Bacillus sp. asal rizosfer kedelai yang berpotensi sebagai pemacu pertumbuhan tanaman dan biokontrol fungi patogen akar
Bacillus sp. ASAL RIZOSFER KEDELAI
YANG BERPOTENSI SEBAGAI PEMACU PERTUMBUHAN
TANAMAN DAN BIOKONTROL FUNGI PATOGEN AKAR
ASRI WIDYAWATI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2008
PERNYATAAN MENGENAI TESIS
DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Bacillus sp. Asal
Rizosfer Kedelai yang Berpotensi sebagai Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan
Biokontrol Fungi Patogen Akar” adalah benar hasil karya saya sendiri dan belum
diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun yang
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Mei 2008
Asri Widyawati
G351060221
RINGKASAN
ASRI WIDYAWATI. Bacillus sp. Asal Rizosfer Kedelai yang Berpotensi sebagai
Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol Fungi Patogen Akar. Dibimbing
oleh ARIS TRI WAHYUDI dan ABDJAD ASIH NAWANGSIH.
Rizosfer tanaman telah diketahui di dalamnya terdapat mikroorganisme
yang bersimbiosis dengan akar. Adanya mikroorganisme tersebut dapat
memberikan efek positif maupun negatif bagi perakaran tanaman. Berbagai jenis
mikroorganisme seperti bakteri telah diketahui dapat dimanfaatkan sebagai agens
hayati untuk meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman yang dikenal luas
dengan istilah Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) atau Rizobakteria
Pemacu Pertumbuhan Tanaman. Bacillus sp. merupakan salah satu kelompok
bakteri yang dapat diisolasi dari tanah dengan karakter Gram positif, berbentuk
batang dan mempunyai kemampuan membentuk endospora pada kondisi
lingkungan yang tidak menguntungkan sehingga dapat toleran pada kondisi
lingkungan kritis. Compant et al. (2005) melaporkan bahwa Bacillus sp.
mempunyai banyak potensi yaitu mampu memproduksi IAA, melarutkan fosfat,
mensekresi siderofor dan berperan sebagai agens biokontrol dengan menginduksi
sistem kekebalan tanaman serta menghasilkan antibiotik.
Penelitian ini bertujuan menapis rizobakteria Bacillus sp. asal rizosfer
tanaman kedelai secara in vitro yang dapat berperan sebagai pemacu pertumbuhan
tanaman dan pengendali fungi patogen penyebab penyakit akar tanaman kedelai
serta identifikasi molekulernya. Karakter yang yang diuji meliputi kemampuan
isolat dalam memproduksi IAA, reaksi hipersensitivitas, pemacuan pertumbuhan,
kemampuan melarutkan fosfat, kemampuan mengkelat besi (dengan memproduksi
siderofor) serta kemampuan mengendalikan fungi patogen akar khususnya
Rhizoctonia solani dan Sclerotium rolfsii. Penelitian ini juga dimaksudkan untuk
mengetahui identitas bakteri yang berpotensi sebagai PGPR berdasarkan sekuen
gen yang menyandikan 16S rRNA.
Pada penelitian ini dilakukan isolasi dan karakterisasi Bacillus sp. yang
berasal dari rizosfer kedelai asal Cirebon dengan metode pengenceran secara
berseri menggunakan media Nutrient Agar (NA). Karakterisasi fisiologi secara
parsial genus Bacillus mengikuti metode standar Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology (Buchanan & Gibbon 1974) yang meliputi pewarnaan
Gram, pewarnaan endospora dan uji katalase. Genus Bacillus memiliki karakter
Gram positif, berbentuk batang, mampu membentuk endospora dan bersifat
katalase positif. Dari hasil isolasi dan karakterisasi ini diperoleh sebanyak 60
isolat merupakan kelompok Bacillus sp.
Kemampuan isolat dalam memproduksi IAA diuji menggunakan metode
kolorimetri dengan menambahkan reagen Salkowski yang diukur pada panjang
gelombang 510 nm. Pada uji ini diperoleh sebanyak 45 isolat mampu
memproduksi IAA dengan konsentrasi yang berbeda-beda dengan kisaran antara
0.06 ppm (Cr 72) hingga 44.66 ppm (Cr 55). Adanya perbedaan dalam
memproduksi IAA oleh bakteri dimungkinkan karena pengaruh perbedaan
aktifitas enzim indolpiruvat dekarboksilase yang terkait dengan tingkat ekspresi
gen ipcd yang menyandikan struktur protein tersebut. Konsentrasi IAA yang
dihasilkan oleh bakteri juga bergantung kepada aktifitas dan jumlah sel,
ketersediaan nutrisi dan substrat L-trp dalam media.
Hasil uji pelarutan fosfat diperoleh sebanyak 36 isolat mampu melarutkan
fosfat yang terkandung dalam media Phikovkaya dengan kemampuan yang
berbeda-beda ditunjukkan oleh zona bening yang terbentuk di sekeliling koloni
bakteri. Adanya kemampuan melarutkan fosfat yang berbeda ini mungkin terkait
dengan jenis asam organik yang disintesis oleh bakteri yang mungkin memiliki
kecocokan ataupun efektifitas dalam memutuskan ikatan pada kompleks kation
logam dengan anion fosfat.
Kemampuan isolat Bacillus sp. dalam memproduksi siderofor diuji dengan
menumbuhkan isolat pada media Chrome Azurol Sulfonat (CAS) agar yang
mengandung Fe dan diinkubasikan semalam. Hasil uji menunjukkan bahwa
sebanyak 43 isolat memproduksi siderofor ditandai dengan terbentuknya zona
berwarna kuning oranye jernih di sekeliling koloni bakteri. Menurut Compant et
al. (2005) siderofor pada berbagai bakteri memiliki kemampuan berbeda dalam
mengkelat besi, namun pada umumnya digunakan untuk menekan cendawan
patogenik yang mempunyai afinitas siderofor rendah. Adanya pengambilan besi
oleh bakteri PGPR ini dapat bertindak sebagai pesaing (competitor) bagi mikrob
fitopatogen.
Seluruh isolat yang mampu memproduksi IAA sebelum ditelaah
kemampuannya dalam pemacuan pertumbuhan diuji hipersensitivitas. Hasil uji
hipersensitivitas menunjukkan bahwa seluruh isolat tidak memberikan reaksi
hipersensitif terhadap tanaman tembakau. Hal ini menunjukkan bahwa seluruh
isolat tidak bersifat sebagai patogen bagi tanaman.
Pada telaah pemacuan pertumbuhan diperoleh sebanyak 6 isolat mampu
memacu secara signifikan taraf 95% terhadap pertumbuhan panjang batang,
panjang akar, dan jumlah akar lateral dan sublateral kecambah kedelai kultivar
Slamet. Isolat Cr 67, Cr 68, Cr 69, dan Cr 71 berhasil memacu pemanjangan akar
primer, isolat Cr 64, Cr 66, Cr 67, Cr 68, dan Cr 71 berhasil memacu
pemanjangan batang, isolat Cr 69 dan Cr 71 mampu memacu pembentukan akar
lateral dan sub lateral. Sedangkan pengaruh inokulasi dengan isolat Cr 77, Cr 82,
Cr 83, Cr 87, Cr 89, Cr 90, dan Cr 91 menyebabkan pertumbuhan panjang akar
kecambah lebih pendek daripada kontrol. Rerata panjang batang kecambah juga
lebih pendek pada kecambah yang diinokulasikan dengan isolat Cr 77 dan Cr 78
dibandingkan dengan kontrol. Jumlah akar lateral dan sub lateral lebih sedikit
daripada kontrol setelah diberi perlakuan dengan isolat Cr 77, Cr 78, Cr 81, Cr 82,
Cr 83, Cr 87, Cr 89, Cr 90, dan Cr 91. Isolat-isolat yang mampu memacu
pertumbuhan tersebut relatif memproduksi IAA justru pada konsentrasi yang
rendah yaitu pada kisaran 0.81 ppm hingga 9.63 ppm. Sedangkan isolat yang
memproduksi IAA yang tinggi antara lain Cr 55 (44.66 ppm), Cr 78 (32.84 ppm),
Cr 84 (30.30), Cr 90 (22.79 ppm) dan Cr 91 (20.32 ppm) tidak mampu memacu
pertumbuhan kecambah kedelai. Hal ini memperkuat pernyataan Husen et al.
(2006) bahwa peningkatan pertumbuhan tanaman terjadi pada pemberian IAA
dengan konsentrasi sangat rendah (0.01 μg/ml-1) sedangkan pada konsentrasi lebih
tinggi cenderung menurunkan pertumbuhan tanaman. Selain itu Glick (1995) juga
menambahkan bahwa produksi IAA yang berlebihan akan memacu hormon etilen
yang dalam konsentrasi tinggi justru menghambat perkembangan / pemanjangan
akar.
Kemampuan isolat Bacillus sp. dalam menekan pertumbuhan cendawan
Rhizoctonia solani dan Sclerotium rolfsii diuji secara kualitatif dan kuantitatif
menggunakan metode kultur ganda selanjutnya dihitung besarnya persentase
penghambatan (Dikin et al. 2006). Sebanyak 28 isolat mempunyai kemampuan
menghambat pertumbuhan R. solani dan sebanyak 2 isolat mempunyai
kemampuan menghambat pertumbuhan radial S. rolfsii.
Penghambatan
pertumbuhan cendawan oleh biokontrol dapat terjadi melalui mikolisis yaitu
hilangnya protoplasma pada struktur dinding sel fungi dan enzim tidak larut pada
dinding sel fungi (Lim et al. 1991). Adanya sejumlah besar isolat yang mampu
menghambat pertumbuhan cendawan kemungkinan karena genus Bacillus mampu
mensintesis berbagai senyawa yang aktif melawan cendawan dan mampu
memproduksi siderofor sehingga bertindak sebagai competitor bagi patogen akar
tersebut. Menurut Compant et al. (2005) dinding sel cendawan S. rolfsii, R. solani
dan Pythium ultimum dapat dihancurkan oleh enzim ß-1,3-glukanase yang
dihasilkan oleh B. cepacea.
Hasil uji karakter PGPR pada isolat Bacillus sp. menunjukkan bahwa empat
isolat diantara 6 isolat yang memacu pertumbuhan kecambah kedelai kultivar
Slamet yaitu isolat Cr 64, Cr 66, Cr 68, dan Cr 71 memiliki karakter yang lengkap
sebagai PGPR yaitu mampu memproduksi hormon IAA, mampu memacu
pertumbuhan tanaman tanpa menyebabkan reaksi hipersensitif, mampu
melarutkan fosfat, mampu memproduksi siderofor serta memiliki kemampuan
sebagai biokontrol fungi patogen akar tanaman kedelai R. solani.
Keragaman 6 isolat Bacillus sp. yang telah diisolasi dan telah diuji
kemampuannya sebagai PGPR yang memacu pertumbuhan tanaman dapat
dianalisis menggunakan pendekatan molekuler berdasarkan sekuen gen 16S rRNA.
DNA hasil isolasi diamplifikasi sebanyak 30 siklus menggunakan mesin PCR
dengan primer 63f dan 1387r (Marchesi et al. 1998) diperoleh panjang basa
nukleotida ± 1300 pb. Selanjutnya hasil identifikasi sekuen parsial gen 16S rRNA
hasil amplifikasi menunjukkan bahwa isolat memiliki persentase homologi
tertentu terhadap isolat yang terdapat pada GenBank. Hasil analisis sekuen parsial
gen 16S rRNA dengan program BLAST-N menunjukkan bahwa Cr 64 memiliki
persentase similaritas 92% dengan Bacillus sp. NRS-800, Cr 66 memiliki
persentase similaritas 94% dengan B. cereus HNR10, Cr 67 memiliki persentase
similaritas 94% dengan B. pumilus str M-1-9-1, Cr 68 memiliki persentase
similaritas 93% dengan B. thuringiensis str FWAW, Cr 69 memiliki persentase
similaritas 98% dengan B. cereus AD2, sedangkan Cr 71 memiliki persentase
similaritas 99% dengan Bacillus shandongensis str SD.
Hasil pengolahan sekuen parsial gen 16S rRNA menggunakan program
NJplot diperoleh dendrogram pohon filogenetik yang memperlihatkan hubungan
kekerabatan antara isolat Bacillus dengan spesies Bacillus spp. Keenam isolat
membentuk 3 kelompok yang berbeda. Cr 64 memisah tersendiri, isolat Cr 66, Cr
68, dan Cr 69 membentuk kelompok sendiri yang terpisah dengan Cr 67 dan Cr
71. Masing-masing isolat memiliki jarak evolusi yang berbeda-beda dengan
spesies Bacillus spp. yang ada pada GenBank. Diversitas keenam isolat cukup
tinggi dan masing - masing isolat memiliki kedekatan kekerabatan pada spesies
yang berbeda-beda.
ABSTRACT
ASRI WIDYAWATI. Bacillus sp. Isolated from Rhizosphere of Soybean Plant as
Plant Growth Promoting Rhizobacteria and Biocontrol of Root Pathogenic Fungi.
Under the direction of ARIS TRI WAHYUDI and ABDJAD ASIH
NAWANGSIH.
Bacillus sp. is one of the rhizosphere bacteria that have important role as
plant growth promoter, known as plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR).
Sixty isolates identified as Bacillus sp. were successfully isolated from
rhizosphere soil of soybean plant of Plumbon, Cirebon, West Java, based on their
morphologies and physiologies characters. 45 Bacillus sp. isolates grown in
Nutrient Broth (NB) medium supplemented with tryptophan (0.2 mM) had ability
to produce IAA. Bacillus sp. Cr 55 had ability to produce the highest IAA was
about 44.66 ppm. Hypersensitivity test revealed that all of Bacillus sp. isolates
were classified as non-pathogenic bacteria. Six Bacillus sp. isolates that have been
characterized to produce IAA were able to induce elongation of primary root and
stem, and numerous of lateral and sub lateral roots. Furthermore, 36 isolates of
Bacillus sp. had ability to solubilize phosphate as indicated by clear zone
surrounding the colonies on Pikovskaya agar, 43 isolates of Bacillus sp. had
ability to produce siderophore, 2 isolates were capable to produce antifungal
compounds to inhibit of S. rolfsii and 28 isolates of them were capable to produce
antifungal compounds to inhibit of R. solani. This study has demonstrated that 4
isolates of Bacillus sp. isolated from rhizosphere of soybean plant can be
determined as potential isolates that can be used as inoculants to promote plant
growth based on the specific characters. The result of identified use 16S rRNA
partial sequence genes of 6 isolates that had ability as PGPR showed that all of
them had similarity with Bacillus spp. from GenBank. Cr 64 had 92% similarity
with Bacillus sp. NRS-800, Cr 66 had 94% similarity with B. cereus HNR10, Cr
67 had 94% similarity with B. pumilus str M1-9-1, Cr 68 had 93% similarity with
B. thuringiensis str FWAW, Cr 69 had 98% similarity with B. cereus AD2 and Cr
71 had 99% similarity with B. shandongensis str SD.
Key Words : Bacillus sp., Indole Acetic Acid (IAA), Phosphate Solubilization,
Germination Seedling Bioassay, Siderophore, Anti Fungi.
© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2008
Hak cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik
atau tinjauan suatu masalah;
b. pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh
karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
Bacillus sp. ASAL RIZOSFER KEDELAI
YANG BERPOTENSI SEBAGAI PEMACU PERTUMBUHAN
TANAMAN DAN BIOKONTROL FUNGI PATOGEN AKAR
ASRI WIDYAWATI
Tesis
Sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2008
: Bacillus sp. Asal Rizosfer Kedelai yang Berpotensi sebagai
Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol Fungi Patogen
Akar
Nama
: Asri Widyawati
NRP
: G351060221
Program Studi : Biologi
Judul
Disetujui,
Komisi Pembimbing
Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si.
Ketua
Dr. Ir. Abdjad Asih Nawangsih, M.Si.
Anggota
Diketahui,
Ketua Program Studi Biologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Dedy Duryadi S, DEA
M.S.
Prof. Dr Ir. Khairil Anwar Notodiputro,
Tanggal Ujian: 14 Mei 2008
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Syukur alhamdulillah penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat,
karunia serta ridlo-Nya sehingga tesis yang berjudul ”Bacillus sp. Asal Rizosfer
Kedelai yang Berpotensi sebagai Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol
Fungi Patogen Akar” ini dapat diselesaikan.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si dan
Dr. Ir. Abdjad Asih Nawangsih, M.Si. selaku dosen pembimbing yang selalu
memberikan bimbingan dan arahannya dalam penyusunan tesis ini. Di samping
itu penulis juga menyampaikan ucapan terima kasih kepada Departemen Agama
RI yang telah memberikan kesempatan sehingga penulis dapat mengikuti program
pendidikan pascasarjana. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Drs.
Komari Zaman selaku Kepala Madrasah Aliyah Negeri (MAN) Godean, Sleman,
Yogyakarta atas dukungan dan kesempatan yang diberikan sehingga penulis dapat
mengikuti program pendidikan pascasarjana IPB.
Penelitian ini sebagian didanai oleh Program Insentif Penelitian Dasar
Kementrian Negara Riset dan Teknologi (KNRT) kepada Aris Tri Wahyudi dan
sebagian lagi didanai dari Departemen Agama RI melalui Kerjasama antara IPB
dengan Departemen Agama RI. Untuk itu kami mengucapkan terima kasih.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak, Kakak-kakak,
Adik dan keponakan atas segala doa, perhatian dan dukungan yang diberikan.
Demikian juga kepada Mbak Rina, Rika, Mbak Ari, teman-teman dan pengelola
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB atas kerjasamanya
selama penelitian ini dilaksanakan.
Semoga tesis ini memberikan manfaat.
Bogor, Mei 2008
Asri Widyawati
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Sleman pada tanggal 22 Mei 1975 dari ayah Drs.
Asri dan ibu Sri Wijati (almh). Penulis merupakan anak keenam dari 7 bersaudara.
Tahun 2000 penulis menyelesaikan program Strata 1 pada Universitas
Negeri Yogyakarta mengambil jurusan Pendidikan Biologi. Selanjutnya penulis
mengajar pada sekolah menengah swasta dari tahun 1998 hingga tahun 2003.
Pada tahun 2004 penulis mengajar di MAN Godean, Sleman, Yogyakarta hingga
sekarang.
Pada bulan Juli 2006 penulis mendapatkan kesempatan mengikuti program
beasiswa pendidikan Pascasarjana dari Departemen Agama RI dan mengambil
Program Studi Biologi, Subprogram Studi Mikrobiologi pada Sekolah
Pascasarjana IPB.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI.................................................................................................... xii
DAFTAR TABEL ........................................................................................... xiv
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xv
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xvi
PENDAHULUAN
Latar Belakang ..........................................................................................
Tujuan ......................................................................................................
1
3
TINJAUAN PUSTAKA
Bacillus sp. ................................................................................................ 4
Karakter Bacillus sp. sebagai PGPR ........................................................ 4
Fungi Patogen Akar Kedelai .................................................................... 9
Gen 16S rRNA ......................................................................................... 10
BAHAN DAN METODE
Isolasi dan Karakterisasi Fisiologi secara Parsial Bacillus sp. ..................
Uji Karakteristik Bacillus sp. sebagai PGPR
Uji Produksi Indole Acetic Acid (IAA) ...............................................
Uji Pelarutan Fosfat ..........................................................................
Uji Produksi Siderofor .......................................................................
Uji Hipersensitivitas ..........................................................................
Telaah Pemacuan Pertumbuhan Tanaman .........................................
Uji Antagonisme terhadap Fungi Patogen Akar ...............................
Identifikasi Berdasarkan Sekuen Gen 16S rRNA
Isolasi DNA ......................................................................................
Amplifikasi DNA ..............................................................................
Analisis Sekuen Gen 16S rRNA ........................................................
HASIL
Isolasi dan Karakterisasi Fisiologi secara Parsial Bacillus sp. .................
Karakter Bacillus sp. sebagai PGPR
Produksi Indole Acetic Acid (IAA) .....................................................
Uji Pelarutan Fosfat ...........................................................................
Uji Produksi Siderofor .......................................................................
Uji Hipersensitivitas ..........................................................................
Telaah Pemacuan Pertumbuhan ..........................................................
Uji Antagonisme terhadap Fungi Patogen Akar ................................
Analisis Sekuen Gen 16S rRNA ...............................................................
11
11
12
12
13
13
13
14
15
15
16
16
18
18
18
21
24
26
PEMBAHASAN
Isolasi dan Karakterisasi Fisiologi secara Parsial Bacillus sp. .................. 29
Karakter Bacillus sp. sebagai PGPR ......................................................... 30
Analisis Sekuen Gen 16S rRNA ............................................................... 37
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ................................................................................................... 39
Saran ......................................................................................................... 39
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 40
LAMPIRAN .................................................................................................... 44
DAFTAR TABEL
Halaman
1
2
3
4
Hasil uji produksi IAA, pelarutan fosfat, uji siderofor dan uji antagonisme terhadap cendawan S. rolfsii dan R. solani pada 45 isolat
Bacillus sp. yang mampu memproduksi IAA ....................................
20
Rerata panjang akar, panjang batang dan jumlah akar lateral dan sub
lateral pada kecambah kedelai kultivar Slamet yang diberi perlakuan
dengan isolat Bacillus sp. dan diinkubasikan selama 7 hari pada
media agar – agar 1% beserta kontrol ...............................................
23
Karakteristik isolat Bacillus sp. yang mampu memacu pertumbuhan
kecambah kedelai kultivar Slamet secara signifikan .........................
35
Karakteristik PGPR isolat Bacillus sp. dan hasil analisis sekuen gen
16S rRNA ...........................................................................................
38
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
5
6
Penampilan koloni isolat Bacillus sp. Cr 66 berumur 24 jam yang
ditumbuhkan pada media cawan gorea Nutrient Agar (A); (B)
penampilan sel Bacillus sp. yang dilakukan perwarnaan gram
menunjukkan Gram positif berbentuk batang; (C) struktur endospora
ditunjukkan dengan tanda anak panah diamati menggunakan
mikroskop cahaya perbesaran 1000 kali .............................................
17
Isolat Bacillus sp. Cr 90 yang ditumbuhkan pada media Phikovkaya
dan diinkubasikan selama 3 hari pada suhu ruang mempunyai
kemampuan melarutkan fosfat yang ditandai oleh terbentuknya zona
bening di sekeliling koloni bakteri (A); (B) penampilan koloni
Bacillus sp. yang ditumbuhkan pada media agar-agar CAS dengan
metode replika dan diinkubasikan semalam menampilkan zona
berwarna oranye jernih di sekeliling koloni bakteri yang
menunjukkan dihasilkannya siderofor ...............................................
19
Panjang akar dan jumlah akar kecambah kedelai kultivar Slamet
berumur tujuh hari pada media agar-agar 1%, (A) kecambah
diinokulasi dengan Bacillus sp. Cr 69; (B) kontrol ...........................
22
Penampilan cendawan R. solani yang diinkubasikan selama 2 hari
pada media PDA pertumbuhan radialnya dihambat oleh isolat
Bacillus sp. Cr 64 (A); penampilan cendawan S. rolfsii yang
diinkubasikan selama 5 hari pada media PDA pertumbuhan
radialnya dihambat oleh isolat Bacillus sp. Cr55 ...............................
25
Elektroforesis gel Agarose 1% dari gen 16S rRNA hasil amplifikasi
PCR sebanyak 30 siklus menggunakan primer 63f dan 1387r
memiliki panjang basa nukleotida sekitar 1.3 kb ................................
27
Dendrogram pohon filogenetik yang mengindikasikan kekerabatan
dari keenam isolat berdasarkan sekuen gen 16S rRNA hasil
amplifikasi PCR dengan isolat dari GenBank (angka di atas garis
cabang menunjukkan panjang percabangan yang mengindikasikan
jarak evolusi antar isolat) ...................................................................
28
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Sekuen parsial gen 16S rRNA 6 isolat pemacu pertumbuhan tanaman
2
Hasil analisis sekuen parsial gen 16S rRNA menggunakan program
44
BLAST-N ............................................................................................
46
3
Komposisi media tumbuh (dalam liter) ..............................................
47
4
Bahan – bahan untuk karakterisasi fisiologi secara parsial genus
Bacillus ...............................................................................................
48
PENDAHULUAN
Latar Belakang Masalah
Pertambahan jumlah penduduk yang sangat pesat menyebabkan kebutuhan
pangan juga meningkat. Berbagai langkah dilakukan masyarakat dan pemerintah
untuk menjaga tetap tersedianya pangan dunia. Langkah-langkah yang diambil
hingga menjelang abad 20 antara lain dengan intensifikasi melalui penggunaan
pupuk sintetis, pestisida dan bibit unggul. Langkah-langkah tersebut ternyata
memberikan efek samping pencemaran lingkungan.
Hal ini mendorong
berkembangnya bioteknologi dengan menggunakan mikroorganisme sebagai
agens untuk meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman sekaligus sebagai
agens pengendali hayati terhadap patogen.
Salah satu kelompok organisme yang sering mengganggu tanaman kedelai
adalah cendawan, dua diantaranya adalah Rhizoctonia solani dan Sclerotium
rolfsii. Keduanya merupakan jenis cendawan yang sering menyerang perakaran
tanaman kedelai dan menyebabkan penyakit busuk akar. Hal ini memerlukan
penanganan lanjut yang lebih efektif.
Rizosfer tanaman telah diketahui di dalamnya terdapat mikroorganisme
yang bersimbiosis dengan akar. Rizosfer atau daerah sekitar perakaran tanaman
relatif kaya akan nutrisi yang berkaitan dengan keadaan di akar yaitu berupa
hilangnya 5 – 21 % hasil fotosintesis tanaman yang dilepaskan sebagai eksudat
akar (Marscher 1995). Sebagai akibatnya, keberadaan nutrisi pada akar ini
mendukung populasi mikrob aktif berkembang dan mampu memproduksi
senyawa yang mungkin menguntungkan, netral atau merugikan bagi tanaman di
atasnya. Adanya mikroorganisme tersebut dapat memberikan efek positif maupun
negatif bagi perakaran tanaman. Berbagai jenis mikroorganisme seperti bakteri
telah diketahui dapat dimanfaatkan sebagai agens hayati untuk meningkatkan
pertumbuhan dan produksi tanaman yang dikenal luas dengan istilah Plant
Growth
Promoting
Rhizobacteria
(PGPR)
Pertumbuhan Tanaman. Bakteri ini secara aktif
atau
Rizobakteria
Pemacu
mengkolonisasi rizosfer dan
permukaan akar serta memberikan pengaruh positif untuk pemacuan pertumbuhan
tanaman melalui penyediaan nutrisi dan hormon bagi tanaman, serta dapat bersifat
antagonistik terhadap bakteri dan fungi patogen (Kloepper et al. 1999; Gray &
2
Smith 2005). Adanya PGPR dapat memberikan keuntungan melalui berbagai
mekanisme antara lain produksi metabolit sekunder seperti antibiotik, kitinase, 1,3
- β-glukanase, sianida, substansi hormon, sebagai agens pengendali biologi
melalui kompetisi, induksi sistem pertahanan terhadap patogen, produksi
siderofor, pelarut fosfat, dan fiksasi N2. (Glick 1995; Husen 2003).
Bakteri
rizosfer yang telah diketahui dapat menghasilkan auksin antara lain Pseudomonas
sp., Azospirillum sp., Azotobacter sp., Bacillus sp., Lactobacillus sp.,
Paenibacillus polymyxa, Enterobacter sp., Serratia marcescens, Klebsiella sp.,
Algaligenes faecalis, dan sianobacteria (Torres-Rubio et al. 2000).
Adapun bakteri yang menjadi topik dalam kajian penelitian ini adalah
bakteri kelompok Bacillus sp. merupakan salah satu kelompok bakteri yang dapat
diisolasi dari tanah dengan karakter Gram positif, berbentuk batang dan
mempunyai kemampuan membentuk endospora pada kondisi lingkungan yang
tidak menguntungkan sehingga dapat toleran pada kondisi lingkungan kritis.
Compant et al. (2005) melaporkan bahwa Bacillus sp. mempunyai banyak potensi
yaitu mampu memproduksi IAA, melarutkan fosfat, mensekresi siderofor dan
berperan sebagai agens biokontrol dengan menginduksi sistem kekebalan tanaman
serta menghasilkan antibiotik.
Berbagai penelitian menunjukkan bahwa sangat banyak jenis mikrob
khususnya bakteri di tanah termasuk Bacillus sp. dapat dimanfaatkan sebagai
PGPR sekaligus dapat berperan untuk mengendalikan penyakit pada tanaman.
Pada genus Bacillus kemampuan biokontrolnya didukung oleh kemampuannya
membentuk spora yang dapat bertahan dan tetap dapat melepaskan metabolit
aktifnya pada kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan sehingga
memungkinkan untuk membuat formulasi produk yang stabil (Kloepper et al.
1999).
Adanya bakteri yang diisolasi dari tanah perakaran kedelai yang berpotensi
sebagai pemacu pertumbuhan tanaman dan pengendali hayati patogen akar
tanaman kedelai diharapkan dapat dimanfaatkan sebagai alternatif galur inokulan
yang dapat meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman kedelai.
Berdasarkan latar belakang di atas maka perlu dilakukan penelitian untuk
mengisolasi dan mengkarakterisasi potensi Bacillus sp. sebagai pemacu
3
pertumbuhan tanaman dan pengendali pertumbuhan fungi patogen akar.
Selanjutnya dilakukan identifikasi molekulernya untuk menentukan galur
inokulannya.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan menapis rizobakteria Bacillus sp. asal rizosfer
tanaman kedelai secara in vitro yang dapat berperan sebagai pemacu pertumbuhan
tanaman dan pengendali fungi patogen penyebab penyakit akar tanaman kedelai
serta identifikasi molekulernya.
TINJAUAN PUSTAKA
Bacillus sp.
Bacillus sp. merupakan bakteri gram positif, berbentuk batang yang
mempunyai kemampuan membentuk endospora pada kondisi yang kurang
menguntungkan. Bakteri ini dapat ditemukan dan dapat diisolasi dari tanah.
Bentuk endospora merupakan nilai lebih bagi bakteri yang sangat terkait secara
ekologi di dalam tanah. Kemampuannya membentuk endospora menyebabkan
bakteri ini relatif lebih tahan terhadap kondisi lingkungan yang kurang
menguntungkan dan kritis misalnya radiasi, panas, asam, desinfektan, kekeringan,
nutrisi yang terbatas dan dapat dorman dalam jangka waktu yang lama hingga
bertahun-tahun. Struktur spora tidak akan terjadi jika sel sedang berada pada fase
pembelahan secara eksponensial tetapi akan dibentuk terutama pada kondisi
nutrisi esensial misalnya karbon dan nitrogen terbatas. Pada Bacillus subtilis
sporulasi terjadi sekitar 8 jam dengan melibatkan hingga 200 gen (Madigan et al.
2000). Selain itu Bacillus sp. mempunyai sifat katalase positif sehingga mampu
menguraikan peroksida toksik menjadi air dan oksigen. Bacillus sp. termasuk
kelompok PGPR yang memiliki banyak potensi karena mampu memproduksi
IAA, melarutkan fosfat, memsekresi siderofor dan berperan sebagai agens
biokontrol dengan menginduksi sistem kekebalan tanaman serta menghasilkan
antibiotik (Compant et al. 2005).
Karakter Bacillus sp. sebagai PGPR
Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) pertama kali didefinisikan
oleh Kloepper dan Schroth (1978) untuk mendeskripsikan bakteri tanah yang
berkumpul di akar setelah benih ditanam. PGPR dapat meningkatkan
pertumbuhan tanaman dengan berbagai mekanisme antara lain fiksasi nitrogen,
produksi siderofor, sebagai pengkelat besi dan sintesis fitohormon. Bakteri
tersebut dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman dengan meningkatkan sistem
perakaran tanaman. Menurut Enebak et al. 1998 (diacu dalam Mello et al. 2004)
PGPR dapat mempengaruhi pertumbuhan tanaman melalui satu mekanisme atau
lebih termasuk meningkatkan fiksasi nitrogen, produksi auksin, giberelin,
5
sitokinin, etilen, melarutkan fosfat dan oksidasi sulfur, meningkatkan ketersediaan
nitrat, produksi antibiotik ekstraseluler, enzim litik, asam hidrosianik,
meningkatkan permiabilitas akar dan kompetisi dalam nutrisi. Kemampuan
rizobakteria dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman sangat bergantung pada
karakter yang merupakan ciri khas dan spesifik gen yang dimilikinya (Nelson
2004).
Mikroorganisme mampu menghasilkan hormon tumbuhan seperti auksin,
sitokinin dan giberelin (Leveau & Lindow 2005). Asam indol asetat atau Indol
acetic acid (IAA) merupakan hormon auksin pertama pada tumbuhan yang
mengendalikan berbagai proses fisiologi penting meliputi pembelahan dan
perkembangan sel, diferensiasi jaringan serta respons terhadap cahaya dan
gravitasi (Salisbury & Ross 1992). Tumbuhan mungkin saja tidak mampu
mencukupi kebutuhan auksin untuk pertumbuhannya secara optimal sehingga
diperlukan tambahan hormon pemacu pertumbuhan dari luar. Menurut Patten dan
Glick (2002) respons tanaman terhadap IAA yang dihasilkan mikrob berbedabeda bergantung pada spesies tanaman dan konsentrasi IAA yang dihasilkan.
Menurut Leveau dan Lindow (2005) hormon IAA atau yang dikenal
sebagai auksin merupakan hormon pemacu pertumbuhan dan mengontrol berbagai
proses fisiologi seperti pembelahan sel, diferensiasi jaringan dan respons terhadap
cahaya dan gravitasi. Bakteri penghasil IAA mempunyai kemampuan membantu
berbagai proses tersebut dengan memasukkan IAA ke dalam pool auksin tanaman.
Akar merupakan organ tanaman yang paling sensitif terhadap fluktuasi kadar IAA
dan responsnya pada peningkatan jumlah IAA eksogenous meluas dari
pemanjangan akar primer, pembentukan akar lateral dan akar liar, sampai
penghentian pertumbuhan.
Biosintesis IAA oleh mikrob ditingkatkan oleh prekursor fisiologi tertentu
yaitu L-Tryptophan (Husen 2003). Protein –TRAP (AT) yang diproduksi oleh
trpA pada Bacillus subtilis dapat mengikat dan menghambat aktifitas triptofan
protein yang berikatan lemah antara Trp-RNA (TRAP). Pada Bacillus subtilis
diperlukan ekspresi dari tujuh gen untuk berlangsungnya biosintesis L-triptofan
dari asam korismat termasuk prekursor asam amino amoniak. Enam dari tujuh gen
terorganisasi sebagai operan triptofan, suboperan dalam superoperon aromatik.
6
Gen triptofan yang ketujuh trpG (pabA) terletak pada operan folat dan
menghasilkan polipeptida yang berperan dalam biosintesis triptofan dan folat
(Wen & Charles 2005).
Manulis et al. (1998) mengemukakan bahwa beberapa lintasan sintesis
IAA pada bakteri yang melibatkan senyawa intermediat indole-3-pyruvate (IpyA)
yaitu indole-3-acetamide (IAM), tryptamine (TAM) dan indole-3-acetonitrile
(IAN). Jalur utama yang ada pada bakteri yaitu lintasan IAM dan IPyA. Bakteri
yang memproduksi IAA menstimulasi pertumbuhan sistem perakaran inang.
Sel tumbuhan memproduksi IAA dari L-tripthofan melalui intermediet
IAM, lintasannya melalui enzim triptofan 2-monooksenase yang mengkatalisis
konversi triptofan menjadi IAM dan enzim indoleacetamid hidrolase yang
mengkatalisis konversi IAM menjadi IAA (Mazzola & White 1993). Tien et al.
(1979) mengamati bahwa produksi IAA meningkat sesuai dengan peningkatan
konsentrasi triptofan dari 1 – 100 ug / ml. Konsentrasi IAA juga meningkat
seiring dengan umur kultur sampai bakteri mencapai fase stasioner. Pengocokan
lebih disukai untuk memproduksi IAA, terutama pada yang mengandung nitrogen
sedangkan fitohormon lainnya juga terdeteksi pada media kultur yaitu giberelin
dan senyawa serupa sitokinin.
Produksi IAA tidak berfungsi nyata sebagai hormon dalam sel bakteri,
dimungkinkan terdapat dalam sel bakteri karena hormon tersebut berperan penting
dalam interaksi antara bakteri dan tanaman. Pada penelitian yang dilakukan Patten
dan Glick (2002) diperoleh bahwa bakteri yang memproduksi IAA menstimulasi
pertumbuhan sistem perakaran inang. Keuntungan dari asosiasi tanaman dengan
bakteri adalah mensuplai sebanyak produk metabolit fiksasi karbon oleh
tumbuhan yang telah hilang ke rhizosfer sebagai eksudat (Martens et al. 1994,
diacu dalam Patten & Glick 2002).
Reaksi awal pengubahan triptofan menjadi indol-3-piruvat dikatalisis oleh
aminotransferase aromatik, dimana empat enzim berhasil diidentifikasi pada
Azospirillum lipoferum. Enzim-enzim yang ditemukan ini spesifik terhadap
berbagai asam amino aromatik dan tidak hanya pada triptofan, sehingga deteksi
pada protein-protein ini kurang membuktikan bahwa IAA disintesis melalui
indole-3-piruvat pada Azospirillum.
7
iaaM
Indole-acetamide
Triptofan
typtamine
Indole-3-pyruvic acid
Indole-3-acetaldehyde
iaaH
ipdC
Indole-3-acetic acid (IAA)
Indole-3-acetic acid
Inndole-3-acetic acid
Gambar 1 Diagram alir lintasan biosintesis IAA pada Bakteri (Hartman et al.
1983; Brandl et al. 1996; Manulis et al. 1980). Gen-gen iaaM, iaaH
dan ipdC masing-masing menyandikan tryptohan-2-monooygenase,
indole-3-acetamide hydrolase dan indole-pyruvat decarboxylase.
Fosfat merupakan salah satu unsur hara yang sangat diperlukan oleh
tanaman. Di dalam tanah hanya sebagian kecil saja fosfat yang dapat diserap oleh
tanaman karena masih terikat dengan kation logam misalnya Fe, Ca dan Al.
Adanya kemampuan bakteri dalam melarutkan fosfat berpotensi untuk
meningkatkan penyerapan unsur fosfat ke dalam tanaman apabila tersedia cukup
endapan fosfat dalam tanah. Bakteri pelarut fosfat dapat menyediakan fosfat
terikat menjadi fosfat yang dapat terlarut sehingga dapat diserap oleh tanaman.
Mekanisme utama pelarutan fosfat pada bakteri dengan memisahkan kation dari
senyawa asam menggunakan asam organik yang disintesisnya (Altomare et al.
1999). Bakteri pelarut fosfat melepaskan ikatan ion fosfat anorganik yang sukar
larut dengan mensekresikan sejumlah asam organik. Beberapa bakteri yang
dilaporkan mempunyai aktifitas fitase (enzim kelompok fosfomonoesterase) yang
mampu menghidrolisis polifosfat organik tak larut (fitat) menjadi rangkaian ester
fosfat dengan bobot molekul yang rendah dari myo-inositol dan fosfat yang
penting untuk prokariot dan eukariot. Bakteri yang mempunyai kemampuan
melarutkan fosfat antara lain Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis, Klebsiella
terrigena, Pseudomonas spp. dan Enterobacter sp. (Idriss et al. 2002).
8
Siderofor merupakan molekul atau ligan pengkelat besi (Fe3+ ) yang
diproduksi oleh bakteri terutama pada tanah netral dan alkalin yang banyak diteliti
saat ini. Siderofor disekresikan oleh mikroorganisme dan tanaman dari famili
Gramineae sebagai respons terhadap defisiensi unsur besi (Crowley 2001, diacu
dalam Nawangsih 2006). Jenis agen pengkelat besi, siderofor, yang dihasilkan
oleh mikroorganisme antara lain berupa hydroxamate dan enterobactin (pada E.
coli). Hidroxamate mengikat besi ferric (Fe3+) yang direduksi dan dilepaskan ke
dalam sel bakteri sebagai besi ferro (Fe2+) (Madigan 2003). Menurut Nawangsih
(2006) hasil deteksi pada beberapa galur Pseudomonas fluorescens, Bacillus
subtilis, dan B. cereus positif menghasilkan senyawa siderofor. Adanya siderofor
pada bakteri ini mendukung kemampuan bakteri sebagai PGPR karena dapat
bertindak dalam kompetisi dengan mikroorganisme patogen dalam menggunakan
Fe3+ yang konsentrasinya sangat terbatas dalam tanah. Namun pengambilan Fe3+
oleh mikroorganisme ini tidak mempengaruhi kebutuhan tanaman akan besi yang
sangat sedikit dibandingkan dengan mikroorganisme
Kemampuan Bacillus sp. sebagai pengendali penyakit tanaman antara lain
karena kemampuannya memproduksi antibiotik yang diekskresikan saat kultur
memasuki fase stasioner (Madigan et al. 2000) dan produksi metabolit sekunder
misalnya enzim kitinase, mycobacilin, basitrasin dan zwittermicin. Menurut
Benhamou et al. (1996) bakteri endofit Bacillus pumilus strain SE34 dapat
digunakan untuk menginduksi ketahanan secara sistemik pada buncis (Pisum
sativum). Bakteri ini dapat merangsang penebalan dinding sel terutama pada
jaringan korteks dengan produksi kitin sehingga patogen tidak dapat melakukan
penetrasi. Patogen hanya terdistribusi pada jaringan epidermis dan tidak dapat
menyebar ke jaringan korteks. Bacillus subtilis diketahui menunjukkan aktifitas
antagonis terhadap bakteri dan fungi fitopatogen. Sedangkan Bacillus cereus
diketahui dapat mereduksi pertumbuhan miselia Sclerotium rolfsii., Fusarium
oxysporum,
Pythium
aphanidermatum,
Helminthosporium
maydis
dan
Rhizoctonia solani dengan zona inhibisi 35.3% - 53.3 % (Muhammad & Amusa
2003).
9
Kemampuan Bacillus sebagai biokontrol juga dapat terjadi melalui mekanisme
resistensi terinduksi oleh B. subtilis pada tanaman yang diserang cendawan A.
niger (Sailaja et al. 1997).
Fungi Patogen Akar Kedelai
Penyakit-penyakit pada tumbuhan baik pada bagian akar, batang, daun dan
bunga ataupun biji sebagian besar disebabkan oleh fungi. Fungi masuk ke dalam
jaringan tanaman melalui struktur terbuka yang alami pada jaringan tanaman
misalnya stomata lentisel, dan hidatoda atau melalui jaringan tanaman yang
terluka. Beberapa fungi mengkolonisasi tanaman kedelai dan benih secara
asimtom. Beberapa fungi yang dikenal menyerang akar tanaman kedelai antara
lain Rhizoctonia solani penyebab penyakit busuk akar dan rebah kecambah
(damping off) serta Sclerotium rolfsii penyebab penyakit busuk akar dan batang
(Hartman et al. 2001) dan damping off pada benih (Agrios 2004). Kedua fungi ini
menyebabkan penyakit yang cukup serius baik pada akar, batang dan bagianbagian tanaman lainnya.
Rhizoctonia solani merupakan fungi saprofit yang dapat bertahan walau
tidak berada pada tanaman inang. R. solani memiliki sel multinukleat yang
hifanya berwarna coklat dan mampu membentuk sklerotia berwarna coklat hingga
hitam. Fungi ini menginfeksi pada saat penanaman benih dan menginfasi
hipokotil selanjutnya menyebabkan damping off atau jika tidak akan
menyebabkan busuk akar. Semua Rhizoctonia terdapat sebagai miselium steril dan
kadang-kadang sebagai sklerotia kecil tanpa diferensiasi jaringan internal (Agrios
2004). Penggunaan Bacillus megaterium diketahui dapat menurunkan tingkat
penyakit yang disebabkan fungi ini (Hartman et al. 2001).
Tanaman kedelai sangat rentan terhadap serangan S. rolfsii yang
menyerang tanaman sejak pembenihan. S. rolfsii memiliki hifa hialin berseptat,
tidak memproduksi spora aseksual, dan mampu membentuk struktur pertahanan
berupa sklerotia sperikel. Massa miselium yang menyerang jaringan memproduksi
sekret berupa asam oksalat, pektinolitik, selulolitik dan enzim-enzim yang dapat
membunuh dan mengurai jaringan tanaman sebelum penetrasi (Agrios 2004).
10
Gen 16S rRNA
RNA di dalam sel dapat dikelompokkan menjadi 2 kelompok yaitu
kelompok RNA yang berhubungan dengan ekspresi gen yaitu mRNA, tRNA dan
kelompok rRNA yang tidak berhubungan dengan ekspresi gen. Ribosomal RNA
merupakan salah satu makromolekul yang menarik karena molekul ini bersifat
stabil, terdapat sekitar 83% dari keseluruhan RNA dalam sel dan merupakan
kerangka ribosom yang sangat berperan dalam mekanisme translasi. Semua rRNA
identik secara fungsional yakni terlibat dalam produksi protein, walaupun
demikian sekuen-sekuen di bagian tertentu terus berevolusi dan mengalami
perubahan pada level struktur primer sambil mempertahankan struktur sekunder
dan tersier yang homolog (Gutell et al. 1994).
Kemampuannya mewakili semua informasi filogenetik dan kepraktisannya
menyebabkan sekuen 16S rRNA lebih sesuai digunakan untuk identifikasi bakteri
daripada menggunakan 5S rRNA atau 23S rRNA. Menurut Bottger (1996)
aplikasi molekuler untuk menganalisis keragaman mikrob melalui analisis gen
16S rRNA sesuai untuk mengidentifikasi mikroorganisme karena gen ini terdapat
pada semua organisme prokariot. Molekul 16S rRNA memiliki daerah-daerah
berbeda berupa sekuen yang konservatif dan sekuen lain yang sangat variatif.
Terdapat lebih dari 4000 entri (sekuen yang terdaftar ) yang ada pada database
16S rRNA yang mencakup sekitar 1800 species yang terus bertambah jumlahnya.
Strategi yang sering digunakan untuk melihat keragaman mikrob meliputi tahaptahap isolasi DNA dari komunitas alami, amplifikasi gen 16S rRNA
menggunakan PCR, penapisan klon-klon untuk variabilitas genetik, pemilihan
klon unik untuk disekuen dan menentukan hubungan filogeniknya (Marchesi et al.
1998). Gen 16S rRNA bersifat relatif stabil dalam sel bakteri daripada rRNA yang
biasanya didegradasi dan hanya terdapat pada fase-fase tertentu saja.
BAHAN DAN METODE
Isolasi dan Karakterisasi Fisiologi secara Parsial Bacillus sp.
Isolasi dilakukan dengan cara mengambil 0.5 gram sampel tanah yang
diperoleh dari rizosfer kedelai asal Cirebon dimasukkan ke dalam 4.5 ml akuades
steril yang sudah terlarut NaCl 0.85% di dalamnya. Sampel divortek dan
dipanaskan pada suhu 80 oC selama 10 menit, selanjutnya dilakukan pengenceran
secara berseri hingga pengenceran 10-6. Sebanyak 100 µl suspensi ditumbuhkan
dalam media Nutrient Agar (NA) dengan metode cawan sebar dengan komposisi
8 g NB, 15 g agar-agar bacto dalam 1 liter akuades. Cawan selanjutnya diinkubasi
selama 24 jam. Koloni yang tumbuh dimurnikan dengan menggunakan media
yang sama. Selanjutnya koloni tunggal diamati karakter morfologinya dan
digoreskan pada media agar miring NA sebagai biakan stok.
Karakterisasi fisiologi isolat untuk menapis isolat meliputi perwarnaan
gram, pewarnaan endospora dan uji katalase mengikuti prosedur Bergey’s Manual
of Determinative Bacteriology (Buchanan & Gibbon 1974) untuk menentukan
isolat tersebut termasuk ke dalam kelompok Bacillus sp. Pewarnaan Gram
menggunakan pereaksi ungu kristal, iodium, etanol 95% dan safranin sebagai
pewarna tandingan. Pewarnaan endospora menggunakan pereaksi malakit hijau
dan safranin. Pengamatan meliputi bentuk sel dan warna sel menggunakan
mikroskop cahaya perbesaran 1000 kali. Uji katalase dilakukan dengan
menggunakan pereaksi hidrogen peroksida 3%.
Uji Karakteristik Bacillus sp. sebagai PGPR
Uji Produksi Indole Acetic Acid (IAA). Produksi IAA dilakukan dengan
menggunakan metode standar sesuai metode yang dilakukan oleh Dey et al.
(2004). Satu lup penuh isolat Bacillus sp. yang dikulturkan pada 10 ml media
Nutrient Broth (NB) yang ditambahkan L-triptofan 0.2 mM diinkubasikan dan
dikocok dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang selama 24 jam dalam ruang
gelap. IAA yang diproduksi oleh Bacillus diuji dengan metode kolorimetri dengan
menggunakan reagen Salkowski (Patten & Glick 2002) yang mengandung 150 ml
H2SO4 pekat, 250 ml Aquades, 7.5 ml FeCl3.6 H2O 0.5 M. Sebanyak 3 ml kultur
12
dari tiap perlakuan dimasukkan ke dalam 2 tabung ependorf kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Sebanyak 2 ml
filtrat yang diperoleh dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril dan ditambahkan
2 ml reagen Salkowski (perbandingan filtrat: reagen = 1:1). Suspensi kemudian
diinkubasikan selama 60 menit pada suhu ruang di dalam ruang gelap.
Selanjutnya dilakukan pengukuran serapan IAAnya dengan menggunakan
spektrofotometer (Spectronic 20) pada panjang gelombang 510 nm.
Uji Pelarutan Fosfat. Uji ini dilakukan dengan menggunakan metode
standar yaitu menggunakan media Pikovskaya (Subba Rao & Shinha 1962; Subba
Rao 1999), dengan komposisi glukosa 10 g, Ca3HPO4 5 g, (NH4)2SO4 0.5 g, KCL
0.2 g, MgSO4.7H2O 0.1 g, ekstrak khamir 0.5 g, MnSO4 25 mg dan FeSO4 25 mg,
serta agar-agar Bacto 20 g dalam 1l akuades. Suspensi isolat bakteri berumur 24
jam ditumbuhkan pada media Phikovkaya yang mengandung trikalsium fosfat
(Ca3PO4) dengan metode sebar, zona bening yang dihasilkan di sekitar koloni
setelah diinkubasi selama 3 hari menunjukkan adanya aktivitas bakteri dalam
melarutkan fosfat.
Uji Produksi Siderofor. Produksi siderofor oleh isolat Bacillus sp. diuji
menggunakan media Chrome Azurol Sulfonat (CAS) agar dengan modifikasi
larutan garam (Husen 2003). Larutan 1 (larutan indikator Fe-CAS) mengandung
10 ml (1mM FeCl3.6H2O didalam 10 mM HCL), 50 ml larutan CAS (1.21 mg ml1
), dan 40 ml larutan hexadecyl-trimetylammonium bromide (HDTMA) (1.82 mg
ml-1). Larutan 2 merupakan larutan buffer, disiapkan dengan melarutkan 30.24 g
PIPES (peperazine-N,N’-bis[2-ethanesulfonic acid]) kedalam 750 ml larutan
garam (3 gr KH2PO4, 5 g NaCl, 10 g NH4Cl, 20 mM MgSO4, 1 mM CaCl2).
Akuades ditambahkan untuk mencapai volume larutan 800 ml sebelum diukur pH
nya hingga 6.8 dengan 50% KOH, kemudian 20 g agar-agar bacto ditambahkan
sebelum diautoklaf. Larutan 3 mengandung 2 g glukosa, 2 g manitol dan mikro
elemen ( 493 mg MgSO4.7H2O, 11 mg CaCl2, 1.17 mg MnSO4.H2O, 1.4 mg
H3BO3, 0.04 mg CuSO4.5H2O, 1.2 mg ZnSO4.7H2O dan 1.0 mg NaMoO4.2H2O)
didalam 70 ml akuades. Larutan 4 berupa 30 ml 10% (w/v) cassamino acid yang
difilter dengan membran milipor 0.45 µm. Media ini dibuat dengan
mencampurkan larutan 2 dan 4 pada suhu 50 οC setelah sterilisasi, kemudian
13
ditambahkan larutan 3 dan larutan 1 secara perlahan-lahan dan dilakukan
homogenisasi dengan menggunakan stirer. Isolat yang telah diremajakan terlebih
dahulu, diuji menggunakan metode replika dengan cara ditotol atau digores pada
media agar CAS dengan dua ulangan. Isolat yang mampu memproduksi siderofor
akan menghasilkan zona berwarna oranye disekitar koloni setelah diinkubasi
semalam.
Uji Hipersensitivitas. Isolat berumur 24 jam dikulturkan pada media NB
cair dan dikocok dengan kecepatan 150 rpm selama 24 jam pada suhu ruang.
Isolat tersebut disuntikkan menggunakan syringe sebanyak 1 ml (diperkirakan >
106 CFU/ml) pada area intervena ruas daun tembakau (Lelliot & Stead 1987)
dengan masing-masing isolat 3 ulangan. Kontrol perlakuan pada uji ini
menggunakan E. coli dan akuades sebagai kontrol negatif serta Ralstonia
solanacearum sebagai kontrol positif. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam
hingga 48 jam untuk mengetahui perubahan warna dan kondisi daun tembakau
setelah disuntikkan dengan isolat. Adanya bercak nekrosis kecoklatan dan
kekeringan pada jaringan daun menunjukkan adanya reaksi hipersensitif positif.
Telaah Pemacuan Pertumbuhan Tanaman. Inokulan dari isolat yang akan
diuji disiapkan dengan meresuspensikan sel berumur 24 jam dari cawan agar-agar
tersebut ke dalam NB. Sebanyak 9 kecambah steril yang berumur 24 jam
diletakkan di atas media agar-agar 1%. Masing-masing kecambah diinokulasikan
dengan 100 μl suspensi bakteri dengan konsentrasi sel kira-kira 1010 sel/ml.
Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan dan 1 perlakuan
kontrol. Pada perlakuan kontrol masing-masing kecambah ditambahkan NB saja.
Setelah 7 hari perlakuan, diamati dan diukur pertumbuhannya yang meliputi
panjang batang, panjang akar utama dan jumlah akar lateral dan sublateral
kemudian dibandingkan dengan kontrol (Dey at al. 2004). Hasil pengukuran
dianalisis secara statistik dengan one-way Analysis of Variance (ANOVA) dan
diuji lanjut dengan uji Duncan pada taraf kesalahan 5% menggunakan software
SAS.
Uji Antagonisme terhadap Fungi Patogen Akar. Uji antagonis dilakukan
secara kualitatif dan kuantitatif dengan menggunakan metode standar kultur
ganda. Isolat Bacillus sp. digores pada medium Potato Dextros Agar (PDA)
14
dalam cawan petri berdiameter 9 cm, berjarak 3 cm dari kultur cendawan
Sclerotium rolsfii dan Rhizoctonia solani yang ditumbuhkan di tengah-tengah
cawan petri. Kultur dan biakan cendawan diinkubasikan selama 5 hari untuk S.
rolfsii dan 2 hari untuk R. solani dan diamati pertumbuhannya. Adanya interaksi
antagonis ditandai dengan terbentuknya zona penghambatan antara isolat Bacillus
sp. dengan cendawan. Uji kuantitatif dilakukan dengan metode oposisi langsung
untuk mengetahui besarnya persentase penghambatan pertumbuhan radial
cendawan
oleh
bakteri.
Besarnya
persentase
penghambatan
dihitung
mengguna
YANG BERPOTENSI SEBAGAI PEMACU PERTUMBUHAN
TANAMAN DAN BIOKONTROL FUNGI PATOGEN AKAR
ASRI WIDYAWATI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2008
PERNYATAAN MENGENAI TESIS
DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Bacillus sp. Asal
Rizosfer Kedelai yang Berpotensi sebagai Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan
Biokontrol Fungi Patogen Akar” adalah benar hasil karya saya sendiri dan belum
diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun yang
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Mei 2008
Asri Widyawati
G351060221
RINGKASAN
ASRI WIDYAWATI. Bacillus sp. Asal Rizosfer Kedelai yang Berpotensi sebagai
Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol Fungi Patogen Akar. Dibimbing
oleh ARIS TRI WAHYUDI dan ABDJAD ASIH NAWANGSIH.
Rizosfer tanaman telah diketahui di dalamnya terdapat mikroorganisme
yang bersimbiosis dengan akar. Adanya mikroorganisme tersebut dapat
memberikan efek positif maupun negatif bagi perakaran tanaman. Berbagai jenis
mikroorganisme seperti bakteri telah diketahui dapat dimanfaatkan sebagai agens
hayati untuk meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman yang dikenal luas
dengan istilah Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) atau Rizobakteria
Pemacu Pertumbuhan Tanaman. Bacillus sp. merupakan salah satu kelompok
bakteri yang dapat diisolasi dari tanah dengan karakter Gram positif, berbentuk
batang dan mempunyai kemampuan membentuk endospora pada kondisi
lingkungan yang tidak menguntungkan sehingga dapat toleran pada kondisi
lingkungan kritis. Compant et al. (2005) melaporkan bahwa Bacillus sp.
mempunyai banyak potensi yaitu mampu memproduksi IAA, melarutkan fosfat,
mensekresi siderofor dan berperan sebagai agens biokontrol dengan menginduksi
sistem kekebalan tanaman serta menghasilkan antibiotik.
Penelitian ini bertujuan menapis rizobakteria Bacillus sp. asal rizosfer
tanaman kedelai secara in vitro yang dapat berperan sebagai pemacu pertumbuhan
tanaman dan pengendali fungi patogen penyebab penyakit akar tanaman kedelai
serta identifikasi molekulernya. Karakter yang yang diuji meliputi kemampuan
isolat dalam memproduksi IAA, reaksi hipersensitivitas, pemacuan pertumbuhan,
kemampuan melarutkan fosfat, kemampuan mengkelat besi (dengan memproduksi
siderofor) serta kemampuan mengendalikan fungi patogen akar khususnya
Rhizoctonia solani dan Sclerotium rolfsii. Penelitian ini juga dimaksudkan untuk
mengetahui identitas bakteri yang berpotensi sebagai PGPR berdasarkan sekuen
gen yang menyandikan 16S rRNA.
Pada penelitian ini dilakukan isolasi dan karakterisasi Bacillus sp. yang
berasal dari rizosfer kedelai asal Cirebon dengan metode pengenceran secara
berseri menggunakan media Nutrient Agar (NA). Karakterisasi fisiologi secara
parsial genus Bacillus mengikuti metode standar Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology (Buchanan & Gibbon 1974) yang meliputi pewarnaan
Gram, pewarnaan endospora dan uji katalase. Genus Bacillus memiliki karakter
Gram positif, berbentuk batang, mampu membentuk endospora dan bersifat
katalase positif. Dari hasil isolasi dan karakterisasi ini diperoleh sebanyak 60
isolat merupakan kelompok Bacillus sp.
Kemampuan isolat dalam memproduksi IAA diuji menggunakan metode
kolorimetri dengan menambahkan reagen Salkowski yang diukur pada panjang
gelombang 510 nm. Pada uji ini diperoleh sebanyak 45 isolat mampu
memproduksi IAA dengan konsentrasi yang berbeda-beda dengan kisaran antara
0.06 ppm (Cr 72) hingga 44.66 ppm (Cr 55). Adanya perbedaan dalam
memproduksi IAA oleh bakteri dimungkinkan karena pengaruh perbedaan
aktifitas enzim indolpiruvat dekarboksilase yang terkait dengan tingkat ekspresi
gen ipcd yang menyandikan struktur protein tersebut. Konsentrasi IAA yang
dihasilkan oleh bakteri juga bergantung kepada aktifitas dan jumlah sel,
ketersediaan nutrisi dan substrat L-trp dalam media.
Hasil uji pelarutan fosfat diperoleh sebanyak 36 isolat mampu melarutkan
fosfat yang terkandung dalam media Phikovkaya dengan kemampuan yang
berbeda-beda ditunjukkan oleh zona bening yang terbentuk di sekeliling koloni
bakteri. Adanya kemampuan melarutkan fosfat yang berbeda ini mungkin terkait
dengan jenis asam organik yang disintesis oleh bakteri yang mungkin memiliki
kecocokan ataupun efektifitas dalam memutuskan ikatan pada kompleks kation
logam dengan anion fosfat.
Kemampuan isolat Bacillus sp. dalam memproduksi siderofor diuji dengan
menumbuhkan isolat pada media Chrome Azurol Sulfonat (CAS) agar yang
mengandung Fe dan diinkubasikan semalam. Hasil uji menunjukkan bahwa
sebanyak 43 isolat memproduksi siderofor ditandai dengan terbentuknya zona
berwarna kuning oranye jernih di sekeliling koloni bakteri. Menurut Compant et
al. (2005) siderofor pada berbagai bakteri memiliki kemampuan berbeda dalam
mengkelat besi, namun pada umumnya digunakan untuk menekan cendawan
patogenik yang mempunyai afinitas siderofor rendah. Adanya pengambilan besi
oleh bakteri PGPR ini dapat bertindak sebagai pesaing (competitor) bagi mikrob
fitopatogen.
Seluruh isolat yang mampu memproduksi IAA sebelum ditelaah
kemampuannya dalam pemacuan pertumbuhan diuji hipersensitivitas. Hasil uji
hipersensitivitas menunjukkan bahwa seluruh isolat tidak memberikan reaksi
hipersensitif terhadap tanaman tembakau. Hal ini menunjukkan bahwa seluruh
isolat tidak bersifat sebagai patogen bagi tanaman.
Pada telaah pemacuan pertumbuhan diperoleh sebanyak 6 isolat mampu
memacu secara signifikan taraf 95% terhadap pertumbuhan panjang batang,
panjang akar, dan jumlah akar lateral dan sublateral kecambah kedelai kultivar
Slamet. Isolat Cr 67, Cr 68, Cr 69, dan Cr 71 berhasil memacu pemanjangan akar
primer, isolat Cr 64, Cr 66, Cr 67, Cr 68, dan Cr 71 berhasil memacu
pemanjangan batang, isolat Cr 69 dan Cr 71 mampu memacu pembentukan akar
lateral dan sub lateral. Sedangkan pengaruh inokulasi dengan isolat Cr 77, Cr 82,
Cr 83, Cr 87, Cr 89, Cr 90, dan Cr 91 menyebabkan pertumbuhan panjang akar
kecambah lebih pendek daripada kontrol. Rerata panjang batang kecambah juga
lebih pendek pada kecambah yang diinokulasikan dengan isolat Cr 77 dan Cr 78
dibandingkan dengan kontrol. Jumlah akar lateral dan sub lateral lebih sedikit
daripada kontrol setelah diberi perlakuan dengan isolat Cr 77, Cr 78, Cr 81, Cr 82,
Cr 83, Cr 87, Cr 89, Cr 90, dan Cr 91. Isolat-isolat yang mampu memacu
pertumbuhan tersebut relatif memproduksi IAA justru pada konsentrasi yang
rendah yaitu pada kisaran 0.81 ppm hingga 9.63 ppm. Sedangkan isolat yang
memproduksi IAA yang tinggi antara lain Cr 55 (44.66 ppm), Cr 78 (32.84 ppm),
Cr 84 (30.30), Cr 90 (22.79 ppm) dan Cr 91 (20.32 ppm) tidak mampu memacu
pertumbuhan kecambah kedelai. Hal ini memperkuat pernyataan Husen et al.
(2006) bahwa peningkatan pertumbuhan tanaman terjadi pada pemberian IAA
dengan konsentrasi sangat rendah (0.01 μg/ml-1) sedangkan pada konsentrasi lebih
tinggi cenderung menurunkan pertumbuhan tanaman. Selain itu Glick (1995) juga
menambahkan bahwa produksi IAA yang berlebihan akan memacu hormon etilen
yang dalam konsentrasi tinggi justru menghambat perkembangan / pemanjangan
akar.
Kemampuan isolat Bacillus sp. dalam menekan pertumbuhan cendawan
Rhizoctonia solani dan Sclerotium rolfsii diuji secara kualitatif dan kuantitatif
menggunakan metode kultur ganda selanjutnya dihitung besarnya persentase
penghambatan (Dikin et al. 2006). Sebanyak 28 isolat mempunyai kemampuan
menghambat pertumbuhan R. solani dan sebanyak 2 isolat mempunyai
kemampuan menghambat pertumbuhan radial S. rolfsii.
Penghambatan
pertumbuhan cendawan oleh biokontrol dapat terjadi melalui mikolisis yaitu
hilangnya protoplasma pada struktur dinding sel fungi dan enzim tidak larut pada
dinding sel fungi (Lim et al. 1991). Adanya sejumlah besar isolat yang mampu
menghambat pertumbuhan cendawan kemungkinan karena genus Bacillus mampu
mensintesis berbagai senyawa yang aktif melawan cendawan dan mampu
memproduksi siderofor sehingga bertindak sebagai competitor bagi patogen akar
tersebut. Menurut Compant et al. (2005) dinding sel cendawan S. rolfsii, R. solani
dan Pythium ultimum dapat dihancurkan oleh enzim ß-1,3-glukanase yang
dihasilkan oleh B. cepacea.
Hasil uji karakter PGPR pada isolat Bacillus sp. menunjukkan bahwa empat
isolat diantara 6 isolat yang memacu pertumbuhan kecambah kedelai kultivar
Slamet yaitu isolat Cr 64, Cr 66, Cr 68, dan Cr 71 memiliki karakter yang lengkap
sebagai PGPR yaitu mampu memproduksi hormon IAA, mampu memacu
pertumbuhan tanaman tanpa menyebabkan reaksi hipersensitif, mampu
melarutkan fosfat, mampu memproduksi siderofor serta memiliki kemampuan
sebagai biokontrol fungi patogen akar tanaman kedelai R. solani.
Keragaman 6 isolat Bacillus sp. yang telah diisolasi dan telah diuji
kemampuannya sebagai PGPR yang memacu pertumbuhan tanaman dapat
dianalisis menggunakan pendekatan molekuler berdasarkan sekuen gen 16S rRNA.
DNA hasil isolasi diamplifikasi sebanyak 30 siklus menggunakan mesin PCR
dengan primer 63f dan 1387r (Marchesi et al. 1998) diperoleh panjang basa
nukleotida ± 1300 pb. Selanjutnya hasil identifikasi sekuen parsial gen 16S rRNA
hasil amplifikasi menunjukkan bahwa isolat memiliki persentase homologi
tertentu terhadap isolat yang terdapat pada GenBank. Hasil analisis sekuen parsial
gen 16S rRNA dengan program BLAST-N menunjukkan bahwa Cr 64 memiliki
persentase similaritas 92% dengan Bacillus sp. NRS-800, Cr 66 memiliki
persentase similaritas 94% dengan B. cereus HNR10, Cr 67 memiliki persentase
similaritas 94% dengan B. pumilus str M-1-9-1, Cr 68 memiliki persentase
similaritas 93% dengan B. thuringiensis str FWAW, Cr 69 memiliki persentase
similaritas 98% dengan B. cereus AD2, sedangkan Cr 71 memiliki persentase
similaritas 99% dengan Bacillus shandongensis str SD.
Hasil pengolahan sekuen parsial gen 16S rRNA menggunakan program
NJplot diperoleh dendrogram pohon filogenetik yang memperlihatkan hubungan
kekerabatan antara isolat Bacillus dengan spesies Bacillus spp. Keenam isolat
membentuk 3 kelompok yang berbeda. Cr 64 memisah tersendiri, isolat Cr 66, Cr
68, dan Cr 69 membentuk kelompok sendiri yang terpisah dengan Cr 67 dan Cr
71. Masing-masing isolat memiliki jarak evolusi yang berbeda-beda dengan
spesies Bacillus spp. yang ada pada GenBank. Diversitas keenam isolat cukup
tinggi dan masing - masing isolat memiliki kedekatan kekerabatan pada spesies
yang berbeda-beda.
ABSTRACT
ASRI WIDYAWATI. Bacillus sp. Isolated from Rhizosphere of Soybean Plant as
Plant Growth Promoting Rhizobacteria and Biocontrol of Root Pathogenic Fungi.
Under the direction of ARIS TRI WAHYUDI and ABDJAD ASIH
NAWANGSIH.
Bacillus sp. is one of the rhizosphere bacteria that have important role as
plant growth promoter, known as plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR).
Sixty isolates identified as Bacillus sp. were successfully isolated from
rhizosphere soil of soybean plant of Plumbon, Cirebon, West Java, based on their
morphologies and physiologies characters. 45 Bacillus sp. isolates grown in
Nutrient Broth (NB) medium supplemented with tryptophan (0.2 mM) had ability
to produce IAA. Bacillus sp. Cr 55 had ability to produce the highest IAA was
about 44.66 ppm. Hypersensitivity test revealed that all of Bacillus sp. isolates
were classified as non-pathogenic bacteria. Six Bacillus sp. isolates that have been
characterized to produce IAA were able to induce elongation of primary root and
stem, and numerous of lateral and sub lateral roots. Furthermore, 36 isolates of
Bacillus sp. had ability to solubilize phosphate as indicated by clear zone
surrounding the colonies on Pikovskaya agar, 43 isolates of Bacillus sp. had
ability to produce siderophore, 2 isolates were capable to produce antifungal
compounds to inhibit of S. rolfsii and 28 isolates of them were capable to produce
antifungal compounds to inhibit of R. solani. This study has demonstrated that 4
isolates of Bacillus sp. isolated from rhizosphere of soybean plant can be
determined as potential isolates that can be used as inoculants to promote plant
growth based on the specific characters. The result of identified use 16S rRNA
partial sequence genes of 6 isolates that had ability as PGPR showed that all of
them had similarity with Bacillus spp. from GenBank. Cr 64 had 92% similarity
with Bacillus sp. NRS-800, Cr 66 had 94% similarity with B. cereus HNR10, Cr
67 had 94% similarity with B. pumilus str M1-9-1, Cr 68 had 93% similarity with
B. thuringiensis str FWAW, Cr 69 had 98% similarity with B. cereus AD2 and Cr
71 had 99% similarity with B. shandongensis str SD.
Key Words : Bacillus sp., Indole Acetic Acid (IAA), Phosphate Solubilization,
Germination Seedling Bioassay, Siderophore, Anti Fungi.
© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2008
Hak cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik
atau tinjauan suatu masalah;
b. pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh
karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
Bacillus sp. ASAL RIZOSFER KEDELAI
YANG BERPOTENSI SEBAGAI PEMACU PERTUMBUHAN
TANAMAN DAN BIOKONTROL FUNGI PATOGEN AKAR
ASRI WIDYAWATI
Tesis
Sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2008
: Bacillus sp. Asal Rizosfer Kedelai yang Berpotensi sebagai
Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol Fungi Patogen
Akar
Nama
: Asri Widyawati
NRP
: G351060221
Program Studi : Biologi
Judul
Disetujui,
Komisi Pembimbing
Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si.
Ketua
Dr. Ir. Abdjad Asih Nawangsih, M.Si.
Anggota
Diketahui,
Ketua Program Studi Biologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Dedy Duryadi S, DEA
M.S.
Prof. Dr Ir. Khairil Anwar Notodiputro,
Tanggal Ujian: 14 Mei 2008
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Syukur alhamdulillah penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat,
karunia serta ridlo-Nya sehingga tesis yang berjudul ”Bacillus sp. Asal Rizosfer
Kedelai yang Berpotensi sebagai Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol
Fungi Patogen Akar” ini dapat diselesaikan.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si dan
Dr. Ir. Abdjad Asih Nawangsih, M.Si. selaku dosen pembimbing yang selalu
memberikan bimbingan dan arahannya dalam penyusunan tesis ini. Di samping
itu penulis juga menyampaikan ucapan terima kasih kepada Departemen Agama
RI yang telah memberikan kesempatan sehingga penulis dapat mengikuti program
pendidikan pascasarjana. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Drs.
Komari Zaman selaku Kepala Madrasah Aliyah Negeri (MAN) Godean, Sleman,
Yogyakarta atas dukungan dan kesempatan yang diberikan sehingga penulis dapat
mengikuti program pendidikan pascasarjana IPB.
Penelitian ini sebagian didanai oleh Program Insentif Penelitian Dasar
Kementrian Negara Riset dan Teknologi (KNRT) kepada Aris Tri Wahyudi dan
sebagian lagi didanai dari Departemen Agama RI melalui Kerjasama antara IPB
dengan Departemen Agama RI. Untuk itu kami mengucapkan terima kasih.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak, Kakak-kakak,
Adik dan keponakan atas segala doa, perhatian dan dukungan yang diberikan.
Demikian juga kepada Mbak Rina, Rika, Mbak Ari, teman-teman dan pengelola
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB atas kerjasamanya
selama penelitian ini dilaksanakan.
Semoga tesis ini memberikan manfaat.
Bogor, Mei 2008
Asri Widyawati
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Sleman pada tanggal 22 Mei 1975 dari ayah Drs.
Asri dan ibu Sri Wijati (almh). Penulis merupakan anak keenam dari 7 bersaudara.
Tahun 2000 penulis menyelesaikan program Strata 1 pada Universitas
Negeri Yogyakarta mengambil jurusan Pendidikan Biologi. Selanjutnya penulis
mengajar pada sekolah menengah swasta dari tahun 1998 hingga tahun 2003.
Pada tahun 2004 penulis mengajar di MAN Godean, Sleman, Yogyakarta hingga
sekarang.
Pada bulan Juli 2006 penulis mendapatkan kesempatan mengikuti program
beasiswa pendidikan Pascasarjana dari Departemen Agama RI dan mengambil
Program Studi Biologi, Subprogram Studi Mikrobiologi pada Sekolah
Pascasarjana IPB.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI.................................................................................................... xii
DAFTAR TABEL ........................................................................................... xiv
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xv
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xvi
PENDAHULUAN
Latar Belakang ..........................................................................................
Tujuan ......................................................................................................
1
3
TINJAUAN PUSTAKA
Bacillus sp. ................................................................................................ 4
Karakter Bacillus sp. sebagai PGPR ........................................................ 4
Fungi Patogen Akar Kedelai .................................................................... 9
Gen 16S rRNA ......................................................................................... 10
BAHAN DAN METODE
Isolasi dan Karakterisasi Fisiologi secara Parsial Bacillus sp. ..................
Uji Karakteristik Bacillus sp. sebagai PGPR
Uji Produksi Indole Acetic Acid (IAA) ...............................................
Uji Pelarutan Fosfat ..........................................................................
Uji Produksi Siderofor .......................................................................
Uji Hipersensitivitas ..........................................................................
Telaah Pemacuan Pertumbuhan Tanaman .........................................
Uji Antagonisme terhadap Fungi Patogen Akar ...............................
Identifikasi Berdasarkan Sekuen Gen 16S rRNA
Isolasi DNA ......................................................................................
Amplifikasi DNA ..............................................................................
Analisis Sekuen Gen 16S rRNA ........................................................
HASIL
Isolasi dan Karakterisasi Fisiologi secara Parsial Bacillus sp. .................
Karakter Bacillus sp. sebagai PGPR
Produksi Indole Acetic Acid (IAA) .....................................................
Uji Pelarutan Fosfat ...........................................................................
Uji Produksi Siderofor .......................................................................
Uji Hipersensitivitas ..........................................................................
Telaah Pemacuan Pertumbuhan ..........................................................
Uji Antagonisme terhadap Fungi Patogen Akar ................................
Analisis Sekuen Gen 16S rRNA ...............................................................
11
11
12
12
13
13
13
14
15
15
16
16
18
18
18
21
24
26
PEMBAHASAN
Isolasi dan Karakterisasi Fisiologi secara Parsial Bacillus sp. .................. 29
Karakter Bacillus sp. sebagai PGPR ......................................................... 30
Analisis Sekuen Gen 16S rRNA ............................................................... 37
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ................................................................................................... 39
Saran ......................................................................................................... 39
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 40
LAMPIRAN .................................................................................................... 44
DAFTAR TABEL
Halaman
1
2
3
4
Hasil uji produksi IAA, pelarutan fosfat, uji siderofor dan uji antagonisme terhadap cendawan S. rolfsii dan R. solani pada 45 isolat
Bacillus sp. yang mampu memproduksi IAA ....................................
20
Rerata panjang akar, panjang batang dan jumlah akar lateral dan sub
lateral pada kecambah kedelai kultivar Slamet yang diberi perlakuan
dengan isolat Bacillus sp. dan diinkubasikan selama 7 hari pada
media agar – agar 1% beserta kontrol ...............................................
23
Karakteristik isolat Bacillus sp. yang mampu memacu pertumbuhan
kecambah kedelai kultivar Slamet secara signifikan .........................
35
Karakteristik PGPR isolat Bacillus sp. dan hasil analisis sekuen gen
16S rRNA ...........................................................................................
38
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
5
6
Penampilan koloni isolat Bacillus sp. Cr 66 berumur 24 jam yang
ditumbuhkan pada media cawan gorea Nutrient Agar (A); (B)
penampilan sel Bacillus sp. yang dilakukan perwarnaan gram
menunjukkan Gram positif berbentuk batang; (C) struktur endospora
ditunjukkan dengan tanda anak panah diamati menggunakan
mikroskop cahaya perbesaran 1000 kali .............................................
17
Isolat Bacillus sp. Cr 90 yang ditumbuhkan pada media Phikovkaya
dan diinkubasikan selama 3 hari pada suhu ruang mempunyai
kemampuan melarutkan fosfat yang ditandai oleh terbentuknya zona
bening di sekeliling koloni bakteri (A); (B) penampilan koloni
Bacillus sp. yang ditumbuhkan pada media agar-agar CAS dengan
metode replika dan diinkubasikan semalam menampilkan zona
berwarna oranye jernih di sekeliling koloni bakteri yang
menunjukkan dihasilkannya siderofor ...............................................
19
Panjang akar dan jumlah akar kecambah kedelai kultivar Slamet
berumur tujuh hari pada media agar-agar 1%, (A) kecambah
diinokulasi dengan Bacillus sp. Cr 69; (B) kontrol ...........................
22
Penampilan cendawan R. solani yang diinkubasikan selama 2 hari
pada media PDA pertumbuhan radialnya dihambat oleh isolat
Bacillus sp. Cr 64 (A); penampilan cendawan S. rolfsii yang
diinkubasikan selama 5 hari pada media PDA pertumbuhan
radialnya dihambat oleh isolat Bacillus sp. Cr55 ...............................
25
Elektroforesis gel Agarose 1% dari gen 16S rRNA hasil amplifikasi
PCR sebanyak 30 siklus menggunakan primer 63f dan 1387r
memiliki panjang basa nukleotida sekitar 1.3 kb ................................
27
Dendrogram pohon filogenetik yang mengindikasikan kekerabatan
dari keenam isolat berdasarkan sekuen gen 16S rRNA hasil
amplifikasi PCR dengan isolat dari GenBank (angka di atas garis
cabang menunjukkan panjang percabangan yang mengindikasikan
jarak evolusi antar isolat) ...................................................................
28
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Sekuen parsial gen 16S rRNA 6 isolat pemacu pertumbuhan tanaman
2
Hasil analisis sekuen parsial gen 16S rRNA menggunakan program
44
BLAST-N ............................................................................................
46
3
Komposisi media tumbuh (dalam liter) ..............................................
47
4
Bahan – bahan untuk karakterisasi fisiologi secara parsial genus
Bacillus ...............................................................................................
48
PENDAHULUAN
Latar Belakang Masalah
Pertambahan jumlah penduduk yang sangat pesat menyebabkan kebutuhan
pangan juga meningkat. Berbagai langkah dilakukan masyarakat dan pemerintah
untuk menjaga tetap tersedianya pangan dunia. Langkah-langkah yang diambil
hingga menjelang abad 20 antara lain dengan intensifikasi melalui penggunaan
pupuk sintetis, pestisida dan bibit unggul. Langkah-langkah tersebut ternyata
memberikan efek samping pencemaran lingkungan.
Hal ini mendorong
berkembangnya bioteknologi dengan menggunakan mikroorganisme sebagai
agens untuk meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman sekaligus sebagai
agens pengendali hayati terhadap patogen.
Salah satu kelompok organisme yang sering mengganggu tanaman kedelai
adalah cendawan, dua diantaranya adalah Rhizoctonia solani dan Sclerotium
rolfsii. Keduanya merupakan jenis cendawan yang sering menyerang perakaran
tanaman kedelai dan menyebabkan penyakit busuk akar. Hal ini memerlukan
penanganan lanjut yang lebih efektif.
Rizosfer tanaman telah diketahui di dalamnya terdapat mikroorganisme
yang bersimbiosis dengan akar. Rizosfer atau daerah sekitar perakaran tanaman
relatif kaya akan nutrisi yang berkaitan dengan keadaan di akar yaitu berupa
hilangnya 5 – 21 % hasil fotosintesis tanaman yang dilepaskan sebagai eksudat
akar (Marscher 1995). Sebagai akibatnya, keberadaan nutrisi pada akar ini
mendukung populasi mikrob aktif berkembang dan mampu memproduksi
senyawa yang mungkin menguntungkan, netral atau merugikan bagi tanaman di
atasnya. Adanya mikroorganisme tersebut dapat memberikan efek positif maupun
negatif bagi perakaran tanaman. Berbagai jenis mikroorganisme seperti bakteri
telah diketahui dapat dimanfaatkan sebagai agens hayati untuk meningkatkan
pertumbuhan dan produksi tanaman yang dikenal luas dengan istilah Plant
Growth
Promoting
Rhizobacteria
(PGPR)
Pertumbuhan Tanaman. Bakteri ini secara aktif
atau
Rizobakteria
Pemacu
mengkolonisasi rizosfer dan
permukaan akar serta memberikan pengaruh positif untuk pemacuan pertumbuhan
tanaman melalui penyediaan nutrisi dan hormon bagi tanaman, serta dapat bersifat
antagonistik terhadap bakteri dan fungi patogen (Kloepper et al. 1999; Gray &
2
Smith 2005). Adanya PGPR dapat memberikan keuntungan melalui berbagai
mekanisme antara lain produksi metabolit sekunder seperti antibiotik, kitinase, 1,3
- β-glukanase, sianida, substansi hormon, sebagai agens pengendali biologi
melalui kompetisi, induksi sistem pertahanan terhadap patogen, produksi
siderofor, pelarut fosfat, dan fiksasi N2. (Glick 1995; Husen 2003).
Bakteri
rizosfer yang telah diketahui dapat menghasilkan auksin antara lain Pseudomonas
sp., Azospirillum sp., Azotobacter sp., Bacillus sp., Lactobacillus sp.,
Paenibacillus polymyxa, Enterobacter sp., Serratia marcescens, Klebsiella sp.,
Algaligenes faecalis, dan sianobacteria (Torres-Rubio et al. 2000).
Adapun bakteri yang menjadi topik dalam kajian penelitian ini adalah
bakteri kelompok Bacillus sp. merupakan salah satu kelompok bakteri yang dapat
diisolasi dari tanah dengan karakter Gram positif, berbentuk batang dan
mempunyai kemampuan membentuk endospora pada kondisi lingkungan yang
tidak menguntungkan sehingga dapat toleran pada kondisi lingkungan kritis.
Compant et al. (2005) melaporkan bahwa Bacillus sp. mempunyai banyak potensi
yaitu mampu memproduksi IAA, melarutkan fosfat, mensekresi siderofor dan
berperan sebagai agens biokontrol dengan menginduksi sistem kekebalan tanaman
serta menghasilkan antibiotik.
Berbagai penelitian menunjukkan bahwa sangat banyak jenis mikrob
khususnya bakteri di tanah termasuk Bacillus sp. dapat dimanfaatkan sebagai
PGPR sekaligus dapat berperan untuk mengendalikan penyakit pada tanaman.
Pada genus Bacillus kemampuan biokontrolnya didukung oleh kemampuannya
membentuk spora yang dapat bertahan dan tetap dapat melepaskan metabolit
aktifnya pada kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan sehingga
memungkinkan untuk membuat formulasi produk yang stabil (Kloepper et al.
1999).
Adanya bakteri yang diisolasi dari tanah perakaran kedelai yang berpotensi
sebagai pemacu pertumbuhan tanaman dan pengendali hayati patogen akar
tanaman kedelai diharapkan dapat dimanfaatkan sebagai alternatif galur inokulan
yang dapat meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman kedelai.
Berdasarkan latar belakang di atas maka perlu dilakukan penelitian untuk
mengisolasi dan mengkarakterisasi potensi Bacillus sp. sebagai pemacu
3
pertumbuhan tanaman dan pengendali pertumbuhan fungi patogen akar.
Selanjutnya dilakukan identifikasi molekulernya untuk menentukan galur
inokulannya.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan menapis rizobakteria Bacillus sp. asal rizosfer
tanaman kedelai secara in vitro yang dapat berperan sebagai pemacu pertumbuhan
tanaman dan pengendali fungi patogen penyebab penyakit akar tanaman kedelai
serta identifikasi molekulernya.
TINJAUAN PUSTAKA
Bacillus sp.
Bacillus sp. merupakan bakteri gram positif, berbentuk batang yang
mempunyai kemampuan membentuk endospora pada kondisi yang kurang
menguntungkan. Bakteri ini dapat ditemukan dan dapat diisolasi dari tanah.
Bentuk endospora merupakan nilai lebih bagi bakteri yang sangat terkait secara
ekologi di dalam tanah. Kemampuannya membentuk endospora menyebabkan
bakteri ini relatif lebih tahan terhadap kondisi lingkungan yang kurang
menguntungkan dan kritis misalnya radiasi, panas, asam, desinfektan, kekeringan,
nutrisi yang terbatas dan dapat dorman dalam jangka waktu yang lama hingga
bertahun-tahun. Struktur spora tidak akan terjadi jika sel sedang berada pada fase
pembelahan secara eksponensial tetapi akan dibentuk terutama pada kondisi
nutrisi esensial misalnya karbon dan nitrogen terbatas. Pada Bacillus subtilis
sporulasi terjadi sekitar 8 jam dengan melibatkan hingga 200 gen (Madigan et al.
2000). Selain itu Bacillus sp. mempunyai sifat katalase positif sehingga mampu
menguraikan peroksida toksik menjadi air dan oksigen. Bacillus sp. termasuk
kelompok PGPR yang memiliki banyak potensi karena mampu memproduksi
IAA, melarutkan fosfat, memsekresi siderofor dan berperan sebagai agens
biokontrol dengan menginduksi sistem kekebalan tanaman serta menghasilkan
antibiotik (Compant et al. 2005).
Karakter Bacillus sp. sebagai PGPR
Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) pertama kali didefinisikan
oleh Kloepper dan Schroth (1978) untuk mendeskripsikan bakteri tanah yang
berkumpul di akar setelah benih ditanam. PGPR dapat meningkatkan
pertumbuhan tanaman dengan berbagai mekanisme antara lain fiksasi nitrogen,
produksi siderofor, sebagai pengkelat besi dan sintesis fitohormon. Bakteri
tersebut dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman dengan meningkatkan sistem
perakaran tanaman. Menurut Enebak et al. 1998 (diacu dalam Mello et al. 2004)
PGPR dapat mempengaruhi pertumbuhan tanaman melalui satu mekanisme atau
lebih termasuk meningkatkan fiksasi nitrogen, produksi auksin, giberelin,
5
sitokinin, etilen, melarutkan fosfat dan oksidasi sulfur, meningkatkan ketersediaan
nitrat, produksi antibiotik ekstraseluler, enzim litik, asam hidrosianik,
meningkatkan permiabilitas akar dan kompetisi dalam nutrisi. Kemampuan
rizobakteria dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman sangat bergantung pada
karakter yang merupakan ciri khas dan spesifik gen yang dimilikinya (Nelson
2004).
Mikroorganisme mampu menghasilkan hormon tumbuhan seperti auksin,
sitokinin dan giberelin (Leveau & Lindow 2005). Asam indol asetat atau Indol
acetic acid (IAA) merupakan hormon auksin pertama pada tumbuhan yang
mengendalikan berbagai proses fisiologi penting meliputi pembelahan dan
perkembangan sel, diferensiasi jaringan serta respons terhadap cahaya dan
gravitasi (Salisbury & Ross 1992). Tumbuhan mungkin saja tidak mampu
mencukupi kebutuhan auksin untuk pertumbuhannya secara optimal sehingga
diperlukan tambahan hormon pemacu pertumbuhan dari luar. Menurut Patten dan
Glick (2002) respons tanaman terhadap IAA yang dihasilkan mikrob berbedabeda bergantung pada spesies tanaman dan konsentrasi IAA yang dihasilkan.
Menurut Leveau dan Lindow (2005) hormon IAA atau yang dikenal
sebagai auksin merupakan hormon pemacu pertumbuhan dan mengontrol berbagai
proses fisiologi seperti pembelahan sel, diferensiasi jaringan dan respons terhadap
cahaya dan gravitasi. Bakteri penghasil IAA mempunyai kemampuan membantu
berbagai proses tersebut dengan memasukkan IAA ke dalam pool auksin tanaman.
Akar merupakan organ tanaman yang paling sensitif terhadap fluktuasi kadar IAA
dan responsnya pada peningkatan jumlah IAA eksogenous meluas dari
pemanjangan akar primer, pembentukan akar lateral dan akar liar, sampai
penghentian pertumbuhan.
Biosintesis IAA oleh mikrob ditingkatkan oleh prekursor fisiologi tertentu
yaitu L-Tryptophan (Husen 2003). Protein –TRAP (AT) yang diproduksi oleh
trpA pada Bacillus subtilis dapat mengikat dan menghambat aktifitas triptofan
protein yang berikatan lemah antara Trp-RNA (TRAP). Pada Bacillus subtilis
diperlukan ekspresi dari tujuh gen untuk berlangsungnya biosintesis L-triptofan
dari asam korismat termasuk prekursor asam amino amoniak. Enam dari tujuh gen
terorganisasi sebagai operan triptofan, suboperan dalam superoperon aromatik.
6
Gen triptofan yang ketujuh trpG (pabA) terletak pada operan folat dan
menghasilkan polipeptida yang berperan dalam biosintesis triptofan dan folat
(Wen & Charles 2005).
Manulis et al. (1998) mengemukakan bahwa beberapa lintasan sintesis
IAA pada bakteri yang melibatkan senyawa intermediat indole-3-pyruvate (IpyA)
yaitu indole-3-acetamide (IAM), tryptamine (TAM) dan indole-3-acetonitrile
(IAN). Jalur utama yang ada pada bakteri yaitu lintasan IAM dan IPyA. Bakteri
yang memproduksi IAA menstimulasi pertumbuhan sistem perakaran inang.
Sel tumbuhan memproduksi IAA dari L-tripthofan melalui intermediet
IAM, lintasannya melalui enzim triptofan 2-monooksenase yang mengkatalisis
konversi triptofan menjadi IAM dan enzim indoleacetamid hidrolase yang
mengkatalisis konversi IAM menjadi IAA (Mazzola & White 1993). Tien et al.
(1979) mengamati bahwa produksi IAA meningkat sesuai dengan peningkatan
konsentrasi triptofan dari 1 – 100 ug / ml. Konsentrasi IAA juga meningkat
seiring dengan umur kultur sampai bakteri mencapai fase stasioner. Pengocokan
lebih disukai untuk memproduksi IAA, terutama pada yang mengandung nitrogen
sedangkan fitohormon lainnya juga terdeteksi pada media kultur yaitu giberelin
dan senyawa serupa sitokinin.
Produksi IAA tidak berfungsi nyata sebagai hormon dalam sel bakteri,
dimungkinkan terdapat dalam sel bakteri karena hormon tersebut berperan penting
dalam interaksi antara bakteri dan tanaman. Pada penelitian yang dilakukan Patten
dan Glick (2002) diperoleh bahwa bakteri yang memproduksi IAA menstimulasi
pertumbuhan sistem perakaran inang. Keuntungan dari asosiasi tanaman dengan
bakteri adalah mensuplai sebanyak produk metabolit fiksasi karbon oleh
tumbuhan yang telah hilang ke rhizosfer sebagai eksudat (Martens et al. 1994,
diacu dalam Patten & Glick 2002).
Reaksi awal pengubahan triptofan menjadi indol-3-piruvat dikatalisis oleh
aminotransferase aromatik, dimana empat enzim berhasil diidentifikasi pada
Azospirillum lipoferum. Enzim-enzim yang ditemukan ini spesifik terhadap
berbagai asam amino aromatik dan tidak hanya pada triptofan, sehingga deteksi
pada protein-protein ini kurang membuktikan bahwa IAA disintesis melalui
indole-3-piruvat pada Azospirillum.
7
iaaM
Indole-acetamide
Triptofan
typtamine
Indole-3-pyruvic acid
Indole-3-acetaldehyde
iaaH
ipdC
Indole-3-acetic acid (IAA)
Indole-3-acetic acid
Inndole-3-acetic acid
Gambar 1 Diagram alir lintasan biosintesis IAA pada Bakteri (Hartman et al.
1983; Brandl et al. 1996; Manulis et al. 1980). Gen-gen iaaM, iaaH
dan ipdC masing-masing menyandikan tryptohan-2-monooygenase,
indole-3-acetamide hydrolase dan indole-pyruvat decarboxylase.
Fosfat merupakan salah satu unsur hara yang sangat diperlukan oleh
tanaman. Di dalam tanah hanya sebagian kecil saja fosfat yang dapat diserap oleh
tanaman karena masih terikat dengan kation logam misalnya Fe, Ca dan Al.
Adanya kemampuan bakteri dalam melarutkan fosfat berpotensi untuk
meningkatkan penyerapan unsur fosfat ke dalam tanaman apabila tersedia cukup
endapan fosfat dalam tanah. Bakteri pelarut fosfat dapat menyediakan fosfat
terikat menjadi fosfat yang dapat terlarut sehingga dapat diserap oleh tanaman.
Mekanisme utama pelarutan fosfat pada bakteri dengan memisahkan kation dari
senyawa asam menggunakan asam organik yang disintesisnya (Altomare et al.
1999). Bakteri pelarut fosfat melepaskan ikatan ion fosfat anorganik yang sukar
larut dengan mensekresikan sejumlah asam organik. Beberapa bakteri yang
dilaporkan mempunyai aktifitas fitase (enzim kelompok fosfomonoesterase) yang
mampu menghidrolisis polifosfat organik tak larut (fitat) menjadi rangkaian ester
fosfat dengan bobot molekul yang rendah dari myo-inositol dan fosfat yang
penting untuk prokariot dan eukariot. Bakteri yang mempunyai kemampuan
melarutkan fosfat antara lain Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis, Klebsiella
terrigena, Pseudomonas spp. dan Enterobacter sp. (Idriss et al. 2002).
8
Siderofor merupakan molekul atau ligan pengkelat besi (Fe3+ ) yang
diproduksi oleh bakteri terutama pada tanah netral dan alkalin yang banyak diteliti
saat ini. Siderofor disekresikan oleh mikroorganisme dan tanaman dari famili
Gramineae sebagai respons terhadap defisiensi unsur besi (Crowley 2001, diacu
dalam Nawangsih 2006). Jenis agen pengkelat besi, siderofor, yang dihasilkan
oleh mikroorganisme antara lain berupa hydroxamate dan enterobactin (pada E.
coli). Hidroxamate mengikat besi ferric (Fe3+) yang direduksi dan dilepaskan ke
dalam sel bakteri sebagai besi ferro (Fe2+) (Madigan 2003). Menurut Nawangsih
(2006) hasil deteksi pada beberapa galur Pseudomonas fluorescens, Bacillus
subtilis, dan B. cereus positif menghasilkan senyawa siderofor. Adanya siderofor
pada bakteri ini mendukung kemampuan bakteri sebagai PGPR karena dapat
bertindak dalam kompetisi dengan mikroorganisme patogen dalam menggunakan
Fe3+ yang konsentrasinya sangat terbatas dalam tanah. Namun pengambilan Fe3+
oleh mikroorganisme ini tidak mempengaruhi kebutuhan tanaman akan besi yang
sangat sedikit dibandingkan dengan mikroorganisme
Kemampuan Bacillus sp. sebagai pengendali penyakit tanaman antara lain
karena kemampuannya memproduksi antibiotik yang diekskresikan saat kultur
memasuki fase stasioner (Madigan et al. 2000) dan produksi metabolit sekunder
misalnya enzim kitinase, mycobacilin, basitrasin dan zwittermicin. Menurut
Benhamou et al. (1996) bakteri endofit Bacillus pumilus strain SE34 dapat
digunakan untuk menginduksi ketahanan secara sistemik pada buncis (Pisum
sativum). Bakteri ini dapat merangsang penebalan dinding sel terutama pada
jaringan korteks dengan produksi kitin sehingga patogen tidak dapat melakukan
penetrasi. Patogen hanya terdistribusi pada jaringan epidermis dan tidak dapat
menyebar ke jaringan korteks. Bacillus subtilis diketahui menunjukkan aktifitas
antagonis terhadap bakteri dan fungi fitopatogen. Sedangkan Bacillus cereus
diketahui dapat mereduksi pertumbuhan miselia Sclerotium rolfsii., Fusarium
oxysporum,
Pythium
aphanidermatum,
Helminthosporium
maydis
dan
Rhizoctonia solani dengan zona inhibisi 35.3% - 53.3 % (Muhammad & Amusa
2003).
9
Kemampuan Bacillus sebagai biokontrol juga dapat terjadi melalui mekanisme
resistensi terinduksi oleh B. subtilis pada tanaman yang diserang cendawan A.
niger (Sailaja et al. 1997).
Fungi Patogen Akar Kedelai
Penyakit-penyakit pada tumbuhan baik pada bagian akar, batang, daun dan
bunga ataupun biji sebagian besar disebabkan oleh fungi. Fungi masuk ke dalam
jaringan tanaman melalui struktur terbuka yang alami pada jaringan tanaman
misalnya stomata lentisel, dan hidatoda atau melalui jaringan tanaman yang
terluka. Beberapa fungi mengkolonisasi tanaman kedelai dan benih secara
asimtom. Beberapa fungi yang dikenal menyerang akar tanaman kedelai antara
lain Rhizoctonia solani penyebab penyakit busuk akar dan rebah kecambah
(damping off) serta Sclerotium rolfsii penyebab penyakit busuk akar dan batang
(Hartman et al. 2001) dan damping off pada benih (Agrios 2004). Kedua fungi ini
menyebabkan penyakit yang cukup serius baik pada akar, batang dan bagianbagian tanaman lainnya.
Rhizoctonia solani merupakan fungi saprofit yang dapat bertahan walau
tidak berada pada tanaman inang. R. solani memiliki sel multinukleat yang
hifanya berwarna coklat dan mampu membentuk sklerotia berwarna coklat hingga
hitam. Fungi ini menginfeksi pada saat penanaman benih dan menginfasi
hipokotil selanjutnya menyebabkan damping off atau jika tidak akan
menyebabkan busuk akar. Semua Rhizoctonia terdapat sebagai miselium steril dan
kadang-kadang sebagai sklerotia kecil tanpa diferensiasi jaringan internal (Agrios
2004). Penggunaan Bacillus megaterium diketahui dapat menurunkan tingkat
penyakit yang disebabkan fungi ini (Hartman et al. 2001).
Tanaman kedelai sangat rentan terhadap serangan S. rolfsii yang
menyerang tanaman sejak pembenihan. S. rolfsii memiliki hifa hialin berseptat,
tidak memproduksi spora aseksual, dan mampu membentuk struktur pertahanan
berupa sklerotia sperikel. Massa miselium yang menyerang jaringan memproduksi
sekret berupa asam oksalat, pektinolitik, selulolitik dan enzim-enzim yang dapat
membunuh dan mengurai jaringan tanaman sebelum penetrasi (Agrios 2004).
10
Gen 16S rRNA
RNA di dalam sel dapat dikelompokkan menjadi 2 kelompok yaitu
kelompok RNA yang berhubungan dengan ekspresi gen yaitu mRNA, tRNA dan
kelompok rRNA yang tidak berhubungan dengan ekspresi gen. Ribosomal RNA
merupakan salah satu makromolekul yang menarik karena molekul ini bersifat
stabil, terdapat sekitar 83% dari keseluruhan RNA dalam sel dan merupakan
kerangka ribosom yang sangat berperan dalam mekanisme translasi. Semua rRNA
identik secara fungsional yakni terlibat dalam produksi protein, walaupun
demikian sekuen-sekuen di bagian tertentu terus berevolusi dan mengalami
perubahan pada level struktur primer sambil mempertahankan struktur sekunder
dan tersier yang homolog (Gutell et al. 1994).
Kemampuannya mewakili semua informasi filogenetik dan kepraktisannya
menyebabkan sekuen 16S rRNA lebih sesuai digunakan untuk identifikasi bakteri
daripada menggunakan 5S rRNA atau 23S rRNA. Menurut Bottger (1996)
aplikasi molekuler untuk menganalisis keragaman mikrob melalui analisis gen
16S rRNA sesuai untuk mengidentifikasi mikroorganisme karena gen ini terdapat
pada semua organisme prokariot. Molekul 16S rRNA memiliki daerah-daerah
berbeda berupa sekuen yang konservatif dan sekuen lain yang sangat variatif.
Terdapat lebih dari 4000 entri (sekuen yang terdaftar ) yang ada pada database
16S rRNA yang mencakup sekitar 1800 species yang terus bertambah jumlahnya.
Strategi yang sering digunakan untuk melihat keragaman mikrob meliputi tahaptahap isolasi DNA dari komunitas alami, amplifikasi gen 16S rRNA
menggunakan PCR, penapisan klon-klon untuk variabilitas genetik, pemilihan
klon unik untuk disekuen dan menentukan hubungan filogeniknya (Marchesi et al.
1998). Gen 16S rRNA bersifat relatif stabil dalam sel bakteri daripada rRNA yang
biasanya didegradasi dan hanya terdapat pada fase-fase tertentu saja.
BAHAN DAN METODE
Isolasi dan Karakterisasi Fisiologi secara Parsial Bacillus sp.
Isolasi dilakukan dengan cara mengambil 0.5 gram sampel tanah yang
diperoleh dari rizosfer kedelai asal Cirebon dimasukkan ke dalam 4.5 ml akuades
steril yang sudah terlarut NaCl 0.85% di dalamnya. Sampel divortek dan
dipanaskan pada suhu 80 oC selama 10 menit, selanjutnya dilakukan pengenceran
secara berseri hingga pengenceran 10-6. Sebanyak 100 µl suspensi ditumbuhkan
dalam media Nutrient Agar (NA) dengan metode cawan sebar dengan komposisi
8 g NB, 15 g agar-agar bacto dalam 1 liter akuades. Cawan selanjutnya diinkubasi
selama 24 jam. Koloni yang tumbuh dimurnikan dengan menggunakan media
yang sama. Selanjutnya koloni tunggal diamati karakter morfologinya dan
digoreskan pada media agar miring NA sebagai biakan stok.
Karakterisasi fisiologi isolat untuk menapis isolat meliputi perwarnaan
gram, pewarnaan endospora dan uji katalase mengikuti prosedur Bergey’s Manual
of Determinative Bacteriology (Buchanan & Gibbon 1974) untuk menentukan
isolat tersebut termasuk ke dalam kelompok Bacillus sp. Pewarnaan Gram
menggunakan pereaksi ungu kristal, iodium, etanol 95% dan safranin sebagai
pewarna tandingan. Pewarnaan endospora menggunakan pereaksi malakit hijau
dan safranin. Pengamatan meliputi bentuk sel dan warna sel menggunakan
mikroskop cahaya perbesaran 1000 kali. Uji katalase dilakukan dengan
menggunakan pereaksi hidrogen peroksida 3%.
Uji Karakteristik Bacillus sp. sebagai PGPR
Uji Produksi Indole Acetic Acid (IAA). Produksi IAA dilakukan dengan
menggunakan metode standar sesuai metode yang dilakukan oleh Dey et al.
(2004). Satu lup penuh isolat Bacillus sp. yang dikulturkan pada 10 ml media
Nutrient Broth (NB) yang ditambahkan L-triptofan 0.2 mM diinkubasikan dan
dikocok dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang selama 24 jam dalam ruang
gelap. IAA yang diproduksi oleh Bacillus diuji dengan metode kolorimetri dengan
menggunakan reagen Salkowski (Patten & Glick 2002) yang mengandung 150 ml
H2SO4 pekat, 250 ml Aquades, 7.5 ml FeCl3.6 H2O 0.5 M. Sebanyak 3 ml kultur
12
dari tiap perlakuan dimasukkan ke dalam 2 tabung ependorf kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Sebanyak 2 ml
filtrat yang diperoleh dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril dan ditambahkan
2 ml reagen Salkowski (perbandingan filtrat: reagen = 1:1). Suspensi kemudian
diinkubasikan selama 60 menit pada suhu ruang di dalam ruang gelap.
Selanjutnya dilakukan pengukuran serapan IAAnya dengan menggunakan
spektrofotometer (Spectronic 20) pada panjang gelombang 510 nm.
Uji Pelarutan Fosfat. Uji ini dilakukan dengan menggunakan metode
standar yaitu menggunakan media Pikovskaya (Subba Rao & Shinha 1962; Subba
Rao 1999), dengan komposisi glukosa 10 g, Ca3HPO4 5 g, (NH4)2SO4 0.5 g, KCL
0.2 g, MgSO4.7H2O 0.1 g, ekstrak khamir 0.5 g, MnSO4 25 mg dan FeSO4 25 mg,
serta agar-agar Bacto 20 g dalam 1l akuades. Suspensi isolat bakteri berumur 24
jam ditumbuhkan pada media Phikovkaya yang mengandung trikalsium fosfat
(Ca3PO4) dengan metode sebar, zona bening yang dihasilkan di sekitar koloni
setelah diinkubasi selama 3 hari menunjukkan adanya aktivitas bakteri dalam
melarutkan fosfat.
Uji Produksi Siderofor. Produksi siderofor oleh isolat Bacillus sp. diuji
menggunakan media Chrome Azurol Sulfonat (CAS) agar dengan modifikasi
larutan garam (Husen 2003). Larutan 1 (larutan indikator Fe-CAS) mengandung
10 ml (1mM FeCl3.6H2O didalam 10 mM HCL), 50 ml larutan CAS (1.21 mg ml1
), dan 40 ml larutan hexadecyl-trimetylammonium bromide (HDTMA) (1.82 mg
ml-1). Larutan 2 merupakan larutan buffer, disiapkan dengan melarutkan 30.24 g
PIPES (peperazine-N,N’-bis[2-ethanesulfonic acid]) kedalam 750 ml larutan
garam (3 gr KH2PO4, 5 g NaCl, 10 g NH4Cl, 20 mM MgSO4, 1 mM CaCl2).
Akuades ditambahkan untuk mencapai volume larutan 800 ml sebelum diukur pH
nya hingga 6.8 dengan 50% KOH, kemudian 20 g agar-agar bacto ditambahkan
sebelum diautoklaf. Larutan 3 mengandung 2 g glukosa, 2 g manitol dan mikro
elemen ( 493 mg MgSO4.7H2O, 11 mg CaCl2, 1.17 mg MnSO4.H2O, 1.4 mg
H3BO3, 0.04 mg CuSO4.5H2O, 1.2 mg ZnSO4.7H2O dan 1.0 mg NaMoO4.2H2O)
didalam 70 ml akuades. Larutan 4 berupa 30 ml 10% (w/v) cassamino acid yang
difilter dengan membran milipor 0.45 µm. Media ini dibuat dengan
mencampurkan larutan 2 dan 4 pada suhu 50 οC setelah sterilisasi, kemudian
13
ditambahkan larutan 3 dan larutan 1 secara perlahan-lahan dan dilakukan
homogenisasi dengan menggunakan stirer. Isolat yang telah diremajakan terlebih
dahulu, diuji menggunakan metode replika dengan cara ditotol atau digores pada
media agar CAS dengan dua ulangan. Isolat yang mampu memproduksi siderofor
akan menghasilkan zona berwarna oranye disekitar koloni setelah diinkubasi
semalam.
Uji Hipersensitivitas. Isolat berumur 24 jam dikulturkan pada media NB
cair dan dikocok dengan kecepatan 150 rpm selama 24 jam pada suhu ruang.
Isolat tersebut disuntikkan menggunakan syringe sebanyak 1 ml (diperkirakan >
106 CFU/ml) pada area intervena ruas daun tembakau (Lelliot & Stead 1987)
dengan masing-masing isolat 3 ulangan. Kontrol perlakuan pada uji ini
menggunakan E. coli dan akuades sebagai kontrol negatif serta Ralstonia
solanacearum sebagai kontrol positif. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam
hingga 48 jam untuk mengetahui perubahan warna dan kondisi daun tembakau
setelah disuntikkan dengan isolat. Adanya bercak nekrosis kecoklatan dan
kekeringan pada jaringan daun menunjukkan adanya reaksi hipersensitif positif.
Telaah Pemacuan Pertumbuhan Tanaman. Inokulan dari isolat yang akan
diuji disiapkan dengan meresuspensikan sel berumur 24 jam dari cawan agar-agar
tersebut ke dalam NB. Sebanyak 9 kecambah steril yang berumur 24 jam
diletakkan di atas media agar-agar 1%. Masing-masing kecambah diinokulasikan
dengan 100 μl suspensi bakteri dengan konsentrasi sel kira-kira 1010 sel/ml.
Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan dan 1 perlakuan
kontrol. Pada perlakuan kontrol masing-masing kecambah ditambahkan NB saja.
Setelah 7 hari perlakuan, diamati dan diukur pertumbuhannya yang meliputi
panjang batang, panjang akar utama dan jumlah akar lateral dan sublateral
kemudian dibandingkan dengan kontrol (Dey at al. 2004). Hasil pengukuran
dianalisis secara statistik dengan one-way Analysis of Variance (ANOVA) dan
diuji lanjut dengan uji Duncan pada taraf kesalahan 5% menggunakan software
SAS.
Uji Antagonisme terhadap Fungi Patogen Akar. Uji antagonis dilakukan
secara kualitatif dan kuantitatif dengan menggunakan metode standar kultur
ganda. Isolat Bacillus sp. digores pada medium Potato Dextros Agar (PDA)
14
dalam cawan petri berdiameter 9 cm, berjarak 3 cm dari kultur cendawan
Sclerotium rolsfii dan Rhizoctonia solani yang ditumbuhkan di tengah-tengah
cawan petri. Kultur dan biakan cendawan diinkubasikan selama 5 hari untuk S.
rolfsii dan 2 hari untuk R. solani dan diamati pertumbuhannya. Adanya interaksi
antagonis ditandai dengan terbentuknya zona penghambatan antara isolat Bacillus
sp. dengan cendawan. Uji kuantitatif dilakukan dengan metode oposisi langsung
untuk mengetahui besarnya persentase penghambatan pertumbuhan radial
cendawan
oleh
bakteri.
Besarnya
persentase
penghambatan
dihitung
mengguna