N2 fixation and methane oxidation activity of mixed of culture of Azotobacter sp., Azospirillum sp., and Methanotrophic Bacteria

AKTIVITAS FIKSASI NITROGEN DAN OKSIDASI METAN
KOMBINASI BIAKAN Azotobacter sp., Azospirillum sp., DAN
BAKTERI METANOTROF

IVAN PERMANA PUTRA

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

ABSTRAK
IVAN PERMANA PUTRA. Aktivitas Fiksasi N2 dan Oksidasi Metan Kombinasi Biakan
Azotobacter sp., Azospirillum sp., dan Bakteri Metanotrof. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA
dan ALINA AKHDIYA.
Bakteri metanotrof merupakan bakteri pengoksidasi metan. Selain itu, bakteri metanotrof
tipe II dan tipe X juga mampu memfiksasi nitrogen karena adanya enzim nitrogenase. Tetapi
aktivitas oksidasi metan dihambat oleh keberadaan amonium. Penelitian ini dilakukan untuk
menguji aktivitas oksidasi metan dan fiksasi nitrogen keempat isolat bakteri metanotrof yaitu
BGM 1, BGM 5, BGM 9, dan SKM 14 yang dikombinasikan dengan bakteri penambat nitrogen

(Azotobacter dan Azospirillum). Sebanyak 6 kombinasi dikulturkan kemudian diinokulasikan ke
campuran media NMS tanpa unsur N, kemudian diuji aktivitas oksidasi metan dan fiksasi nitrogen.
Aktivitas oksidasi metan tertinggi terdapat pada kombinasi isolat BGM 5, BGM 9, Azospirillum,
dan Azotobacter yaitu sebesar 184,5 x 10-8 M/sel/hari . Aktivitas akumulasi amonium tertinggi
terdapat pada kombinasi isolat BGM 5, BGM 9, dan Azotobacter yaitu sebesar 4,075 M.
Aktivitas oksidasi metan dan akumulasi amonium bakteri metanotrof menunjukkan hasil yang
lebih tinggi saat dikombinasikan dengan bakteri penambat nitrogen.
Kata kunci: Metan, bakteri metanotrof, bakteri penambat nitrogen,oksidasi metan, fiksasi nitrogen

ABSTRACT
IVAN PERMANA PUTRA. N2 Fixation and Methane Oxidation Activity of mixed of culture of
Azotobacter sp., Azospirillum sp., and Methanotrophic Bacteria. Under supervision of IMAN
RUSMANA and ALINA AKHDIYA.
Metanotrophs bacteria are methane oxidizing bacteria. Methanotrophic bacteria especially
type II and type X were also able to fix nitrogen using nitrogenase enzyme. This reasearch was
conducted to determine activity of methane oxidation and nitrogen fixation of four isolates of
methanotropic bacteria i.e. BGM 1, BGM 5, BGM 9, and SKM 14 which were combined with
nitrogen-fixing bacteria (Azotobacter sp. and Azospirillum sp.). Six combinations were cultured
and then inoculated into nitrogen free NMS medium. Activity of methane oxidation and nitrogen
fixation activity was analysed. The highest methane oxidation activity was found in the mixed

culture of BGM 9, BGM 5, Azotobacter sp., and Azospirillum sp. isolates. The activity was 184.5
x 10-8 M/cell /day. The highest accumulation of ammonium was found in the mixed culture of
BGM 5, BGM 9, and Azotobacter sp. isolates. The concentration of accumulated ammonium was
4.075 M. Methane oxidation activity and ammonium accumulation of methanotrophic bacteria
showed
higher result when they were combined with nitrogen fixing bacteria.
Key words: Methane, methanotrophic bacteria, nitrogen-fixing bacteria, methane oxidation,
nitrogen-fixation

AKTIVITAS FIKSASI NITROGEN DAN OKSIDASI METAN
KOMBINASI BIAKAN Azotobacter sp., Azospirillum sp., DAN
BAKTERI METANOTROF

IVAN PERMANA PUTRA

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi


DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

Judul
Nama
NIM

: Aktivitas Fiksasi Nitrogen dan Oksidasi Metan Kombinasi Biakan
Azotobacter sp., Azospirillum sp., dan Bakteri Metanotrof
: Ivan Permana Putra
: G34070016

Menyetujui:
Pembimbing I,

Pembimbing II,


(Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si.)
NIP 196507201991031002

(Alina Akhdiya, M.Si.)
NIP 196812082001122001

Mengetahui:
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

(Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.S.)
NIP 196410021989031002

Tanggal Lulus:

PRAKATA

Alhamdulillahirobbil’alamin, puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT yang
telah memberikan rahmat dan karunia sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini.
Tema yang dipilih dalam penelitian ini adalah mengenai aktivitas fiksasi N2 dan oksidasi metan

kombinasi biakan Azotobacter sp., Azospirillum sp., dan bakteri Metanotrof. Penelitian ini
dilaksanakan mulai bulan Januari hingga Mei 2011 di Laboratorium Mikrobiologi Departemen
Biologi, Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si. dan Ibu
Alina Akhdiya, M.Si. selaku pembimbing atas arahan dan bimbingan yang diberikan dalam
pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terima kasih yang sebesar-besarnya
kepada Keluarga tercinta Bapak, Mamak, Abang, Adek dan Keluarga Besar atas do’a, dukungan,
dan kasih sayang yang diberikan. Terima kasih juga kepada Bu Ratna, Kak Tea, Kak Vina, Kak
Fina, Ka Tyas, Alm. Pak Sesep, Bang jo, Rani, Tira, Atun, Vita, Hana, dan teman-teman
seperjuangan di Biologi 44 atas semua kebersamaan dan motivasi yang telah diberikan.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.

Bogor, 2011

Ivan Permana Putra

RIWAYAT HIDUP
Ivan Permana Putra dilahirkan di Manggar-Bangka Belitung pada tanggal 10 september
1989 dari ayahanda Wahyu Setyawan dan ibunda Hartini. Penulis merupakan anak ke-dua dari tiga
bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari SMU Plus Negeri 1 Pemali Bangka-Belitung dan lolos

seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif sebagai ketua divisi Budaya, Olahraga, dan
Seni (BOS) Ikatan Keluarga Pelajar Belitung (IKPB), Anggota UKM sepakbola IPB 2007-2008,
Duta Lingkungan FMIPA IPB 2009-2010, staff divisi Biosains Himpunan Mahasiswa Biologi
(Himabio) pada tahun 2009-2010, Ketua Kelompok PKMP lolos didanai DIKTI tahun 2008
(Ekstrak Karamunting Sebagai Zat Antioksidan) dan 2009 (Potensi Lumut Sebagai Zat
Antimikrob).
Penulis merupakan asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar Tingkat Persiapan
Bersama IPB pada tahun 2009-2011, Ekologi Dasar tahun 2009, Fisiologi Prokariot tahun 2009,
serta Ilmu Lingkungan tahun 2010. Penulis juga merupakan pengajar biologi bimbingan belajar
B’expert tahun 200λ-2011, Primagama tahun 211, dan Mitra Siswa tahun 2010-2011.
Pada tahun 2009, penulis melakukan Studi Lapang di Wana Wisata Cangkuang
Sukabumi, Jawa Barat dengan judul laporan Laju Denitrifikasi dan Nitrifikasi Mikroba Tanah
Hutan Cangkuang’. Pada tahun 2010, penulis melakukan Praktik Kerja Lapang di Balai Benih Ikan
Air Tawar Mempaya Dinas Kelautan dan Perikanan Kabupaten Belitung Timur dari bulan Juli
sampai bulan Agustus dengan judul laporan “Pengembangan Benih Ikan Lele Dumbo Dengan
Pemijahan Kawin Suntik di Balai Benih Ikan Air Tawar Mempaya Dinas Kelautan dan Perikanan
Kabupaten Belitung Timur ”.


DAFTAR ISI
Halaman

DAFTAR TABEL ................................................................................................ viii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ viii
PENDAHULUAN................................................................................................... 1
Latar Belakang .................................................................................................... 1
Tujuan ................................................................................................................. 1
Waktu dan Tempat .............................................................................................. 1
BAHAN DAN METODE ....................................................................................... 1
Isolat Bakteri ...................................................................................................... 1
Peremajaan dan Perbanyakan Isolat. ............................................................... 2
Formulasi Kultur Bakteri Kombinasi .............................................................. 2
Uji Aktivitas Oksidasi Metan .......................................................................... 2
Analisis Kadar Amonium ................................................................................ 2
Penghitungan Populasi Bakteri dalam Kultur ................................................. 2
Pengukuran Optical Density (OD) Kultur Kombinasi .................................... 2
HASIL ..................................................................................................................... 2
Peremajaan dan Perbanyakan Isolat .................................................................... 2

Uji Aktivitas Oksidasi Metan .............................................................................. 3
Penghitungan Populasi Bakteri dalam Kultur ..................................................... 3
Optical Density (OD) Kultur Bakteri Kombinasi ............................................... 3
PEMBAHASAN ..................................................................................................... 4
SARAN ................................................................................................................... 5
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................. 5
LAMPIRAN ............................................................................................................ 7

DAFTAR TABEL
Halaman
1

Populasi masing-masing bakteri pada tiap kombinasi .......................................................... 4

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Morfologi koloni isolat BGM 9 dengan masa inkubasi lima hari pada suhu 27-29°C........... 3
2 Aktivitas oksidasi CH4 kultur kombinasi ............................................................................... 3
3 Aktivitas akumulasi amonium kultur kombinasi..................................................................... 3
4 Rapat optis masing-masing kultur kombinasi ......................................................................... 4


DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Kurva standar ammonium ...................................................................................................... 8
2 Koloni isolat kombinasi hasil pencawanan ............................................................................. 8

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Metan (CH4) merupakan salah satu gas
yang berkontribusi terhadap pemanasan
global. Intergovernmental Panel of Climate
Change (2007), menyatakan bahwa kontribusi
metan terhadap pemanasan global menempati
urutan ketiga setelah CFC dan N2O.
Kontribusi metan terhadap pemanasan global
lebih besar dibandingkan dengan CO2, karena
CH4 lebih efektif menyerap radiasi pada
panjang gelombang 4-100 nm (irradiasi sinar

infra merah) dibandingkan dengan CO2
(Lelieveld et al. 1993; Hanson & Hanson
1996). Sebesar 43% dari emisi metan ke
atmosfer berasal dari lahan basah, yakni 20%
dari sawah dan sisanya berasal dari lahan rawa
(Wild
1995;
Notohadiprawiro
2006).
Indonesia dengan luas sawah lebih dari 9 juta
ha diduga memberi kontribusi terhadap total
emisi metan. Untuk mewujudkan sistem
pertanian lahan sawah yang ramah
lingkungan, dapat dilakukan dengan menekan
tingkat emisi gas metan diantaranya melalui
pemanfaatan bakteri metanotrof. Emisi metan
dari lingkungan akuatik seperti tanah sawah
pada dasarnya ditentukan oleh dua proses
mikrobial yang berbeda, yaitu produksi metan
dan konsumsi metan (Rudd dan Taylor 1980).

Pada tanah sawah, metan diproduksi sebagai
hasil antara dan hasil akhir dari berbagai
proses mikrobial, seperti dekomposisi
anaerobik bahan organik oleh Arkea
Methanogen. Sementara sebagian dari metan
yang diproduksi akan dioksidasikan oleh
bakteri metanotrof yang bersifat aerobik di
lapisan permukaan tanah dan di zona
perakaran. Bakteri metanotrof merupakan
bakteri yang memanfaatkan CH4 sebagai
donor elektron untuk menghasilkan energi dan
sebagai sumber karbonnya (Hanson dan
Hanson 1996).
Pupuk nitrogen (N) dalam bentuk urea
sudah menjadi kebutuhan pokok bagi petani
sebagai upaya pemenuhan kebutuhan unsur N
pada lahan pertanian. Umumnya petani
memberikan pupuk dengan takaran tinggi,
melebihi kebutuhan pada lahan tanaman,
sehingga menyebabkan pemborosan dan
pencemaran lingkungan. Salah satu solusi
tepat untuk mengatasi hal tersebut ialah
dengan menggunakan agen pemfiksasi
nitrogen biologis seperti Azotobacter dan
Azospirillum. Dinitrogen diubah menjadi
amonium melalui reduksi elektron dan
protonasi gas dinitrogen. Selain mampu
menambat nitrogen, kedua bakteri ini juga

menghasilkan zat pengatur tumbuh giberelin,
sitokinin, dan asam indol asetat yang dapat
memacu pertumbuhan tanaman (Alexander
1977). Berbagai hasil penelitian menunjukkan
bahwa inokulasi tanah atau benih dengan
bakteri yang efektif menambat nitrogen dapat
meningkatkan
produktivitas
tanaman.
Poduktivitas panen padi yang dinokulasikan
dengan Azospirillum dan Azotobacter
dilaporkan mengalami peningkatan sebesar
5-60% (Kumar dan Balasubramanian 1986).
Informasi tentang aktivitas oksidasi metan
dan fiksasi nitrogen bakteri metanotrof yang
dikombinasikan dengan Azotobacter dan
Azospirillum di Indonesia masih jarang.
Berdasarkan penelitian Chatrina (2010)
diketahui bahwa kombinasi isolat bakteri
metanotrof BGM 5 dan BGM 9 memiliki
aktivitas oksidasi metan tertinggi. Penelitian
lainnya menunjukkan bahwa kombinasi SKM
14 dan BGM 1 merupakan kombinasi bakteri
metanotrof yang memiliki kemampuan
oksidasi metan dalam lumpur steril tertinggi
(Hanif 2010). Keempat isolat tersebut
berpotensi dikembangkan lebih lanjut dengan
cara dikombinasikan dengan bakteri penambat
nitrogen yaitu Azospirillum dan Azotobacter.
Informasi
mengenai
kajian
terhadap
kombinasi ini dalam mengoksidasi metan dan
menambat N2 penting dilakukan, sehingga
hasilnya
dapat
dimanfaatkan
untuk
mewujudkan sistem pertanian yang ramah
lingkungan.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
aktivitas kultur kombinasi Metanotrof,
Azotobacter sp., dan Azospirillum sp. dalam
mereduksi emisi metan dan memfiksasi
nitrogen.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Januari sampai dengan bulan Mei 2011 di
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen
Biologi, FMIPA, IPB.

BAHAN DAN METODE

Isolat Bakteri
Isolat bakteri metanotrof BGM 1, BGM
5, BGM 9, dan SKM 14 (Hapsari 2008), isolat
Azotobacter dan Azospirillum koleksi
Departemen Biologi FMIPA IPB.

2

Peremajaan dan Perbanyakan Isolat.
Isolat BGM 1,BGM 5, BGM 9, dan SKM 14
diremajakan pada medium NMS + 1%
methanol (Lampiran 3). Isolat Azotobacter
dan Azospirillum diperbanyak dengan
menggunakan media NMS + sukrosa 1%
(Lampiran 3). Kemudian keduanya diinkubasi
pada suhu ruang selama 5-7 hari (Hanson
1998). Koloni-koloni yang terpisah kemudian
digores kembali sampai didapatkan kolonikoloni yang murni. Isolat murni yang didapat
disimpan pada medium agar miring NMS
yang diberi 1 % metanol untuk bakteri
metanotrof dan NMS yang diberi 1% sukrosa
untuk bakteri pemfiksasi nitrogen.
Formulasi Kultur Bakteri Kombinasi.
Formulasi
dilakukan
dengan
mengkombinasikan isolat bakteri terbaik
metanotrof dalam mengoksidasi metan
berdasarkan penelitian Chatrina dan Hanif
tahun 2010 dengan bakteri
penambat
nitrogen. Kombinasi yang dibuat adalah :
kombinasi A (BGM 1, SKM 14, dan
Azospirillum), kombinasi B (BGM 1, SKM
14, dan Azotobacter), kombinasi C (BGM 5,
BGM 9, dan Azospirillum), kombinasi D
(BGM 5, BGM 9, dan Azotobacter),
kombinasi E (BGM 1, SKM 14, Azospirillum,
dan Azotobacter), serta kombinasi F (BGM 5,
BGM 9, Azospirillum, dan Azotobacter).
Masing-masing kombinasi dibuat sebanyak
tiga ulangan dan sebagai kontrol digunakan
media cair yang tidak diinokulasikan
kombinasi bakteri. Sebanyak 0,1ml isolat
bakteri metanotrof dan penambat N2
diinokulasikan ke dalam 9 ml medium
NMS+1% sukrosa bebas nitrogen dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 15 hari.
Komposisi gas di bagian head space dibuat
menjadi 50% metan dan 50% udara. Inkubasi
dilakukan selama 15 hari diatas mesin
pengocok pada suhu ruang 27-30ºC dan
kondisi gelap.
Uji Aktivitas Oksidasi Metan. Pada
akhir masa inkubasi dilakukan pengukuran
gas metan tersisa pada bagian head space
dengan menggunakan teknik kromatografi
(Kumaraswamy et al. 2001). Analisis gas
metan ini dilakukan di Balai Penelitian
Lingkungan Pertanian, Jakenan Pati, Jawa
Tengah.
Analisis Kadar Amonium. Pengukuran
aktivitas fiksasi N2, dilakukan dengan
mengukur
kadar
amonium
yang
terakumulasikan dalam kultur. Sebanyak 5 ml
kultur disentrifuse pada kecepatan 4000 rpm
selama 10 menit pada suhu ruang. Kemudian,
3 ml supernatan ditambah dengan 0,12 ml

fenol alkohol 10% dan divortex hingga
homogen. Selanjutnya ke dalam campuran
ditambahkan dengan 0,12 ml larutan NaDihidronitroprusit 0,5%, dan divortex kembali
hingga
homogen.
Campuran
tersebut
ditambah dengan 0,3 ml Na-sitrat : NAhipoklorit (1:4) dan didiamkan selama satu
jam sampai berubah warna menjadi biru
(Cleseri et al. 1989). Selanjutnya dilakukan
pengukuran kadar amonium terakumulasi
dengan menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 640 nm. Amonium
terakumulasi berdasarkan kurva standar
(Lampiran 1) dihitung dengan persamaan
berikut :
[amonium] =
Penghitungan Populasi Bakteri dalam
Kultur. Sebanyak 1 ml isolat bakteri
kombinasi diencerkan sampai 10-3, 10-4, dan
10-5. Selanjutnya dari tiap pengenceran
diambil 0,1 ml dan disebar ke media
NMS+1%
metanol+1%
sukrosa
lalu
diinkubasi selama 3 hari. Setelah 3 hari
dilakukan penghitungan masing-masing sel
bakteri pada tiap Kombinasi
Pengukuran Optical Density (OD)
Kultur Kombinasi. Rapat optis
kultur
kombinasi pada akhir inkubasi diukur
menggunakan spektrofotometer vis Genesys
20 Prancis 200-1000 nm pada OD620 dengan
blanko Akuades.

HASIL
Peremajaan dan Perbanyakan Isolat
Sebanyak empat isolat bakteri metanotrof
yang memiliki aktivitas oksidasi metan
tertinggi (Chatrina 2010; Hanif 2010) berhasil
diremajakan. Isolat BGM 1,BGM 5, BGM 9
(Gambar 1), dan SKM 14 menunjukkan warna
koloni yang berbeda ( bening, putih krem,
pink, pink oranye, kuning terang, dan oranye)
pada media NMS + 1% metanol, sesuai
dengan hasil penelitian Hapsari (2008).
Kecepatan pertumbuhan koloni tiap isolat juga
bervariasi, yaitu mencapai ukuran 2 mm
dalam waktu 3 – 14 hari. SKM 14 merupakan
isolat yang memiliki kecepatan pertumbuhan
paling tinggi, sedangkan BGM 1 merupakan
isolat yang paling lambat ketika ditumbhkan
pada media NMS.
Koloni Azotobacter pada media NMS +
1% sukrosa menunjukkan karakteristik :
koloni berbentuk bulat, halus, berwarna putih,
bening sampai keruh dan coklat. Koloni
Azospirillum yang berhasil diperbanyak tidak

3

Uji Aktivitas Oksidasi Metan.
Hasil uji aktivitas oksidasi metan
menggunakan kromatografi gas menunjukkan
bahwa empat dari enam kombinasi isolat yang
digunakan menunjukkan kemampuan oksidasi
metan setelah diinkubasi selama 15 hari. Laju
oksidasi metan tertinggi ditunjukkan oleh
kombinasi F (BGM 5, BGM 9, Azospirillum,
dan Azotobacter) yaitu sebesar 184,5 x 10-8
M/sel/hari atau setara dengan 28,λ4 ppm/ml
kultur/hari. Aktivitas oksidasi metan ini lebih
tinggi
10,742
ppm/ml
kultur/hari
dibandingkan dengan hasil penelitian Chatrina
(2010). Laju
oksidasi metan terendah
ditunjukkan oleh kombinasi D (BGM 5,
BGM 9, dan Azotobacter) yaitu sebesar 9,3 x
10-8 M/sel/hari (Gambar 2).

Analisis Kadar Amonium.
Uji aktivitas fiksasi nitrogen pada isolat
kombinasi yang berhasil diremajakan pada
medium NMS bebas unsur N menunjukkan
bahwa kadar amonium terakumulasi tertinggi
pada masa akhir inkubasi (hari ke-15)
ditunjukkan oleh kombinasi D (BGM 5, BGM
9, dan Azotobacter) sebesar 4,075 M
(Gambar 3). Aktivitas akumulasi amonium ini
lebih tinggi dibandingkan dengan hasil
penelitian Chatrina (2010) yaitu sebesar 2,755
µM. Akumulasi amonium pada kombinasi A
(2,113 M) dan B (2,943 M), sedangkan
pada kombinasi C (1,434 M) dan E (1,509
M). Akumulasi amonium
terendah
ditunjukkan oleh kombinasi F (BGM 5, BGM
9, Azospirillum, dan Azotobacter) sebesar
0,981 M.
6
Akumulasi Amonium (µM)

jauh
berbeda
dengan
Azotobacter.
Kecepatan pertumbuhan kedua bakteri
tersebut tidak sama. Diameter koloni
Azotobacter relatif lebih besar dibandingkan
dengan koloni Azospirillum.

5

4,1
2,9

4
3

2,1
1,4

2

1,5

0,9

1
0
A

B
C
D
E
F
Kode Kombinasi Isolat

A (BGM1, SKM14, Azs)

Gambar 1 Morfologi koloni isolat BGM 9
dengan masa inkubasi lima hari
pada suhu 27-29°C

Oksidasi CH4 (x10-8µM/se/hari)

300
250

184,5

200

150

132,4

128,1

100
50

0

0

9,3

0
A

B
C
D
E
F
Kode Kombinasi Isolat

A (BGM1, SKM14, Azs)
B (BGM 1, SKM 14,,Azt)
C (BGM 5, BGM 9, Azs)

D (BGM 5, BGM 9, Azt)
E (BGM1, SKM14, Azs,Azt
F (BGM 5, BGM 9,Azs,Azt)

Gambar 2 Aktivitas oksidasi CH4 kultur
kombinasi

B (BGM 1, SKM 14,,Azt)
C (BGM 5, BGM 9, Azs)

Gambar 3

D (BGM 5, BGM 9, Azs)
E (BGM1, SKM14, Azs,Azt
F (BGM 5, BGM 9,Azs,Azt)

Aktivitas akumulasi amonium
kultur kombinasi

Penghitungan Populasi Bakteri dalam
Kultur.
Populasi total bakteri kultur kombinasi
pada akhir inkubasi (Lampiran 2) tertinggi
terdapat pada kombinasi D (BGM 5, BGM 9,
dan Azotobacter) yaitu 120,5x105 CFU/ml.
Sedangkan populasi total bakteri paling
rendah terdapat pada kombinasi F (Tabel 1).
Optical Density (OD) Kultur Bakteri
Kombinasi.
Hasil pengukuran rapat optis (OD620)
selama inkubasi kultur bakteri kombinasi
menunjukkan pertumbuhan yang berbeda
(Gambar 4). Setelah diinkubasi selama 15 hari
diatas mesin pengocok pada suhu ruang (2730ºC) dan kondisi gelap, didapatkan hasil
pengukuran rapat optis tertinggi pada
kombinasi F (BGM 5, BGM 9, Azospirillum ,

4

dan Azotobacter) yaitu sebesar 0,052.
Sedangkan nilai rapat optis terendah terdapat
pada kombinasi E (BGM 1, SKM 14,
Azospirillum, dan Azotobacter) yaitu sebesar
0,042. Nilai OD untuk empat kombinasi
lainnya terlihat tidak berbeda jauh.
Tabel 1 Populasi masing-masing bakteri pada
tiap kombinasi.
Sampel
A

B

C

D

E

F

Optical Denssity (OD)

0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0

Isolat

Populasi sel
(x105 CFU/ml)

BGM 1

2,0

SKM 14

14,0

AZS

3,0

BGM 1

7,0

SKM 14

9,0

AZT

3,0

BGM 5

3,4

BGM 9

1,5

AZS

17,4

BGM 5

102,5

BGM 9

11,5

AZT

6,5

BGM 1

6,0

SKM 14

20,0

AZS

9,0

AZT

8,0

BGM 5

9,1

BGM 9

0,7

AZS

0,5

AZT

0,5

0,045

0,047 0,047

0,052
0,044

0,042

A
B
C
D
E
Kode Kombinasi Isolat
A (BGM1, SKM14, Azs)
B (BGM 1, SKM 14,,Azt)
C (BGM 5, BGM 9, Azs)

Gambar 4

F

D (BGM 5, BGM 9, Azt)
E (BGM1, SKM14, Azs,Azt
F (BGM 5, BGM 9,Azs,Azt)

Rapat Optis masing-masing
kultur kombinasi

PEMBAHASAN
Sawah adalah sebuah ekosistem yang di
dalamnya
terdapat
aktivitas
berbagai
kelompok
mikroorganisme
yang
mendiaminya. Kondisi sawah yang tergenang
memudahkan terbentuknya GRK metan yang
diproduksi oleh kelompok arkea metanogen
(Conrad 1996). Indonesia dengan luas sawah
lebih dari 9 juta ha diduga memberi kontribusi
besar terhadap total emisi metan di atmosfer.
Upaya penurunan emisi metan secara biologis
dapat dilakukan dengan menggunakan
kelompok bakteri metanotrof yang dapat
memanfaatkan metan sebagai sumber karbon
dalam kondisi oksigenik. Selain itu,
pemenuhan akan sumber N2 juga dapat
dilakukan dengan penambahan inokulan
bakteri penambat N2 ke lahan sawah yang
tentunya
lebih
ramah
lingkungan
dibandingkan dengan penggunaan pupuk
kimia (Page 1986).
Berdasarkan hasil penelitian
yang
dilakukan, kombinasi F ( BGM 5, BGM 9,
Azospirillum, dan Azotobacter) merupakan
kombinasi yang memiliki laju oksidasi metan
tertinggi dibandingkan kombinasi lainnya.
Hasil tersebut mengindikasikan bahwa
kemampuan optimal oksidasi metan bakteri
metanotrof dipengaruhi oleh aktivitas bakteri
penambat
nitrogen
karena
akumulasi
amonium dapat menghambat proses oksidasi
metan. Amonium dan metan memiliki struktur
molekul yang analog, sehingga apabila
tersedia secara bersamaan maka akan terjadi
kompetisi substrat yang akan digunakan oleh
bakteri metanotrof ( King & Schneell 1994).
Hal ini juga diperkuat oleh fakta bahwa
bakteri metanotrof juga memiliki kemampuan
untuk mengoksidasi amonium yang ada untuk
mendapatkan energi dan sintesis material sel
sehingga proses ini akan menghambat
oksidasi metan (Hanson & Hanson 1996).
Metabolisme bakteri metanotrof diawali
dengan proses oksidasi metan menjadi
metanol melalui pelepasan ikatan O – O dari
ikatan dioksigen oleh enzim MMO (Methane
Mono Oxygenase). Semua bakteri metanotrof
dapat mengekspresikan MMO (Hanson &
Hanson 1996). Metanotrof mempunyai dua
tipe MMO yaitu soluble MMO (sMMO) dan
particulate MMO (pMMO). sMMO lebih
efektif mentransformasi metan karena mampu
menggunakan dua jalur untuk mengoksidasi
formaldehid menjadi CO2. Bakteri metanotrof
tipe II dan X diketahui
mampu
mengekspresikan enzim ini (Hanson &
Hanson 1996). Astuti (2009) melaporkan

5

bahwa BGM 9 memiliki kemiripan 85%
dengan Methylococcus capsulatus yang
merupakan bakteri metanotrof tipe X.
Salah satu cara yang dapat dilakukan
untuk
mengetahui
kemampuan
suatu
organisme dalam menambat nitrogen ialah
dengan
mengukur
amonium
yang
diakumulasikannya. Hasil pengukuran kadar
amonium menggunakan medium bebas N2
menunjukkan bahwa kultur kombinasi D
( BGM 5, BGM 9, dan Azotobacter) mampu
mengakumulasi amonium lebih tinggi
dibanding
kombinasi
lainnya
setelah
diinkubasi selama 15 hari. Efektivitas
kombinasi D dalam menambat nitrogen
dipengaruhi oleh keberadaan Azospirillum.
Proses fiksasi N2 bakteri metanotrof dan
penambat nitrogen dimediasi oleh enzim
nitrogenase. Enzim ini sangat sensitif dengan
keberadaan O2 karena akan menghambat
ekspresi gen nifD dan nifH yang menyandikan
enzim nitrogenase (Auman et al. 2001).
Tetapi oksigen juga dibutuhkan dalam
respirasi aerob untuk menghasilkan ATP yang
mendukung aktivitas nitrogenase. Fiksasi satu
molekul nitrogen membutuhkan 16 molekul
ATP yang selanjutnya akan diubah menjadi
dua molekul amonia (2NH3) (Madigan et al.
2009). Azospirillum bersifat mikroaerofilik
sehingga lebih sensitif terhadap oksigen pada
konsentrasi tinggi (saturasi udara 50% pada
set percobaan), berbeda halnya dengan bakteri
Azotobacter yang bersifat aerob obligat
sehingga mampu menggunakan O2 yang
tersedia.
Populasi bakteri pada kultur kombinasi
tertinggi terdapat pada kombinasi D (BGM 5,
BGM 9, dan Azotobacter). Populasi yang
tinggi pada formulasi tersebut berkorelasi
positif dengan kadar amonium terakumulasi.
Selain perbedaan aktivitas enzim nitrogenase
masing-masing isolat, kemampuan untuk
mengakumulasikan amonium pada bakteri
metanotrof juga dipengaruhi oleh tingkat
pertumbuhannya (Maisaroh 2010). Pada
kultur kombinasi, akumulasi amonium diduga
juga dipengaruhi oleh aktivitas bakteri
metanorof yang mampu menambat nitrogen
ataupun menggunakan hasil fiksasi nitrogen
tersebut.
Metanotrof merupakan bakteri yang
tumbuh lambat. Hal ini disebabkan karena
waktu generasi yang dibutuhkan sel bakteri ini
relatif lebih lama. Panjangnya waktu generasi
bakteri ini dikarenakan CH4 sebagai sumber
karbon dan energi hanya menghasilkan
material sel dan energi lebih kecil untuk
metabolisme sel. Nilai OD masing-masing

kombinasi (Gambar 3) menunjukan bakteri
metanotrof yang dikulturkan pada media cair
NMS tumbuh optimal pada umur 15 hari
inkubasi.

SIMPULAN
Aktivitas oksidasi metan tertinggi terdapat
pada kombinasi F ( BGM 5, BGM 9,
Azospirillum, dan Azotobacter ) sebesar
184,5x10-8 M/sel/hari . Aktivitas akumulasi
amonium tertinggi terdapat pada kombinasi D
( BGM 5, BGM 9, dan Azotobacter) yaitu
sebesar 4,075 M . Aktivitas oksidasi metan
dan akumulasi amonium bakteri metanotrof
menunjukkan hasil yang lebih tinggi saat
dikombinasikan dengan bakteri penambat
nitrogen.

SARAN
Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk
mengetahui efektivitas formulasi bakteri
dalam mengoksidasi metan dan menambat
Nitrogen pada tanah dan lahan sawah.

DAFTAR PUSTAKA
Alexander M. 1977. Introduction to Soil
Mycrobiology. 2nd Ed. New York: John
Wiley and Sons.
Astuti DD. 2009. Karakterisasi Fisiologi dan
Identifikasi Molekuler Isolat-isolat Bakteri
Metanotrof asal Sawah Wilayah Bogor
dan Sukabumi [skripsi]. Bogor: Fakultas
MIPA, Institut Pertanian Bogor.
Auman AJ, Speake SS, Lidstrom ME. 2001.
nifH sequences and nitrogen fixation in
type I and type II Methanotrophs. Appl
Environ Microbiol 67: 4009–4016.
Cleseri LS, Greenberg AE and Trussel RR.
1989. Standard Method for the
Examination of Water and Waste Water.
Baltimore: Port City Press.
Conrad R, Rothfus F. 1991. Methane
oxidation in the soil surface layer of
aflooded rice field and the effect of
ammonium. Biol Fertil Soil 12:28-32.
Hanson R, Hanson TE. 1996. Metanotrophic
bacteria. J Microbiol Reviews 60 : 439471.
Hapsari W. 2008. Isolasi dan Karakterisasi
Bakteri Metanotrof Asal Sawah di Bogor

6

dan Sukabumi [skripsi]. Bogor: Fakultas
MIPA, Institut Pertanian Bogor.
[IPCC] Intergovernmental Panel on Climate
Change. 2007. The Physical Science Basis.
Cambridge: Cambridge University Press.
King GM & Schnell S. 1994. Mechanistic
analysis of ammonium inhibition of
atmospheric methane consumption in
forest soils. Appl Environ Microbiol 60:
3514–3521.
Kumar K. and Balasubramanian B. 1986.
Field response of rice to Azospirillum
biofertilizer. Curr Rsrch 15:74–76.
Kumaraswamy
S,
Ramakrishnan
B,
Sethunathan N. 2001. Methane production
and oxidation in annoxic rice soil as influ
enced by inorganic redox species. J
Environ Qual 30: 2195-2201.
Lelieveld J, Crutzen PJ, Bruhl C. 1993.
Climate Effects of Atmospheric Methane.
Chemosphere 26: 739-768.
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV,
Clark DP. 2009. Brock Biology of
Microorganism 12th Ed. San Francisco:
Pearson Benjamin Cummings.
Maisaroh. 2010. Aktivitas Enzim Nitrogenase
dan Oksidasi Metan Bakteri Metanotrof
Asal Sawah [tesis]. Bogor:Program
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Notohadiprawiro T. 2006. Sawah Dalam Tata
Guna Lahan. Yogyakarta: UGM Press.
Oremland RS, and Capone DG. 1998. Use of
“specific” inhibitors in biogeo chemistry
and microbial ecology. Adv Microb Ecol.
10:285-383.
Page, W.J. 1986. Sodium-dependent growth
of Azotobacter chroococcum. Appl
Environ Microbiol 51: 510-514.
Rudd JWN, Taylor CD. 1980. Methan
cycling in aquatic environment. Adv Aq
Microbiol 2:77-150.
Sagala BT. 2009. Seleksi dan Uji Aktivitas
Fiksasi Nitrogen (N2) Bakteri Metanotrof
Asal Sawah pada Konsentrasi Oksigen
(O2) Berbeda [skripsi]. Bogor: Fakultas
MIPA, Institut Pertanian Bogor.
Somasegaran & Hoben. 1994. Hand Book for
Rhizobia. New York : Springer-Verlag.
Wild A. 1995. Soils and The Environment: An
Introduction. Cambridge: Cambridge
University Press.
Yagi K & Minami K. 1990. Effects of organic
matter applications on methane emission
from Japanese paddy fields. Di dalam :
Bowman AF, editor. Soil and the
Greenhouse Effect. New York: John Wiley
and Sons. hlm 467-473.

7

LAMPIRAN

8

Lampiran 1 Kurva standar ammonium

0,8
y = 0,006x + 0,053
R² = 0,999

0,7

Absorbansi

0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0

20

40

60

80

100

120

Konsentrasi (ppm)

Lampiran 2 Koloni isolat kombinasi hasil pencawanan

BGM 1

Azotobacter

BGM 9

SKM 14

Lampiran 3 Komposisi media NMS (Nitrate Mineral Salt)
Komposisi media Nitrat Mineral Salts (NMS) : MgSO4.7H2O 1.0 g/L, CaCl2.6H2O 0.2 g/L,
KNO3 1.0 g/L, KH2PO4 0.272 g/L, Na2HPO4 4.0 g/L, NH4Cl 4.0 mg/L, Na2EDTA 0.5 g/L,
FeSO4.7H2O 0.2 g/L, H3BO4 0.03 g/L, CoCl2.6H2O 0.02 g/L, ZnSO4.7H2O 0.01 g/L, MnCl2.4H2O
3.0 mg/L, Na2MoO4. 2H2O 3.0 mg/L, NiCl2.6H2O 2.0 mg/L, CaCl2.2H2O 1.0 mg/L, Bacto agar 20
g/L, methanol 1%, dan sukrosa 1%.

ABSTRAK
IVAN PERMANA PUTRA. Aktivitas Fiksasi N2 dan Oksidasi Metan Kombinasi Biakan
Azotobacter sp., Azospirillum sp., dan Bakteri Metanotrof. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA
dan ALINA AKHDIYA.
Bakteri metanotrof merupakan bakteri pengoksidasi metan. Selain itu, bakteri metanotrof
tipe II dan tipe X juga mampu memfiksasi nitrogen karena adanya enzim nitrogenase. Tetapi
aktivitas oksidasi metan dihambat oleh keberadaan amonium. Penelitian ini dilakukan untuk
menguji aktivitas oksidasi metan dan fiksasi nitrogen keempat isolat bakteri metanotrof yaitu
BGM 1, BGM 5, BGM 9, dan SKM 14 yang dikombinasikan dengan bakteri penambat nitrogen
(Azotobacter dan Azospirillum). Sebanyak 6 kombinasi dikulturkan kemudian diinokulasikan ke
campuran media NMS tanpa unsur N, kemudian diuji aktivitas oksidasi metan dan fiksasi nitrogen.
Aktivitas oksidasi metan tertinggi terdapat pada kombinasi isolat BGM 5, BGM 9, Azospirillum,
dan Azotobacter yaitu sebesar 184,5 x 10-8 M/sel/hari . Aktivitas akumulasi amonium tertinggi
terdapat pada kombinasi isolat BGM 5, BGM 9, dan Azotobacter yaitu sebesar 4,075 M.
Aktivitas oksidasi metan dan akumulasi amonium bakteri metanotrof menunjukkan hasil yang
lebih tinggi saat dikombinasikan dengan bakteri penambat nitrogen.
Kata kunci: Metan, bakteri metanotrof, bakteri penambat nitrogen,oksidasi metan, fiksasi nitrogen

ABSTRACT
IVAN PERMANA PUTRA. N2 Fixation and Methane Oxidation Activity of mixed of culture of
Azotobacter sp., Azospirillum sp., and Methanotrophic Bacteria. Under supervision of IMAN
RUSMANA and ALINA AKHDIYA.
Metanotrophs bacteria are methane oxidizing bacteria. Methanotrophic bacteria especially
type II and type X were also able to fix nitrogen using nitrogenase enzyme. This reasearch was
conducted to determine activity of methane oxidation and nitrogen fixation of four isolates of
methanotropic bacteria i.e. BGM 1, BGM 5, BGM 9, and SKM 14 which were combined with
nitrogen-fixing bacteria (Azotobacter sp. and Azospirillum sp.). Six combinations were cultured
and then inoculated into nitrogen free NMS medium. Activity of methane oxidation and nitrogen
fixation activity was analysed. The highest methane oxidation activity was found in the mixed
culture of BGM 9, BGM 5, Azotobacter sp., and Azospirillum sp. isolates. The activity was 184.5
x 10-8 M/cell /day. The highest accumulation of ammonium was found in the mixed culture of
BGM 5, BGM 9, and Azotobacter sp. isolates. The concentration of accumulated ammonium was
4.075 M. Methane oxidation activity and ammonium accumulation of methanotrophic bacteria
showed
higher result when they were combined with nitrogen fixing bacteria.
Key words: Methane, methanotrophic bacteria, nitrogen-fixing bacteria, methane oxidation,
nitrogen-fixation

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Metan (CH4) merupakan salah satu gas
yang berkontribusi terhadap pemanasan
global. Intergovernmental Panel of Climate
Change (2007), menyatakan bahwa kontribusi
metan terhadap pemanasan global menempati
urutan ketiga setelah CFC dan N2O.
Kontribusi metan terhadap pemanasan global
lebih besar dibandingkan dengan CO2, karena
CH4 lebih efektif menyerap radiasi pada
panjang gelombang 4-100 nm (irradiasi sinar
infra merah) dibandingkan dengan CO2
(Lelieveld et al. 1993; Hanson & Hanson
1996). Sebesar 43% dari emisi metan ke
atmosfer berasal dari lahan basah, yakni 20%
dari sawah dan sisanya berasal dari lahan rawa
(Wild
1995;
Notohadiprawiro
2006).
Indonesia dengan luas sawah lebih dari 9 juta
ha diduga memberi kontribusi terhadap total
emisi metan. Untuk mewujudkan sistem
pertanian lahan sawah yang ramah
lingkungan, dapat dilakukan dengan menekan
tingkat emisi gas metan diantaranya melalui
pemanfaatan bakteri metanotrof. Emisi metan
dari lingkungan akuatik seperti tanah sawah
pada dasarnya ditentukan oleh dua proses
mikrobial yang berbeda, yaitu produksi metan
dan konsumsi metan (Rudd dan Taylor 1980).
Pada tanah sawah, metan diproduksi sebagai
hasil antara dan hasil akhir dari berbagai
proses mikrobial, seperti dekomposisi
anaerobik bahan organik oleh Arkea
Methanogen. Sementara sebagian dari metan
yang diproduksi akan dioksidasikan oleh
bakteri metanotrof yang bersifat aerobik di
lapisan permukaan tanah dan di zona
perakaran. Bakteri metanotrof merupakan
bakteri yang memanfaatkan CH4 sebagai
donor elektron untuk menghasilkan energi dan
sebagai sumber karbonnya (Hanson dan
Hanson 1996).
Pupuk nitrogen (N) dalam bentuk urea
sudah menjadi kebutuhan pokok bagi petani
sebagai upaya pemenuhan kebutuhan unsur N
pada lahan pertanian. Umumnya petani
memberikan pupuk dengan takaran tinggi,
melebihi kebutuhan pada lahan tanaman,
sehingga menyebabkan pemborosan dan
pencemaran lingkungan. Salah satu solusi
tepat untuk mengatasi hal tersebut ialah
dengan menggunakan agen pemfiksasi
nitrogen biologis seperti Azotobacter dan
Azospirillum. Dinitrogen diubah menjadi
amonium melalui reduksi elektron dan
protonasi gas dinitrogen. Selain mampu
menambat nitrogen, kedua bakteri ini juga

menghasilkan zat pengatur tumbuh giberelin,
sitokinin, dan asam indol asetat yang dapat
memacu pertumbuhan tanaman (Alexander
1977). Berbagai hasil penelitian menunjukkan
bahwa inokulasi tanah atau benih dengan
bakteri yang efektif menambat nitrogen dapat
meningkatkan
produktivitas
tanaman.
Poduktivitas panen padi yang dinokulasikan
dengan Azospirillum dan Azotobacter
dilaporkan mengalami peningkatan sebesar
5-60% (Kumar dan Balasubramanian 1986).
Informasi tentang aktivitas oksidasi metan
dan fiksasi nitrogen bakteri metanotrof yang
dikombinasikan dengan Azotobacter dan
Azospirillum di Indonesia masih jarang.
Berdasarkan penelitian Chatrina (2010)
diketahui bahwa kombinasi isolat bakteri
metanotrof BGM 5 dan BGM 9 memiliki
aktivitas oksidasi metan tertinggi. Penelitian
lainnya menunjukkan bahwa kombinasi SKM
14 dan BGM 1 merupakan kombinasi bakteri
metanotrof yang memiliki kemampuan
oksidasi metan dalam lumpur steril tertinggi
(Hanif 2010). Keempat isolat tersebut
berpotensi dikembangkan lebih lanjut dengan
cara dikombinasikan dengan bakteri penambat
nitrogen yaitu Azospirillum dan Azotobacter.
Informasi
mengenai
kajian
terhadap
kombinasi ini dalam mengoksidasi metan dan
menambat N2 penting dilakukan, sehingga
hasilnya
dapat
dimanfaatkan
untuk
mewujudkan sistem pertanian yang ramah
lingkungan.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
aktivitas kultur kombinasi Metanotrof,
Azotobacter sp., dan Azospirillum sp. dalam
mereduksi emisi metan dan memfiksasi
nitrogen.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Januari sampai dengan bulan Mei 2011 di
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen
Biologi, FMIPA, IPB.

BAHAN DAN METODE

Isolat Bakteri
Isolat bakteri metanotrof BGM 1, BGM
5, BGM 9, dan SKM 14 (Hapsari 2008), isolat
Azotobacter dan Azospirillum koleksi
Departemen Biologi FMIPA IPB.

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Metan (CH4) merupakan salah satu gas
yang berkontribusi terhadap pemanasan
global. Intergovernmental Panel of Climate
Change (2007), menyatakan bahwa kontribusi
metan terhadap pemanasan global menempati
urutan ketiga setelah CFC dan N2O.
Kontribusi metan terhadap pemanasan global
lebih besar dibandingkan dengan CO2, karena
CH4 lebih efektif menyerap radiasi pada
panjang gelombang 4-100 nm (irradiasi sinar
infra merah) dibandingkan dengan CO2
(Lelieveld et al. 1993; Hanson & Hanson
1996). Sebesar 43% dari emisi metan ke
atmosfer berasal dari lahan basah, yakni 20%
dari sawah dan sisanya berasal dari lahan rawa
(Wild
1995;
Notohadiprawiro
2006).
Indonesia dengan luas sawah lebih dari 9 juta
ha diduga memberi kontribusi terhadap total
emisi metan. Untuk mewujudkan sistem
pertanian lahan sawah yang ramah
lingkungan, dapat dilakukan dengan menekan
tingkat emisi gas metan diantaranya melalui
pemanfaatan bakteri metanotrof. Emisi metan
dari lingkungan akuatik seperti tanah sawah
pada dasarnya ditentukan oleh dua proses
mikrobial yang berbeda, yaitu produksi metan
dan konsumsi metan (Rudd dan Taylor 1980).
Pada tanah sawah, metan diproduksi sebagai
hasil antara dan hasil akhir dari berbagai
proses mikrobial, seperti dekomposisi
anaerobik bahan organik oleh Arkea
Methanogen. Sementara sebagian dari metan
yang diproduksi akan dioksidasikan oleh
bakteri metanotrof yang bersifat aerobik di
lapisan permukaan tanah dan di zona
perakaran. Bakteri metanotrof merupakan
bakteri yang memanfaatkan CH4 sebagai
donor elektron untuk menghasilkan energi dan
sebagai sumber karbonnya (Hanson dan
Hanson 1996).
Pupuk nitrogen (N) dalam bentuk urea
sudah menjadi kebutuhan pokok bagi petani
sebagai upaya pemenuhan kebutuhan unsur N
pada lahan pertanian. Umumnya petani
memberikan pupuk dengan takaran tinggi,
melebihi kebutuhan pada lahan tanaman,
sehingga menyebabkan pemborosan dan
pencemaran lingkungan. Salah satu solusi
tepat untuk mengatasi hal tersebut ialah
dengan menggunakan agen pemfiksasi
nitrogen biologis seperti Azotobacter dan
Azospirillum. Dinitrogen diubah menjadi
amonium melalui reduksi elektron dan
protonasi gas dinitrogen. Selain mampu
menambat nitrogen, kedua bakteri ini juga

menghasilkan zat pengatur tumbuh giberelin,
sitokinin, dan asam indol asetat yang dapat
memacu pertumbuhan tanaman (Alexander
1977). Berbagai hasil penelitian menunjukkan
bahwa inokulasi tanah atau benih dengan
bakteri yang efektif menambat nitrogen dapat
meningkatkan
produktivitas
tanaman.
Poduktivitas panen padi yang dinokulasikan
dengan Azospirillum dan Azotobacter
dilaporkan mengalami peningkatan sebesar
5-60% (Kumar dan Balasubramanian 1986).
Informasi tentang aktivitas oksidasi metan
dan fiksasi nitrogen bakteri metanotrof yang
dikombinasikan dengan Azotobacter dan
Azospirillum di Indonesia masih jarang.
Berdasarkan penelitian Chatrina (2010)
diketahui bahwa kombinasi isolat bakteri
metanotrof BGM 5 dan BGM 9 memiliki
aktivitas oksidasi metan tertinggi. Penelitian
lainnya menunjukkan bahwa kombinasi SKM
14 dan BGM 1 merupakan kombinasi bakteri
metanotrof yang memiliki kemampuan
oksidasi metan dalam lumpur steril tertinggi
(Hanif 2010). Keempat isolat tersebut
berpotensi dikembangkan lebih lanjut dengan
cara dikombinasikan dengan bakteri penambat
nitrogen yaitu Azospirillum dan Azotobacter.
Informasi
mengenai
kajian
terhadap
kombinasi ini dalam mengoksidasi metan dan
menambat N2 penting dilakukan, sehingga
hasilnya
dapat
dimanfaatkan
untuk
mewujudkan sistem pertanian yang ramah
lingkungan.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
aktivitas kultur kombinasi Metanotrof,
Azotobacter sp., dan Azospirillum sp. dalam
mereduksi emisi metan dan memfiksasi
nitrogen.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Januari sampai dengan bulan Mei 2011 di
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen
Biologi, FMIPA, IPB.

BAHAN DAN METODE

Isolat Bakteri
Isolat bakteri metanotrof BGM 1, BGM
5, BGM 9, dan SKM 14 (Hapsari 2008), isolat
Azotobacter dan Azospirillum koleksi
Departemen Biologi FMIPA IPB.

2

Peremajaan dan Perbanyakan Isolat.
Isolat BGM 1,BGM 5, BGM 9, dan SKM 14
diremajakan pada medium NMS + 1%
methanol (Lampiran 3). Isolat Azotobacter
dan Azospirillum diperbanyak dengan
menggunakan media NMS + sukrosa 1%
(Lampiran 3). Kemudian keduanya diinkubasi
pada suhu ruang selama 5-7 hari (Hanson
1998). Koloni-koloni yang terpisah kemudian
digores kembali sampai didapatkan kolonikoloni yang murni. Isolat murni yang didapat
disimpan pada medium agar miring NMS
yang diberi 1 % metanol untuk bakteri
metanotrof dan NMS yang diberi 1% sukrosa
untuk bakteri pemfiksasi nitrogen.
Formulasi Kultur Bakteri Kombinasi.
Formulasi
dilakukan
dengan
mengkombinasikan isolat bakteri terbaik
metanotrof dalam mengoksidasi metan
berdasarkan penelitian Chatrina dan Hanif
tahun 2010 dengan bakteri
penambat
nitrogen. Kombinasi yang dibuat adalah :
kombinasi A (BGM 1, SKM 14, dan
Azospirillum), kombinasi B (BGM 1, SKM
14, dan Azotobacter), kombinasi C (BGM 5,
BGM 9, dan Azospirillum), kombinasi D
(BGM 5, BGM 9, dan Azotobacter),
kombinasi E (BGM 1, SKM 14, Azospirillum,
dan Azotobacter), serta kombinasi F (BGM 5,
BGM 9, Azospirillum, dan Azotobacter).
Masing-masing kombinasi dibuat sebanyak
tiga ulangan dan sebagai kontrol digunakan
media cair yang tidak diinokulasikan
kombinasi bakteri. Sebanyak 0,1ml isolat
bakteri metanotrof dan penambat N2
diinokulasikan ke dalam 9 ml medium
NMS+1% sukrosa bebas nitrogen dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 15 hari.
Komposisi gas di bagian head space dibuat
menjadi 50% metan dan 50% udara. Inkubasi
dilakukan selama 15 hari diatas mesin
pengocok pada suhu ruang 27-30ºC dan
kondisi gelap.
Uji Aktivitas Oksidasi Metan. Pada
akhir masa inkubasi dilakukan pengukuran
gas metan tersisa pada bagian head space
dengan menggunakan teknik kromatografi
(Kumaraswamy et al. 2001). Analisis gas
metan ini dilakukan di Balai Penelitian
Lingkungan Pertanian, Jakenan Pati, Jawa
Tengah.
Analisis Kadar Amonium. Pengukuran
aktivitas fiksasi N2, dilakukan dengan
mengukur
kadar
amonium
yang
terakumulasikan dalam kultur. Sebanyak 5 ml
kultur disentrifuse pada kecepatan 4000 rpm
selama 10 menit pada suhu ruang. Kemudian,
3 ml supernatan ditambah dengan 0,12 ml

fenol alkohol 10% dan divortex hingga
homogen. Selanjutnya ke dalam campuran
ditambahkan dengan 0,12 ml larutan NaDihidronitroprusit 0,5%, dan divortex kembali
hingga
homogen.
Campuran
tersebut
ditambah dengan 0,3 ml Na-sitrat : NAhipoklorit (1:4) dan didiamkan selama satu
jam sampai berubah warna menjadi biru
(Cleseri et al. 1989). Selanjutnya dilakukan
pengukuran kadar amonium terakumulasi
dengan menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 640 nm. Amonium
terakumulasi berdasarkan kurva standar
(Lampiran 1) dihitung dengan persamaan
berikut :
[amonium] =
Penghitungan Populasi Bakteri dalam
Kultur. Sebanyak 1 ml isolat bakteri
kombinasi diencerkan sampai 10-3, 10-4, dan
10-5. Selanjutnya dari tiap pengenceran
diambil 0,1 ml dan disebar ke media
NMS+1%
metanol+1%
sukrosa
lalu
diinkubasi selama 3 hari. Setelah 3 hari
dilakukan penghitungan masing-masing sel
bakteri pada tiap Kombinasi
Pengukuran Optical Density (OD)
Kultur Kombinasi. Rapat optis
kultur
kombinasi pada akhir inkubasi diukur
menggunakan spektrofotometer vis Genesys
20 Prancis 200-1000 nm pada OD620 dengan
blanko Akuades.

HASIL
Peremajaan dan Perbanyakan Isolat
Sebanyak empat isolat bakteri metanotrof
yang memiliki aktivitas oksidasi metan
tertinggi (Chatrina 2010; Hanif 2010) berhasil
diremajakan. Isolat BGM 1,BGM 5, BGM 9
(Gambar 1), dan SKM 14 menunjukkan warna
koloni yang berbeda ( bening, putih krem,
pink, pink oranye, kuning terang, dan oranye)
pada media NMS + 1% metanol, sesuai
dengan hasil penelitian Hapsari (2008).
Kecepatan pertumbuhan koloni tiap isolat juga
bervariasi, yaitu mencapai ukuran 2 mm
dalam waktu 3 – 14 hari. SKM 14 merupakan
isolat yang memiliki kecepatan pertumbuhan
paling tinggi, sedangkan BGM 1 merupakan
isolat yang paling lambat ketika ditumbhkan
pada media NMS.
Koloni Azotobacter pada media NMS +
1% sukrosa menunjukkan karakteristik :
koloni berbentuk bulat, halus, berwarna putih,
bening sampai keruh dan coklat. Koloni
Azospirillum yang berhasil diperbanyak tidak

2

Peremajaan dan Perbanyakan Isolat.
Isolat BGM 1,BGM 5, BGM 9, dan SKM 14
diremajakan pada medium NMS + 1%
methanol (Lampiran 3). Isolat Azotobacter
dan Azospirillum diperbanyak dengan
menggunakan media NMS + sukrosa 1%
(Lampiran 3). Kemudian keduanya diinkubasi
pada suhu ruang selama 5-7 hari (Hanson
1998). Koloni-koloni yang terpisah kemudian
digores kembali sampai didapatkan kolonikoloni yang murni. Isolat murni yang didapat
disimpan pada medium agar miring NMS
yang diberi 1 % metanol untuk bakteri
metanotrof dan NMS yang diberi 1% sukrosa
untuk bakteri pemfiksasi nitrogen.
Formulasi Kultur Bakteri Kombinasi.
Formulasi
dilakukan
dengan
mengkombinasikan isolat bakteri terbaik
metanotrof dalam mengoksidasi metan
berdasarkan penelitian Chatrina dan Hanif
tahun 2010 dengan bakteri
penambat
nitrogen. Kombinasi yang dibuat adalah :
kombinasi A (BGM 1, SKM 14, dan
Azospirillum), kombinasi B (BGM 1, SKM
14, dan Azotobacter), kombinasi C (BGM 5,
BGM 9, dan Azospirillum), kombinasi D
(BGM 5, BGM 9, dan Azotobacter),
kombinasi E (BGM 1, SKM 14, Azospirillum,
dan Azotobacter), serta kombinasi F (BGM 5,
BGM 9, Azospirillum, dan Azotobacter).
Masing-masing kombinasi dibuat sebanyak
tiga ulangan dan sebagai kontrol digunakan
media cair yang tidak diinokulasikan
kombinasi bakteri. Sebanyak 0,1ml isolat
bakteri metanotrof dan penambat N2
diinokulasikan ke dalam 9 ml medium
NMS+1% sukrosa bebas nitrogen dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 15 hari.
Komposisi gas di bagian head space dibuat
menjadi 50% metan dan 50% udara. Inkubasi
dilakukan selama 15 hari diatas mesin
pengocok pada suhu ruang 27-30ºC dan
kondisi gelap.
Uji Aktivitas Oksidasi Metan. Pada
akhir masa inkubasi dilakukan pengukuran
gas metan tersisa pada bagian head space
dengan menggunakan teknik kromatografi
(Kumaraswamy et al. 2001). Analisis gas
metan ini dilakukan di Balai Penelitian
Lingkungan Pertanian, Jakenan Pati, Jawa
Tengah.
Analisis Kadar Amonium. Pengukuran
aktivitas fiksasi N2, dilakukan dengan
mengukur
kadar
amonium
yang
terakumulasikan dalam kultur. Sebanyak 5 ml
kultur disentrifuse pada kecepatan 4000 rpm
selama 10 menit pada suhu ruang. Kemudian,
3 ml supernatan ditambah dengan 0,12 ml

fenol alkohol 10% dan divortex hingga
homogen. Selanjutnya ke dalam campuran
ditambahkan dengan 0,12 ml larutan NaDihidronitroprusit 0,5%, dan divortex kembali
hingga
homogen.
Campuran
tersebut
ditambah dengan 0,3 ml Na-sitrat : NAhipoklorit (1:4) dan didiamkan selama satu
jam sampai berubah warna menjadi biru
(Cleseri et al. 1989). Selanjutnya dilakukan
pengukuran kadar amonium terakumulasi
dengan menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 640 nm. Amonium
terakumulasi berdasarkan kurva standar
(Lampiran 1) dihitung dengan persamaan
berikut :
[amonium] =
Penghitungan Populasi Bakteri dalam
Kultur. Sebanyak 1 ml isolat bakteri
kombinasi diencerkan sampai 10-3, 10-4, dan
10-5. Selanjutnya dari tiap pengenceran
diambil 0,1 ml dan disebar ke media
NMS+1%
metanol+1%
sukrosa
lalu
diinkubasi selama 3 hari. Setelah 3 hari
dilakukan penghitungan masing-masing sel
bakteri pada tiap Kombinasi
Pengukuran Optical Density (OD)
Kultur Kombinasi. Rapat optis
kultur
kombinasi pada akhir inkubasi diukur
menggunakan spektrofotometer vis Genesys
20 Prancis 200-1000 nm pada OD620 dengan
blanko Akuades.

HASIL
Peremajaan dan Perbanyakan Isolat
Sebanyak empat isolat bakteri metanotrof
yang memiliki aktivitas oksidasi metan
tertinggi (Chatrina 2010; Hanif 2010) berhasil
diremajakan. Isolat BGM 1,BGM 5, BGM 9
(Gambar 1), dan SKM 14 menunjukkan warna
koloni yang berbeda ( bening, putih krem,