacistein 3999; Gram ef a!. 1999), ktsrang-kerangan (Dwtlbt dan
Langdon ? 9W;Riuelme et BI. 1997)dan udang Fjahyadi et a!. 1994; Rengpipat ef
a/. I.9gSa, f W b , 2000;GOMBZ-GiIet a[.ZQOQ),
M u r u t Blmrnberg et a/. (19931, tahap pelakatan bairteri patogen pada
tubuh inang mtupahn prasyarslt yang akan rnenerttukan k-asilan
bakteri
tersebut dalarn mlakukan kolonisasi dan rnensek~sikanfaktor-faktor virulensi.
Virulensi V. harveyi m i t a n dengan protein ekstraseluk dan turninesensi yang
diatur secara krsarna metalui mkanisrne quwum sensing interselubr (Manefield
%ta/. 2800).
Adanya kmpetisi tempat plekafan antara V. haw8yi &wan baM&
problotiic pads tubuh udang diharapkan dapat m e w a h tercapainya quonrm
sen-
sehlgus s e b Faldar-faker virubnsi. Dewan dmikian, bawd yang
rnarnpu rnenghambat pelekatan, kolanisasi clan prkurnbuhan V. harvsyi swta tidak
bemifat patqen terhadap larva udang, patensial digunakan set3agai biokontrol
untuk melawan Vibrio patogen tersebut.
Karena tam laclang bbas V i m tidak &media (Warneed t 993;Widanarni
dan Suwanto 20001,maka untuk mehkukan esei pelekatan V. harveyi p d a lawa
&ng
diperiuiran pnailda molekukr sebagai gen pelapw. Satah satu p a &
rnabkuler yang swing diunakan untuk menelaah amitas bakteri di lingkungan
3
adalah gen gfp (green ffmsc3ent protein) (Manning 1997; Janssan 2003). Gen
tersebut jika terekspresi akan menghasilkan protein GFP yang h w n d a r hijau jika
diarnati dengan cahaya W (Tsien 1998), sehingga pengarmatan ekspresinya relatif
mudah.
Selain itu, -ai
pnanda rnoMukr gen g@
rnerniliki bebrapa
keuntungan, antara lain tidak rnernbutuhkan kofaktar atau penamkhan substrat
untuk visualisasinya, sensitif, stabil, firfak toksik, setttn tidak mengganggu fungsi dan
peftumtwhan sel (Jmnhans et a!. 1998; Ling et a/. 2000). Penanda resisten
terhadap antibiotik rifampisin juga dapat digunakan untuk V. harveyi kafena pada
urnurnnya Vibnio t m & &
sensitif terhaclap antibiotik rCfarnpisin frjahyadi et al.
1994). m
a
nmama mabkufer tersebut, V B h uji dapat dibedakan dad V i m
lain yaw sebeiurnnya telah terclapat pada larva udang atau air media
pemeliharaannya mhingga esei pelekatan d a m dilakukan.
Tufuan
Pemlitian ini bertujuan untuk;:
1. Mernpfajari kemampuan genghambatan
Vibri0 kandidat probiotik
tertradap pertumbuhan V. harveyi patogen pada larva udang.
2. Memplajari pelekaian dan patogenisitas V. harveyi pada larva udang
menggunakan gensnda maleiruler sebagai gen plapur.
3. Mempelajari penggunaan pnanda molekuler dalam essi pefekatan unkrk
penapisan baMeri prabiotik.
Kegunaan Penelaan
Pemlitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai suatu metode unkrk
menguji patogenisitas V. harveyi pada larva udang windu dan juga sebagai suatu
metode untuk menapis bakteri probiotik yang patensial rnarnpu rnenghambat
Vibrio patogen.
Secar-d keseluruhan, hasii pnetitian ini diharapkan dapat
rnernhrikan infomasi penting daiam usaha pnanggulangan penyakit vibriosis
pada larva d a n g windu di indanesia.
Wbrfo hanreyi dan Penyakit Udang Berpandar
V. harveyt adalah bakteri yang hidup di lingkungan perairan laut, dan
termasuk bakteri yang dapal berpendadar (Baurnann et al. 1994). Beberapa nama
lain dari bakteri ini adalah Beneckea haweyi dan Lrrcibactefium haweyi, dan
kernudian diwbut sebagai Vnhhffeyi atau V. carcireriae (Pedersen et al, 1998).
Ciri-ciri morfologl dan ffsiologi V. harveyj pada medium NrPtrien Agar
dengan NaCl 1,596 dan seawater cempIet8-agar fSWC-agar) antara lain: benkrk
koloni bulat dengan etevasi cembung, krwarna krem, clan diarnsternya 2-3 mm
setelah inkubsi 24 jam pada suhu 28°C. Jika diamati di ruang gelap, V. hhweyi
tarnpak berpendar dan pendarannya ,dapat bedahan hingga 2-3 hari.
Bakteri
tersebut termasuk Gram negati, sd tunggal b h n t u k M a n g pendek, bemifat
matil, aksidase pasitif, sensitif tehaclap uji vibriostatik 011 29 (2,4-diamina67, diisopmpylpfen'dinephosphate), tidak
r n m b n t uk gas dari fermentasi
terhadap 0-glukasa, tidak marnpraduksi H2S, tumbuh pada media dfangan
penamkhan 1 hingga 6% NaCCf, dan mernpunyai flageta pada salah satu kutub
selnya (Baumann et a!. Ig94; Lavilla-Pitoga ef a/, 1.990;Suwarrto et a!. 1998).
Pada medium sefektiif untuk genus Vibrio, y&u TCBS-agar {ThiosuIfafe
Carate Bile-Safi Sucrose), kolani V. harveyi be~warnahijau dan hrpendar jika
diamati pada ruang getap (Lavilla-Pitogo ef a!. 1990), Kemarnpuan berpendar
merupakan hasif aktivitas enzim luciferase yang dapat brfungsi sebagai
katalisator dalam proses oksidasi reduksi.
Proses oksidasi rnefibatkan flavin
rnononukhticla dan a k h i d alifatik rantai panjang sebagai sutsstratnya.
rnononukleotida dan asam lemak disertai dengan pelepasan ernisi cahaya
dangan panjang gelombang sekiar 490 nm. Gengen yaw msngkodskan fungsi
perpendaran ini disandikan datam suatu aperun yang disebut dengan owran lux
(Meighen 1991; Ruby 1996).
V. haweyi pada urnumnya bersifat patagen apartunistik, yaitu organisme
yang dafam keadaan
normal ada dafam lingkungan pemeliharaan dan
bekernbang dari sifat saprofitik menjadi patogenik apabila kondisi lingkungan
dan inang rnemburuk. Pada saat tejadinya wabah, populasi bakteri ini dapat
rneningkat menjadi ribuan kali dalarn wadahlbak pemefiharaan larva, dan ha1 ini
tejadi setelah usaha budidaya udang windu Writembang semra intensif (LavillaPitoga ef a/. 1990). Menurut Saulnkr et a!. (2000) beberapa gatur V. harveyi
rnenrpakan patogen wbnamya dan penyebab utama penyakit vibrbsis pada
udang windu.
Kesimpulan tersebut diambil tserdasarican studi virulensi dari
beberapa galur V. harveyi yang diisalasi dari larva sekarat (man'bund) dan
diinfeksikan kmbafi pada udang sahat.
Beberapa dari gafur tersebut dapat
manyebabkan kematian total larva udang dengan dosis yang sangat rendah (102
CFU/ml).
Di antara spies-spsies bakteri k p n d a r yang diisolasi dari areal
pertarnbakan udang, panti-panti prnbenihan, dan pada tubuh udang yang
sekarat, V, harvayi adalah spesies yang paling =ring dapat dlsolasi daripada
spesbs Vr'bn'o fainnya (Ruangpan 1998; Tendencia dan da la Pena 2001).
Bakteri ini juga dapat diigolasi dari air, kotoran dan sitsoskeleton induk udang, air
penetasan gaitan alarni, Arfemia, serta dari usus udang sehat (Lavilla-Pitogo
et a/. 1982). Bebrapa pneliti rnenyatakan batrwa penyakit vibriosis terjadi
karena adanya infeksi sekuder oleh patogen oportunistik.
Sedangkan
penyebatr utamanya adalah infeksi oieh patogen lain, defisiensi nutrisi, kondisi
lingitungan, dan stress (Lavilla-Piago et a!. 1992, Lihtner eta/+1992).
Di Indonesia, wabh penyakit akibat serawan V. hanreyi krpenclar
dilapofkan tejadi di panti-panti pernbnihan yang terdapat di Jawa f imur, Jawa
6
Tengah, Jawa Barat, Sumatera Utara, dan Sulawesi Selatan (Tjahjadi et a!. 1994;
Prayitno dan Latchford 1995; Suwanto et a!. 1998). Di negara lain wabah
penyakif in! juga terjadi di Thailand (Pasharawipas et a!. 1998), di Philipina
(Lavilla-Pifogo at a/. 1990), dan di India (Karunasagar et a!. 1994). W a h h
penyakit ini pada umumnya rnernuncak pada rnusirn penghujan (Lavilla-Pitago
et at. t990).
Sejumlah pnelitian rnenunjukkan bahwa pnggunaan antibiotik untuk
pernberantasan penyakit vibriasis telah menysbabkan resistensi bsakteri Vibria
terhadap bebrapa jsnis antibiotik (Tjahjadi ef al 1994;Kanrnasagar et a!. 1994;
Teo et a!. 2000; Tendsnda dan de fa Pena 2UU1). Penggunaan anfibitik juga
iturang efektif itarena V. harveyi dapat rnernbentuk biafrfm yang dapat rnelindungi
sel-sel bakteri ifad bahan aktif antibiotik dan desinfektan sehingga tetap hidup
{Karunasagar et a!. 1996).
Penggunaan vaksin dan irnunostimulan untuk
rnengelrclalikan penyakit vibriosis ternyata dapat mengurangi tingkat kmatian
ikan dan udang (Vadstein 1997; Devaraja ef al. 1998; Alabi ef a/. 1999). Akan
tetapi tidak sernua s p i e s Vibrio penyekb penyakit vibriasis dapat dikermdalikan
dengan rnenggunakan vaksin, oleh karma sering kali galur-galur Vibrio dalam
satu spesies tidak hornogsn. Hasil penelitian Swanto et a!. (.1998)
rnenunjukkan
k h w a galur V. harvayi berpendar yang wnyerang farva udang sangat
bewafiasi pada musirn dan takasi yang k W a , sehingga suli memtukan
galur yang tepat sebagai bahan vaksin.
Petekatan clan Patownisitas V, frameyi
Menurut Bloembrg tat d. ((1993),
tahap pekkatan bakteri patogen pada
inang merupakan pcasprat yang akan menentuhn kekrbsilan baM& tersebut
dalam mebkukan $colonis& dan rnmsekresikan fairtor-faMw virubnsi. Virulensi
V. haweyi b e h i i n dengan protein ekstraseluler dan lurnimnsi yang diatur
secara bbersama deh rnekanisme q m m sensing interseluk (Harris dan Owens,
1999), sehingga penggunaan senyawa yang brsifat antaganis terhadap signal
i n t d u l e r tersebut potwsial untuk mqontrol %Pangan V. harveyi pada larva
udang (Manefield et a/. 2000).
Quorum sensing pada V. hafveyi terjadi dengan rnenggunakan senyaw
acyf Iromosffnne lacton (AHL) tertentu, ya kni N-(3-fiydoxybut~noif~L-homose##e
factone (HBHL) sehgai sinyalnya (Whitebad et a/. 2001). Bila jumlah sd kkteri
telah mencapai kepadatan tertentu maka HBHL itu akan rnernbentuk kornwks
dewan protein pengaktr khusus yang akhirnya krfungsi untuk mengaktiin
skspmsi sejurnlah gen-gwt wnyancli emimn;rim untuk luminesensi, s d m
kiinase, dan protease ektrasetuler, serta MQT-faktw patagenisitas lainnya
f Manefrefd et a!-2000:Whitehead et a!. 2001). Oengan dernikian, adanya karnpetisi
tempat pekkatan antam V. harveyi clan hkteri probiotik pada
larva udang
diharapkan dapat rnencegah tercapainya q u m sensing sekaligus sekresi fakturfaktor vintlensi.
Menun&Whitehead et al. (2001), V. haw~yirnerniliki kbih dati satu quorum
sensing dengan dua rnokkul sinyaf, yakni rnolekuf sinyal Ai-l dan Ab2. Molekut
sinyal Al-l digunakan untuk komunikasi intm-specks (dalam satu s p s k s )
sedangkan Al-2 untuk komunikasi inter-specks (antar s p s k ) .
Lebh lanjut
dijelaskan bahwa banyak s p i e s lain seperti V. & d m , V. p a r a h ~ ~ k u s ,
V. an@i/~~tlm,
V. a l g i ~ i a r s V.
, nahgens, d m Phdobacferrum pbsphmum
juga rnsnghasilkan molekul sinyaf dengan aktivitas seperti A!-2.
Bahkan hasil
analisis lebih lanjut menunjukkan bahwa N-2 yaw dihasilkan oleh E. cdcofi,
SalmmIfa typhimurium, dan V. chdera merniliki homologi yang sangat tinggi
dengan Al-2 V. bweyi. ihngan demikian, anfara V. harveyi dan bkWi kandiia£
prubiotik yang aitan diujikan s&a
dengan baMeri lain yang ada p d a larva udang
kmungkinan akan terjadi saling komunikasi m a n efek bmtipik yaw belurn
diketahui. Hal ini karena hrbagai fungsi bakteri seperti faktor vintbnsi, transfer
DNA dengan kanjugasi, simbiosis, dan produksi antibiotik dikwrtrol oleh rnekanisme
quorum sensing (Bassbr 2003).
Lavilla-Pitogo et al. (4992) melaporkan bahwa ko#onisasibakteri tarjadi
khusus pada organ-organ saluran pencemaan dan jarang diternukan pada
aksaskeletun. Penggunaan teknik antibodi flouresen menunjukkan bahwa
V. vulnificus berada pada hernotimfa dan saluran pencemaan udang windu (Sung
dan Sang 1996). Hasil penelitian Soto-Rodriguez et a!, (2003)rnenggunakan
pnanda
5-(4,6-dicAIomfn'azi17-2-y
t)
aminoflu~~esceh (5-WAF,
D-16),
rnenunjukkan bhwa V. harveyi meqkolonisasi saluran pencemaan larva (zoea
dan mysis) udang vaname
(Litopenaeus vannelmefl. V,/,harveyijugs diketahui
memilih aaittivitas enzim kitinase, protease, dan lipase (Baurnanrt et a/. 19%).
Endm kitinase memungkinkan bagi
harveyi untuk menguraikan Kitin dan
krkolonisasi di dalarn tubuh larva udang windu.
Salah satu mekanisms yang rnungkin terjadl untuk men-ah
blonisasi
baMeri patogen pada inang adalah dengan rnenarnbahkan bakteri lain yang
rnarnpu krkompetisi dengan bakteri patagen dalam rnendominasi ternpat
plekatan (Verschure faf sf. 2000), tee et al. (2000) manambahkan bahwa
keWhasiIan baktwi probiotik berkomptisi dengan bakteri patogen ditentukan
hrdasakan kernampuannya mengkolonisasi inang dsngan melakat pada
mukosa usus. Dengan demikhn, VibrEo sp. yang rnampu mengtrambat pelekatan,
kohisasi, dan pefturnbuhan V. harvsyi serta tidak bersifat patogen terhaclap larva
udang, potensial cfigunakan sebagai Wukontrol untuk melawan V i b h patogen
tersebut.
Narnun dernikian, kernungkinan bkteri probiatik m j a d i patogan juga
p d u dipehjari karena V. a@ind@cus yaw tdah disarankan sebagai bakteri
probiotik Mapi galur lain dari bakteri ini tmyata &pat menyebabkan vibriosis p d a
ikan, udang, dan Arfemiia (Gomez4itl et al. 2 W ; Vilfamil et a!. 2003). Okh karena
itu, karaktwhsi dan identifiicasi baketi probiotik pmting dilaitukan untuk
memkdakan dengan galur lain yang patensial bemifat patqsn. Karakterisasi dan
identifikasi juga pnting dilakukan unkrk kontrol kualitas dan kebutuhan paten
(Garnez-Eill et al. 2UU0).
B a k d Prubiotik wbagaf Agen Biokontrol pada Larva Udang
Menurut fuller (19921, probiotik adalah rnikrab hidup yang ditambsahkan
ke dalam pakan yang dapat rnernberikan pengaruh rnenguntungkan bagi hewan
hang dengan rnernperbaiki iceseimbangan rnikrob ususnya.
akuatik, =lain
Pada h e w n
saluran pencemaan, air di sekeliling organisme tersebut juga
memegang peranan penting. Sehingga probiotik untuk hewan akuatik adalatr
age# rnikrob hidup yang mernhrikan penganth menguntungkan pada inang
dengan rnernocfifikasi komunitas mikrob atau berasosiasi dengan inang,
menjamin perkikan dalam penggunaan pakan atau memperbaiki nilai nutrisinya,
rnernperbaiki respan inang terhadap penyakit, atau memperbaiki kualitas
lingkungan arnbangnya (Verschuere et a!. 2000).
Biakantrol menunrt @mz-Gil
ef a/. (2000) adabfr penggunaan rnusuh
alarniah untuk rnengumngi kerusakan yang disebabkan oteh organisme krbahaya
sampai tingkat y a q &pat di&&rir, atau lebih tepat lagi pengaturn papulasi
penyakit ofeh musuh alamiahnya. L&ih lanjut ditamkhkan bahwa komunitas
mi&& di dalarn saluran p m a a n hewan sampai batas tertentu membri
ketahanan atau perlinduwan terhadap penya)rit. Demikian pula pacla populasi
alamiah hewan akuatik, rnikrobiota di dalam saluran penceman dapat
menmrminkan fingkungan akuatik ternbut. Narnun demikian, pada perneliharaan
larva dengan icepadatan tinggi di &lam wadah Widaya, keseimbangan dapat
berubah karena penggunaan air yang suciah d'iddnfelrsi, r n i h l g a , nauplii
Adamia, rotifer, dan berbagai antibiotk pembunuh bakteri. Airibatnya, kamunitas
mikrob pelindurmg tidak &pat bkmbang baik di lingkungannya rnaupun di dalam
sistem saluran p e m a a n larva. Pascafarva yang dipetihara di dalarn lingkungan
yang refati steril di suatu pembenihn tidak dapat tumbuh dengan baik dan
rnernperfihatkan daya hidup yang rendah bila terpapar pada karnpleks populasi
rnikrob di petak pndederan atau pembesaran. Pascalarva tersebut akan mudah
terserang penyakit M a terkena stress lingkungan atau terinfeksi oleh bakteri yang
patensial bersifat patagen.
Banyak spsies bakteri tetah digunakan sebagai pfabiatik rnaupun
biakontraf pada larva udang, wlaupun hasilnya M u m semuanya memuaskan.
Tjahjacli et ab (1994) menunjukkan bahwa papulasi bkteri V. harveyi di
lingkungan pemeliharaan udang dapat &&&an dengan caw mengintroduksikan
bakteri tertenkr yang diisolasi dari perairan laut di sekitar tambak atau
pembenihan udang. Muliani et #I. (2003)juga melaporkan bahwa isolat B L S 2
yang kemudian diidantifikasi sebagai Pseudo~ftemmonassp. Edssp-l efe)ctif
rnenghambat pertumbuhan V, harveyj MR5339 secara in witm rnaupun in vivo
pada larva udang windu karma senyawa antirnikrob yang dihasilkannya.
Widiyanta et d (1998) melaporitan bahwa kitteri fotosintetik afioksigenik MW4
dan MW5 hrpotensi untuk dikembangkan wbagai biokontrol pada tarnbak
udang karma mampu rnenekan perturnbuhan V. harveeyi masing-masing sebesar
90 dan 70%.
Rengpipat et al. (1W ,
1998b)mdaporkan hhwa Bac#/ussp.$1 1 yang
dihrikan ke larva udang melatui Arternia dapat rneningkaikan perturnbuhan dan
kefangsungan hidup larva tersebut. hrnikian pufa isafat By-9 yang diisolasi oleh
Haryanti ef a!, (20QO)dari daerah perairan pantai Jawa Timur dan Bali, mampu
rnenekan pertumbuhan V. hharvyi
wrta meningkatkarr perturnbuhan dan
kelangsuqan hidup larva udang windu.
Metranisme Kerja dan %leks$ Bakterf Prubiotilr
Menurut Vefsctrwre
ef a/. (2000),mekanisme kerja bakteri
probiatik
dapat dibagi menjadi bebrapa cara, yaitu: (1) produksi senyawa inhibitor; (2)
kornpetisi terhadap senyawa kirnia atau sumbr energi (nutrisi); (3) kornpetisi
terhadap tempat ppelekatan; (4) peningkatan respon imun (kekebalan); (5)
perbaikan kualitas air; dan (6)interaksi dengan fitaptankton.
Suatu kelompok mikrob dapat manghasilkan senyawa antirnikrob yang
rnenghambat perlumbuhan miitrob lain dan dapat diigunaitan untuk pengabatan
infeksi rnikrob pada manusia dan h e w n . Riquslms et al. f 1997) melaparkan
bahwa Vibrio sp. yang cfiemukan brasosiasi dewan larva kerarg-kerangan
menjadi probatik yang potensial pada budidaya icerang-kerangan karma rnarnpu
menghambat pertumbuhan V. anguifIamrn yang tefah diketahui bersifat patogen
pada larva tersebut. Selanjutnya, pertumbuhan V. anguillamm dapat diharnbat
oleh Pseudomonas fluumscens AH2 yang diturnbuhkan pada media dengan
konsenfrasi besi terbatas. Pada konsentrasi b s i terbatas, pruduksi stderofor
dan aCrtwitas antikirteri Pseudomonas fluomsmns AH2 rneningkat, sehingga
dapat rnenghambaf prtumbuhan V. sngguifIarum (Gram ei at/. 1999).
Salah satu rnekanisme Lain yang rnungkirt brjadi untuk r n e n q a h
kolonisasi baMeri patogen pada inang adatah dengan rnenamkhkan baMeri lain
yang mampu brkwnpetisi dangan kkteri patagen daiam mndominasi ternpat
pelekatan (Verschure et a/. 2000). Hasil penefitian Hala et a!. (2002)yang
rnernpelajari mengenai penggunaan gen penanda molekuler untuk deteksi
plekatztrr dan kolonisasi V. haweyi pada larva udang windu rnenunjukkan bahwa
V.
harveyi dapat ditrarnbat
kolonisasinya
dewan
rnengintrorjuksikan
V. mefschnikovii yang diisolasi dari larva udang yang sehat. Vibrb ini rnasih
perlu dipelajari dan dievaluast Iebih tanjut patensinya sekgai probiotik pada
permbenitran udang windu whiqga dapat diperoleh probiotik yang potensiat
seperti yang diperobh Riquelme et a]- (1997) pada bubudiya kerang-kerangan.
Irnunostirnulan adalah suatu senyawa kimia yang dapat rnengaktiian
sistern imun dan rneningkatkan resistensi inang terhadap serangan virus, bakteri,
fungi, dan parasit. Larva ikan, udang, dan invertebrata lainnya pada umurnnya
rnerniliki sistern imun yang kurang krkembang dibrandingkan ikan ckwasa.
Bebrapa penetitian blah dilakukan dalam ugaya meningkatkan respon imun
hewan akuatik, baik rnenggunakan rnikrob hidup maupun ekstrak sel wadstein,
1997; Devaraja et a]., 1998; Afabi et a!., 1999; Skjermo dan Vadstein, 19991,
Hasilnya befum wmuanya memuaskan, walaupun bebrapa dari inang
resistensinya rneningkat terhadag serangan patogen.
Peranan rnikrob dararn mernphiiti kualitas air media budidaya telah
banyak dipetajari.
Bakteri niirifikasi (Nitrosomonas clan Nitmbacfer), telah
diketahui b e ~ r s l n
dalam aksidasi ammonia menjadi nitrat, dernikian juga baMeri
fotasinte4ik anoksigenik (Rhadopseud~manasdan Rhodobactee yang brperan
dalam mendegradasi H2S (Madigan caf a!., 1997). Ammonia dan H2Sadalah dua
senyawa yang sangaf toksik bagi hewan akuatik, termasuk ikan dan udang.
Hasil penelitian Widiyanto et BI. (1998) menunjukkan b a h bakeri btosintetik
anoksigenik MW4 dan M W 5 , selain rnampu msnekan petturnbuhan V. haweyi,
juga mampu menurunkan konmntrasi ti& masing-masing sebesar 60 dan 30°h,
sehingga potensial digunakan sshgai biokondisioner di tambak udang.
lnteraksi bakteri probiofik-fit~planictonw r a tidak langsung dapat
meningkatkan prturnbuhan dan kelangsungan hidup organisme budidaya. Hasil
pemlitian Dwillet dan Langdwl (t 994) rnenunjukkan bahwa penambahan bakteri
galur CA2 ke dafam kutkrr alga dapat meningkatkan nilai nutrisi dari alga tersebut
dan selanjuhya dapat meningkatkan perturnkhan
Iatva )rerang.
dan kelangwngan hidup
Selanjutnya ditarnbahkan oteh Naviner ef a!. (4999) bahwa
senyawa antirnikrab yang diekstrak dari diatom, Skeiefonema wstatum, terbukti
dapat mewhambat V. anguiIIarum dan spesies-spesies Vibrio lain yang bemifat
patogen tarhadap ikan, udang, dan kerang.
Menurut Gamez-Eil (ZUOU), seleksi bakteri pfabiotik biasanya rnentpakan
suatu proses empiris yang didasarkan pada sedikit bukti ilrniah.
Banyak
kegagalan penelltian hkteri prabiotik yang tejadi karma ketiru rnemilih
rnikraarganisrne. Tahapan seleksi memang sudah ditentukan, tefapi tahapan ini
masih p r l u disesuaikan menuntt spesies inang dan lingkungan, sehingga p r l u
untuk memahami rnekanisme aksi probiotik dan msnsntukan kdteria seleksi
kitteri probiotik potensiai.
Kriteria umum sefeitsi tenrtarna ditentukan
berdasarkan pertirnkngan keamanan batogis (biosafety), meto& pruduksi dan
pengalahan, metode pemktian probiotik, s&a lokasi di dalarn tubuh dirnana
rnikroorganisrne tersebut diharapkan a@#.
Metade seleksi bakteri probiotiir untuk kegiafan prnetiharaan larva hewan
akuatik dapat rnencakug beberapa tahap hrikut: (1) pngurnpulan infomasi
dasar, (2) pengumpulan probiotik, potensial, (3) evaluasi ksmarnpuan probiotik
potensial krkompetisi dengan galur patogen, (4) pendugaan patogenisitas
probiotik potensial, (5) evaluasi pengaruh prabiotik potensial pada larva, dan (6)
analisis ekonomis biaya-laba (Gambar 1).
Literature
Review
Pmsekblon
screening of
PROBIOTlCS
swlar strains
COMPETITIQM STRAINS
" "" " " " "
SULlDKWUiD MEDlA
1
PATHOGENICITY
InjeeWn and bath chalienge
I1
r J
EFFECT IN
M E HATCHERY
/
1
1
1I
-- -lC
I
i
EFFECT IN
THE LABQC~ATORY
DEVELOPMENT
OFBROTH
Economic
X
3 1 1 1 1 1 - 1 C J
VIABLE
PRUBiOTIC
Negativeeffect
No effect
R
R
+
Gambar 1. Diagram seieksi balded probiotik untuk pemeliharaan larva hewan
akuatik (Gomez-Gil dan Roque,1998)
Penggunaan Penanda Mofekukr sebagai Gen Pelapor
Oalam bialogi rnalekuler dikenat beberapa gen yang dapat digunakan
sebagai penanda moiekuler (Manning 1997; Jansson 2003). Gen yang akhirakhir ini banyak digunakan untuk rnenandai bakteri unfuk rnernpelajari
patogenisitas bakteri pada inang adalah gen gfp (Ling et a/. 2000; Sukenda dan
Wabbayashi 2001). Gen yang diisolasi dari ubur-ubur (Aequwea victoris) ini
apabila tefekspfesi akan rnenghasiliran protein yang krpendar hijau (Tsien,
7998). Pratein ini menyerap cahaya biw dengan absorbansi rnaksirnum 395 nm
dan memancadcan catraya hijau dengan abeiorbansi maksimurn 5U9 nrn
(Manning 1997; Tsien 1998).
Protein GFP diasumsikan berbentuk silinder yang pada bagian tengahnya
terdapat 15
asam amino, memknkrk kol oc-heliks. Tiga dari asam amino ini
yakni nomar 65 (serin),66 (tyrosin) dan 67 (gtysin) mernhntuk kromofor yaitu
bagian molekul yang mernancarkan cahaya. Kromofor yang rnengikat sisi-sisi
silinder ini akan mefindungi protein tersebut dad enzim-enxim
sel inang dan
radikal-radikal bebas (Manning 199'7;Tsien 1998).
Sekgai penanda molekufsr gen gfp rnerniliki bebrapa keuntungan.
Keberadaan gen ini di dalam sel tidak kfbahaya karena tidak mengganggu
fungsi dan pertumbuhan wl wrta proteinnya tidak bemifat tuksiic. Ueuntungan
fain dari gen ini adialah tidak membutuhkan kofaMor atau pena'mbahan subsirat
untuk visuafisasinya, sensitif, stabit, seFta ekspresinya dapat dideteksi sarnpai
tingkat sel tunggal (Jassnhans et a/. 7998; Ling et a!. ZQQQ).
Penggunaan gen gfp sebagai penanda malekuler telah bemasit
rnenunjukkan rnekanisme =rangan EdwarrJ'sidIa tarda pada sel epitel ikan
gurame {Ling et a!. 2000)see# serangan Pseudomonas pfecog/usfcida pada ikan
ayu (PIeco~Iossusalfivelis)di Jepang (Sukenda clan Wakabayashi 2001). Gen
g%p juga telah berhasil digunakan sebagai penanda bakteri asam talctat
(Lacfohaciffus planfarum dan L. factis) untuk mempelajari kemung kinan
penggunaan baktari tersebut sebagai pernbawa vaksin hidup (GeofFmy et a/.
2000).
Pada penelitian ini, gen gfp yang digunakan adalah gfpuv yang
dikembangkan oteh Crarneri et a/. (3996) dan dioptimasi untuk fluotesansi
rnaksimal jika disksitasi dengan sinar UV (360400nm). Fluoresensi E. coii yang
mengeicspresikan gfpuv sekiiar 18 kali lebih cerah dibandingkan dengan E. ccdi
yang mngekspresikan gfp tipe fiar. Fluaresensi gfpuv ini pada kotuni baker!
dapat diarnati dengan rnenggunakan sinar UV,
Untuk memonitor ke-aan
bbih dari satu bakbri uji dalarn satu tubuh
inang dapat digunakan beberapa penanda yang rnemiliki pendamn wama yang
brbeda (Soto-Rdriguez et 81. 2UU3;Janssan 2003). Suatttu penancla rnolekuler
yang banr-baru ini juga banyak diplajari adalah gen DsRed. Gen tersebut
diisalasi dari kefampok anernan laut (Discusuma sp.) dan jib terrakspresi akan
memanearkan pendaran krwarna mernh (Janswn 2003). Namun pmggunaan
DsRed sabagai penanda rnolekufer rnasih rnernertukan optimasi labih lanjut
karena waMu prnatangan yang diperlukan sangat lama, yakni antam W r a p
jam hingga beberapa had (Janssan 2003).
Penanda resisten tefhadap antibiotik rifarnpism juga dapat d'igunakan
untuk V. hatveyi karena pa& umumnya Vibnia tersebut sensitif terhadap antibik
rifarnpisin (Tjahyadi ef al. 1994). Oengan penanda m & u k
tefsebut, Vibt-io uji
dapat dibedakan dari VibW lain yang sehlurnnya tdah terciapat pada larva udang
atau air W
i
a pmeliharaannya sehingga esei pekkabn &pat dilakukan.
BAI-IAN DAN METODE
Bakteri dsn Plasmid
BaMeri dan plasmid yang digunakan pada penelitian ini disajikan pada
Tabei 1 .
Tabel 1. Galur baktcteri dan plasmid yang digunakan pada penelitian ini
Galur bakteri dan
Karakteristik yang relevan
Tipe liar
Tipe liar
UP
RF
gw, ~ m "
gfp', urn;
gfp*, Krn
G3::mini-Tn JOKrngfp, ~ m " gfp'
,
E* coll
DHSa
HB101
S17-Ihpir
F', lacZAMl5, hsdR17, m A l , gyrA,
thiRes-, Mod-, recA13, ~ m "
Pro", Red, ad'. r e d , diIisogeni
dengan bak t h f a g e hpir
Sumber/Referensi
Koleksi lab (Maros-Sulsel)
UuIelcsi lab (EondoCBati)
Kubksi b b fGandol-Bali)
Penelitian ini
Pmalitian ini
Penelitian ini
PenaBan ini
Penelitian ini
Penelitian ini
Penelitian ini
Sambrook ef al. (I
989)
Sambrook ef al. (1989)
l-lerrsro et a/. (1990)
Sukenda & Wakabayashi
tzml)
~ b ' rep*,
,
MCS p0luescript II , h" Kovac et a). (19%)
Cot E l replimn, tm*, ~ r n ~
D i et Eal. (1980)
Ptac dan gfp d i s i s p n pada MCS
Panelitian ini
pBBRfMCS2, Urn , gfp+
Identik dengan pUC18 dengan dua
situs unik Nan mengapit MCS
Vekfor integrasi kromosom hrnrnan
Tn5
pLUfKrn dengan
gfp tanpa promotok diklan di bagian
upstream kan, Km
PIac dan @p ffisisipkan pada MCS
Peneiitian ini
pUClbNot, ApR,gfp'
Plac dan gfp disisipkan p d a MCS
Panelitian ini
pUTmini-Tn5 SplSm, ApR,gfp",
swm"
P I ~ CA$,
,
DSR&+
Plac dan DsRed disisipkan pads
MCS aB8R-lMCSZ. ~m".
DsRed*
Ctontech
Penelitien ini
Isolasi M M o Kandidat Prubiotik
V l b h kanrficlat prokotik diisolasi dari berbagai stadia larva udang windu
dan media perneliharaannya, termasuk dari ku&ur pakan alaminya, di ternpat
pernbenihan udang, Labuhan, Pangandaran, dan Lamgung.
Masing-masing
sarnpl dimbar pada media seleMi Thiosulphafe Citmte Bi/&a#
Sucrose (TCBS-
agar, Qxoid) dan selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang (28-31)OC selama
BIQKONTROL,VtBRlQSXS PADA U R V A UDANG WINDU:
KQNSTRUKSX PENANDA MOLEKULER
DAN ESEI PELEKATAN
SEKOWH PASCASARJANA
XNSTXTUT PERTANlAN BQGOR
2004
WDANARNI, Penapisan BaMeri Probatik untuk Biokontrol Vibriosis pada Larva
Udang Windu: Konstruksi Penanda Malekuler dan Esei Pelekatan. Dibimbing
aleh AMTONIUS SUWAMTO, SUKENDA, dan BLSlANA WiDLYATI M Y .
BaMeri prubiatik untuk biokantrol vibriasis pada larva udang windu telah
diisatasi dari larva udang windu dan lingkungan perneliharaannya. fjampir
sernua isalat yang diperaleh dapat rnengharnbat pertumbuhan V. harveyi
patogen. lsolat SKT-b yang diisotasi dari Skeletonema efektif rnengharnbat
perturnbuhan V. harveyi dan secara signifikan dapat rneningkatkan kelangsungan
hidup larva udang windu. fsalat tersebut pada kunsentrasi 10~-10*
CFUlml tidak
bersifat patogen pada lawa udang. Masil karakterisasi rnenunjukkan bahwa
isalat SKT-b adalah blcteri Gram negatif, bersifat motil, brbentuir batang
pendek, kalaninya berwarna kuning pada media TCBS, dan bersifat menyebar
pada media SWC-agar. fsafat tersebut dapat rnenggunakan glukosa dan
sukrasa sekgai surnbr kart>on tetapi tidak dapat mqgunakan IaMusa,
rnenghasilkan enzim protease dan arnilase tetapi tidak rnenghagilkan kiiinase.
Hasil analisis sekuen sebaghan gen 1GS-rRNA msnunjukkan bahwa SKT-b
termasuk spesies Vibrio alginalytr'cus. Untuk mempelajari rnekanisrne kerja
SKT-b dalarn menekart serangan V. harvayi, khususnya brhadap komptisi
tempat pelekatan, dikonskuksi V. haweyi rekornbinan yang rnembawa gen gfp
sebagai pnanda rnobkuler. Koloni dan sel V. hanreyi yang rnembawa gfp pada
plasmid brinang fuas (pWGU1) rnenghasilkan pendaran berwarna hijau karma
produksi GFP. Keberadaan plasmid tersebut tidak rnempengaruhi prtumbuhan
dan patugenisitas V hanreyi,
Narnun dernikian, pWGOl tidak dapat
dipertahanitan V. harveyi pada media tanpa antibiotik dalam jangka waktu lama.
Oleh karena %u, dikonstfuksi tfansposan mini-Tn5 dan Tnf0 untuk menyisipkan
gen gfp Iangsuq pada genam V. h w o y i untuk mendapatkan V* haweyi gfp'
yang stabit.
Transposisi ke V haweyi rnenggunakan mini-Tn5 tidak
met~ghasil
kan transkanjugan walaupun dengan Tn70 diperoleh dengan frekwensi
yang retatif tinggi (lag). Satu transkonjugan hasil transposisi Tn10 dari
V. haweyi G3 yaitu GSTn#@fpdapat rnengekspresikan gfp dengan baik yang
selanjutnya digunakan daQm esei pebkt;an, Sel G3-Tnl@fp dapat diamati
lafigsung pada =furan wnwmaan larva udang dan populasinya pada pertahan
dengan pnambat~ariSKT-b lebih rendah dibanding tanpa SKT-t). Hat ini
menunjukiran kernungkinan adanya komgetisi tempat pieitatan atau sumber
nutrisi antara V. harvayi dan SKT-b, Aplikasi SKT-b pada larva udang rnelalui
Adernia yang diperiraya dengan SKT-b rnenghasilkan perturnbuhan yang lebih
tinggi dibanding kontral.
ABSTRACT
WIDANARNI, Screening of Probiotic Bacteria for Biocuntrol of Vibriosis in Tiger
Shrimp Larvae: Construction of Molecular Marker and Adherence Assay. Under
the direction of ANTONlUS SUWANTO, SUKENDA, and BIBIANA WIDIYATI
MY.
Probiotic ba&eria far biocuntrol of vibriosis were isolated from tiger shrimp
larvae and hatchery environment. Almost all probiotic isolates wuld inhibit the
growth of pathogenic Vibn'o haweyi. SST-b isolate from SkeIetonema was very
effective in inhibiting V, harveyi and significantly reduced larval mortaltty in
pathogen challenge assays.
These prospective probiotic bacteria, at
concentration 10'-10~ CFUfml, did not show pathogenicity to shrimp larvae.
SKT-b was Gram negative, short rod shape, exhibited yellow colonies an TCBS
and swarming an SWC-agar media, motile, utilized glucose and sucrose but not
lactose; produced extmcellular protease ancl amylase, but did not produce
&itinasen Partial sequencing of 16s-rRMA gene showed that SKT-b was similar
to Vib* algindyticus. To analyse mechanism of tiisease suppression by SKT-b,
especially on their competition for adhesion sites, we constructed recombinant
V. herveyi carrying gfp gene as a rnokufar marker. V. harvayi carrying gfp
don& in a broad-host range plasmid (pWGO1) resulted in green-fluarescent
colonies and cells due to the production of GFP, Growth cuwe analysis and
pathogenicity assays showed that the recombinant V. h a ~ e y exhibited
i
similar
growth profiles as the wild type parental strain and did not show alteration in their
pathogenicity. However, under nun selective long-term experiments without
antibiotic pressure, pWGO? was not staMy maintained in any V. harveyi strains
used in this study. Therefore we canstructed a mini Tn5 and TnIO transpuson
containing gfp gene to be inserted into V. hatveyfs genamic DNA to yield stable
transcanjugants. Tn5 transposition in V. harvejli strains did nut yield any
transcanjugants, although we could obtain relatively trigti ( 1 0 ~ transmjugans
)
employing Tn10. One uf Tn 10 derived isolate of V, harvoyi G3 ((33-Tnf Ogfp)
showed gfp expression and was further employed for adherence assay.
Fluorescent G3-TnPOgfp cells could be obwwed inside the digestive tract of
shrimp lanrae and fts population with SKT-b treatment was lower than without
pmbiatic, demonstrating possible cornpetitiun for adherence sites or nutrition
between V. harvsyi and SKY-b. ltrtroduction of S W b into shrimp tame through
SKT-Mnriched Ademr'a resulted in higher growth rate than the mtrol.
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya rnenyatakan bahwa disertasi yang berjudui:
PENAPISAN BAKTERI PROBlOTlK UNTUK 810KQWTR01, VIBRIOSIS
PADA LARVA UDANG WIHDU: KONSTRUKSI
PENANDA MOLEKULER
DAN ESEl PEEKATAN
Adalah benar merupakan hasil karya sendiri dan belum p m a h dipublikasikan
orang lain. Semua surnber data dan infwmasi yang digunakan ielah dinyatakan
secara jalas datr ciapat diperiksa kebnarannya.
Bogor, Mei 2004
PENAPlSAN W R I PROBIOTIK UNTUK
BIOKOMTRUL VlBRlQSIS PADA U R V A UDANG WXIYDU:
KUNSTRUKSI PEWNDA MOLEKULER
DAM ESEl PELEKATAN
OLEEI:
WIDANARNI
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memptofeh gelar
Ooktar pada
Program Studi Biobgi
SEKOUH PASCASAWANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2004
Judul Uisertasi
: Penapisarr
untuk
bakteri probiotik
biakuntrai
vibriosis pada larva udang windu: konstruksi
penanda rnolekuler dan esei pelelcatan
Narna
: Widanarni
NRP
: P17600007
Program Studi
: Biologi
Prof. Dr. ir. Antonius Suwanto, MSc
Ketua
_C_C.''
Prof. Dr. Dh. Bibiana W. Lay. MSc
Anggota
2. Ketua Program Studi Biaiagi
A D e k a n !Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Dedy Duwadi S., DEA
7
Tanggal lulus:
MSc
Penulis dilahirkan di Blitar pada tanggal 27 September 1967 dari ayah
Goded Nistamar dan ibu 5ri Muharti. Pendidikan sarjana di tampuh di Program
Studi Budidaya Perairan, Fakuttas Perikanan dan llmu Kelautan (PB, lutus pads
tahun 1991.
Pada tahun 1992-1993 penulis mengikuti research student di
Laboratory of Fish Phydogy, Depattment of Fisheries, Facufiy of Agricuftum/,
University of Tokyo, Jepang. Pada tahun 1996, penutis diterima di Program Studi
Bialagi pada Program Pascasarjana 1P8 dan rnenamatkannya pada tahun 1999.
Kewmpatan untuk rnelanjutkan ke program doktar pada program studi dan pada
perguruan tinggi yang sama diperoleh pada tahun ZQOO. Beasiswa pendidikan
pascasarjana diperoleh dad Departemen Pendidikan Nasional.
Penulis k k e j a sebagai stat pengajar di Departemen Budiiaya Perairan,
Fakultas Perikanan dan llmu Kelautan, IPB sejak tahun 1994. Pada tahun 19961998 penulis rnenjadi peneliti utama pada Riset Unggulan Terpadu (RUT IV)
bidang Teknolugi Hasii Pertanian dan Rise! Dasar pada tahun 7999-2000.
Selarna mengikuti program 53, penulis rnenjadi anggata Perhimpunan
Mikrubialogi Indonesia. Bebrapa b r y a ilrniah yang telah dihasilkan selama
pnulis mangiituti program 53 antam lain: (9) Genetic diver*
of ampicifIin
resistant Vibm isoiated fmm various stages d shrimp larvae devefopmeni, telah
diterbitkan pada jurnal Biotropia (15:3647) )add tahun 2WU,(2) Skrining isalat-
isolat Vibrio untuk biakontrat vibriosis pada larva udang windu, telah disajikan
pada Seminar Nasional Crustitacea ke-2 di Bugor, pada bulan Agustus 2002,(3)
Construction of recombinant Vibriu harveyt to study its adherence and
pathogenic@ in shrimp larvae, trttah disajikan pada 9 Symposium on Diseases
in Asian Aquaculture di Queensland, Australia, pada bulan Desamber 2002 dan
selanjutnya akan diterbititan pada jurnal Diseases in Asian Aquaculturn, (4)
P&cy
of Vibrio isdates for biocontrol of vibn'osis in tiger shdmp (Penaeus
monodon) lawae, telah diterbitkan pada jurnal Biotropia (20:11-23) pada tahun
2003 dan (5) Mo/ecu/aranalysis of pmbiatic bacteria fur bimnfrof of vibn'asis in
shrimp larvae, telah disajikan pada Marine Biotechrtology Conference di Chiba,
Jepang, pada bulan September 2003.
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, atas rahrnat dan
hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan peneliian dan penulisan disertasi
dengan judul: Psnapisan balrteit probiotik untuk biokontral vibriosis pada
larva urfang wtndu: konstruksi penanda malekufer dan emi pelekatan,
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis
sarnpaikan kepada Prof. Dr. Ir. Antonius Swanto, M Sc sebagai gum dan
pernbirnbing, atas bimbingan clan arahan yang diberikan sejak kuliah,
penyusunan proposal, pelaksanaan pmalitian, dan penulisan d i r t a s i ini. Beliau
jugs telah memberi kesemgatan cian kepercayaan kepada penufis untuk
mernbantu dalarn proyek penetitian rnengenai "frubiotik untuk Udang" yang
didanai ofeh DlP SEAMEO-BIOTRQP dan Intemasionaf Foundation for Science
(IFS), Sweden, sejak tahun 2001 hingga 2003.
Atas birnbingan yang sangat
intensif dari bliau pula sehingga bebrapa bagian dari dimrtasi ini dapat
disajikan pada seminar internasbnal serta dipublikasikan pada jurnai
internasional.
Penuiis juga rnenyarnpaikant&ma kasih dan penghargaan yang setinggi-
tingginya kepada: Dr. lr. Sukenda, MSc dan Prof. Dr. Dh. Bibiana W.Lay, MSc
sebagai guru dan pernbimbing, am birnbingan dan saran yang dibtiiran sejak
kuliah, penyusunan proposal, pelaksanaan penelitian, dan penulsan disehsi ini.
Kepada Dr. Ir. b d y Duryadi S., 0€A sebagai W u a Program Studi Wiologi
penulis juga menyampaikan tetirna kasih atas birnbingan dan nasihat yang
dikrikan. Ucapan terirna kasih juga penuiis sampaikan kepada Prof, Dr, Takashi
Aoki,
Or. lkuo Hirona, Dr. Tsuyushi Ohira, dan Ryasuke Yasawa, Laboratmy of
Genetics and Biachemistrj,l Tu&o Unive*
of F:ish@n"Bs,atas bimbingan dan
fasilitas yang diberikan untuk keperluan dakurnentasi fluoresensi,
Ucapan terima kasih yang sebsar-besamya juga penulis sampaikan
kepada: Rektar lnstitut Pertanian Bogor dan Dekan Sekolah Pascasarjana lP8
atas kesernpatan yang dibrikan untuk rnengikuti pendidikan di Sekolah
Pascasarjana IPB; Direktorat Jenderai Pendidikan Tinggi rnelaiui BPPS yang
telah rnernbrikan biaya pndidikan; DIP SEAMEO-BfOTROP dan IFS yang telah
menanggung sernua biaya penelitian; dan Direktur SEAMEO-BIOTROP yang
blah rnenyediakan fasifitas pranelitian pada Labaratorlurn Biologi Malekuler.
Kepada ternan-teman mahasiswa: Bu Nyurnan, Bu Selly, Mbak Ella,
Mbak Etty, lrawan, Yogi, Pak Hem, Pak Mardi, Yusuf, Peter, Nana, Cecil, Bu hi,
Esti, Wiwit, dan adik-adik mahasiswa S-1 serta teknisi Pak Huwn dan Pak
Ran&, penulis rnengucapkan terirna kasih yang sebesar-besamya atas banban
clan kerjasarnzt yang baik selarna pelaksanaan penelitian di Laboratorium Biologi
Molekuler, SHMEG1310"FROP dan Laboratoriurn Kesehatan Ikan, Fakultas
Perikanan dan ltmu Kelautan, 1PB.
Ucapan terima kasih penutis sampaikan pula kepada Dr. Ir. Ketut
Sugama, MSc dan Dr. !r. I Wayan Teguh Wibawan, MSi sabagai penguji tuar
kornisi yang telah rnemkrikan krifik dan saran &mi perbaikan disertasi ini.
Terima kasih yang tulus pnulis sampaikan kepada Ayah, Ibu, Nenek,
dan adik-adik atas daa dan kasih sayang yang dihrikan demi kesuksesan studi
penulk. Ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis
sarnpaikan kepada suami tercinta Prof, Dr. Ir. Muhammad Zairin Jr, MSc yang
dengan setia dan sangat sabar rnendarnpingi penulis dan rnernbimbing anak
anak kami tercinta Gentiga Muhammad Zairin dan Dwiputra Muhammad Zairin.
Kepada sernua pihak yang tefah rnembantu dan tidak dapat disebutkan
satu prsatu penulis msngucapkan terima kasih atas segata bantuannya,
sernoga Affah SWT akan rnernberikan balasan yang setimpal, Amin.
Penulis
Patogenisitas Vibn'u Kandidat Probiutik ............................................................ 37
Uji fn V h V i r i o Kandidat Prabiutik ................................................................. 39
Konstruksi dan Esei Penggunaan Penanda gfp pada V. harvtayi ......................43
Konstfuksi Plasmid Pernbawa DsRed untuk Vibrio SKT-b ............................. 53
Esei Pelekatan V. harveyj dart Vibrio SKT-b pada Larva Udang ...................... 54
Aplikasi Vibrio SKT-b pad# Lawa Udang Melatui Pengkayaan Artemia ........... 60
a. Pengkayaan Artemia dengan Vjbria SKT-b .........................................60
b. Patogenisitas Vibrio SKTb pada Artemia .............................................61
c. Pertumbuhan dan Kelangsungan Hidup Larva Udang Windu
dengan Pengkayaan Artemia ..................................................................... 62
.........
............64
KaraMerisasi dan Identifikasi Vibrio SKT-b ...................
.
.
.
KESIMPUIAN DAN SARAN
............................................................................ 66
Kesirnpulan ...................................................................................................... 66
Saran ............................................................................................................. 67
DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................
68
No.
Teks
Halaman
.1. Galur baMeri dan plasmid yang digunakan pad#
penelitian ini ...............................................................................................
17
2. Sandi dan asal isoiat VibriQ kandidat probiotik yang
digunakan dalam penelitian ini ..........................
.
.
.............................31
3, Patogenisitas V. harveyi R ~ Rdart tipe liarnya ............................................ 35
4. Uelangsungan hidup larva udang windu pada uji
patoganisitas Vibrio kandidat probiotik .....................................
... . . . . . . . . . .38
5. Patoganisitas V. hatveyi (pWGOl) dan tipe liarnya .....................................
6. Transposisi pWGU3 dad E. d i S 17-3Apir ke V. haw@
dan R. sphaemides2.4.1
........................................................................
47
50
'7. Transposisi pLOFKmgfp dari E. cofi ShRIQ,kpir ke
V. harveyidan SKT-b ............................................................................... 51
8. Perturnbuhan b
u
m dan prnnjartg larva udang windu
pada pedakuan kontral dan Vibrio SKT-b selarna dust
minggu pemeliharaan,................................................................................. 62
9. Jurnlah Vibrio SKT-b di air media pemeliharaan clan
lama udang windu pada awal dan akhir percobaan.................................... 63
No.
Halaman
Teks
1 . Diagram seleksi bakteri grabiotik untuk perneliharaan larva hewan
akuatik (Garnez-Gil dan Raque, 1998) ....................................................... 14
2. Konstntksi plasmid parnbawa gfp (pWGO1) untuk ekspresi
ekstrakromosorn pada V. h a a ~ y .........................
i
.
.
.................................21
3. Konstruksi plasmid perantara pembawer gfp (pWG02)
...............................
23
4. Konstruksi ptasrnid pernbawa gfp untuk transposisi berdasar Tn5 .............. 24
5. Konstruksi plasmid pembawa &Red (pM0-3)...........................................
26
6. PenampiIan Vibna kandidat probiotik pads media TCBS-agar (A)
dan SWC-agar (8).....................
.,.,.
.......................................................... 32
7. Profil DNA genorn V. hanreyi G3,G?,dan MR5339 berdasarkan
hasil pmotangan dengan endm restriksi Notf. M adalah DNA
genom Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 yang dipotong dengan
enzim restriksi Aset sebagai marker............................................................32
8. PenampiIan V. harveyi pada media TCBS-agar yang diamati
pada kandisi twang (A) dan gefap (B) ........................................................
33
9. Perbandingan perturnbuhan V. fiarveyi @ dan t i p liarnya (wt) ................. 34
10. Pewhambatan
V. haarvyyi MR5339 RP oleh Vfbria kandidat
. .
probrotrk pada uji in vitro ...........................................................................
36
lI.
Ketangsungan hidup larva udang windu pada uji patogenisitas
dengan berbgai tingkat konsentrad Vibrio SKT-b ..................................... 38
12. Ketangsungan hidup larva udang windu pada uji h vivo Vibrio
kandidat probiotik ............................ ,
......................................................... 39
13. Jurnlah sel Vib* sp. dan V. harveyi MR5339 RP pada air media
pernefiharaan larva udang ................... ,
.
...................................................41
14, Jurntah sel Vi6rio sp. dan V. harveyi MR 5339 W s e ~ t a
akurnutasi larva mati pada uji in vivo ..............................
................. 42
l 5 . Plasmid rekornbinan pWGO'I. M: marker l kb Ladder,
1: pSKLU1-EmRf 2: pBBR1MCS2-EcoR t 3: pWGOt -EmRI ..................... 44
.
.
16. PenampiIan kafani (A) dan sel(8) E. cdi OU5a (pWEO1) yang
diamati dengan rnikroskop fluaresen ...........................
. , . .................... 44
17. PenampiIan set V. haweyi (pWGO1) yang diamati dengan mikroskap
fluwesen ................................................................................................
45
18. Perbandingan perturnbuhan V. harveyi (pWGO?)dan tipe liarnya
.................................................................................................................. 46
19. Stabititas plasmid pWGO4 pada V. harveyi MR5339,G3, clan G7
....................................................................................................................
47
20. Plasmid rekarnbinan pWG02 dan pWG03. An: marker 1 kb Ladder,
I:gSKL0.t-EcoRI, 2: pUC'l8Rl~i-€coRl,3: ~ W G U ~ - E C O R ~ ,
4: pWGO2-Notl, 5: pUTminiTnSSplSm-NO&6: pWE03-#dl ...................... 48
21. Penampilan kulani (A) dan sel(8) E coli DHSa (pWGO2) yang
diarnati dengan rnikroskop ftuaresen ........................................................ 49
22. Penampitan koloni (A) dan el (8)E. cdiS17--11pir (pWG03)
yang diamati dengan rnikraskop fluaresen .......................................~......... 49
23.Penarnpilan kolafii (A) dan sel(0) V. harveyi G3-Tn 1C)gfpyang
diamati dengan rnikroskup fluoresen ..........................................................
24. Konstruksi gfp pada pLOFUmgfp (Stretton et a/..,1998)
51
............................. 53
25. Prafil DNA genorn bebrapa mutan V. harveyf G3 (M: marker
R. sphaemides 2.4.1 yang dipatong den an endm restti ksi Asef ,
1 dan 8: G3 tipe liar, 2: G%Tnl@fp (Km dan mengekspresikan
........-,.......
............................. 52
gfp), 37:mutan G3 (KrnR) ...................,
.
W
26.Kelangsungan hidup larva udang windu pada uji patogenisitas
V. harveyiG3 tipe liar dan G3-TnfOgfp ......................................................
52
27.Stabifitas gfp pada V. harveyiG3-Tn f Ugfp dan G3 f pWGO1) ................... 53
28, Penarnpilan sei E, &/ DHficx (pWRO1) yang diamati dengan
rnikroskop fluoresen ..................................................................................
54
29.Usus l a m udang wincju pada bebrapa perlakuan-inokutasi
V. harveyiG3-TnfqXfp ................................................................................
55
30.Usus larva udang w i d u yang dikolonisasi dengan V. harveyi
G3-Tn f Qgfp ................................................................................................ 56
31. Poputasi V. harveyi G3 RPdi air media perneliharaan, larva
hidup, dan larva mati pada perlakuan dengan penambahan
SKT-b ~ f f dan
f tanpa SKT-b R ~ R..................................................................
57
32. Poputasi V. Aarvayj G3 RPdi air media pernelihara-dan,larva
hidup, dan larva mati pada prlakuan dengan penarnbahan
SKT-b RPdan tanpa $KT-b RPselama 5 hari pengarnatan ...................... 58
33.Jumfah Vibrio SKT-b pada Artemia selarna 6 jam masa
pengkayaan ...........................................................................................
60
34. Kelangsungan hidup Arfemia pada uji patogenisitas
Vibrio SKT-b ........................................................................................... 61
35.Kalangsungan hidup fawa udang windu pada perlakuan bntrol
dan Vibrio SKT-b selarna dua rninggu pemeliharaan ...................
.
.
.
...
64
PENDAHULUAN
Udang windu (Penaeus monadon), rnerupakan salah satu kornoditas
ekspor unggulan Rasil perikanan. Pemerintah, rnelalui Program Peningkatan
10.19 milyar dari perikanan, Dari jurntah tersebut sebagian besar digantungkan
kepada budidaya udang yang diharapkan rnarnpu menyumbangkan devisa
sebanyak US $6.79 rnifyar (Basoeki 2000).
penunman k u a l h lingkungan budidaya masih rnerupakan icendala utama untuk
rnencapai tujuan tersebut. %rangan penyakit bairterial pada tingkat pemknihan
yang paling &us
dan sering rnenyebabiran tetjadinya kematian massal pada larva
ltdang windu adalah serangan b a k t d bwpmiar yang diideiWikasi -ai
Vibh
harveyi (Lavilla-Pitogo et a/. 11990;Karunasagar ef a/. I994; Ruangpan et a!. 1998).
Baktwi ini p d a umurnnya menyerang larva udang pada sMia zma, m p i s dan
awal pascalanra (Lavilla-Pitogo ei a!. 1990) sehingga rnerupakan kendala dalarn
pnyediaan bmih udang yew sehat dahm jurnlah b a r yang diperlukan untuit
tenrs-menerus dengan dosis suboptimat tefah naengakibatican
harveyi menjadi
resisten (Karunasagar et a/. 1994; Tjahjadi et a/. 1994; Teo et a!, 2000).
Penggunaan vaksin juga suli diterapkan karma galur V. hwveyj yang menyerang
larva uclang sangat kmriasi (Suwanto ef
at/.
41998). *lain
iki, degradasi vaksin
yang diserap rnerupakan masatah lain disamping beragamnya galur V. haweyi
patogen (Alabi et a/, 1999).
Dengan adanya kehmahan-itelmahan dad brbagai upaya yang telah
dilakukan, pmggunaan bkteri prubiik sebagai agen biontrctl pada pembenihn
udang menawatltan atternatif p r n m h a n untuk menanggulangi pernasalahan
Dasar penclekatan ini adalah dengan rnenggunakan aldivitas
tersebut.
rnikroorganisrne yang dapat rnenekan atau rnengtrarnbat prturnbuhan V, haw8yi
tanpa menirnbulkan darnpak bumk terhdap sistem keseimbangttnekolqis rnikrob.
Cam ini tefah terbuMi brhasil dan banyak cjigunzrlran pada usaha hewan tsrnak
(Fuller 1992; Ohhim et al. 11996), narnun k r u akhir-akhir ini diteliti untuk
ciiapliicasikan pada sistern hdidayia perairan, rnisalnya gada bucfiaya ikan
(Skjemo dan Vacistein 3999; Gram ef a!. 1999), ktsrang-kerangan (Dwtlbt dan
Langdon ? 9W;Riuelme et BI. 1997)dan udang Fjahyadi et a!. 1994; Rengpipat ef
a/. I.9gSa, f W b , 2000;GOMBZ-GiIet a[.ZQOQ),
M u r u t Blmrnberg et a/. (19931, tahap pelakatan bairteri patogen pada
tubuh inang mtupahn prasyarslt yang akan rnenerttukan k-asilan
bakteri
tersebut dalarn mlakukan kolonisasi dan rnensek~sikanfaktor-faktor virulensi.
Virulensi V. harveyi m i t a n dengan protein ekstraseluk dan turninesensi yang
diatur secara krsarna metalui mkanisrne quwum sensing interselubr (Manefield
%ta/. 2800).
Adanya kmpetisi tempat plekafan antara V. haw8yi &wan baM&
problotiic pads tubuh udang diharapkan dapat m e w a h tercapainya quonrm
sen-
sehlgus s e b Faldar-faker virubnsi. Dewan dmikian, bawd yang
rnarnpu rnenghambat pelekatan, kolanisasi clan prkurnbuhan V. harvsyi swta tidak
bemifat patqen terhadap larva udang, patensial digunakan set3agai biokontrol
untuk melawan Vibrio patogen tersebut.
Karena tam laclang bbas V i m tidak &media (Warneed t 993;Widanarni
dan Suwanto 20001,maka untuk mehkukan esei pelekatan V. harveyi p d a lawa
&ng
diperiuiran pnailda molekukr sebagai gen pelapw. Satah satu p a &
rnabkuler yang swing diunakan untuk menelaah amitas bakteri di lingkungan
3
adalah gen gfp (green ffmsc3ent protein) (Manning 1997; Janssan 2003). Gen
tersebut jika terekspresi akan menghasilkan protein GFP yang h w n d a r hijau jika
diarnati dengan cahaya W (Tsien 1998), sehingga pengarmatan ekspresinya relatif
mudah.
Selain itu, -ai
pnanda rnoMukr gen g@
rnerniliki bebrapa
keuntungan, antara lain tidak rnernbutuhkan kofaktar atau penamkhan substrat
untuk visualisasinya, sensitif, stabil, firfak toksik, setttn tidak mengganggu fungsi dan
peftumtwhan sel (Jmnhans et a!. 1998; Ling et a/. 2000). Penanda resisten
terhadap antibiotik rifampisin juga dapat digunakan untuk V. harveyi kafena pada
urnurnnya Vibnio t m & &
sensitif terhaclap antibiotik rCfarnpisin frjahyadi et al.
1994). m
a
nmama mabkufer tersebut, V B h uji dapat dibedakan dad V i m
lain yaw sebeiurnnya telah terclapat pada larva udang atau air media
pemeliharaannya mhingga esei pelekatan d a m dilakukan.
Tufuan
Pemlitian ini bertujuan untuk;:
1. Mernpfajari kemampuan genghambatan
Vibri0 kandidat probiotik
tertradap pertumbuhan V. harveyi patogen pada larva udang.
2. Memplajari pelekaian dan patogenisitas V. harveyi pada larva udang
menggunakan gensnda maleiruler sebagai gen plapur.
3. Mempelajari penggunaan pnanda molekuler dalam essi pefekatan unkrk
penapisan baMeri prabiotik.
Kegunaan Penelaan
Pemlitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai suatu metode unkrk
menguji patogenisitas V. harveyi pada larva udang windu dan juga sebagai suatu
metode untuk menapis bakteri probiotik yang patensial rnarnpu rnenghambat
Vibrio patogen.
Secar-d keseluruhan, hasii pnetitian ini diharapkan dapat
rnernhrikan infomasi penting daiam usaha pnanggulangan penyakit vibriosis
pada larva d a n g windu di indanesia.
Wbrfo hanreyi dan Penyakit Udang Berpandar
V. harveyt adalah bakteri yang hidup di lingkungan perairan laut, dan
termasuk bakteri yang dapal berpendadar (Baurnann et al. 1994). Beberapa nama
lain dari bakteri ini adalah Beneckea haweyi dan Lrrcibactefium haweyi, dan
kernudian diwbut sebagai Vnhhffeyi atau V. carcireriae (Pedersen et al, 1998).
Ciri-ciri morfologl dan ffsiologi V. harveyj pada medium NrPtrien Agar
dengan NaCl 1,596 dan seawater cempIet8-agar fSWC-agar) antara lain: benkrk
koloni bulat dengan etevasi cembung, krwarna krem, clan diarnsternya 2-3 mm
setelah inkubsi 24 jam pada suhu 28°C. Jika diamati di ruang gelap, V. hhweyi
tarnpak berpendar dan pendarannya ,dapat bedahan hingga 2-3 hari.
Bakteri
tersebut termasuk Gram negati, sd tunggal b h n t u k M a n g pendek, bemifat
matil, aksidase pasitif, sensitif tehaclap uji vibriostatik 011 29 (2,4-diamina67, diisopmpylpfen'dinephosphate), tidak
r n m b n t uk gas dari fermentasi
terhadap 0-glukasa, tidak marnpraduksi H2S, tumbuh pada media dfangan
penamkhan 1 hingga 6% NaCCf, dan mernpunyai flageta pada salah satu kutub
selnya (Baumann et a!. Ig94; Lavilla-Pitoga ef a/, 1.990;Suwarrto et a!. 1998).
Pada medium sefektiif untuk genus Vibrio, y&u TCBS-agar {ThiosuIfafe
Carate Bile-Safi Sucrose), kolani V. harveyi be~warnahijau dan hrpendar jika
diamati pada ruang getap (Lavilla-Pitogo ef a!. 1990), Kemarnpuan berpendar
merupakan hasif aktivitas enzim luciferase yang dapat brfungsi sebagai
katalisator dalam proses oksidasi reduksi.
Proses oksidasi rnefibatkan flavin
rnononukhticla dan a k h i d alifatik rantai panjang sebagai sutsstratnya.
rnononukleotida dan asam lemak disertai dengan pelepasan ernisi cahaya
dangan panjang gelombang sekiar 490 nm. Gengen yaw msngkodskan fungsi
perpendaran ini disandikan datam suatu aperun yang disebut dengan owran lux
(Meighen 1991; Ruby 1996).
V. haweyi pada urnumnya bersifat patagen apartunistik, yaitu organisme
yang dafam keadaan
normal ada dafam lingkungan pemeliharaan dan
bekernbang dari sifat saprofitik menjadi patogenik apabila kondisi lingkungan
dan inang rnemburuk. Pada saat tejadinya wabah, populasi bakteri ini dapat
rneningkat menjadi ribuan kali dalarn wadahlbak pemefiharaan larva, dan ha1 ini
tejadi setelah usaha budidaya udang windu Writembang semra intensif (LavillaPitoga ef a/. 1990). Menurut Saulnkr et a!. (2000) beberapa gatur V. harveyi
rnenrpakan patogen wbnamya dan penyebab utama penyakit vibrbsis pada
udang windu.
Kesimpulan tersebut diambil tserdasarican studi virulensi dari
beberapa galur V. harveyi yang diisalasi dari larva sekarat (man'bund) dan
diinfeksikan kmbafi pada udang sahat.
Beberapa dari gafur tersebut dapat
manyebabkan kematian total larva udang dengan dosis yang sangat rendah (102
CFU/ml).
Di antara spies-spsies bakteri k p n d a r yang diisolasi dari areal
pertarnbakan udang, panti-panti prnbenihan, dan pada tubuh udang yang
sekarat, V, harvayi adalah spesies yang paling =ring dapat dlsolasi daripada
spesbs Vr'bn'o fainnya (Ruangpan 1998; Tendencia dan da la Pena 2001).
Bakteri ini juga dapat diigolasi dari air, kotoran dan sitsoskeleton induk udang, air
penetasan gaitan alarni, Arfemia, serta dari usus udang sehat (Lavilla-Pitogo
et a/. 1982). Bebrapa pneliti rnenyatakan batrwa penyakit vibriosis terjadi
karena adanya infeksi sekuder oleh patogen oportunistik.
Sedangkan
penyebatr utamanya adalah infeksi oieh patogen lain, defisiensi nutrisi, kondisi
lingitungan, dan stress (Lavilla-Piago et a!. 1992, Lihtner eta/+1992).
Di Indonesia, wabh penyakit akibat serawan V. hanreyi krpenclar
dilapofkan tejadi di panti-panti pernbnihan yang terdapat di Jawa f imur, Jawa
6
Tengah, Jawa Barat, Sumatera Utara, dan Sulawesi Selatan (Tjahjadi et a!. 1994;
Prayitno dan Latchford 1995; Suwanto et a!. 1998). Di negara lain wabah
penyakif in! juga terjadi di Thailand (Pasharawipas et a!. 1998), di Philipina
(Lavilla-Pifogo at a/. 1990), dan di India (Karunasagar et a!. 1994). W a h h
penyakit ini pada umumnya rnernuncak pada rnusirn penghujan (Lavilla-Pitago
et at. t990).
Sejumlah pnelitian rnenunjukkan bahwa pnggunaan antibiotik untuk
pernberantasan penyakit vibriasis telah menysbabkan resistensi bsakteri Vibria
terhadap bebrapa jsnis antibiotik (Tjahjadi ef al 1994;Kanrnasagar et a!. 1994;
Teo et a!. 2000; Tendsnda dan de fa Pena 2UU1). Penggunaan anfibitik juga
iturang efektif itarena V. harveyi dapat rnernbentuk biafrfm yang dapat rnelindungi
sel-sel bakteri ifad bahan aktif antibiotik dan desinfektan sehingga tetap hidup
{Karunasagar et a!. 1996).
Penggunaan vaksin dan irnunostimulan untuk
rnengelrclalikan penyakit vibriosis ternyata dapat mengurangi tingkat kmatian
ikan dan udang (Vadstein 1997; Devaraja ef al. 1998; Alabi ef a/. 1999). Akan
tetapi tidak sernua s p i e s Vibrio penyekb penyakit vibriasis dapat dikermdalikan
dengan rnenggunakan vaksin, oleh karma sering kali galur-galur Vibrio dalam
satu spesies tidak hornogsn. Hasil penelitian Swanto et a!. (.1998)
rnenunjukkan
k h w a galur V. harvayi berpendar yang wnyerang farva udang sangat
bewafiasi pada musirn dan takasi yang k W a , sehingga suli memtukan
galur yang tepat sebagai bahan vaksin.
Petekatan clan Patownisitas V, frameyi
Menurut Bloembrg tat d. ((1993),
tahap pekkatan bakteri patogen pada
inang merupakan pcasprat yang akan menentuhn kekrbsilan baM& tersebut
dalam mebkukan $colonis& dan rnmsekresikan fairtor-faMw virubnsi. Virulensi
V. haweyi b e h i i n dengan protein ekstraseluler dan lurnimnsi yang diatur
secara bbersama deh rnekanisme q m m sensing interseluk (Harris dan Owens,
1999), sehingga penggunaan senyawa yang brsifat antaganis terhadap signal
i n t d u l e r tersebut potwsial untuk mqontrol %Pangan V. harveyi pada larva
udang (Manefield et a/. 2000).
Quorum sensing pada V. hafveyi terjadi dengan rnenggunakan senyaw
acyf Iromosffnne lacton (AHL) tertentu, ya kni N-(3-fiydoxybut~noif~L-homose##e
factone (HBHL) sehgai sinyalnya (Whitebad et a/. 2001). Bila jumlah sd kkteri
telah mencapai kepadatan tertentu maka HBHL itu akan rnernbentuk kornwks
dewan protein pengaktr khusus yang akhirnya krfungsi untuk mengaktiin
skspmsi sejurnlah gen-gwt wnyancli emimn;rim untuk luminesensi, s d m
kiinase, dan protease ektrasetuler, serta MQT-faktw patagenisitas lainnya
f Manefrefd et a!-2000:Whitehead et a!. 2001). Oengan dernikian, adanya karnpetisi
tempat pekkatan antam V. harveyi clan hkteri probiotik pada
larva udang
diharapkan dapat rnencegah tercapainya q u m sensing sekaligus sekresi fakturfaktor vintlensi.
Menun&Whitehead et al. (2001), V. haw~yirnerniliki kbih dati satu quorum
sensing dengan dua rnokkul sinyaf, yakni rnolekuf sinyal Ai-l dan Ab2. Molekut
sinyal Al-l digunakan untuk komunikasi intm-specks (dalam satu s p s k s )
sedangkan Al-2 untuk komunikasi inter-specks (antar s p s k ) .
Lebh lanjut
dijelaskan bahwa banyak s p i e s lain seperti V. & d m , V. p a r a h ~ ~ k u s ,
V. an@i/~~tlm,
V. a l g i ~ i a r s V.
, nahgens, d m Phdobacferrum pbsphmum
juga rnsnghasilkan molekul sinyaf dengan aktivitas seperti A!-2.
Bahkan hasil
analisis lebih lanjut menunjukkan bahwa N-2 yaw dihasilkan oleh E. cdcofi,
SalmmIfa typhimurium, dan V. chdera merniliki homologi yang sangat tinggi
dengan Al-2 V. bweyi. ihngan demikian, anfara V. harveyi dan bkWi kandiia£
prubiotik yang aitan diujikan s&a
dengan baMeri lain yang ada p d a larva udang
kmungkinan akan terjadi saling komunikasi m a n efek bmtipik yaw belurn
diketahui. Hal ini karena hrbagai fungsi bakteri seperti faktor vintbnsi, transfer
DNA dengan kanjugasi, simbiosis, dan produksi antibiotik dikwrtrol oleh rnekanisme
quorum sensing (Bassbr 2003).
Lavilla-Pitogo et al. (4992) melaporkan bahwa ko#onisasibakteri tarjadi
khusus pada organ-organ saluran pencemaan dan jarang diternukan pada
aksaskeletun. Penggunaan teknik antibodi flouresen menunjukkan bahwa
V. vulnificus berada pada hernotimfa dan saluran pencemaan udang windu (Sung
dan Sang 1996). Hasil penelitian Soto-Rodriguez et a!, (2003)rnenggunakan
pnanda
5-(4,6-dicAIomfn'azi17-2-y
t)
aminoflu~~esceh (5-WAF,
D-16),
rnenunjukkan bhwa V. harveyi meqkolonisasi saluran pencemaan larva (zoea
dan mysis) udang vaname
(Litopenaeus vannelmefl. V,/,harveyijugs diketahui
memilih aaittivitas enzim kitinase, protease, dan lipase (Baurnanrt et a/. 19%).
Endm kitinase memungkinkan bagi
harveyi untuk menguraikan Kitin dan
krkolonisasi di dalarn tubuh larva udang windu.
Salah satu mekanisms yang rnungkin terjadl untuk men-ah
blonisasi
baMeri patogen pada inang adalah dengan rnenarnbahkan bakteri lain yang
rnarnpu krkompetisi dengan bakteri patagen dalam rnendominasi ternpat
plekatan (Verschure faf sf. 2000), tee et al. (2000) manambahkan bahwa
keWhasiIan baktwi probiotik berkomptisi dengan bakteri patogen ditentukan
hrdasakan kernampuannya mengkolonisasi inang dsngan melakat pada
mukosa usus. Dengan demikhn, VibrEo sp. yang rnampu mengtrambat pelekatan,
kohisasi, dan pefturnbuhan V. harvsyi serta tidak bersifat patogen terhaclap larva
udang, potensial cfigunakan sebagai Wukontrol untuk melawan V i b h patogen
tersebut.
Narnun dernikian, kernungkinan bkteri probiatik m j a d i patogan juga
p d u dipehjari karena V. a@ind@cus yaw tdah disarankan sebagai bakteri
probiotik Mapi galur lain dari bakteri ini tmyata &pat menyebabkan vibriosis p d a
ikan, udang, dan Arfemiia (Gomez4itl et al. 2 W ; Vilfamil et a!. 2003). Okh karena
itu, karaktwhsi dan identifiicasi baketi probiotik pmting dilaitukan untuk
memkdakan dengan galur lain yang patensial bemifat patqsn. Karakterisasi dan
identifikasi juga pnting dilakukan unkrk kontrol kualitas dan kebutuhan paten
(Garnez-Eill et al. 2UU0).
B a k d Prubiotik wbagaf Agen Biokontrol pada Larva Udang
Menurut fuller (19921, probiotik adalah rnikrab hidup yang ditambsahkan
ke dalam pakan yang dapat rnernberikan pengaruh rnenguntungkan bagi hewan
hang dengan rnernperbaiki iceseimbangan rnikrob ususnya.
akuatik, =lain
Pada h e w n
saluran pencemaan, air di sekeliling organisme tersebut juga
memegang peranan penting. Sehingga probiotik untuk hewan akuatik adalatr
age# rnikrob hidup yang mernhrikan penganth menguntungkan pada inang
dengan rnernocfifikasi komunitas mikrob atau berasosiasi dengan inang,
menjamin perkikan dalam penggunaan pakan atau memperbaiki nilai nutrisinya,
rnernperbaiki respan inang terhadap penyakit, atau memperbaiki kualitas
lingkungan arnbangnya (Verschuere et a!. 2000).
Biakantrol menunrt @mz-Gil
ef a/. (2000) adabfr penggunaan rnusuh
alarniah untuk rnengumngi kerusakan yang disebabkan oteh organisme krbahaya
sampai tingkat y a q &pat di&&rir, atau lebih tepat lagi pengaturn papulasi
penyakit ofeh musuh alamiahnya. L&ih lanjut ditamkhkan bahwa komunitas
mi&& di dalarn saluran p m a a n hewan sampai batas tertentu membri
ketahanan atau perlinduwan terhadap penya)rit. Demikian pula pacla populasi
alamiah hewan akuatik, rnikrobiota di dalam saluran penceman dapat
menmrminkan fingkungan akuatik ternbut. Narnun demikian, pada perneliharaan
larva dengan icepadatan tinggi di &lam wadah Widaya, keseimbangan dapat
berubah karena penggunaan air yang suciah d'iddnfelrsi, r n i h l g a , nauplii
Adamia, rotifer, dan berbagai antibiotk pembunuh bakteri. Airibatnya, kamunitas
mikrob pelindurmg tidak &pat bkmbang baik di lingkungannya rnaupun di dalam
sistem saluran p e m a a n larva. Pascafarva yang dipetihara di dalarn lingkungan
yang refati steril di suatu pembenihn tidak dapat tumbuh dengan baik dan
rnernperfihatkan daya hidup yang rendah bila terpapar pada karnpleks populasi
rnikrob di petak pndederan atau pembesaran. Pascalarva tersebut akan mudah
terserang penyakit M a terkena stress lingkungan atau terinfeksi oleh bakteri yang
patensial bersifat patagen.
Banyak spsies bakteri tetah digunakan sebagai pfabiatik rnaupun
biakontraf pada larva udang, wlaupun hasilnya M u m semuanya memuaskan.
Tjahjacli et ab (1994) menunjukkan bahwa papulasi bkteri V. harveyi di
lingkungan pemeliharaan udang dapat &&&an dengan caw mengintroduksikan
bakteri tertenkr yang diisolasi dari perairan laut di sekitar tambak atau
pembenihan udang. Muliani et #I. (2003)juga melaporkan bahwa isolat B L S 2
yang kemudian diidantifikasi sebagai Pseudo~ftemmonassp. Edssp-l efe)ctif
rnenghambat pertumbuhan V, harveyj MR5339 secara in witm rnaupun in vivo
pada larva udang windu karma senyawa antirnikrob yang dihasilkannya.
Widiyanta et d (1998) melaporitan bahwa kitteri fotosintetik afioksigenik MW4
dan MW5 hrpotensi untuk dikembangkan wbagai biokontrol pada tarnbak
udang karma mampu rnenekan perturnbuhan V. harveeyi masing-masing sebesar
90 dan 70%.
Rengpipat et al. (1W ,
1998b)mdaporkan hhwa Bac#/ussp.$1 1 yang
dihrikan ke larva udang melatui Arternia dapat rneningkaikan perturnbuhan dan
kefangsungan hidup larva tersebut. hrnikian pufa isafat By-9 yang diisolasi oleh
Haryanti ef a!, (20QO)dari daerah perairan pantai Jawa Timur dan Bali, mampu
rnenekan pertumbuhan V. hharvyi
wrta meningkatkarr perturnbuhan dan
kelangsuqan hidup larva udang windu.
Metranisme Kerja dan %leks$ Bakterf Prubiotilr
Menurut Vefsctrwre
ef a/. (2000),mekanisme kerja bakteri
probiatik
dapat dibagi menjadi bebrapa cara, yaitu: (1) produksi senyawa inhibitor; (2)
kornpetisi terhadap senyawa kirnia atau sumbr energi (nutrisi); (3) kornpetisi
terhadap tempat ppelekatan; (4) peningkatan respon imun (kekebalan); (5)
perbaikan kualitas air; dan (6)interaksi dengan fitaptankton.
Suatu kelompok mikrob dapat manghasilkan senyawa antirnikrob yang
rnenghambat perlumbuhan miitrob lain dan dapat diigunaitan untuk pengabatan
infeksi rnikrob pada manusia dan h e w n . Riquslms et al. f 1997) melaparkan
bahwa Vibrio sp. yang cfiemukan brasosiasi dewan larva kerarg-kerangan
menjadi probatik yang potensial pada budidaya icerang-kerangan karma rnarnpu
menghambat pertumbuhan V. anguifIamrn yang tefah diketahui bersifat patogen
pada larva tersebut. Selanjutnya, pertumbuhan V. anguillamm dapat diharnbat
oleh Pseudomonas fluumscens AH2 yang diturnbuhkan pada media dengan
konsenfrasi besi terbatas. Pada konsentrasi b s i terbatas, pruduksi stderofor
dan aCrtwitas antikirteri Pseudomonas fluomsmns AH2 rneningkat, sehingga
dapat rnenghambaf prtumbuhan V. sngguifIarum (Gram ei at/. 1999).
Salah satu rnekanisme Lain yang rnungkirt brjadi untuk r n e n q a h
kolonisasi baMeri patogen pada inang adatah dengan rnenamkhkan baMeri lain
yang mampu brkwnpetisi dangan kkteri patagen daiam mndominasi ternpat
pelekatan (Verschure et a/. 2000). Hasil penefitian Hala et a!. (2002)yang
rnernpelajari mengenai penggunaan gen penanda molekuler untuk deteksi
plekatztrr dan kolonisasi V. haweyi pada larva udang windu rnenunjukkan bahwa
V.
harveyi dapat ditrarnbat
kolonisasinya
dewan
rnengintrorjuksikan
V. mefschnikovii yang diisolasi dari larva udang yang sehat. Vibrb ini rnasih
perlu dipelajari dan dievaluast Iebih tanjut patensinya sekgai probiotik pada
permbenitran udang windu whiqga dapat diperoleh probiotik yang potensiat
seperti yang diperobh Riquelme et a]- (1997) pada bubudiya kerang-kerangan.
Irnunostirnulan adalah suatu senyawa kimia yang dapat rnengaktiian
sistern imun dan rneningkatkan resistensi inang terhadap serangan virus, bakteri,
fungi, dan parasit. Larva ikan, udang, dan invertebrata lainnya pada umurnnya
rnerniliki sistern imun yang kurang krkembang dibrandingkan ikan ckwasa.
Bebrapa penetitian blah dilakukan dalam ugaya meningkatkan respon imun
hewan akuatik, baik rnenggunakan rnikrob hidup maupun ekstrak sel wadstein,
1997; Devaraja et a]., 1998; Afabi et a!., 1999; Skjermo dan Vadstein, 19991,
Hasilnya befum wmuanya memuaskan, walaupun bebrapa dari inang
resistensinya rneningkat terhadag serangan patogen.
Peranan rnikrob dararn mernphiiti kualitas air media budidaya telah
banyak dipetajari.
Bakteri niirifikasi (Nitrosomonas clan Nitmbacfer), telah
diketahui b e ~ r s l n
dalam aksidasi ammonia menjadi nitrat, dernikian juga baMeri
fotasinte4ik anoksigenik (Rhadopseud~manasdan Rhodobactee yang brperan
dalam mendegradasi H2S (Madigan caf a!., 1997). Ammonia dan H2Sadalah dua
senyawa yang sangaf toksik bagi hewan akuatik, termasuk ikan dan udang.
Hasil penelitian Widiyanto et BI. (1998) menunjukkan b a h bakeri btosintetik
anoksigenik MW4 dan M W 5 , selain rnampu msnekan petturnbuhan V. haweyi,
juga mampu menurunkan konmntrasi ti& masing-masing sebesar 60 dan 30°h,
sehingga potensial digunakan sshgai biokondisioner di tambak udang.
lnteraksi bakteri probiofik-fit~planictonw r a tidak langsung dapat
meningkatkan prturnbuhan dan kelangsungan hidup organisme budidaya. Hasil
pemlitian Dwillet dan Langdwl (t 994) rnenunjukkan bahwa penambahan bakteri
galur CA2 ke dafam kutkrr alga dapat meningkatkan nilai nutrisi dari alga tersebut
dan selanjuhya dapat meningkatkan perturnkhan
Iatva )rerang.
dan kelangwngan hidup
Selanjutnya ditarnbahkan oteh Naviner ef a!. (4999) bahwa
senyawa antirnikrab yang diekstrak dari diatom, Skeiefonema wstatum, terbukti
dapat mewhambat V. anguiIIarum dan spesies-spesies Vibrio lain yang bemifat
patogen tarhadap ikan, udang, dan kerang.
Menurut Gamez-Eil (ZUOU), seleksi bakteri pfabiotik biasanya rnentpakan
suatu proses empiris yang didasarkan pada sedikit bukti ilrniah.
Banyak
kegagalan penelltian hkteri prabiotik yang tejadi karma ketiru rnemilih
rnikraarganisrne. Tahapan seleksi memang sudah ditentukan, tefapi tahapan ini
masih p r l u disesuaikan menuntt spesies inang dan lingkungan, sehingga p r l u
untuk memahami rnekanisme aksi probiotik dan msnsntukan kdteria seleksi
kitteri probiotik potensiai.
Kriteria umum sefeitsi tenrtarna ditentukan
berdasarkan pertirnkngan keamanan batogis (biosafety), meto& pruduksi dan
pengalahan, metode pemktian probiotik, s&a lokasi di dalarn tubuh dirnana
rnikroorganisrne tersebut diharapkan a@#.
Metade seleksi bakteri probiotiir untuk kegiafan prnetiharaan larva hewan
akuatik dapat rnencakug beberapa tahap hrikut: (1) pngurnpulan infomasi
dasar, (2) pengumpulan probiotik, potensial, (3) evaluasi ksmarnpuan probiotik
potensial krkompetisi dengan galur patogen, (4) pendugaan patogenisitas
probiotik potensial, (5) evaluasi pengaruh prabiotik potensial pada larva, dan (6)
analisis ekonomis biaya-laba (Gambar 1).
Literature
Review
Pmsekblon
screening of
PROBIOTlCS
swlar strains
COMPETITIQM STRAINS
" "" " " " "
SULlDKWUiD MEDlA
1
PATHOGENICITY
InjeeWn and bath chalienge
I1
r J
EFFECT IN
M E HATCHERY
/
1
1
1I
-- -lC
I
i
EFFECT IN
THE LABQC~ATORY
DEVELOPMENT
OFBROTH
Economic
X
3 1 1 1 1 1 - 1 C J
VIABLE
PRUBiOTIC
Negativeeffect
No effect
R
R
+
Gambar 1. Diagram seieksi balded probiotik untuk pemeliharaan larva hewan
akuatik (Gomez-Gil dan Roque,1998)
Penggunaan Penanda Mofekukr sebagai Gen Pelapor
Oalam bialogi rnalekuler dikenat beberapa gen yang dapat digunakan
sebagai penanda moiekuler (Manning 1997; Jansson 2003). Gen yang akhirakhir ini banyak digunakan untuk rnenandai bakteri unfuk rnernpelajari
patogenisitas bakteri pada inang adalah gen gfp (Ling et a/. 2000; Sukenda dan
Wabbayashi 2001). Gen yang diisolasi dari ubur-ubur (Aequwea victoris) ini
apabila tefekspfesi akan rnenghasiliran protein yang krpendar hijau (Tsien,
7998). Pratein ini menyerap cahaya biw dengan absorbansi rnaksirnum 395 nm
dan memancadcan catraya hijau dengan abeiorbansi maksimurn 5U9 nrn
(Manning 1997; Tsien 1998).
Protein GFP diasumsikan berbentuk silinder yang pada bagian tengahnya
terdapat 15
asam amino, memknkrk kol oc-heliks. Tiga dari asam amino ini
yakni nomar 65 (serin),66 (tyrosin) dan 67 (gtysin) mernhntuk kromofor yaitu
bagian molekul yang mernancarkan cahaya. Kromofor yang rnengikat sisi-sisi
silinder ini akan mefindungi protein tersebut dad enzim-enxim
sel inang dan
radikal-radikal bebas (Manning 199'7;Tsien 1998).
Sekgai penanda molekufsr gen gfp rnerniliki bebrapa keuntungan.
Keberadaan gen ini di dalam sel tidak kfbahaya karena tidak mengganggu
fungsi dan pertumbuhan wl wrta proteinnya tidak bemifat tuksiic. Ueuntungan
fain dari gen ini adialah tidak membutuhkan kofaMor atau pena'mbahan subsirat
untuk visuafisasinya, sensitif, stabit, seFta ekspresinya dapat dideteksi sarnpai
tingkat sel tunggal (Jassnhans et a/. 7998; Ling et a!. ZQQQ).
Penggunaan gen gfp sebagai penanda malekuler telah bemasit
rnenunjukkan rnekanisme =rangan EdwarrJ'sidIa tarda pada sel epitel ikan
gurame {Ling et a!. 2000)see# serangan Pseudomonas pfecog/usfcida pada ikan
ayu (PIeco~Iossusalfivelis)di Jepang (Sukenda clan Wakabayashi 2001). Gen
g%p juga telah berhasil digunakan sebagai penanda bakteri asam talctat
(Lacfohaciffus planfarum dan L. factis) untuk mempelajari kemung kinan
penggunaan baktari tersebut sebagai pernbawa vaksin hidup (GeofFmy et a/.
2000).
Pada penelitian ini, gen gfp yang digunakan adalah gfpuv yang
dikembangkan oteh Crarneri et a/. (3996) dan dioptimasi untuk fluotesansi
rnaksimal jika disksitasi dengan sinar UV (360400nm). Fluoresensi E. coii yang
mengeicspresikan gfpuv sekiiar 18 kali lebih cerah dibandingkan dengan E. ccdi
yang mngekspresikan gfp tipe fiar. Fluaresensi gfpuv ini pada kotuni baker!
dapat diarnati dengan rnenggunakan sinar UV,
Untuk memonitor ke-aan
bbih dari satu bakbri uji dalarn satu tubuh
inang dapat digunakan beberapa penanda yang rnemiliki pendamn wama yang
brbeda (Soto-Rdriguez et 81. 2UU3;Janssan 2003). Suatttu penancla rnolekuler
yang banr-baru ini juga banyak diplajari adalah gen DsRed. Gen tersebut
diisalasi dari kefampok anernan laut (Discusuma sp.) dan jib terrakspresi akan
memanearkan pendaran krwarna mernh (Janswn 2003). Namun pmggunaan
DsRed sabagai penanda rnolekufer rnasih rnernertukan optimasi labih lanjut
karena waMu prnatangan yang diperlukan sangat lama, yakni antam W r a p
jam hingga beberapa had (Janssan 2003).
Penanda resisten tefhadap antibiotik rifarnpism juga dapat d'igunakan
untuk V. hatveyi karena pa& umumnya Vibnia tersebut sensitif terhadap antibik
rifarnpisin (Tjahyadi ef al. 1994). Oengan penanda m & u k
tefsebut, Vibt-io uji
dapat dibedakan dari VibW lain yang sehlurnnya tdah terciapat pada larva udang
atau air W
i
a pmeliharaannya sehingga esei pekkabn &pat dilakukan.
BAI-IAN DAN METODE
Bakteri dsn Plasmid
BaMeri dan plasmid yang digunakan pada penelitian ini disajikan pada
Tabei 1 .
Tabel 1. Galur baktcteri dan plasmid yang digunakan pada penelitian ini
Galur bakteri dan
Karakteristik yang relevan
Tipe liar
Tipe liar
UP
RF
gw, ~ m "
gfp', urn;
gfp*, Krn
G3::mini-Tn JOKrngfp, ~ m " gfp'
,
E* coll
DHSa
HB101
S17-Ihpir
F', lacZAMl5, hsdR17, m A l , gyrA,
thiRes-, Mod-, recA13, ~ m "
Pro", Red, ad'. r e d , diIisogeni
dengan bak t h f a g e hpir
Sumber/Referensi
Koleksi lab (Maros-Sulsel)
UuIelcsi lab (EondoCBati)
Kubksi b b fGandol-Bali)
Penelitian ini
Pmalitian ini
Penelitian ini
PenaBan ini
Penelitian ini
Penelitian ini
Penelitian ini
Sambrook ef al. (I
989)
Sambrook ef al. (1989)
l-lerrsro et a/. (1990)
Sukenda & Wakabayashi
tzml)
~ b ' rep*,
,
MCS p0luescript II , h" Kovac et a). (19%)
Cot E l replimn, tm*, ~ r n ~
D i et Eal. (1980)
Ptac dan gfp d i s i s p n pada MCS
Panelitian ini
pBBRfMCS2, Urn , gfp+
Identik dengan pUC18 dengan dua
situs unik Nan mengapit MCS
Vekfor integrasi kromosom hrnrnan
Tn5
pLUfKrn dengan
gfp tanpa promotok diklan di bagian
upstream kan, Km
PIac dan @p ffisisipkan pada MCS
Peneiitian ini
pUClbNot, ApR,gfp'
Plac dan gfp disisipkan p d a MCS
Panelitian ini
pUTmini-Tn5 SplSm, ApR,gfp",
swm"
P I ~ CA$,
,
DSR&+
Plac dan DsRed disisipkan pads
MCS aB8R-lMCSZ. ~m".
DsRed*
Ctontech
Penelitien ini
Isolasi M M o Kandidat Prubiotik
V l b h kanrficlat prokotik diisolasi dari berbagai stadia larva udang windu
dan media perneliharaannya, termasuk dari ku&ur pakan alaminya, di ternpat
pernbenihan udang, Labuhan, Pangandaran, dan Lamgung.
Masing-masing
sarnpl dimbar pada media seleMi Thiosulphafe Citmte Bi/&a#
Sucrose (TCBS-
agar, Qxoid) dan selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang (28-31)OC selama