Methane Oxidation and Ammonium Accumulation Activity and Characterization of nifH and nifD Genes of Methanotrophic Bacteria from Ricefields
AMMONIUM SERTA KARAKTERISASI GEN nifH
DAN nifD BAKTERI METANOTROF ASAL SAWAH
ARI FINA BINTARTI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan dengan sebenarnya bahwa tesis yang berjudul,
Aktivitas Oksidasi Metan dan Akumulasi Ammonium serta Karakterisasi
Gen nifH dan nifD Bakteri Metanotrof Asal Sawah adalah hasil karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun
kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Bogor, Juli 2011
Ari Fina Bintarti
G351090091
ABSTRACT
ARI FINA BINTARTI. Methane Oxidation and Ammonium Accumulation
Activity and Characterization of nifH and nifD Genes of Methanotrophic Bacteria
from Ricefields. Under Direction of IMAN RUSMANA and ARIS TRI
WAHYUDI
Metanotrophic bacteria have ability to oxidize methane. In addition they can
fix atmospheric nitrogen, hence this bacterium has the potential role as a nitrogen
source provider in the wetland. Nitrogen fixation process is catalyzed by the
nitrogenase enzyme complex, encoded by nifH and nifD genes. Characterization
these genes would support the use of methanotrophic bacteria in agriculture.
Three methanotrophic bacteria isolated from rice fields i.e. BGM1, BGM3, and
BGM9 were determined their methane oxidation and ammonium accumulation
activities. Methane oxidation activity was analyzed using gas chromatography
every two days. The concentration of ammonium in the culture supernatant was
measured using phenate method. BGM1 isolate had a high ammonium
accumulation rate, it was 2.77 ± 0.75 μmol/mL/day. The highest methane
oxidation rate was shown by BGM3 isolate, the rate was 376.79 µmol/mL/day.
nifD and nifH genes of three isolates and six other isolates (SS1, SS3, SS10,
ST18, SP3 and INP4) were characterized. Based on nifH sequences analysis SS1
isolate was closely related to Beijerinckia mobilis and SS3, SS10, ST 18 isolates
were closely related to B. indica subsp. indica ATCC 9039. While BGM3, INP4,
and BGM9 isolates were related to nifH of uncultured nitrogen-fixing bacterium.
Sequence analysis of nifD gene showed that SS1, SS3, SS10, ST 18 isolates were
closely related to B. indica subsp. indica ATCC 9039 and BGM3, BGM9, INP4
isolates were closely related to Xanthobacter autotrophicus Py2.
Keywords: Methanotrophic bacteria, nitrogen fixation, nitrogenase, nifH, nifD
RINGKASAN
ARI FINA BINTARTI. Aktivitas Oksidasi Metan dan Akumulasi Ammonium
serta Karakterisasi Gen nifH dan nifD Bakteri Metanotrof Asal Sawah. Dibimbing
oleh IMAN RUSMANA and ARIS TRI WAHYUDI
Bakteri metanotrof merupakan bakteri yang mampu menggunakan metan
sebagai sumber karbon dan energi untuk pertumbuhannya. Metan tersebut akan
dioksidasi menjadi metanol atau dioksidasi lebih lanjut menjadi CO2. Enzim yang
berperan dalam oksidasi metan adalah metan monooksigenase (MMO). Selain itu
metanotrof tipe II dan tipe X diketahui mampu memfiksasi nitrogen menjadi
ammonium, sehingga bakteri metanotrof pemfiksasi nitrogen tersebut juga
berperan penting sebagai penyedia sumber nitrogen di lahan sawah. Fiksasi
nitrogen dikatalisis oleh kompleks enzim nitrogenase. Enzim tersebut tersusun
oleh protein Fe (dinitrogenase reduktase) yang disandikan oleh gen nifH dan
protein FeMo (dinitrogenase) yang dikodekan oleh gen nifDK. Gen nifH dan nifD
mempunyai sekuen yang conserved terutama gen nifH, sehingga menjadikannya
alat molekuler yang ideal untuk mempelajari kemampuan fiksasi nitrogen,
distribusi, maupun filogeni bakteri diazotrof.
Tiga isolat metanotrof yaitu BGM1, BGM3, dan BGM 9 digunakan sebagai
isolat uji untuk mempelajari aktivitas oksidasi metan dan akumulasi
ammoniumnya. Aktivitas oksidasi metan dilakukan dengan menghitung
konsentrasi gas metan yang ada di headspace menggunakan kromatografi gas
setiap dua hari sekali. Sedangkan untuk menghitung konsentrasi ammonium yang
terakumulasi di dalam media kultur digunakan spektofotometer pada panjang
gelombang 640 nm.
Ketiga isolat tersebut mampu mengoksidasi metan selama pertumbuhannya,
dan oksidasi metan tertinggi adalah isolat BGM3 sebesar 376.79 µmol/mL/hari.
Ketiga isolat tersebut juga mampu memfiksasi nitrogen yang ditunjukkan dengan
peningkatan konsentrasi ammonium yang terakumulasi di dalam media. Laju
akumulasi ammonium tertinggi pada isolat BGM1 sebesar 2.77 ± 0.75
μmol/mL/hari. Gen nifH dan nifD dari ketiga isolat tersebut dan enam isolat lain
(SS1, SS3, SS10, ST18, SP3, dan INP4) kemudian dikarakterisasi.
Analisis sekuen gen nifH menggunakan blastX menunjukkan bahwa isolat
BGM3, BGM9, dan INP4 berkerabat dekat dengan nifH dari bakteri pemfiksasi
nitrogen yang belum bisa dikulturkan, sedangkan isolat SS1, SS3, SS10, dan
ST18 berkerabat dekat dengan nifH dari genus Beijerinckia yaitu B. mobilis dan
B. indica subsp. indica ATCC 9039. Berdasarkan analisis sekuen gen nifD, isolat
BGM3, BGM9, dan INP4 berkerabat dekat dengan nifD dari Xanthobacter
autotrophicus Py2, sedangkan isolat SS1, SS3, SS10, dan ST18 berkerabat dekat
dengan nifD dari B. indica subsp. indica ATCC 9039. Isolat BGM1, BGM3, dan
BGM9 berpotensi untuk diaplikasikan di sawah sebagai pereduksi metan dan juga
penyedia sumber nitrogen.
Kata kunci: metanotrof, oksidasi metan, fiksasi nitrogen, nitrogenase, nifH, nifD
©Hak Cipta milik IPB, tahun 2011
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis
dalam apapun tanpa izin IPB.
AKTIVITAS OKSIDASI METAN DAN AKUMULASI
AMMONIUM SERTAKARAKTERISASI GEN nifH
DAN nifD BAKTERI METANOTROF ASAL SAWAH
ARI FINA BINTARTI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Mayor Mikrobiologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
Penguji Luar Komisi Ujian Tesis: Dr. Rahayu Widyastuti, M. Sc.
Judul
Nama
NRP
Program Studi
: Aktivitas Oksidasi Metan dan Akumulasi Ammonium serta
Karakterisasi Gen nifH dan nifD Bakteri Metanotrof asal
Sawah
: Ari Fina Bintarti
: G351090091
: Mikrobiologi
Disetujui,
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si.
Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si.
Ketua
Anggota
Diketahui
Ketua Mayor Mikrobiologi
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr. Gayuh Rahayu, M.Si.
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Tanggal Ujian: 22 Juli 2011
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala Rahmat
dan karuniaNya sehingga karya ilmiah yang berjudul ”Aktivitas Oksidasi Metan
dan Akumulasi Ammonium serta Karakterisasi Gen nifH dan nifD Bakteri
Metanotrof asal Sawah” dapat diselesaikan.
Penulis menyampaikan penghargaan dan ucapan terima kasih yang sebesarbesarnya kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Bapak Dr. Aris Tri
Wahyudi, M.Si. atas semua bantuan, bimbingan, dan saran kepada penulis selama
menempuh pendidikan S2. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ibu Dr.
Rahayu Widyastuti, M.Sc. selaku penguji luar komisi yang telah memberikan
koreksi dan arahan untuk perbaikan tesis ini. Penulis juga mengucapkan banyak
terima kasih kepada Prof. D.B. Nedwell atas segala bantuan, masukan, dan
bimbingan selama penelitian di Laboratorium Ekologi Mikroba, Departemen Ilmu
Biologi, Universitas Essex, UK.
Terima kasih kepada Kepala dan Staf Laboratorium Mikrobiologi
Departemen Biologi FMIPA IPB, Kepala dan Staf Laboratorium Ekologi Mikroba,
Departemen Ilmu Biologi, Universitas Essex, UK. Ungkapan terima kasih yang
tak terhingga kepada Ayah, ibu, dan seluruh keluarga besar atas doa, kasih sayang
serta keikhlasannya. Tidak lupa kepada rekan-rekan penulis mengucapkan terima
kasih atas semua bantuan dan kerjasamanya.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu
kritik dan saran sangat diharapkan. Penulis berharap semoga karya ilmiah ini
dapat bermanfaat bagi pembaca.
Bogor, Juli 2011
Ari Fina Bintarti
G351090091
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Rembang pada tanggal 13 Januari 1987 dari ayah
Subiyanto, S.Pd, dan Ibu Jumiasih (Alm). Penulis merupakan putri pertama dari
tiga bersaudara.
Tahun 2004 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Rembang dan pada tahun yang
sama penulis diterima di IPB pada Program Studi Biologi, Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam melalui Undangan Seleksi
Masuk IPB (USMI). Pada tahun 2007, penulis melaksanakan praktik kerja
lapangan di PT Pyridam Farma, Cianjur, Jawa Barat. Pada tahun 2009, penulis
melanjutkan studi pada mayor Mikrobiologi, Sekolah Pascasarjana IPB.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif menjadi asisten praktikum
Biologi Dasar (2007/2008), Mikrobiologi Dasar (2007/2008), Biologi Alga dan
Lumut (2007/2008), dan Avertebrata (2007/2008). Karya ilmiah berjudul
“Aktivitas Oksidasi metan dan Akumulasi Ammonium Bakteri Metanotrof asal
sawah” telah disajikan pada Seminar Nasional Sains III di Bogor pada bulan
November 2010 dan karya ilmiah berjudul “Aktivitas Oksidasi Metan dan
Akumulasi Ammonium serta Karakterisasi Gen nifH dan nifD Bakteri Metanotrof
asal Sawah” telah disajikan pada Seminar Internasional ke-4 Perhimpunan
Mikrobiologi Indonesia di Bali pada bulan Juni 2011.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..........................................................................................
vi
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................
vii
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................
viii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ......................................................................................
Tujuan Penelitian ..................................................................................
Manfaat Penelitian ................................................................................
1
2
2
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Metanotrof ...............................................................................
Oksidasi Metan oleh Bakteri Metanotrof .............................................
Fiksasi Nitrogen oleh Bakteri Metanotrof ............................................
Enzim Nitrogenase ...............................................................................
Gen nifH dan nifD.................................................................................
Karakterisasi Gen nif pada Bakteri Metanotrof ....................................
3
4
6
8
9
10
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian...............................................................
Alat dan Bahan .....................................................................................
Uji Aktivitas Oksidasi Metan ...............................................................
Uji Akumulasi Ammonium ..................................................................
Isolasi DNA, Amplifikasi Gen nifH dan nifD, dan
Visualisasi Amplikon ...........................................................................
Sekuensing DNA dan Analisis Bioinformatika ...................................
12
12
12
12
13
13
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil ......................................................................................................
Pembahasan ..........................................................................................
14
28
SIMPULAN DAN SARAN ...........................................................................
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................
LAMPIRAN ...................................................................................................
38
39
45
DAFTAR TABEL
Halaman
1.
2.
3.
Gen nif dan fungsinya ...........................................................................
Hasil analisis sekuen gen nifD dengan menggunakan program
BLAST-X .............................................................................................
Hasil analisis sekuen gen nifH dengan menggunakan program
BLAST-X .............................................................................................
9
19
20
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Jalur oksidasi metan dan asimilasi formaldehida pada
metanotrof. ............................................................................................
Aktivitas oksidasi metan dan OD sel isolat BGM1 pada media
NMS bebas nitrat dan ammonium.. ......................................................
Aktivitas oksidasi metan dan OD sel isolat BGM3 pada media
NMS bebas nitrat dan ammonium.. ......................................................
Aktivitas oksidasi metan dan OD sel isolat BGM9 pada media
NMS bebas nitrat dan ammonium. .......................................................
Konsentrasi ammonium dan OD sel isolat BGM1 pada media
NMS bebas nitrat dan ammonium. .......................................................
Konsentrasi ammonium dan OD sel isolat BGM3 pada media
NMS bebas nitrat dan ammonium ........................................................
Konsentrasi ammonium dan OD sel isolat BGM9 pada media
NMS bebas nitrat dan ammonium. .......................................................
Laju akumulasi ammonium isolat BGM1, BGM3, dan BGM9 ...........
Elektroforesis gel agarose 1% gen nifD berukuran 1900 bp yang
diamplifikasi dengan PCR (Keterangan : M= 1 kb ladder,
Sumur 1= BGM3; 2= BGM9; 3= SS1; 4= SS3; 5= SS10; 6=
ST18; 7= INP4) ....................................................................................
Elektroforesis gel agarose 1% gen nifH berukuran 400 bp yang
diamplifikasi dengan PCR (Keterangan: M= 1 kb ladder, sumur
1= BGM3, 2= BGM9, 3= SS1, 4= SS3, 5= SS10, 6= ST18, 7=
INP4, 8= SP3) .......................................................................................
Prediksi struktur tiga dimensi protein (a) NifH: kuning= lembar
beta, hijau= heliks alfa, merah= klaster 4Fe-4S dan (b) NifD:
kuning= lembar beta, hijau= heliks alfa, A= klaster FeMo-co,
B= klaster P ..........................................................................................
Penjajaran sekuen asam amino NifH isolat BGM3, BGM9, SS1,
SS3, SS10, ST18, INP4, dan SP3 dengan sekuen asam amino
NifH bakteri pembanding dari GenBank ..............................................
Penjajaran sekuen asam amino NifH isolat BGM3, BGM9, SS1,
SS3, SS10, ST18, dan INP4 dengan sekuen asam amino NifH
bakteri pembanding dari GenBank .......................................................
6
14
14
15
16
16
16
17
18
18
21
22
24
14.
15.
16.
Filogenetik berdasarkan sekuen asam amino NifH isolat
metanotrof yang dibandingkan dengan beberapa bakteri
diazotrof dengan metode NJ dan bootstrap 1000x ...............................
Filogenetik berdasarkan sekuen asam amino NifD isolat
metanotrof yang dibandingkan dengan beberapa bakteri
diazotrof dengan metode NJ dan bootstraP 1000x ...............................
Filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA isolat metanotrof
yang dibandingkan dengan beberapa bakteri diazotrof dengan
metode NJ dan bootstrap 1000x ...........................................................
26
27
28
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Optical Density (OD) sel dan konsentrasi gas metan di
headspace kultur metanotrof pada media NMS bebas nitrat dan
ammonium pada suhu 30 °C selama 12 hari. .......................................
Optical Density (OD) sel dan konsentrasi ammonium kultur
metanotrof pada media NMS bebas nitrat dan ammonium pada
suhu 30 °C selama 19 hari.. ..................................................................
Urutan sekuen gen nifH, sekuen asam amino NifH, dan hasil
blast-X BGM3.. .................................................................................
Urutan sekuen gen nifH, sekuen asam amino NifH, dan hasil
blast-X BGM9. .....................................................................................
Urutan sekuen gen nifH, sekuen asam amino NifH, dan hasil
blast-X SS1. ..........................................................................................
Urutan sekuen gen nifH, sekuen asam amino NifH, dan hasil
blast-X SS3 ...........................................................................................
Urutan sekuen gen nifH, sekuen asam amino NifH, dan hasil
blast-X SS10. ........................................................................................
Urutan sekuen gen nifH, sekuen asam amino NifH, dan hasil
blast-X ST18 .........................................................................................
Urutan sekuen gen nifH, sekuen asam amino NifH, dan hasil
blast-X INP4 .........................................................................................
Urutan sekuen gen nifH, sekuen asam amino NifH, dan hasil
blast-X SP3 ...........................................................................................
Urutan sekuen gen nifD, sekuen asam amino NifD, dan hasil
blast-X SS1 ...........................................................................................
Urutan sekuen gen nifD, sekuen asam amino NifD, dan hasil
blast-X SS3 ...........................................................................................
Urutan sekuen gen nifD, sekuen asam amino NifD, dan hasil
blast-X SS10 .........................................................................................
Urutan sekuen gen nifD, sekuen asam amino NifD, dan hasil
blast-X ST18 .........................................................................................
Urutan sekuen gen nifD, sekuen asam amino NifD, dan hasil
blast-X INP4 .........................................................................................
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
58
60
61
63
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Metanotrof adalah bakteri yang mampu tumbuh dengan menggunakan
metan sebagai sumber karbon dan energi. Oksidasi gas metan oleh bakteri
metanotrof di lahan sawah dapat mencapai 80% dari metan yang diproduksi oleh
bakteri metanogen (Conrad & Rothfus 1991). Oleh karena itu, bakteri metanotrof
mempunyai potensi untuk mereduksi gas metan di atmosfer.
Famili metanotrof terdiri dari Methylococcaceae (metanotrof tipe I) dan
Methylocystaceae (metanotrof tipe II). Metanotrof tipe I terdiri dari genus
Methylomonas,
Methylobacter,
Methylosphaera,
dan
Methylomicrobium.
Sedangkan metanotrof tipe II terdiri dari genus Methylosinus dan Methylocystis.
Selain itu terdapat kelompok baru metanotrof tipe X yaitu genus Methylococcus
dan Methylocaldum. Auman et al. (2001) dan Fedorov et al. (2008) melaporkan
metanotrof tipe II dan anggota metanotrof tipe X yaitu genus Methylococcus
mampu memfiksasi nitrogen menjadi ammonium. Penelitian terbaru yang
dilakukan oleh Khadem et al. (2010) melaporkan bahwa metanotrof
termoasidofilik genus Methylacidiphilum, filum Verrucomicrobia yaitu M.
fumariolicum SolV juga mampu memfiksasi nitrogen. Sugitha dan Kumar (2009)
mengatakan bahwa bakteri pemfiksasi nitrogen yang hidup bebas merupakan
sumber nitrogen yang potensial di lahan sawah.
Enzim yang berperan dalam proses fiksasi nitrogen ialah kompleks enzim
nitrogenase.
Komplek
enzim
nitrogenase
terdiri
dari
protein
Fe-Mo
(dinitrogenase) dan protein Fe (dinitrogenase reduktase) yang disandikan oleh gen
nifHDK (Sugitha & Kumar 2009). Dinitrogenase tersusun atas tetramer α2β2,
subunit α dan β masing-masing dikodekan oleh nifD dan nifK, sedangkan
dinitrogenase reduktase dikodekan oleh nifH. Gen nifD dan nifH merupakan
komponen utama dalam komplek enzim nitrogenase (Choo et al. 2003; Dedysh et
al. 2004). Gen nifH dan nifD merupakan gen yang sangat conserved baik struktur,
fungsi, dan sekuen asam aminonya (Boulygina et al. 2002).
Berbagai penelitian dilakukan untuk mempelajari bakteri metanotrof dari
segi molekuler dan kaitannya dengan kemampuannya dalam memfiksasi nitrogen.
Fedorov
et
al.
(2007)
mendeteksi
gen
nif
pada
Methylobacter
dan
membandingkannya dengan sekuen nukleotida diazotrof dari takson yang berbeda.
Dedysh et al. (2004) mengkarakterisasi gen nifD dan nifH pada metanotrof
asidofilik genus Methylocella dan Methylocapsa dan hubungan filogenetiknya
dengan Beijerinckia. Auman et al. (2001) mengkarakterisasi gen nifD dan nifH
untuk menyelidiki kemampuan fiksasi nitrogen pada Methylosinus trichosporium
OB3b, Methylobacter marinus A45, Methylomonas methanica S1, Methylomonas
rubra, dan Methylomicrobium albus BG8. Akan tetapi informasi tentang
keragaman genetik gen nifH dan nifD bakteri metanotrof dari Indonesia masih
jarang. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mempelajari aktivitas
oksidasi metan serta mendeteksi keberadaan gen nifH dan nifD yang berkaitan
dengan kemampuannya dalam memfiksasi nitrogen. Informasi yang didapatkan
dari penelitian ini diharapkan dapat mendukung pemanfaatan bakteri tersebut
sebagai penambat nitrogen dan pereduksi emisi metan di lahan pertanian.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari aktivitas oksidasi metan dan
akumulasi ammonium serta mengidentifikasi gen nifH dan nifD dari beberapa
bakteri metanotrof asal sawah.
Manfaat Penelitian
Hasil yang didapatkan dari penelitian ini diharapkan dapat digunakan
sebagai informasi dasar tentang gen-gen tropis yang berkaitan dengan proses
fiksasi nitrogen pada bakteri metanotrof dari Indonesia. Informasi tersebut dapat
mendukung pemanfaatan bakteri metanotrof sebagai penambat nitrogen sekaligus
pereduksi emisi metan di lahan sawah.
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Metanotrof
Metanotrof merupakan bakteri Gram negatif dan termasuk ke dalam
kelompok metilotrof. Kelompok bakteri metilotrof mempunyai kemampuan untuk
tumbuh pada senyawa beratom karbon satu seperti metan, metanol, amina
termetilasi, halometan, maupun senyawa termetilasi yang mengandung sulfur
(Norina 2007; Hanson & Hanson 1996).
Metanotrof tumbuh dengan baik pada kondisi aerob, meskipun bakteri ini
juga dapat tumbuh pada lingkungan mikroaerofil. Metanotrof membutuhkan
komposisi metan di atmosfer sebesar 10-50%. Habitat yang sering menjadi tempat
hidup metanotrof adalah daerah akar dan sekitar perakaran. Terdapat dua famili
metanotrof yaitu Methylococcaceae (metanotrof tipe I) termasuk filum
gammaproteobakteria dan Methylocystaceae (metanotrof tipe II) yang termasuk
ke dalam filum Alphaproteobacteria. Metanotrof tipe I yaitu genus Methylomonas,
Methylobacter,
Methylosarcina,
Methylothermus,
Methylohalobius,
Methylosphaera, dan Methylomicrobium menggunakan jalur ribulosa monofosfat
(RuMP) dalam mengasimilasi formaldehida suatu senyawa intermediet penting
dalam oksidasi metan menjadi CO2, genus Methylosoma belum diketahui cara
mengasimilasi sumber karbonnya. Sedangkan metanotrof tipe II yang terdiri dari
genus
Methylosinus,
Methylocella,
Methylocapsa,
dan
Methylocystis
menggunakan jalur serin. Kelompok baru metanotrof tipe X yaitu genus
Methylococcus dan Methylocaldum mempunyai karakter fisiologi sama dengan
tipe I yang menggunakan jalur RuMP. Perbedaannya ialah metanotrof tipe X
mempunyai enzim ribulosabifosfat karboksilase, suatu enzim yang terdapat pada
siklus Calvin-Benson. Metanotrof tipe X juga tumbuh pada temperatur yang lebih
tinggi dari pada metanotrof tipe I dan II dan mempunyai DNA dengan persentase
GC yang lebih tinggi dari pada kebanyakan metanotrof tipe I (Bowman 2006;
Hanson & Hanson 1996).
Penelitian terbaru yang dilakukan oleh para peneliti telah menemukan dan
mengidentifikasi anggota metanotrof baru yang berbeda dari filum gamma dan
alfaproteobakteria. Metanotrof tersebut merupakan genus Methylacidiphila dan
dimasukkan ke dalam filum Verrucomicrobia. Tiga jenis metanotrof genus
Methylacidiphila antara lain M. infernorum V4 (Dunfield et al. 2007), M.
fumarolicum SolV (Pol et al. 2007), dan M. kamchatkense Kam1 (Islam et al.
2008) masing-masing berhasil diisolasi dari lahan geotermal yang mengandung
metan di New Zealand, lumpur volkano solfatara di Italia, dan mata air panas
asam di Kamchatka, Rusia. Anggota metanotrof ini merupakan termoasidofilik
dan dapat tumbuh pada temperatur lebih dari 50 °C dan pH di bawah 5. Selain itu
juga ditemukan metanotrof berfilamen yaitu Crenothrix polyspora (Stoecker et al.
2006) dan Clonothrix fusca (Vigliotta et al. 2007) yang termasuk ke dalam filum
gammaproteobakteria dan secara filogenetik berkerabat dekat dengan metanotrof
tipe I. Heyer et al. (2005) mengisolasi metanotrof halofilik Methylohalobius
crimeensis 10KiT dan melaporkan bahwa metanotrof tersebut mampu tumbuh
pada konsentrasi NaCl 15 %, Sorokin et al. (2007) juga berhasil mengisolasi
metanotrof halofilik filum gammaproteobakteria yaitu Methylohalomonas lacus
dan Methylonatrum kenyense dari danau hipersalin yang mengandung klorid dan
sulfat di Rusia.
Oksidasi Metan oleh Bakteri Metanotrof
Gas metan secara alami diproduksi di lingkungan anaerob oleh arkhea
metanogenik. Lahan sawah basah merupakan salah satu sumber emisi metan yang
menghasilkan sekitar 115 Tongram metan per tahun atau sebesar 21% dari total
metan yang dilepaskan ke atmosfer (Hanson & Hanson 1996).
Metan sebagai salah satu gas rumah kaca memiliki sifat meneruskan radiasi
gelombang pendek atau cahaya matahari tetapi menyerap dan memantulkan
radiasi gelombang panjang sehingga meningkatkan suhu di atmosfer bumi
(Setyanto et al. 2004). Hanson dan Hanson (1996) melaporkan bahwa metan
mampu menyerap radiasi infra merah 30 kali lebih besar dibandingkan
karbondioksida sehingga metan mempunyai potensi lebih besar dalam pemanasan
global.
Oksidasi metan dapat terjadi baik dalam keadaan anaerob maupun aerob di
berbagai lingkungan seperti lahan basah, sawah, tanah gambut, tanah hutan, dan
tambang batubara (Han et al. 2009). Oksidasi metan secara anaerob dilaporkan
oleh Nercessian et al. (2005) terjadi di hydrothermal vents dan sedimen laut
dalam. Bakteri metanotrof yang ditemukan, diketahui melakukan simbiosis
dengan berasosiasi di dalam jaringan insang Mytilidae yang hidup di lingkungan
hydrothermal vents. Sejauh ini mikroorganisme yang berperan dalam oksidasi
metan secara anaerob belum bisa dikulturkan. Mikroorganisme yang terlibat
dalam oksidasi metan secara anaerob ini diidentifikasi sebagai arkhea
metanotrofik (ANME), ANME-1 (Hinrich et al.1999), ANME-2 (Boetius et al.
2000), dan ANME-3 (Knittel et al. 2005).
Proses oksidasi metan dikatalisis oleh enzim metan monooksigenase
(MMO). Tahap pertama oksidasi metan akan menghasilkan metanol yang
kemudian dioksidasi menjadi formaldehida. Formaldehida kemudian diasimilasi
ke dalam biomassa sel atau dioksidasi lebih lanjut menjadi karbondioksida untuk
menghasilkan energi pereduksi untuk biosintesis dan hidroksilasi metan (Gambar
1) (Hanson & Hanson 1996). Auman et al. (2001) mengatakan sebagian besar
metanotrof tipe I hanya mempunyai MMO yang berikatan dengan membran
intrasitoplasmik yang disebut partikulat MMO (pMMO), sedangkan metanotrof
tipe II dan Methylococcus juga mempunyai MMO yang berada di sitoplasma yang
dinamakan soluble MMO (sMMO).
Berbagai penelitian dilakukan untuk mempelajari oksidasi metan pada
metanotrof. Benstead et al. (1998) melaporkan bahwa dua bakteri metanotrof
yaitu Methylobacter albus BG8 dan Methylosinus trichosporium OB3b mampu
mengoksidasi metan pada kultur batch dengan substrat metanol. Pada penelitian
sebelumnya oleh Best dan Higgins (1981) dilaporkan bahwa metanol merupakan
inhibitor kompetitif bagi enzim MMO. Hilangnya aktivitas epoksidasi dan
hidroksilasi kultur M. trichosporium OB3b yang ditumbuhkan dengan metanol
menunjukkan bahwa sistem enzim yang berperan bersifat indusibel. Matheson et
al. (1997) melaporkan tentang terhambatnya proses oksidasi metan pada
Methylococcus
capsulatus
(Bath)
ketika
dipaparkan
dengan
hidroklorofluorokarbon 21, difluoroklorometan, fluorodiklorometan, dan berbagai
metan terflorinasi.
Selama ini metanotrof diketahui hanya dapat mengoksidasi metan atau
sumber karbon C1 lain seperti metanol dan metilamin. Akan tetapi penelitian yang
dilakukan oleh Dedysh et al. (2005b) menunjukkan bahwa metanotrof asidofilik
dari genus Methylocella juga dapat menggunakan senyawa multikarbon sebagai
sumber karbon dan energi. Senyawa multikarbon yang dapat digunakan antara
lain asetat, suksinat, piruvat, malat, dan etanol. Genus Methylocella terdiri dari M.
palustris, M. silvestris, dan M. tundrae yang masing-masing diisolasi dari tanah
gambut, hutan, dan tundra. Anggota genus tersebut dan Methylocapsa acidiphila
mengelompok dalam satu klaster yang berbeda dengan metanotrof tipe II lain.
Bahkan Methylocella lebih dekat kekerabatannya dengan Beijerinckia indica.
Selain itu, tidak adanya sistem membran internal yang mengandung pMMO
membuat Methylocella secara morfologi dan metabolisme berbeda dengan
metanotrof lain. Dari fakta tersebut, genus Methylocella digolongkan sebagai
metanotrof fakultatif.
Gambar 1 Jalur oksidasi metan dan asimilasi formaldehida pada metanotrof
(Hanson & Hanson 1996).
Fiksasi Nitrogen pada Bakteri Metanotrof
Proses fiksasi nitrogen secara umum dapat terjadi melalui tiga cara. Pertama
adalah fiksasi nitrogen yang terjadi secara alami melalui kilat dan total nitrogen
yang difiksasi melalui proses ini diperkirakan sebesar 5-8%. Cara kedua adalah
fiksasi nitrogen dari industri pembuatan pupuk melalui proses Haber-Bosch yang
membutuhkan energi sangat besar dan memfiksasi nitrogen sebesar 50%. Terakhir
adalah fiksasi nitrogen secara biologis yang dilakukan oleh mikroorganisme
diazotrof. Diazotrof tersebut bisa hidup bebas atau bersimbiosis dengan tumbuhan
(Caton 2007).
Distribusi diazotrof di alam sangat luas dan meliputi bakteria dan arkhaea.
Fiksasi nitrogen secara biologis hanya dapat dilakukan oleh bakteri dan arkhaea
baik itu aerobik, mikroaerofilik, fakultatif maupun anaerob obligat yang
mempunyai operon nif, yang mengkodekan enzim nitrogenase (Capone et al.
2006).
Metanotrof diketahui dapat mengekspresikan enzim nitrogenase dan
memfiksasi nitrogen sebagai sumber N, meskipun proses ini terbatas pada
beberapa genus saja. Metanotrof tipe II dan anggota metanotrof tipe X yaitu genus
Methylococcus memperlihatkan kemampuan dalam memfiksasi nitrogen, sehingga
dapat diaplikasikan pada lingkungan yang jumlah nitrogennya terbatas (Carini et
al. 2003). Selain itu, Auman et al. (2001) juga melaporkan bahwa metanotrof tipe
I yaitu genus Methylomonas dan Methylobacter marinus A45 mengindikasikan
adanya kemampuan dalam memfiksasi nitrogen.
Bakteri pemfiksasi nitrogen sebagian besar mempunyai gen struktural
pengkode enzim nitrogenase yang terdiri dari nifH, D, dan K terletak
berdampingan dalam satu operon. Ward et al. (2004) melaporkan bahwa
Methylococcus capsulatus mampu memfiksasi nitrogen dan gen-gen struktural
penyandi enzim nitrogenase (nifHDK) terletak berdampingan seperti bakteri
pemfiksasi nitrogen lain. Perpanjangan dari gen-gen nif tersebut ialah nifE, nifN,
dan nifX, berfungsi untuk sintesis kofaktor Fe-Mo. Gen-gen tersebut mempunyai
kesamaan sekuen yang tinggi diantara bakteri diazotrof.
Proses fiksasi nitrogen bisa terjadi di berbagai lingkungan seperti di lahan
basah seperti sawah (Sugitha & Kumar 2009), rizosfer (Zumft 1997), lingkungan
akuatik (Hanson & Hanson 1996), lingkungan asam (Dedysh et al. 2004), acidic
forest cambisol (Dunfield et al. 2003), thermal soil (Burr et al. 2006), bahkan laut
dalam dan hydrothermal vents (Mehta et al. 2003).
Reaksi biokimia dari proses fiksasi nitrogen membutuhkan energi berupa
ATP dalam jumlah besar, sehingga fiksasi nitrogen merupakan proses yang mahal.
Selain ATP, pada proses fiksasi nitrogen juga dibutuhkan feredoksin tereduksi
sebagai donor elektron, sitokrom sebagai protein pembawa elektron, dan koenzim.
Proses ini menghabiskan energi sebanyak 16 ATP untuk memfiksasi satu mol N2,
dengan stoikiometri sebagai berikut:
N2 + 8e- + 16 ATP + 16 H2O
2NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi + 8 H+
(Caton 2007).
Enzim Nitrogenase
Konversi nitrogen menjadi ammonia dikatalisis oleh enzim nitrogenase.
Enzim ini merupakan suatu kompleks metallo-protein yang mempunyai struktur
yang conserved. Nitrogenase terdiri dari dua komponen protein yang dapat larut
yaitu komponen I berupa protein Fe-Mo dan komponen II yaitu protein Fe.
Protein Fe berfungsi sebagai donor elektron yang bergantung ATP yang ditransfer
kepada komponen I, sedangkan protein Fe-Mo mengandung situs katalitik enzim
(Chai 2007). Penambatan nitrogen berlangsung secara anaerob atau mikroaerob,
karena keberadaan oksigen akan dapat menghambat aktivitas enzim nitrogenase.
Komponen I (dinitrogenase) yang dikodekan oleh nifDK mempunyai berat
molekul antara 220-250 kiloDalton. Subunit ini berbentuk tetramer dengan dua
metallo-komplek heterodimer yang disebut klaster fosfat (P) dan kofaktor besi
molibdenum (FeMo-co). Satu subunit memiliki sepasang α-β dan sepasang klaster
P dan molekul FeMo-co. Molekul FeMo-co terdiri dari satu gugus homositrat dan
MoFe3-S3. Komponen yang lebih kecil yaitu komponen II (dinitrogenase
reduktase) dikodekan oleh nifH memiliki berat molekul sekitar 60-70 kiloDalton.
Komponen II tersusun oleh dua subunit identik α yang mempunyai gugus 4Fe-4S
di tengah. Komponen ini juga memiliki dua situs pengikatan Mg-ATP yang
terletak di setiap subunit, dimana bagian ini adalah donor elektron obligat kepada
komplek Fe-Mo. Oleh karena itu, protein ini sangat esensial untuk proses fiksasi
nitrogen (Caton 2007).
Nitrogenase alternatif dibentuk pada saat molibdenum terbatas. Enzim
nitrogenase ini tidak mengandung molibdenum, tetapi digantikan oleh vanadium
dan besi atau besi saja. Nitrogenase alternatif vanadium dan nitrogenase yang
hanya mengandung besi saja masing-masing dikodekan oleh gen vnf dan anf dan
mempunyai struktur heksamer yang dikodekan oleh operon vnfDGK dan anfDGK.
(Jäntti 2007; Caton 2007).
Enzim nitrogenase sangat sensitif terhadap oksigen. Oleh karena itu oksigen
merupakan salah satu faktor yang mengatur proses fiksasi nitrogen. Oksigen akan
merusak enzim nitrogenase dan menghambat proses fiksasi nitrogen. Untuk
organisme pemfiksasi nitrogen anaerob obligat, pengaturan terhadap konsentrasi
oksigen tidak menjadi masalah karena lingkungan tempat hidupnya bebas oksigen,
sedangkan organisme diazotrof aerob dan anaerob fakultatif mempunyai suatu
mekanisme atau strategi tertentu untuk melindungi enzim nitrogenase dari paparan
oksigen (Jäntti 2007).
Gen nifH dan nifD
Proses reduksi nitrogen menjadi ammonia secara genetik dikontrol oleh gen
nif. Terdapat sekitar 20 gen nif pada Klebsiella pneumonia yang menyandikan
aktivitas fiksasi nitrogen. Dalam proses fiksasi nitrogen terdapat sekitar 20 kb
DNA untuk menyandikan gen-gen yang dibutuhkan untuk mengekspresikan
komplek enzim (Tabel 1) (Lee et al. 2000; Caton 2007).
Tabel 1 Gen nif dan fungsinya
Gen nif
Fungsi
Aktivator transkripsi
nifA
Sintesis kofaktor Fe-Mo
nifB
Maturasi dan aktivasi nifH
nifZ
Struktur nitrogenase; protein Fe
nifH
Struktur nitrogenase; protein Fe-Mo subunit α
nifD
Struktur nitrogenase; protein Fe-Mo subunit
nifK
Sintesis kofaktor Fe-Mo
nifE
Sintesis kofaktor Fe-Mo
nifN
Sintesis kofaktor Fe-Mo
nifX
Sintesis kofaktor Fe-Mo
nifQ
Maturasi dan aktivasi, kumpulan dari klaster Fe-S
nifU
Maturasi dan aktivasi, sistein desulfurase homodimer
nifS
Sintesis kofaktor Fe-Mo; homositrat sintase
nifV
Maturasi dan aktivasi; perlindungan terhadap oksigen
nifW
dari protein Fe-Mo
Belum diketahui
nifT
nifY/nafY Chaperon untuk protein Fe-Mo; nafY merupakan FeMoco carrier
Sintesis FeMo-co
nifE
Flavodoxin; donor electron untuk nifH
nifM
nifF
Negative regulatory element
nifL
Positive regulatory element
Gen nifH dan nifD adalah gen yang sangat penting dalam proses fiksasi
nitrogen karena menyandikan komplek enzim nitrogenase. Pada sebagian besar
diazotrof, gen nifHDK letaknya saling bersebelahan. Analisis sekuen dari gen-gen
yang
berhubungan
dengan
fiksasi
nitrogen
dari
berbagai
diazotrof
memperlihatkan penataan gen nif dan asosiasinya masing-masing sangat berbeda.
Pada alfa dan gamma proteobakteria yang bertanggung jawab dalam proses
transkripsi enzim nitrogenase ialah operon nifHDK, sedangkan pada diazotrof
simbiosis yang tumbuh lambat enzim nitrogenasenya dikodekan oleh dua operon
nifH dan nifDK (Choo et al. 2003).
Gen nifH sering digunakan sebagai penanda suatu mikroorganisme yang
dapat memfiksasi nitrogen. Sekuen gen nifH dari bakteri pada berbagai habitat
telah dibuat basis datanya dan beberapa primer oligonukleotida universal untuk
mengamplifikasi gen nifH telah diketahui. Gen struktural lain pengkode
nitrogenase ialah nifD. Gen nifD juga bisa digunakan sebagai penanda
kemampuan suatu mikroorganisme dalam memfiksasi nitrogen, akan tetapi primer
untuk amplifikasinya masih sedikit yang telah diketahui. Hal ini dapat dikatakan
bahwa protein NifD kurang conserved jika dibandingkan dengan NifH, sehingga
seleksi primer untuk deteksi dan amplifikasi gen nifD masih menjadi masalah
yang signifikan (Fedorov et al. 2008). Ueda et al. (1995) mengatakan bahwa gen
nifH sama sekali tidak mengalami perubahan selama melewati proses evolusi. Gen
nifH mempunyai sekuen basis data non-ribosomal terbesar dari berbagai
mikroorganisme. Gen nifH memperlihatkan keunikan filogenetik sehingga dapat
dibuat hubungan kekerabatan dari mikroorganisme diazotrof. Karena sifatnya
yang conserved, nifH merupakan alat molekuler yang ideal untuk mempelajari
fiksasi nitrogen secara biologis di lingkungan. Selain itu nifH dapat juga
digunakan untuk menentukan distribusi filogenetik dari setiap kelompok diazotrof.
Karakterisasi Gen nif pada Bakteri Metanotrof
Beberapa peneliti telah melakukan karakterisasi gen nif pada kelompok
bakteri metanotrof. Auman et al. (2001) melakukan karakterisasi fragmen gen
nifH dari metanotrof tipe I dan tipe II melalui amplifikasi dengan PCR dan
sekuensing DNA. Dari analisis sekuen nifH memperlihatkan bahwa sekuen nifH
dari metanotrof tipe I (Methylobacter marinus A45, Methylomonas sp. LW 13 dan
LW 15, dan M. methanica S1) sekelompok dengan sekuen nifH dengan diazotrof
dari gammaproteobakteria. Sedangkan metanotrof tipe II (Methylocystis sp. LW 2
dan LW 5, Methylosinus sp. PW 1, LW 3, LW 8, dan LW 4, dan M. trichosporium
OB3b) sekelompok dengan sekuen nifH dengan diazotrof dari alfaproteobakteria.
Hasil penelitian yang dilakukan oleh Auman et al. (2001) menunjukkan
perbandingan sekuen NifH pada tiga isolat Methylomonas memperlihatkan
homologi yang tinggi (95-99%) dengan sekuen NifH bakteri pemfiksasi nitrogen
yang diamplifikasi dari sampel perakaran padi dan danau air tawar. Sekuen NifH
isolat metanotrof tipe II memperlihatkan homologi sebesar 94-99% dengan sekuen
NifH dari berbagai lingkungan termasuk perakaran padi, danau air tawar, lautan
oligotrofik, dan tanah hutan. Hasil tersebut memperlihatkan bahwa metanotrof
pemfiksasi nitrogen mempunyai penyebaran yang luas dan berperan penting
dalam siklus nitrogen di berbagai lingkungan
Dedysh et al. (2004) melaporkan bahwa bakteri metanotrof asidofilik secara
filogenetik berkerabat dekat dengan bakteri heterotrof pemfiksasi nitrogen dari
genus Beijerinckia. Sekuen gen nifH dan nifD dari isolat metanotrof asidofilik
Methylocella dan Methylocapsa serta dari Beijerinckia dibandingkan dengan
sekuen gen nifH dan nifD dari isolat metanotrof asidofilik yaitu tipe I,
alfaproteobakteria (Methylosinus dan Methylocystis) dan metanotrof tipe II,
gammaproteobakteria. Dalam proses amplifikasi gen nifH digunakan kombinasi
primer F1 dan nifH-r yang menghasilkan produk PCR 453 bp. Dari hasil
amplifikasi nifD diketahui bahwa gen nifH dan nifD terletak pada operon yang
sama yang menunjukkan bahwa organisasi gen nif pada isolat metanotrof
asidofilik sama dengan alfaproteobakteria dan gammaproteobakteria (nifHDK).
Penelitian yang dilakukan Dedysh et al. (2004) juga menunjukkan bahwa
nilai kemiripan sekuen NifH dan NifD pada Methylocapsa acidiphila B2 dan
Beijerinckia lebih tinggi (98.5 % dan 96.6 %) dibandingkan dengan nilai
kemiripan berdasarkan 16S rRNA. Dedysh et al. (2004) mengatakan,
kemungkinan dua bakteri tersebut berasal dari nenek moyang bakteri pemfiksasi
nitrogen asidofilik yang sama.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan dari bulan Juli 2010 sampai dengan Maret 2011 di
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah inkubator bergoyang,
sentrifus, laminar air flow, lemari pendingin, autoklaf, pipet mikro. Bahan-bahan
yang digunakan ialah isolat bakteri metanotrof asal sawah (BGM1, BGM3, dan
BGM9) yang berhasil diisolasi dari penelitian sebelumnya (Hapsary 2008) untuk
diuji aktivitas oksidasi metan dan akumulasi ammonium serta karakterisasi gen
nifH dan nifDnya dan isolat SS1, SS3, SS10, ST18, SP3, dan INP4 (Reginaldi
2010) untuk dikarakterisasi gen nifH dan nifDnya, media Nitrate Mineral Salt
(NMS), bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA dan PCR.
Uji Aktivitas Oksidasi Metan
Uji aktivitas oksidasi metan dilakukan dengan mengkulturkan ketiga isolat
uji (BGM1, BGM3, dan BGM9) ke dalam media cair NMS bebas nitrat dan
ammonium dengan sumber karbon gas metan. Kultur sebanyak lima ml
diinokulasikan ke dalam 40 ml media NMS cair pada botol serum volume 120 ml.
Komposisi gas di headspace
diatur menjadi 50 % metan dan 50 % udara,
kemudian diinkubasi di atas inkubator bergoyang pada suhu 30 ºC pada kondisi
gelap selama 12 hari. Uji aktivitas oksidasi metan dilakukan dengan mengukur
konsentrasi gas metan pada bagian headspace menggunakan kromatografi gas
setiap dua hari sekali (Kumaraswamy et al. 2001).
Uji Akumulasi Ammonium
Uji ini dilakukan dengan mengkulturkan isolat BGM1, BGM3, dan BGM9
ke dalam 40 ml media cair NMS bebas nitrat dan ammonium lalu diinkubasi pada
suhu 30 ºC selama 19 hari di atas inkubator bergoyang. Untuk pembuatan kurva
standar ammonium digunakan konsentrasi ammonium 5, 10, 40, 80, dan 100 µM
dari stok larutan NH4Cl 1 mM. Kultur bakteri diambil setiap tiga hari sekali
kemudian disentrifugasi pada 4000 g selama 10 menit, supernatan yang
didapatkan digunakan sebagai sampel. Dua ml sampel dan larutan standar diuji
konsentrasi ammoniumnya menggunakan spektrofotometer dengan panjang
gelombang 640 nm (Hans 1998). Densitas sel dihitung pada panjang gelombang
620 nm.
Isolasi DNA, Amplifikasi Gen nifH dan nifD, dan Visualisasi Amplikon
Isolasi DNA genom dilakukan dengan metode Lazo (Lazo et al. 1987).
Amplifikasi gen nifH dan nifD menggunakan primer spesifik. Primer spesifik untuk
gen nifH yang digunakan adalah nH17K-F (TAYGGNAASGGCGGTATCGG
YAA)
dan
nH139P-R
(TGGCATSGCRAARCCRCCGCAMACMACGTC)
(Elbetagy & Ando 2008). Sedangkan primer spesifik untuk gen nifD yang
digunakan adalah primer nifHD-F (CAGGAAATCTACATCGTCATGTC) dan
nifD-R (TCCCANGARTGCATCTGRCGGA) (Dedysh et al. 2004).
Reaksi PCR dengan menggunakan volume campuran 50µL. Komposisi
reaksi PCR yang digunakan adalah sebagai berikut: 10x KOD Hot Start DNA
Polymerase Buffer (konsentrasi akhir 1x) sebanyak 5µL, 25mM MgSO4
(konsentrasi akhir 1.5mM) 3 µL, 2mM dNTPs (konsentrasi akhir 0.2mM) 5µL,
10µM primer (konsentrasi akhir 0.3µM) 1.5µL, DNA cetakan (100ng) 1µL, dan
1µL KOD Hot Start DNA Polymerase (1U/µL). Elektroforesis dilakukan dengan
menggunakan agarose 1% pada tegangan listrik 70V selama 45 menit. Visualisasi
menggunakan Ethidium Bromide (EtBr) dan diamati di bawah UV transluminator.
Sekuensing DNA dan Analisis Bioinformatika
Pengurutan DNA hasil amplifikasi dilakukan dengan memanfaatkan jasa
perusahaan sekuensing 1st Base, Singapura. Sekuen yang diperoleh dijajarkan
dengan data di GenBank menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X dari situs
NCBI
(National
Center
for
Biotechnology
Information)
melalui
http://www.ncbi.nlm.nih.gov. untuk mengetahui tingkat kemiripan gen nif dari isolat
yang dianalisis. Deduksi sekuen DNA menjadi protein dilakukan menggunakan
Expasy translate tools. Konstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan
menggunakan program MEGA 4.0, metode Neighbor Joining (NJ) (Tamura et al.
2007) dengan bootstrap 1000x, sedangkan analisis protein dilakukan menggunakan
Conserved Domain dan SCAN PROSITE. Visualisasi struktur tiga dimensi protein
menggunakan program Cn3D 4.1.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pertumbuhan dan Aktivitas Oksidasi Metan
Uji oksidasi metan dilakukan untuk menentukan apakah isolat BGM1,
BGM3, dan BGM9 mampu mengoksidasi metan selama periode inkubasi. Hasil
uji oksidasi metan, menunjukkan bahwa ketiga isolat tersebut mampu
mengoksidasi metan sebagai sumber karbon dan energi. Hal ini terlihat dari
densitas sel ketiga isolat yang menunjukkan peningkatan selama periode inkubasi.
Isolat BGM1 mempunyai laju oksidasi metan tertinggi sebesar 232.71
µmol/mL/hari, BGM3 sebesar 376.79 µmol/mL/hari, dan BGM9 sebesar 235.93
0.018
0.016
0.014
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002
0
460
410
360
310
260
210
160
110
60
10
4
6
8
10
Densitas Sel
Oksidasi Metan
(µmol/ml/hari)
µmol/mL/hari (Gambar 2, 3, dan 4).
12
Hari
0.018
0.016
0.014
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002
0
460
410
360
310
260
210
160
110
60
10
4
6
8
10
Densitas Sel
Oksidasi Metan
(µmol/ml/hari)
Gambar 2 Aktivitas oksidasi metan ( ) dan OD sel (
) isolat BGM1
pada media NMS bebas nitrat dan ammonium.
12
Hari
Gambar 3 Aktivitas oksidasi metan ( ) dan OD sel (
) isolat BGM3
pada media NMS bebas nitrat dan ammonium.
0.018
0.016
0.014
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002
0
460
410
360
310
260
210
160
110
60
10
4
6
8
10
Densitas Sel
Oksidasi Metan
(µmol/ml/hari)
12
Hari
Gambar 4 Aktivitas oksidasi metan ( ) dan OD sel (
pada media NMS bebas nitrat dan ammonium.
) isolat BGM9
Kinetika pertumbuhan sel dapat memberikan informasi tentang kecepatan
pertumbuhan sel. Parameter yang dihitung dalam kinetika pertumbuhan sel adalah
laju pertumbuhan spesifik (µ) dan percepatan pertumbuhan maksimum (Vmax).
Laju pertumbuhan spesifik isolat BGM1, BGM3, dan BGM9 masing-masing
sebesar 0.134 hari-1(r2 = 0.97), 0.151 hari-1 (r2 = 0.97), dan 0.130 hari-1 (r2 = 0.98).
Isolat BGM1 mempunyai nilai Vmax sebesar 0.51 hari-1 (r2 = 0.74), BGM3
sebesar 0.53 hari-1 (r2 = 0.86), dan BGM9 sebesar 0.54 hari-1 (r2 = 0.81).
Akumulasi Ammonium dalam Kultur Bakteri Metanotrof
Hasil uji akumulasi ammonium memperlihatkan bahwa ketiga isolat bakteri
metanotrof BGM1, BGM3, dan BGM9 yang ditumbuhkan pada media NMS
bebas nitrat dan ammonium, mampu mengakumulasi ammonium. Konsentrasi
ammonium dalam kultur ketiga isolat bakteri tersebut meningkat selama periode
inkubasi dan mencapai konsentrasi tertinggi pada hari terakhir inkubasi.
Konsentrasi ammonium tertinggi pada isolat BGM1, BGM3, dan BGM9 masingmasing sebesar 24.79 µM, 17.77 µM, dan 13.98 µM (Gambar 5, 6, dan 7).
0.11
0.1
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
Konsentrasi Ammonium
(µM)
30
25
20
15
10
5
0
1
4
7
10
13
16
Densitas Sel
19
Hari
) isolat BGM1
0.11
0.1
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
30
25
20
15
10
5
0
1
4
7
10
13
16
Densitas Sel
Konsentrasi Ammonium
(µM)
Gambar 5 Konsentrasi ammonium (
) dan OD sel (
pada media NMS bebas nitrat dan ammonium.
19
Hari
) isolat BGM3
0.11
0.1
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
30
25
20
15
10
5
0
1
4
7
10
13
16
Densitas Sel
Konsentrasi Ammonium
(µM)
Gambar 6 Konsentrasi ammonium (
) dan OD sel (
pada media NMS bebas nitrat dan ammonium.
19
Hari
Gambar 7 Konsentrasi ammonium (
) dan OD sel (
pada media NMS bebas nitrat dan ammonium.
) isolat BGM9
Isolat BGM1 mempunyai laju akumulasi ammonium tertinggi sebesar 2.69
Laju Akumulasi Ammonium
(µmol/ml/hari)
± 0.75 µmol/mL/hari (Gambar 8).
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
2.69
1.73
0.92
BGM1
BGM3
BGM9
Isolat
Gambar 8 Laju akumulasi ammonium isolat BGM1, BGM3, dan BGM9.
Karakteristik nifD dan nifH dari Bakteri Metanotrof
Ketiga isolat yang mempunyai aktivitas oksidasi metan dan akumulasi
ammonium yaitu BGM1, BGM3, dan BGM9 dan enam isolat lain yang
merupakan isolat terpilih dan mampu mengakumulasi ammonium yaitu SS1, SS3,
SS10, ST18, SP3, dan INP4 (Reginaldi 2010) diamplifikasi gen nifH dan nifDnya.
Amplifikasi berhasil dilakukan dengan menggunakan pasangan primer nifHD-F
dan nifD-R. Pasangan primer tersebut berhasil mengamplifikasi gen nifD isolat
BGM3 dan BGM9. Sedangkan isolat BGM1 dan SP3 tidak berhasil
teramplifikasi. Hasil visualisasinya memperlihatkan pita DNA berukuran 1.9 kb
(Gambar 9).
M
1
2
3
4
5
6
7
10000 bp
~1900 bp
2000 bp
1500 bp
300 bp
Gambar 9 Elektroforesis gel agarose 1% gen nifD berukurun 1900 bp
yang diamplifikasi dengan PCR (Keterangan : M= 1 kb ladder,
Sumur 1= BGM3; 2= BGM9; 3= SS1; 4= SS3; 5= SS10; 6=
ST18; 7= INP4).
Isolat BGM3 dan BGM9 serta enam isolat lain (SS1, SS3, SS10, ST18, SP3,
INP4) teramplifikasi gen nifHnya menggunakan pasangan primer nH17K-F dan
nH139P-R. Hasil visualisasi amplikon pada gel elekroforesis yang diamati di atas
UV transluminator memperlihatkan pita DNA berukuran 400 bp (Gambar 10).
M
1
2
3
4
5
6
7
8
10000 bp
500 bp
300 bp
~ 400 bp
Gambar 10 Elektroforesis gel agarose 1% gen nifH berukuran 400 bp
yang diamplifikasi dengan PCR (Keterangan: M= 1 kb
ladder, sumur 1= BGM3, 2= BGM9, 3= SS1, 4= SS3, 5=
SS10, 6= ST18, 7= INP4, 8= SP3).
Produk amplifikasi gen nifD dan nifH disekuen untuk mengetahui urutan
nu