Gambaran respon kebal ayam petelur terhadap vaksin inaktif avian influenza h5n1 monovalen (clade 2.3.2) dan bivalen (clade2.1.3 dan 2.3.2)
GAMBARAN RESPON KEBAL AYAM PETELUR
TERHADAP VAKSIN INAKTIF AVIAN INFLUENZA H5N1
MONOVALEN (CLADE 2.3.2) DAN BIVALEN (CLADE 2.1.3
DAN 2.3.2)
DEDEK HARYANTO
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Gambaran Respon
Kebal Ayam Petelur terhadap Vaksin Inaktif Avian Influenza H5N1 Monovalen
(clade 2.3.2) dan Bivalen (clade 2.3.2 dan 2.1.3) adalah benar karya saya dengan
arahan dari pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2014
Dedek Haryanto
NIM B04100094
*Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerjasama dengan pihak luar
IPB harus didasarkan pada perjanjian kerjasama terkait
ABSTRAK
DEDEK HARYANTO. Gambaran Respon Kebal Ayam Petelur terhadap Vaksin
Inaktif Avian Influenza H5N1 Monovalen (clade 2.3.2) dan Bivalen (clade 2.3.2
dan 2.1.3). Dibimbing oleh RETNO D. SOEJOEDONO dan NI LUH PUTU IKA
MAYASARI.
Virus Avian Influenza (AI) H5N1 clade 2.3.2 terdeteksi di Indonesia pada
tahun 2012. Kementerian Pertanian Indonesia mengeluarkan kebijakan pembuatan
vaksin monovalen (AI H5N1 clade 2.3.2) dan bivalen (AI H5N1 clade 2.3.2 dan
2.1.3) untuk mengurangi kerugian yang diakibatkan oleh virus AI H5N1 clade
2.3.2 dan AI H5N1 clade 2.1.3 pada unggas (ayam dan itik). Penelitian ini
bertujuan mengukur respon kebal ayam petelur yang divaksinasi AI H5N1 inaktif
monovalen dan bivalen. Penelitian ini menggunakan ayam petelur sebanyak 135
ekor yang dibagi menjadi 3 kelompok. Masing-masing kelompok sebanyak 45
ekor. Vaksinasi dilakukan pada hari ke-10 dan 31. Koleksi serum ayam petelur
dilakukan sebanyak 6 kali (hari ke-17, 28, 31, 38, 45 dan 52). Hasil pengukuran
titer antibodi menggunakan uji Hambatan Aglutinasi (HI) memperlihatkan
pemberian vaksin monovalen mampu memberikan perlindungan terhadap antigen
AI H5N1 clade 2.3.2 sampai level protektif dan pemberian vaksin bivalen mampu
menginduksi pembentukan antibodi terhadap antigen AI H5N1 clade 2.3.2 dan AI
H5N1 clade 2.1.3 sampai level protektif.
Kata kunci: Avian Influenza, bivalen, monovalen, vaksin
ABSTRAC
DEDEK HARYANTO. Immune Response of Chickens against Inactivated Avian
Influenza Vaccine H5N1 Monovalen (clade 2.3.2) and Bivalen (clade 2.3.2 and
2.1.3). Supervised by RETNO D. SOEJOEDONO dan NI LUH PUTU IKA
MAYASARI.
Avian Influenza (AI) virus H5N1 clade 2.3.2 was detected in Indonesia in 2012.
The Indonesian Ministry of Agriculture issued policy of making monovalent and
bivalent vaccines to minimize losses caused by AI H5N1 clade 2.3.2 and clade
2.1.3 in poultry (chickens and ducks). This research aimed to measure the immune
response of chickens which were vaccinated monovalent vaccine (AI H5N1 clade
2.3.2) and bivalent vaccine (AI H5N1 clade 2.3.2 and 2.1.3). This research
conducted by dividing 135 chickens into 3 groups and each group contained 45
chickens. Vaccination was performed on day 10 and 31. Serum collection was
done as many as 6 times (on day 17, 28, 31, 38, 45 and 52). Antibody titer was
measured using Haemaglution Inhibition (HI) test. HI titer of monovalent vaccine
showed protective level when measured using antigent AI H5N1 clade 2.3.2.
Bivalent vaccine was able to induce protective levels of antibody against antigent
AI H5N1 clade 2.3.2 and 2.1.3.
Keywords: Avian Infuenza, bivalent, monovalent, vaccine
GAMBARAN RESPON KEBAL AYAM PETELUR
TERHADAP VAKSIN INAKTIF AVIAN INFLUENZA H5N1
MONOVALEN (CLADE 2.3.2) DAN BIVALEN (CLADE 2.1.3
DAN 2.3.2)
DEDEK HARYANTO
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi
Nama
NIM
: Gambaran Respon Kebal Ayam Petelur terhadap Vaksin
Inaktif Avian Influenza H5N1 Monovalen (clade 2.3.2) dan
Bivalen (clade 2.1.3 dan 2.3.2)
: Dedek Haryanto
: B04100094
Disetujui oleh
Prof Dr Drh Retno D. Soejoedono MS
Pembimbing I
Dr Drh Ni Luh Putu Ika Mayasari
Pembimbing II
Diketahui oleh
Drh Agus Setiyono MS PhD APVet
Wakil Dekan Fakultas Kedokteran Hewan
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak Juni 2013 hingga April 2014 ini
adalah Gambaran Respon Kebal Ayam Petelur terhadap Vaksin Inaktif Avian
Influenza H5N1 Monovalen (clade 2.3.2) dan Bivalen (clade 2.3.2 dan 2.1.3).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Drh Retno D. Soejeodono dan
Dr Drh Ni Luh Putu Ika Mayasari selaku pembimbing, Dr Drh Sri Murtini, MSi
yang telah memberikan kesempatan untuk melakukan penelitian dibagian
Mikrobiologi Medik FKH IPB, Prof Dr Drh Muhamad Agus Setiadi selaku
pembimbing akademik serta rekan sepenelitian Ahmad Mustofa. Disamping itu,
penghargaan penulis sampaikan kepada Mas Wahyu, Pak Nur, Pak Lukman,
Mbak Selin, Mbak Pupi beserta seluruh staf di Bagian Mikrobiologi Medik yang
lain. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayahanda Sumpeno, ibuda
Painah, Kakanda Sutrisno, Kakanda Sutarno, Ayunda Erna Wati, Ayunda Erni,
Adinda Hermin Rahayu Pertiwi serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih
sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, November 2014
Dedek Haryanto
B04100094
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
1
1
2
2
MATERI DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Alat dan Bahan
Rancangan Percobaan
Pengambilan Darah dan Evaluasi Titer Antibodi
Pembuatan Suspensi Sel Darah Merah 1%
Uji Haemaglutinasi (HA) Mikrotitrasi
Uji Hambatan Aglutinasi (HI) Mikrotitrasi
Analisis Data
2
2
2
2
3
4
4
5
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
6
SIMPULAN
11
DAFTAR PUSTAKA
12
RIWAYAT HIDUP
15
DAFTAR TABEL
1. Rancangan percobaan
3
2. Rataan titer antibodi yang diuji dengan antigen AI H5N1 clade 2.3.2
6
3. Rataan titer antibodi yang diuji dengan antigen AI H5N1 clade 2.1.3
8
DAFTAR GAMBAR
1. Rataan titer antibodi yang diuji dengan antigen AI H5N1 clade 2.3.2
7
2. Rataan titer antibodi yang diuji dengan antigen AI H5N1 clade 2.1.3
8
3. Rataan titer antibodi kelompok monovalen yang diuji dengan antigen
AI H5N1 clade 2.1.3 dan 2.3.2
9
4. Rataan titer antibodi kelompok bivalen yang diuji dengan antigen
AI H5N1 clade 2.1.3 dan 2.3.2.
10
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Avian Influenza (AI) adalah penyakit yang disebabkan oleh virus
Influenza subtipe A. Virus AI dapat menyebabkan gangguan pernafasan sampai
kematian pada unggas dan mamalia. Induk semang alami dari penyakit ini adalah
bebek liar dan unggas air. Wabah penyakit AI di Indonesia telah diidentifikasi
sejak tahun 2003 (Dharmayanti et al. 2004). Virus AI dapat menginfeksi ayam ras
petelur, ayam pedaging, burung puyuh dan itik (Dharmayanti et al. 2006). Unggas
yang terinfeksi virus AI memperlihatkan gejala klinis berupa penurunan konsumsi
pakan, diare, tremor dan penurunan produksi telur (Withworth et al. 2007).
Usaha peternakan ayam petelur merupakan sektor peternakan yang paling
banyak merasakan dampak wabah AI di Indonesia. Peternak ayam petelur yang
terdapat di Indonesia pada tahun 2012 berjumlah 202 perusahaan dengan total
populasi 139 juta ekor (BPS 2012a). Populasi ayam petelur tersebut dapat
memproduksi telur sebanyak 1.4 juta ton/tahun (BPS 2012b). Wabah virus AI
menimbulkan dampak ekonomi diantaranya adalah menurunnya jumlah peternak,
menurunnya skala usaha dan menurunnya pendapatan dari memelihara unggas.
Koordinasi Komite Nasional Flu Burung dan Kesiapsiagaan Menghadapi Pandemi
Influenza (Komnas FBPI) memperkirakan besarnya kerugian akibat wabah AI
dari 2004 – 2008 sebesar 4.3 triliun, diluar kerugian hilangnya kesempatan kerja
dan berkurangnya konsumsi protein (Basuno 2008).
Wabah AI menyebabkan ratusan ribu itik mati di daerah Jawa Tengah,
Yogyakarta dan Jawa Timur yang disebabkan oleh virus AI H5N1 clade 2.3.2
(Wibawa et al. 2012). Virus tersebut merupakan subtipe clade baru yang
ditemukan di Indonesia. Virus AI yang diisolasi dari itik pada tahun 2012, setelah
dilakukan analisis filogenetik memperlihatkan bahwa virus AI H5N1 clade 2.3.2
merupakan introduksi dari Vietnam (Dharmayanti et al. 2013). Virus AI yang
selama ini sering menjadi wabah di Indonesia yang diisolasi dari unggas dan
manusia merupakan virus AI H5N1 clade 2.1.1, 2.1.2, dan 2.1.3 (WHO 2011).
Virus AI H5N1 clade 2.3.2 sedang aktif bersirkulasi di Indonesia, namun
kewaspadaan terhadap virus AI H5N1 clade 2.1.3 harus tetap ditingkatkan karena
virus ini terbukti telah banyak menimbulkan kematian pada unggas. Virus AI
H5N1 clade 2.1.3 dan clade 2.3.2 yang bersirkulasi di Indonesia membutuhkan
perhatian yang serius karena virus ini bersifat patogen dan zoonosis (Dharmayanti
et al. 2013).
Pada tanggal 3 Januari 2013, Direktorat Jenderal Peternakan dan
Kesehatan Hewan mengeluarkan keputusan nomor: 03051/PD 620/F/01/2013
mengenai vaksinasi pada itik dan unggas. Penanganan dan pencegahan virus AI
yang beredar di Indonesia dilakukan melalui penyediaan vaksin AI. Vaksin yang
diproduksi yaitu vaksin monovalen dan bivalen yang berasal dari virus AI H5N1
clade 2.1.3 atau clade 2.3.2 (BPPP 2013). Vaksin ini diharapkan mampu
melindungi itik dan ayam komersial dari serangan virus AI H5N1 clade 2.3.2 dan
clade 2.1.3.
2
Tujuan
Penelitian ini dilakukan untuk mengukur respon tanggap kebal ayam
petelur yang divaksinasi dengan vaksin inaktif AI H5N1 monovalen (clade 2.3.2)
dan bivalen (clade 2.1.3 dan 2.3.2).
Manfaat
Penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi tentang respon
tanggap kebal ayam petelur yang divaksinasi dengan vaksin inaktif AI H5N1
monovalen (clade 2.3.2) dan bivalen (clade 2.1.3 dan 2.3.2).
MATERI DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Juli 2013 – April 2014. Penelitian ini
berupa percobaan laboratorium dan lapangan yang dilakukan di Laboratorium
Terpadu Bagian Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan
Kesehatan Masyarakat Veteriner dan kandang hewan percobaan Unit Pengelola
Hewan Laboratorium Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan untuk melakukan penelitian ini adalah suspensi sel
darah merah 5% dan 1%, NaCl Fisiologis, Na-sitrat 3.8%, alkohol 70%, antigen
AI H5NI clade 2.1.3 dan clade 2.3.2 sebagai virus standar 4 HAU, larutan
Posphate Buffer Saline (PBS) dan vaksin uji monovalen dan bivalen.
Alat yang digunakan yaitu tabung standar 10 ml, syringe 1 ml dan 3 ml,
lemari pendingin, micropippete, microplate, pippete tip, microtube 1.5 ml, kapas,
kandang litter, rak tabung mikro, ice pack, cooler box dan alat sentrifus Haereus®.
Rancangan Percobaan
Penelitian ini menggunakan ayam petelur jenis Hisex brown sebanyak 155
ekor. Ayam petelur sebanyak 20 ekor diambil darahnya pada hari pertama untuk
mengetahui titer antibodi asal induk, kemudian 135 ayam dikelompokkan menjadi
3. Kelompok pertama sebanyak 45 ekor ayam sebagai kontrol (tidak vaksinasi).
Kelompok kedua sebanyak 45 ekor ayam diberi perlakuan vaksinasi AI
monovalen. Kelompok ketiga sebanyak 45 ekor ayam diberi perlakukan vaksinasi
AI bivalen. Vaksinasi ke-1 dilakukan melalui rute subkutan dengan dosis 0.2
ml/ekor pada hari ke-10. Vaksinasi ke-2 dilakukan melalui rute intramuskular
dengan dosis 0.5 ml/ekor pada hari ke-31. Pengambilan darah untuk koleksi
serum dilakukan pada masing-masing kelompok secara acak sebanyak 10 ekor
pada hari ke-17, 28, 31, 38, 45 dan 52.
3
Tabel 1 Rancangan percobaan
Hari ke
1
7
10
17 dan
28
31
38, 45
dan 52
Keterangan perlakuan
Day Old Chickens (DOC) sebanyak 155 ekor digunakan dalam
penelitian, kemudian 20 ekor DOC diambil darah intrakardial untuk
diperiksa antibodi asal induk
Pemisahaan dan penandaan untuk masing-masing kelompok
Kelompok monovalen dan bivalen
Kelompok kontrol
Vaksinasi:
1. Kelompok monovalen divaksinasi dengan
vaksin monovalen (AI H5N1 clade 2.3.2)
melalui rute subkutan dengan dosis 0.2
ml/ekor
2. Kelompok bivalen divaksinasi dengan vaksin
bivalen (AI H5N1 clade 2.3.2 dan 2.1.3)
melalui rute subkutan dengan dosis 0.2
ml/ekor
Pengambilan darah pada setiap kelompok vaksinasi Pengambilan
masing-masing 10 ekor ayam
darah kelompok
kontrol sebanyak
10 ekor ayam
Pengambilan darah sebelum vaksinasi masing- Pengambilan
masing 10 ekor. Vaksinasi :
darah kelompok
1. Kelompok monovalen divaksinasi dengan kontrol sebanyak
vaksin monovalen (AI H5N1 clade 2.3.2) 10 ekor ayam
melalui rute intramuskular dengan dosis 0.5
ml/ekor
2. Kelompok bivalen divaksinasi dengan
vaksin bivalen (AI H5N1 clade 2.3.2 dan
2.1.3) melalui rute intramuskular dengan
dosis 0.5 ml/ekor
Pengambilan darah pada setiap kelompok vaksinasi Pengambilan
masing-masing 10 ekor ayam
darah kelompok
kontrol sebanyak
10 ekor ayam
Pengambilan Darah dan Evaluasi Titer Antibodi
Anak ayam (DOC) diambil darahnya untuk uji Hambatan Aglutinasi (HI)
yang digunakan untuk menghitung titer antibodi asal induk. Pengambilan darah
untuk koleksi serum dilakukan pada hari ke-17, 28, 31, 38, 45 dan 52. Darah
dibawa ke laboratorium Terpadu bagian Mikrobiologi Medik FKH-IPB. Darah
dibiarkan dalam syringe dengan posisi horizontal dan disimpan di suhu ruang
selama 30 menit. Serum yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5
ml, kemudian disimpan dalam lemari pendingin -20 ºC untuk pengujian
selanjutnya.
4
Pembuatan Suspensi Sel Darah Merah 1%
Darah utuh ayam (whole blood) ditambahkan antikoagulan Natrium Sitrat
3.8% dengan perbandingan 4:1, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 1500 rpm
(Heareus®) selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang, sedangkan sel
darah merah yang mengendap dicuci atau dibilas NaCl fisiologis dengan volume
yang sama, kemudian disentrifugasi kembali. Pencucian dilakukan sebanyak 3
kali. Hasilnya didapatkan sel darah merah dengan konsentrasi 100%, kemudian
dilakukan pengenceran dengan penambahan NaCl fisiologis secara bertingkat
menjadi 50%, 5% dan 1%. Suspensi sel darah merah 1% digunakan untuk uji
Haemaglutinasi (HA) dan Hambatan Aglutinasi (HI).
Uji Haemaglutinasi (HA) Mikrotitrasi
Uji Haemaglutinasi (HA) menggunakan metode HA standar yang
ditetapkan OIE (OIE 2014). Posphate Buffer Saline (PBS) sebanyak 25 µ l
dimasukkan ke sumur microplate berdasar V dari baris A – E di kolom 2 – 12 dan
baris F di kolom 1 – 12. Suspensi antigen (AI H5N1 clade 2.1.3 atau clade 2.3.2)
sebanyak 50 µl dimasukkan ke sumur A1 sampai E1. Antigen dari sumur A1
sampai E1 sebanyak 25 µl dipindahkan ke sumur A2 sampai E2 menggunakan
pipet multichanel lalu dihomogenkan dengan cara menghisap dan mengeluarkan
campuran sebanyak 10 kali. PBS sebanyak 25 µl dimasukan ke dalam sumur B2
dan dihomogenkan dengan cara menghisap dan mengeluarkan campuran 10 kali,
selanjutnya dari B2 dikeluarkan sebanyak 25 µl sehingga pengenceran pada sumur
B2 menjadi 1/3. PBS sebanyak 75 µl dimasukkan ke dalam sumur C2 dan
dihomogenkan dengan cara menghisap dan mengeluarkan campuran sebanyak 10
kali, selanjutnya dari C2 dikeluarkan sebanyak 75 µl sehingga pengenceran pada
sumur C2 menjadi 1/5. PBS sebanyak 125 µl dipipet ke dalam sumur D2 dan
dihomogenkan dengan cara menghisap dan mengeluarkan campuran 10 kali,
selanjutnya dari D2 dikeluarkan sebanyak 125 µl sehingga pengenceran pada
sumur tersebut menjadi 1/7. PBS sebanyak 175 µl dipipet ke dalam sumur E2 dan
dihomogenkan dengan cara menghisap dan mengeluarkan campuran sebanyak 10
kali, selanjutnya dari E2 dikeluarkan sebanyak 175 µl sehingga pengenceran pada
sumur tersebut menjadi 1/9. Suspensi dari kolom A2 sampai ke E2 dipipet
menggunakan tips yang baru sebanyak 25 µl ke dalam A3 sampai E3 dan
dihomogenkan dengan cara menghisap dan mengeluarkan campuran sebanyak 10
kali. Suspensi dari kolom A3 sampai E3 sebanyak 25 µl dipindahkan ke dalam
kolom A4 sampai E4 dan dihomogenkan dengan cara menghisap dan
mengeluarkan campuran sebanyak 10 kali. Langkah ini diulangi hingga kolom
A12 sampai E12. Suspensi yang telah homogen pada kolom A12 sampai E12
dibuang sebanyak 25 µl. PBS sebanyak 25 µl dimasukkan ke dalam sumur baris A
– F di kolom 1 – 12. Suspensi sel darah merah 1% sebanyak 25 µl ditambahkan ke
dalam sumur baris A – F di kolom 1 – 12. Plate digoyang untuk
menghomogenkan campuran larutan selama 10 detik, kemudian plate diinkubasi
selama 30 menit pada suhu ruang. Hasil uji HA dibaca dengan cara memiringkan
microplate 45º. Sumur yang memperlihatkan endapan seperti pada sumur kontrol
negatif (sumur F1 – F12) dinyatakan negatif HA, sedangkan yang memperlihatkan
aglutinasi (penggumpalan sel darah merah) dinyatakan positif HA.
5
Uji Hambatan Aglutinasi (HI) Mikrotitrasi
Uji Hambatan Aglutinasi (HI) menggunakan metode HI standar yang
ditetapkan OIE (OIE 2014). PBS sebanyak 25 µl dimasukan ke dalam sumur
microplate berdasar V dari baris A – H dikolom 1 – 12. Serum ayam sebanyak 25
µl dimasukkan ke dalam sumur A1 – F1, kemudian dihomogenkan dengan cara
menghisap dan mengeluarkan campuran sebanyak 10 kali. Suspensi di sumur A1
– F1 dipindahkan ke sumur A2 – F2 sebanyak 25 µl, kemudian dihomogenkan.
Langkah ini diulangi hingga sumur A12 – F12, kemudian suspensi yang telah
homogen disumur A12 – F12 dibuang sebanyak 25 µl. Suspensi antigen AI H5N1
clade 2.1.3 atau clade 2.3.2 sebanyak 25 µl dimasukkan ke dalam sumur dari baris
A – G dikolom 1 – 12 dan diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. PBS
sebanyak 25 µl dimasukkan ke dalam sumur H1 – H12. Suspensi sel darah merah
1% sebanyak 25 µl dimasukkan ke dalam semua sumur. Plate digoyang selama 10
detik untuk menghomogenkan larutan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 30
menit. Hasil diamati setelah semua kontrol positif memperlihatkan adanya reaksi
hambatan aglutinasi. Hasil uji HI dibaca dengan cara memiringkan microplate 45º.
Sumur yang memperlihatkan aglutinasi (penggumpalan sel darah merah) seperti
pada kontrol negatif (sumur G1 – G12) dinyatakan negatif HI. Sumur yang
memperlihatkan endapan seperti pada sumur kontrol positif (sumur H1 – H12)
dinyatakan positif HI. Batas akhir pada pengenceran tertinggi yang menghambat
aglutinasi secara sempurna disebut dengan “end point”.
Rataan titer antibodi dihitung dengan menggunakan rumus:
log2 GMT
Keterangan:
= (log2 t1)(S1)+(log2 t2)(S2) +…. (log2 tn)(Sn)
N
N
= Jumlah serum yang diamati
T
= Tinggi titer antibodi pada pengenceran tertinggi
(yang masih dapat menghambat aglutinasi sel
darah merah)
S
= Jumlah contoh serum yang bertiter t
n
= Sampel ke-n.
GMT = Geometric Mean Titre (Rataan titer antibodi)
Analisis Data
Data titer antibodi yang diperoleh dari penelitian ini dianalisis
menggunakan metode analysis of variance (Anova) dan dilanjutkan dengan uji
Duncan untuk membuktikan adanya perbedaan yang nyata antar perlakuan.
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Antibodi Asal Induk
Titer antibodi asal induk yang diuji dengan metode Hambatan Aglutinasi
(HI) dengan menggunakan antigen AI H5N1 clade 2.3.2 dan AI H5N1 clade 2.1.3
diperoleh rataan titer antibodi masing-masing yaitu 5.67 log2 dan 3.65 log2
(Tabel 2 dan Tabel 3). Rataan titer antibodi asal induk yang diuji dengan antigen
AI H5N1 clade 2.3.2 cukup protektif terhadap virus AI. Menurut OIE (2014) titer
AI protektif terhadap virus AI jika titer HI mencapai 4 log2. Antibodi yang
terukur pada hari pertama berasal dari induk ayam (antibodi asal induk). Induk
ayam dapat menurunkan antibodi ke anaknya melalui kuning telur. Antibodi asal
induk yang terdapat pada kuning telur kemudian diserap oleh embrio ayam
melalui sistem sirkulasi darah (Hamal 2006).
Titer antibodi kelompok kontrol yang diuji dengan antigen AI H5N1 clade
2.3.2 dan clade 2.1.3 (Tabel 2 dan Tabel 3) merupakan antibodi asal induk.
Antibodi asal induk yang terbentuk diduga berasal dari vaksinasi menggunakan
antigen AI H5N1 clade 2.1.3 pada induk ayam. Hal ini dapat terlihat dari
perbedaan titer antibodi yang terukur saat diuji dengan antigen AI H5N1 clade
2.1.3 dan clade 2.3.2. Titer antibodi kelompok kontrol yang diuji dengan antigen
AI H5N1 clade 2.3.2 lebih rendah dibandingkan dengan antigen AI H5N1 clade
2.1.3. Titer antibodi yang diuji dengan antigen AI H5N1 clade 2.1.3 dapat
bertahan di level protektif hingga hari ke-28, kemudian menurun hingga tidak
terdeteksi pada hari ke-52. Hal ini sesuai dengan karakteristik antibodi asal induk
yang hanya dapat bertahan selama 4 minggu (OIE 2010). Titer antibodi kelompok
kontrol yang terukur dengan menggunakan antigen penguji AI H5N1 clade 2.3.2
diduga akibat adanya reaksi silang.
Antibodi Ayam Kelompok Monovalen dan Bivalen yang Diuji dengan
Antigen AI H5N1 clade 2.3.2
Tabel 2 Rataan titer antibodi ayam yang diuji dengan antigen AI H5N1 clade 2.3.2
Hari ke
kontrol
Mab
17
28
31
38
45
52
1.22 ± 0.97a,w
2.16 ± 1.95a,w
2.63 ± 1.36a,w
1.67 ± 1.23b,w
1.10 ± 0.87b,w
1.60 ± 0.88b,w
Perlakuan
monovalen
5.67 ± 1.37
1.30 ± 0.48a,z
2.72 ±2.41a,yz
3.36 ± 3.00a,xy
4.90 ± 1.85a,x
7.00 ± 1.94a,w
7.18 ±1.83a,w
bivalen
1.20 ± 1.03a,y
2.58 ± 3.14a,xy
3.45 ± 3.36a,x
4.16 ± 1.40a,x
7.00 ± 1.54a,w
6.84 ± 1.06a,w
Mab: maternal antibodi, huruf superscript (a,b) yang berbeda pada baris yang sama menyatakan
adanya perbedaan nyata pada taraf P
TERHADAP VAKSIN INAKTIF AVIAN INFLUENZA H5N1
MONOVALEN (CLADE 2.3.2) DAN BIVALEN (CLADE 2.1.3
DAN 2.3.2)
DEDEK HARYANTO
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Gambaran Respon
Kebal Ayam Petelur terhadap Vaksin Inaktif Avian Influenza H5N1 Monovalen
(clade 2.3.2) dan Bivalen (clade 2.3.2 dan 2.1.3) adalah benar karya saya dengan
arahan dari pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2014
Dedek Haryanto
NIM B04100094
*Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerjasama dengan pihak luar
IPB harus didasarkan pada perjanjian kerjasama terkait
ABSTRAK
DEDEK HARYANTO. Gambaran Respon Kebal Ayam Petelur terhadap Vaksin
Inaktif Avian Influenza H5N1 Monovalen (clade 2.3.2) dan Bivalen (clade 2.3.2
dan 2.1.3). Dibimbing oleh RETNO D. SOEJOEDONO dan NI LUH PUTU IKA
MAYASARI.
Virus Avian Influenza (AI) H5N1 clade 2.3.2 terdeteksi di Indonesia pada
tahun 2012. Kementerian Pertanian Indonesia mengeluarkan kebijakan pembuatan
vaksin monovalen (AI H5N1 clade 2.3.2) dan bivalen (AI H5N1 clade 2.3.2 dan
2.1.3) untuk mengurangi kerugian yang diakibatkan oleh virus AI H5N1 clade
2.3.2 dan AI H5N1 clade 2.1.3 pada unggas (ayam dan itik). Penelitian ini
bertujuan mengukur respon kebal ayam petelur yang divaksinasi AI H5N1 inaktif
monovalen dan bivalen. Penelitian ini menggunakan ayam petelur sebanyak 135
ekor yang dibagi menjadi 3 kelompok. Masing-masing kelompok sebanyak 45
ekor. Vaksinasi dilakukan pada hari ke-10 dan 31. Koleksi serum ayam petelur
dilakukan sebanyak 6 kali (hari ke-17, 28, 31, 38, 45 dan 52). Hasil pengukuran
titer antibodi menggunakan uji Hambatan Aglutinasi (HI) memperlihatkan
pemberian vaksin monovalen mampu memberikan perlindungan terhadap antigen
AI H5N1 clade 2.3.2 sampai level protektif dan pemberian vaksin bivalen mampu
menginduksi pembentukan antibodi terhadap antigen AI H5N1 clade 2.3.2 dan AI
H5N1 clade 2.1.3 sampai level protektif.
Kata kunci: Avian Influenza, bivalen, monovalen, vaksin
ABSTRAC
DEDEK HARYANTO. Immune Response of Chickens against Inactivated Avian
Influenza Vaccine H5N1 Monovalen (clade 2.3.2) and Bivalen (clade 2.3.2 and
2.1.3). Supervised by RETNO D. SOEJOEDONO dan NI LUH PUTU IKA
MAYASARI.
Avian Influenza (AI) virus H5N1 clade 2.3.2 was detected in Indonesia in 2012.
The Indonesian Ministry of Agriculture issued policy of making monovalent and
bivalent vaccines to minimize losses caused by AI H5N1 clade 2.3.2 and clade
2.1.3 in poultry (chickens and ducks). This research aimed to measure the immune
response of chickens which were vaccinated monovalent vaccine (AI H5N1 clade
2.3.2) and bivalent vaccine (AI H5N1 clade 2.3.2 and 2.1.3). This research
conducted by dividing 135 chickens into 3 groups and each group contained 45
chickens. Vaccination was performed on day 10 and 31. Serum collection was
done as many as 6 times (on day 17, 28, 31, 38, 45 and 52). Antibody titer was
measured using Haemaglution Inhibition (HI) test. HI titer of monovalent vaccine
showed protective level when measured using antigent AI H5N1 clade 2.3.2.
Bivalent vaccine was able to induce protective levels of antibody against antigent
AI H5N1 clade 2.3.2 and 2.1.3.
Keywords: Avian Infuenza, bivalent, monovalent, vaccine
GAMBARAN RESPON KEBAL AYAM PETELUR
TERHADAP VAKSIN INAKTIF AVIAN INFLUENZA H5N1
MONOVALEN (CLADE 2.3.2) DAN BIVALEN (CLADE 2.1.3
DAN 2.3.2)
DEDEK HARYANTO
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi
Nama
NIM
: Gambaran Respon Kebal Ayam Petelur terhadap Vaksin
Inaktif Avian Influenza H5N1 Monovalen (clade 2.3.2) dan
Bivalen (clade 2.1.3 dan 2.3.2)
: Dedek Haryanto
: B04100094
Disetujui oleh
Prof Dr Drh Retno D. Soejoedono MS
Pembimbing I
Dr Drh Ni Luh Putu Ika Mayasari
Pembimbing II
Diketahui oleh
Drh Agus Setiyono MS PhD APVet
Wakil Dekan Fakultas Kedokteran Hewan
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak Juni 2013 hingga April 2014 ini
adalah Gambaran Respon Kebal Ayam Petelur terhadap Vaksin Inaktif Avian
Influenza H5N1 Monovalen (clade 2.3.2) dan Bivalen (clade 2.3.2 dan 2.1.3).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Drh Retno D. Soejeodono dan
Dr Drh Ni Luh Putu Ika Mayasari selaku pembimbing, Dr Drh Sri Murtini, MSi
yang telah memberikan kesempatan untuk melakukan penelitian dibagian
Mikrobiologi Medik FKH IPB, Prof Dr Drh Muhamad Agus Setiadi selaku
pembimbing akademik serta rekan sepenelitian Ahmad Mustofa. Disamping itu,
penghargaan penulis sampaikan kepada Mas Wahyu, Pak Nur, Pak Lukman,
Mbak Selin, Mbak Pupi beserta seluruh staf di Bagian Mikrobiologi Medik yang
lain. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayahanda Sumpeno, ibuda
Painah, Kakanda Sutrisno, Kakanda Sutarno, Ayunda Erna Wati, Ayunda Erni,
Adinda Hermin Rahayu Pertiwi serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih
sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, November 2014
Dedek Haryanto
B04100094
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
1
1
2
2
MATERI DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Alat dan Bahan
Rancangan Percobaan
Pengambilan Darah dan Evaluasi Titer Antibodi
Pembuatan Suspensi Sel Darah Merah 1%
Uji Haemaglutinasi (HA) Mikrotitrasi
Uji Hambatan Aglutinasi (HI) Mikrotitrasi
Analisis Data
2
2
2
2
3
4
4
5
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
6
SIMPULAN
11
DAFTAR PUSTAKA
12
RIWAYAT HIDUP
15
DAFTAR TABEL
1. Rancangan percobaan
3
2. Rataan titer antibodi yang diuji dengan antigen AI H5N1 clade 2.3.2
6
3. Rataan titer antibodi yang diuji dengan antigen AI H5N1 clade 2.1.3
8
DAFTAR GAMBAR
1. Rataan titer antibodi yang diuji dengan antigen AI H5N1 clade 2.3.2
7
2. Rataan titer antibodi yang diuji dengan antigen AI H5N1 clade 2.1.3
8
3. Rataan titer antibodi kelompok monovalen yang diuji dengan antigen
AI H5N1 clade 2.1.3 dan 2.3.2
9
4. Rataan titer antibodi kelompok bivalen yang diuji dengan antigen
AI H5N1 clade 2.1.3 dan 2.3.2.
10
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Avian Influenza (AI) adalah penyakit yang disebabkan oleh virus
Influenza subtipe A. Virus AI dapat menyebabkan gangguan pernafasan sampai
kematian pada unggas dan mamalia. Induk semang alami dari penyakit ini adalah
bebek liar dan unggas air. Wabah penyakit AI di Indonesia telah diidentifikasi
sejak tahun 2003 (Dharmayanti et al. 2004). Virus AI dapat menginfeksi ayam ras
petelur, ayam pedaging, burung puyuh dan itik (Dharmayanti et al. 2006). Unggas
yang terinfeksi virus AI memperlihatkan gejala klinis berupa penurunan konsumsi
pakan, diare, tremor dan penurunan produksi telur (Withworth et al. 2007).
Usaha peternakan ayam petelur merupakan sektor peternakan yang paling
banyak merasakan dampak wabah AI di Indonesia. Peternak ayam petelur yang
terdapat di Indonesia pada tahun 2012 berjumlah 202 perusahaan dengan total
populasi 139 juta ekor (BPS 2012a). Populasi ayam petelur tersebut dapat
memproduksi telur sebanyak 1.4 juta ton/tahun (BPS 2012b). Wabah virus AI
menimbulkan dampak ekonomi diantaranya adalah menurunnya jumlah peternak,
menurunnya skala usaha dan menurunnya pendapatan dari memelihara unggas.
Koordinasi Komite Nasional Flu Burung dan Kesiapsiagaan Menghadapi Pandemi
Influenza (Komnas FBPI) memperkirakan besarnya kerugian akibat wabah AI
dari 2004 – 2008 sebesar 4.3 triliun, diluar kerugian hilangnya kesempatan kerja
dan berkurangnya konsumsi protein (Basuno 2008).
Wabah AI menyebabkan ratusan ribu itik mati di daerah Jawa Tengah,
Yogyakarta dan Jawa Timur yang disebabkan oleh virus AI H5N1 clade 2.3.2
(Wibawa et al. 2012). Virus tersebut merupakan subtipe clade baru yang
ditemukan di Indonesia. Virus AI yang diisolasi dari itik pada tahun 2012, setelah
dilakukan analisis filogenetik memperlihatkan bahwa virus AI H5N1 clade 2.3.2
merupakan introduksi dari Vietnam (Dharmayanti et al. 2013). Virus AI yang
selama ini sering menjadi wabah di Indonesia yang diisolasi dari unggas dan
manusia merupakan virus AI H5N1 clade 2.1.1, 2.1.2, dan 2.1.3 (WHO 2011).
Virus AI H5N1 clade 2.3.2 sedang aktif bersirkulasi di Indonesia, namun
kewaspadaan terhadap virus AI H5N1 clade 2.1.3 harus tetap ditingkatkan karena
virus ini terbukti telah banyak menimbulkan kematian pada unggas. Virus AI
H5N1 clade 2.1.3 dan clade 2.3.2 yang bersirkulasi di Indonesia membutuhkan
perhatian yang serius karena virus ini bersifat patogen dan zoonosis (Dharmayanti
et al. 2013).
Pada tanggal 3 Januari 2013, Direktorat Jenderal Peternakan dan
Kesehatan Hewan mengeluarkan keputusan nomor: 03051/PD 620/F/01/2013
mengenai vaksinasi pada itik dan unggas. Penanganan dan pencegahan virus AI
yang beredar di Indonesia dilakukan melalui penyediaan vaksin AI. Vaksin yang
diproduksi yaitu vaksin monovalen dan bivalen yang berasal dari virus AI H5N1
clade 2.1.3 atau clade 2.3.2 (BPPP 2013). Vaksin ini diharapkan mampu
melindungi itik dan ayam komersial dari serangan virus AI H5N1 clade 2.3.2 dan
clade 2.1.3.
2
Tujuan
Penelitian ini dilakukan untuk mengukur respon tanggap kebal ayam
petelur yang divaksinasi dengan vaksin inaktif AI H5N1 monovalen (clade 2.3.2)
dan bivalen (clade 2.1.3 dan 2.3.2).
Manfaat
Penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi tentang respon
tanggap kebal ayam petelur yang divaksinasi dengan vaksin inaktif AI H5N1
monovalen (clade 2.3.2) dan bivalen (clade 2.1.3 dan 2.3.2).
MATERI DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Juli 2013 – April 2014. Penelitian ini
berupa percobaan laboratorium dan lapangan yang dilakukan di Laboratorium
Terpadu Bagian Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan
Kesehatan Masyarakat Veteriner dan kandang hewan percobaan Unit Pengelola
Hewan Laboratorium Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan untuk melakukan penelitian ini adalah suspensi sel
darah merah 5% dan 1%, NaCl Fisiologis, Na-sitrat 3.8%, alkohol 70%, antigen
AI H5NI clade 2.1.3 dan clade 2.3.2 sebagai virus standar 4 HAU, larutan
Posphate Buffer Saline (PBS) dan vaksin uji monovalen dan bivalen.
Alat yang digunakan yaitu tabung standar 10 ml, syringe 1 ml dan 3 ml,
lemari pendingin, micropippete, microplate, pippete tip, microtube 1.5 ml, kapas,
kandang litter, rak tabung mikro, ice pack, cooler box dan alat sentrifus Haereus®.
Rancangan Percobaan
Penelitian ini menggunakan ayam petelur jenis Hisex brown sebanyak 155
ekor. Ayam petelur sebanyak 20 ekor diambil darahnya pada hari pertama untuk
mengetahui titer antibodi asal induk, kemudian 135 ayam dikelompokkan menjadi
3. Kelompok pertama sebanyak 45 ekor ayam sebagai kontrol (tidak vaksinasi).
Kelompok kedua sebanyak 45 ekor ayam diberi perlakuan vaksinasi AI
monovalen. Kelompok ketiga sebanyak 45 ekor ayam diberi perlakukan vaksinasi
AI bivalen. Vaksinasi ke-1 dilakukan melalui rute subkutan dengan dosis 0.2
ml/ekor pada hari ke-10. Vaksinasi ke-2 dilakukan melalui rute intramuskular
dengan dosis 0.5 ml/ekor pada hari ke-31. Pengambilan darah untuk koleksi
serum dilakukan pada masing-masing kelompok secara acak sebanyak 10 ekor
pada hari ke-17, 28, 31, 38, 45 dan 52.
3
Tabel 1 Rancangan percobaan
Hari ke
1
7
10
17 dan
28
31
38, 45
dan 52
Keterangan perlakuan
Day Old Chickens (DOC) sebanyak 155 ekor digunakan dalam
penelitian, kemudian 20 ekor DOC diambil darah intrakardial untuk
diperiksa antibodi asal induk
Pemisahaan dan penandaan untuk masing-masing kelompok
Kelompok monovalen dan bivalen
Kelompok kontrol
Vaksinasi:
1. Kelompok monovalen divaksinasi dengan
vaksin monovalen (AI H5N1 clade 2.3.2)
melalui rute subkutan dengan dosis 0.2
ml/ekor
2. Kelompok bivalen divaksinasi dengan vaksin
bivalen (AI H5N1 clade 2.3.2 dan 2.1.3)
melalui rute subkutan dengan dosis 0.2
ml/ekor
Pengambilan darah pada setiap kelompok vaksinasi Pengambilan
masing-masing 10 ekor ayam
darah kelompok
kontrol sebanyak
10 ekor ayam
Pengambilan darah sebelum vaksinasi masing- Pengambilan
masing 10 ekor. Vaksinasi :
darah kelompok
1. Kelompok monovalen divaksinasi dengan kontrol sebanyak
vaksin monovalen (AI H5N1 clade 2.3.2) 10 ekor ayam
melalui rute intramuskular dengan dosis 0.5
ml/ekor
2. Kelompok bivalen divaksinasi dengan
vaksin bivalen (AI H5N1 clade 2.3.2 dan
2.1.3) melalui rute intramuskular dengan
dosis 0.5 ml/ekor
Pengambilan darah pada setiap kelompok vaksinasi Pengambilan
masing-masing 10 ekor ayam
darah kelompok
kontrol sebanyak
10 ekor ayam
Pengambilan Darah dan Evaluasi Titer Antibodi
Anak ayam (DOC) diambil darahnya untuk uji Hambatan Aglutinasi (HI)
yang digunakan untuk menghitung titer antibodi asal induk. Pengambilan darah
untuk koleksi serum dilakukan pada hari ke-17, 28, 31, 38, 45 dan 52. Darah
dibawa ke laboratorium Terpadu bagian Mikrobiologi Medik FKH-IPB. Darah
dibiarkan dalam syringe dengan posisi horizontal dan disimpan di suhu ruang
selama 30 menit. Serum yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5
ml, kemudian disimpan dalam lemari pendingin -20 ºC untuk pengujian
selanjutnya.
4
Pembuatan Suspensi Sel Darah Merah 1%
Darah utuh ayam (whole blood) ditambahkan antikoagulan Natrium Sitrat
3.8% dengan perbandingan 4:1, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 1500 rpm
(Heareus®) selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang, sedangkan sel
darah merah yang mengendap dicuci atau dibilas NaCl fisiologis dengan volume
yang sama, kemudian disentrifugasi kembali. Pencucian dilakukan sebanyak 3
kali. Hasilnya didapatkan sel darah merah dengan konsentrasi 100%, kemudian
dilakukan pengenceran dengan penambahan NaCl fisiologis secara bertingkat
menjadi 50%, 5% dan 1%. Suspensi sel darah merah 1% digunakan untuk uji
Haemaglutinasi (HA) dan Hambatan Aglutinasi (HI).
Uji Haemaglutinasi (HA) Mikrotitrasi
Uji Haemaglutinasi (HA) menggunakan metode HA standar yang
ditetapkan OIE (OIE 2014). Posphate Buffer Saline (PBS) sebanyak 25 µ l
dimasukkan ke sumur microplate berdasar V dari baris A – E di kolom 2 – 12 dan
baris F di kolom 1 – 12. Suspensi antigen (AI H5N1 clade 2.1.3 atau clade 2.3.2)
sebanyak 50 µl dimasukkan ke sumur A1 sampai E1. Antigen dari sumur A1
sampai E1 sebanyak 25 µl dipindahkan ke sumur A2 sampai E2 menggunakan
pipet multichanel lalu dihomogenkan dengan cara menghisap dan mengeluarkan
campuran sebanyak 10 kali. PBS sebanyak 25 µl dimasukan ke dalam sumur B2
dan dihomogenkan dengan cara menghisap dan mengeluarkan campuran 10 kali,
selanjutnya dari B2 dikeluarkan sebanyak 25 µl sehingga pengenceran pada sumur
B2 menjadi 1/3. PBS sebanyak 75 µl dimasukkan ke dalam sumur C2 dan
dihomogenkan dengan cara menghisap dan mengeluarkan campuran sebanyak 10
kali, selanjutnya dari C2 dikeluarkan sebanyak 75 µl sehingga pengenceran pada
sumur C2 menjadi 1/5. PBS sebanyak 125 µl dipipet ke dalam sumur D2 dan
dihomogenkan dengan cara menghisap dan mengeluarkan campuran 10 kali,
selanjutnya dari D2 dikeluarkan sebanyak 125 µl sehingga pengenceran pada
sumur tersebut menjadi 1/7. PBS sebanyak 175 µl dipipet ke dalam sumur E2 dan
dihomogenkan dengan cara menghisap dan mengeluarkan campuran sebanyak 10
kali, selanjutnya dari E2 dikeluarkan sebanyak 175 µl sehingga pengenceran pada
sumur tersebut menjadi 1/9. Suspensi dari kolom A2 sampai ke E2 dipipet
menggunakan tips yang baru sebanyak 25 µl ke dalam A3 sampai E3 dan
dihomogenkan dengan cara menghisap dan mengeluarkan campuran sebanyak 10
kali. Suspensi dari kolom A3 sampai E3 sebanyak 25 µl dipindahkan ke dalam
kolom A4 sampai E4 dan dihomogenkan dengan cara menghisap dan
mengeluarkan campuran sebanyak 10 kali. Langkah ini diulangi hingga kolom
A12 sampai E12. Suspensi yang telah homogen pada kolom A12 sampai E12
dibuang sebanyak 25 µl. PBS sebanyak 25 µl dimasukkan ke dalam sumur baris A
– F di kolom 1 – 12. Suspensi sel darah merah 1% sebanyak 25 µl ditambahkan ke
dalam sumur baris A – F di kolom 1 – 12. Plate digoyang untuk
menghomogenkan campuran larutan selama 10 detik, kemudian plate diinkubasi
selama 30 menit pada suhu ruang. Hasil uji HA dibaca dengan cara memiringkan
microplate 45º. Sumur yang memperlihatkan endapan seperti pada sumur kontrol
negatif (sumur F1 – F12) dinyatakan negatif HA, sedangkan yang memperlihatkan
aglutinasi (penggumpalan sel darah merah) dinyatakan positif HA.
5
Uji Hambatan Aglutinasi (HI) Mikrotitrasi
Uji Hambatan Aglutinasi (HI) menggunakan metode HI standar yang
ditetapkan OIE (OIE 2014). PBS sebanyak 25 µl dimasukan ke dalam sumur
microplate berdasar V dari baris A – H dikolom 1 – 12. Serum ayam sebanyak 25
µl dimasukkan ke dalam sumur A1 – F1, kemudian dihomogenkan dengan cara
menghisap dan mengeluarkan campuran sebanyak 10 kali. Suspensi di sumur A1
– F1 dipindahkan ke sumur A2 – F2 sebanyak 25 µl, kemudian dihomogenkan.
Langkah ini diulangi hingga sumur A12 – F12, kemudian suspensi yang telah
homogen disumur A12 – F12 dibuang sebanyak 25 µl. Suspensi antigen AI H5N1
clade 2.1.3 atau clade 2.3.2 sebanyak 25 µl dimasukkan ke dalam sumur dari baris
A – G dikolom 1 – 12 dan diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. PBS
sebanyak 25 µl dimasukkan ke dalam sumur H1 – H12. Suspensi sel darah merah
1% sebanyak 25 µl dimasukkan ke dalam semua sumur. Plate digoyang selama 10
detik untuk menghomogenkan larutan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 30
menit. Hasil diamati setelah semua kontrol positif memperlihatkan adanya reaksi
hambatan aglutinasi. Hasil uji HI dibaca dengan cara memiringkan microplate 45º.
Sumur yang memperlihatkan aglutinasi (penggumpalan sel darah merah) seperti
pada kontrol negatif (sumur G1 – G12) dinyatakan negatif HI. Sumur yang
memperlihatkan endapan seperti pada sumur kontrol positif (sumur H1 – H12)
dinyatakan positif HI. Batas akhir pada pengenceran tertinggi yang menghambat
aglutinasi secara sempurna disebut dengan “end point”.
Rataan titer antibodi dihitung dengan menggunakan rumus:
log2 GMT
Keterangan:
= (log2 t1)(S1)+(log2 t2)(S2) +…. (log2 tn)(Sn)
N
N
= Jumlah serum yang diamati
T
= Tinggi titer antibodi pada pengenceran tertinggi
(yang masih dapat menghambat aglutinasi sel
darah merah)
S
= Jumlah contoh serum yang bertiter t
n
= Sampel ke-n.
GMT = Geometric Mean Titre (Rataan titer antibodi)
Analisis Data
Data titer antibodi yang diperoleh dari penelitian ini dianalisis
menggunakan metode analysis of variance (Anova) dan dilanjutkan dengan uji
Duncan untuk membuktikan adanya perbedaan yang nyata antar perlakuan.
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Antibodi Asal Induk
Titer antibodi asal induk yang diuji dengan metode Hambatan Aglutinasi
(HI) dengan menggunakan antigen AI H5N1 clade 2.3.2 dan AI H5N1 clade 2.1.3
diperoleh rataan titer antibodi masing-masing yaitu 5.67 log2 dan 3.65 log2
(Tabel 2 dan Tabel 3). Rataan titer antibodi asal induk yang diuji dengan antigen
AI H5N1 clade 2.3.2 cukup protektif terhadap virus AI. Menurut OIE (2014) titer
AI protektif terhadap virus AI jika titer HI mencapai 4 log2. Antibodi yang
terukur pada hari pertama berasal dari induk ayam (antibodi asal induk). Induk
ayam dapat menurunkan antibodi ke anaknya melalui kuning telur. Antibodi asal
induk yang terdapat pada kuning telur kemudian diserap oleh embrio ayam
melalui sistem sirkulasi darah (Hamal 2006).
Titer antibodi kelompok kontrol yang diuji dengan antigen AI H5N1 clade
2.3.2 dan clade 2.1.3 (Tabel 2 dan Tabel 3) merupakan antibodi asal induk.
Antibodi asal induk yang terbentuk diduga berasal dari vaksinasi menggunakan
antigen AI H5N1 clade 2.1.3 pada induk ayam. Hal ini dapat terlihat dari
perbedaan titer antibodi yang terukur saat diuji dengan antigen AI H5N1 clade
2.1.3 dan clade 2.3.2. Titer antibodi kelompok kontrol yang diuji dengan antigen
AI H5N1 clade 2.3.2 lebih rendah dibandingkan dengan antigen AI H5N1 clade
2.1.3. Titer antibodi yang diuji dengan antigen AI H5N1 clade 2.1.3 dapat
bertahan di level protektif hingga hari ke-28, kemudian menurun hingga tidak
terdeteksi pada hari ke-52. Hal ini sesuai dengan karakteristik antibodi asal induk
yang hanya dapat bertahan selama 4 minggu (OIE 2010). Titer antibodi kelompok
kontrol yang terukur dengan menggunakan antigen penguji AI H5N1 clade 2.3.2
diduga akibat adanya reaksi silang.
Antibodi Ayam Kelompok Monovalen dan Bivalen yang Diuji dengan
Antigen AI H5N1 clade 2.3.2
Tabel 2 Rataan titer antibodi ayam yang diuji dengan antigen AI H5N1 clade 2.3.2
Hari ke
kontrol
Mab
17
28
31
38
45
52
1.22 ± 0.97a,w
2.16 ± 1.95a,w
2.63 ± 1.36a,w
1.67 ± 1.23b,w
1.10 ± 0.87b,w
1.60 ± 0.88b,w
Perlakuan
monovalen
5.67 ± 1.37
1.30 ± 0.48a,z
2.72 ±2.41a,yz
3.36 ± 3.00a,xy
4.90 ± 1.85a,x
7.00 ± 1.94a,w
7.18 ±1.83a,w
bivalen
1.20 ± 1.03a,y
2.58 ± 3.14a,xy
3.45 ± 3.36a,x
4.16 ± 1.40a,x
7.00 ± 1.54a,w
6.84 ± 1.06a,w
Mab: maternal antibodi, huruf superscript (a,b) yang berbeda pada baris yang sama menyatakan
adanya perbedaan nyata pada taraf P