dalam es selama 5 menit. Satu menit sebelum inkubasi probe dalam es selesai, 50 mL larutan DIG Easy Hyb dipindahkan dari bak plastik ke tabung 50 mL.
Kemudian probe yang sudah didenaturasi ditambahkan ke tabung yang berisi larutan DIG Easy Hyb tersebut dan dicampur dengan baik untuk membentuk
larutan hibridisasi. Selanjutnya larutan hibridisasi dimasukkan ke bak plastik dan dilakukan hibridisasi semalam pada suhu 42
o
C dengan penggoyangan.
Deteksi Menggunakan Chemiluminescent Reaction
Membran dicuci 2 x 5 menit dengan 200 ml washing 1 pada suhu kamar, selanjutnya 2 x 15 menit dengan 200 ml washing 2 pada suhu 68
o
C. Untuk langkah selanjutnya dilakukan pada suhu ruang. Membran diseimbangkan selama
2 menit dengan 200 ml buffer 1 + Tween. Kemudian membran diinkubasi selama 30 menit sampai 3 jam dengan 200 ml buffer 2. Selanjutnya menggunakan bak
plastik baru, membran dicuci untuk membuang antibodi yang berlebihan dengan diinkubasi 2 x 15 menit pada 200 ml buffer 1 + Tween. Selanjutnya membran
diseimbangkan selama 3 menit dengan larutan 40 ml bufer 3. Membran diletakkan bagian DNA menghadap ke atas di atas plastik. Tiga ml Ready-to-use CDP-Star
diteteskan pada permukaan blot sampai seluruh permukaan basah. Kemudian membran dibungkus dengan plastik pembungkus. Membran diinkubasi selama 5
menit pada suhu ruang. Cairan yang berlebih dalam plastik wrap dibuang. Selanjutnya membran dimasukkan dalam kaset dan film X-ray dimasukkan ke
dalam kaset di ruang gelap. Film X-ray direndam selama 1 menit di dalam larutan developer dengan digoyang-goyang, 30 detik di dalam air, dan 2 menit dalam
larutan fiksasi. Selanjutnya film X-ray dibilas dengan air ledeng dan dikering- anginkan.
B. Studi Fisiologi Gen OsDREB1A
Bahan Tanaman
Genotipe padi Nipponbare transgenik B11, C10, Nipponbare, Kalimutu kontrol toleran dan Singkarak kontrol peka.
Pelaksanaan Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Rumah Kaca, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik
Pertanian, Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan November 2011 sampai dengan Februari 2012.
Studi Fisiologi
Biji padi dikecambahkan pada petridis yang telah diberi air. Benih yang telah berkecambah ditanam pada botol yang berisi air sampai menjadi bibit
tanaman kemudian ditanam pada pot diameter 23 cm dengan tinggi 11 cm yang berisi tanah + pasir + pupuk kompos 2:1:1 sebanyak 4,5 kg. Setiap pot berisi 3
tanaman padi dan disiram setiap hari sebanyak 750 ml10 kg media tanam Samaullah dan Daradjat 2001. Pada waktu dilakukan pengujian kekeringan
setiap pot berisi 1 tanaman padi. Pengeringan dilakukan pada umur 40 hari setelah tanam. Setiap hari, ditimbang bobot total setiap pot untuk mengetahui besarnya
evapotranspirasi sampai ada tanaman kontrol peka Singkarak yang mati. Pada pagi hari berikutnya dilakukan penimbangan bobot total setiap pot untuk
mengetahui bobot awal sebelum dilakukan penyiraman lagi. Kemudian dilakukan penyiraman kembali untuk pemulihan. Setelah mengalami evapotranspirasi, bobot
total setiap pot ditimbang dan tanaman disiram kembali sesuai dengan banyaknya air yang hilang selama evapotranspirasi. Peubah yang diamati : jumlah stomata,
bobot tajuk, bobot akar, daun hijau . Pengamatan stomata dilakukan dengan cara mengolesi permukaan daun
padi dengan kutek cat kuku yang transparan. Setelah kutek kering kemudian diambil dengan selotip dan ditempelkan pada gelas preparat selanjutnya diamati di
bawah mikroskop dengan perbesaran 40 x dan dihitung jumlah stomata tiap bidang pandang. Penghitungan dilakukan pada 3 bidang pandang yang berbeda.
Berikut rumus penghitungan stomata: Kerapatan stomata
Diameter bidang pandang = 0,5 mm. Luas bidang pandang = d
2
Isolasi DNA
Metode Dellaporta
el al. 1983 yang sudah dimodifikasi digunakan untuk
isolasi DNA. Daun padi yang masih muda dipotong kecil-kecil dimasukkan ke dalam ependorf dua ml dan diberi gotri pelor, kemudian dimasukkan ke dalam
nitrogen cair dan divorteks sampai halus. Serbuk daun diberi larutan buffer ekstraksi DNA yang sudah ditambah Na-disulfit 0,38 g100ml sebanyak 700 µl.
Selanjutnya tabungdipanaskan dalam penangas air pada suhu 65°C selama lima menit. Untuk memisahkan asam nukleat dengan komponen lain ditambahkan
kloroform : isoamyl alcohol Chisam 24:1 dengan perbandingan 1 : 1, kemudian digoyang atau dikocok selama lebih kurang 50 kocokan, selanjutnya disentrifuge
pada 12,000 rpm selama lima menit. Supernatan dipindahkan ke tabung ependorf 2 ml yang baru, kemudian ditambahkan ethanol absolut 98 dengan
perbandingan supernatant : etanol absolut = 1 : 2 dan dicampur dengan membalik- balikkan tabung. Selanjutnya tabung disentrifuse selama lima menit. Endapan
DNA dicuci dengan etanol 70 dua kali, kemudian dikeringkan di dalam pompa vakum. DNA dilarutkan di dalam Tris-EDTA TE buffer sesuai dengan besar
kecilnya endapan.
Amplifikasi PCR
Campuran reaksi 2 µl buffer 10 x PCR;1,2 µl MgCl; 0,4 µl DNTPs; 2 µl Primer HPTII; 0,16 µl Taq DNA; 9,24 µl ddH
2
O; dan 5 µl sampel DNA dimasukkan di dalam tabung PCR, kemudian diamplifikasi dengan mesin PCR
pada program Hyg-60. Profil suhu yang digunakan adalah predenaturasi 94
o
C selama 5 menit, dilanjutkan dengan 35 siklus meliputi pemisahan denaturation
pada suhu 94
o
C selama 1 menit, penempelan primer annealing pada suhu 60
o
C selama 1 menit, pemanjangan primer extension pada suhu 72
o
C selama 2 menit. Pada tahap akhir PCR dilakukan pemanjangan akhir pada 72
o
C selama 5 menit. Hasil amplifikasi dicek dengan elektrofloresis gel agarose 0,8. Delapan µl DNA
+ 1 µl blue juice dicampur kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Separasi dilakukan pada voltase 80 – 100 V selama sekitar satu jam. Gel direndam dalam
larutan 0,5 gml Ethidium Bromide dan pita DNA divisualisasikan menggunakan Chemidoc.
Hasil Penelitian A. Evaluasi Toleransi Tanaman Transgenik terhadap Kekeringan
Bibit tanaman padi transgenik yang berasal dari sembilan genotipe yang lolos seleksi 100 mgl higromisin dilakukan uji terhadap cekaman kekeringan
dengan hasil tertera pada Tabel 5. Tanaman padi transgenik genotipe B9 dan
kontrol Nipponbare, Batutegi dan Singkarak memiliki skor 9 yaitu mati semua. Tanaman padi transgenik untuk genotipe yang lain memiliki skor kesembuhan
berkisar antara 3 – 7, berarti tanaman masih ada yang hidup dan dapat tumbuh dengan baik. Tanaman padi transgenik generasi T1 ini masih mengalami segregasi
yang menyebabkan nilai skor daun menggulung, dan daun mengering bervariasi. Tabel 5. Skor hasil pengujian kekeringan tanaman padi transgenik T1 dan
tanaman non-transgenik pada fase vegetatif di rumah kaca Fasilitas Uji Terbatas metode Standard Evaluation for Rice dari IRRI 1996
Genotipe Jumlah
tanaman Fase vegetatif
Kesembuhan Daun menggulung
Daun mengering B9
5 9
9 9
B11 5
0-9 0-9
7
B14
5 0-7
0-9 5
C10 5
0-7 0-9
5 C9
10 1-9
3-9 3
C14 5
0-9 0-9
5 C4
5 1-9
1-9 5
C12 5
0-9 1-9
5
C3 5
0-9 0-9
7 Nipponbare 5
7 9
9 Kalimutu 5
7 9
9 Singkarak 5
9 9
9 = dua pot. skor 3 = 70-89 tanaman sembuh, skor 5 = 40-69 tanaman sembuh,
skor 7 = 20-39 tanaman sembuh, skor 9 = 0-19 tananam sembuh.
Gambar 13. Hasil analisis PCR dan hibridisasi Southern sampel DNA padi Nipponbare transgenik
Kontrol= genotipe Nipponbare tipe liar
a. Hasil amplifikasi PCR enam genotipe padi transgenik menggunakan primer HPTII b. Profil hibridisasi Southern lima genotipe padi transgenik
Dari delapan genotipe transgenik yang lebih toleran terhadap kekeringan dibanding Nipponbare non-transgenik ini dipilih 6 genotipe yang memiliki jumlah
anakan yang sama atau lebih banyak dari genotipe Nipponbare tipe liar yaitu genotipe
B11, B14, C10, C14, C12, dan C3. Genotipe-genotipe tersebut kemudian dianalisis menggunakan PCR. Hasil analisis menunjukkan bahwa lima genotipe menghasilkan
pita dengan ukuran yang diharapkan, sementara satu genotipe yaitu C12 tidak menghasilkan pita DNA Gambar 13a dan Tabel 6. Lima genotipe tersebut
selanjutnya dianalisis menggunakan hibridisasi Southern. Hasil analisis hibridisasi terhadap lima sampel DNA menunjukkan bahwa kelima genotipe memiliki 2 – 4
salinan transgen Gambar 13b dan Tabel 6.
Tabel 6. Hasil analisis PCR enam genotipe dan hibridisasi Southern lima genotipe padi transgenik
Genotipe PCR
Southern hibridisasi +- Jumlah
pita B14 + + 2
B11 + + 2 C14 + + 4
C10 + + 2 C12 -
C3 + + 4
tidak dilakukan analisis hibridisasi Southern
Gambar14. Penampilan tanaman padi Nipponbare transgenik generasi T1 setelah uji kekeringan
B. Studi Fisiologi Gen OsDREB1A
