Struktur kimia melanoidin belum sepenuhnya dijelaskan dengan lengkap dalam publikasi-publikasi, untuk itu masih sulit menentukan dengan tepat, secara
umum struktur melanoidin terdiri dari pengulangan gugus aromatik. Homma et al 1997 menjelaskan struktur melanoidin mirip dengan produk reaksi Amadori,
dan juga merupakan unit pengulangan dari konyugasi ikatan rangkap karbon dan nitrogen tersier. Struktur ini sebagaimana halnya pada redukton, seperti
enol dan enaminol. Kromatogram lengkap ada pada Lampiran 17, ringkasan dapat dilihat Tabel 4.6.
D. Senyawa yang Berperan sebagai Antioksidan
Secara keseluruhan fraksi-fraksi produk yang mempunyai aktivitas antioksidan paling kuat pada setiap metode untuk setiap produk dapat
disimpulkan pada Tabel 4.7. Pada Tabel 4.7 menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan terkuat terdapat pada produk KGP. Senyawa yang berperan sebagai
antioksidan di dalam tiap produk diduga berdasarkan adanya senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan seperti: kadar protein terlarut, kadar total fenol,
alfa-amino, disertai memprediksi senyawa yang dominan dalam tiap fraksi dengan melihat karakteristik spektrum uv-vis dan IR tiap fraksi.
Tabel 4.7. Aktivitas antioksidan optimal pada tiap produk
Metode Moromi
Kecap manis Antioksidan
sintetis BHTvit.C
kontrol tanpa
pemanasan dengan
pemanasan dengan
gula kelapa
dengan gula pasir
Rancimatjam 15.85
cF4
15.85
cF4
15
cF3
17.70
dF4
12.1
b
7.54
a
DPPH 49.27
aF3
53.11
bF2
56.49
bF2
66.1
cF1
62.48
c
TBA 2.16
aF2
1.26
aF2
5.01
bF2
1.38
aF2
7.53
c
11.74
d
Tiosianat 83.33
dF1
50
bF2
66.67
cF3
61.11
cF4
40
a
Keterangan: F1: fraksi dengan berat molekul 100 kDa; F2: fraksi dengan berat molekul 30-100 kDa;
F3: fraksi dengan berat molekul 10-30 kDa; F4: fraksi dengan berat molekul 10 kDa Angka yang diikuti dengan huruf yang sama pada masing-masing pengamatan
tiap produk menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf 5
Secara keseluruhan maka fraksi dengan berat molekul besar 30 kDa sampai 100 kDa F1 dan F2 untuk produk M dan MP memiliki kemampuan
menangkap radikal DPPH dan menghambat oksidasi minyak atau lemak lebih kuat dibandingkan fraksi yang lebih kecil berat molekulnya 30 kDa.
Tabel 4.6. Gugus fungsional pada fraksi-fraksi produk M, MP, KGM dan KGP
Gugus fungsional
bilangan gelombang
cm
-1
Moromi Kecap manis
tanpa pemanasan dengan pemanasan
dengan gula kelapa dengan gula pasir
F1 F2
F3 F4 F1
F2 F3 F4
F1 F2
F3 F4
F1 F2
F3 F4
OH..O atau 2060
w w
- w
w w
w w
w w
w w
w C=R=R
-CH 600-900
w w
w -
w w
w w
w w
w w
sh w
-COC 1020-1080
s m
s m
s w
s w
s s
s w
s s
m w
C=C 1240-1265
sh w
m w
m w
sh w
w w
m w
sh w
m w
C=N 1350-1415
sh w
sh sh
sh w
s s
w w
sh w
sh w
sh w
NH 1610-1650
s s
m s
s s
s s
s s
s s
s s
s sh
N+H 2300-2360
br br
- w
- br
- w
COO 2900-3500
m w
w w
br w
br w
w m
s m
sh m
sh w
S = strong; m = medium; w = weak; sh = sharp; br = broad
75
Kemampuan menghambat oksidasi lemak pada produk kecap manis KGM dan KGP terdapat pada fraksi dengan berat molekul 10 kDa sampai 30 kDa F3 dan F4,
sedangkan kemampuan menangkap radikal DPPH lebih kuat terdapat pada fraksi dengan berat molekul 30 kDa sampai 100 kDa F1 dan F2.
Beberapa karakteristik kimia fraksi-fraksi pada tiap produk M, MP, KGM dan KGP yang telah dijelaskan di atas diringkas sebagaimana dalam Tabel 4.8 dimana
kadar protein, alfa-amino dan fenol terkonsentrasi pada faksi F4. Tabel 4.8. Karakteristik kimia dengan kadar tertinggi pada F4 fraksi dengan berat
molekul 10 kDa dalam tiap produk Komponen
Moromi Kecap manis
tanpa pemanasan
dengan pemanasan
dengan gula kelapa
dengan gula pasir
Proteinmgml 2.37
a
1.99
a
1.44
a
1.54
a
Alfa-aminomgml 2.67
c
1.94
b
1.90
b
1.35
a
Fenol ppm 446.15
c
534.18
d
360.94
b
261.3
a
Keterangan: Angka yang diikuti dengan huruf yang sama pada masing-masing pengamatan
tiap produk menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf 5
Kekuatan aktivitas antioksidan ini jika dihubungkan dengan kuantitas protein, alfa-amino dan fenol tidak berhubungan dengan kekuatan aktivitas fraksi-fraksi
sebagai antioksidan. Untuk protein pada semua produk paling banyak terdapat pada fraksi F4 dan antar produk tidak berbeda nyata. Pada alfa-amino tertinggi terdapat
pada produk moromi M dan fenol tertinggi terdapat produk MP dan M. Hasil spektrum uv-vis fraksi-fraksi tiap produk Tabel 4.9 dan IR Tabel 4.6
mengindikasikan bahwa senyawa-senyawa yang dominan dalam fraksi-fraksi produk M, MP, KGM dan KGP adalah senyawa produk reaksi Maillard. Telah banyak
dibahas pada sub bab sebelumnya bahwa proses perubahan produk M menjadi bentuk produk MP, KGM dan KGP diduga banyak melibatkan proses reaksi Maillard.
Pada KGP dan KGM banyak mengandung senyawa produk reaksi Maillard, produk MP lebih banyak mengandung produk reaksi Maillard dibandingkan produk M. Untuk
itu diduga senyawa yang berperan sebagai antioksidan adalah produk reaksi Maillard.
76
Beberapa hasil spektrum uv-vis dari beberapa peneliti pada Tabel 4.10 mendapatkan spektrum uv-vis pada produk reaksi Maillard hasil dari model. Hasil
spektrum uv-vis fraksi-fraksi tiap produk M, MP, KGM dan KGP dicocokkan pada Tabel 4.10 didapatkan fraksi-fraksi tiap produk M, MP, KGM dan KGP Tabel 4.9
mengindikasikan spektrum mengandung banyak senyawa produk reaksi Maillard. Tabel 4.9 Peak maksimum pada spektrum uv-vis fraksi-fraksi tiap produk nm
Fraksi Moromi
kecap manis tanpa
pemanasan dengan
pemanasan dengan gula
kelapa dengan
gula pasir F1
306; 348 350
306 306; 348
F2
306 306
306; 343 306; 342
F3
306; 345 365
380 397
F4
360 350
368 403
Keterangan: F1: fraksi dengan berat molekul 100 kDa; F2: fraksi dengan berat molekul 30-100 kDa; F3: fraksi dengan berat molekul 10-30 kDa; F4: fraksi dengan berat molekul 10 kDa
Tabel 4.10 Spektrum uv-vis sistem model produk reaksi Maillard dari literatur sistem model
serapan optimal reference
arginin,glioksal,furan-2- karboksaldehid
314; 472 Hofmann 1998c
glukosa-glisin 320
Terasawa et al 1991 asam dehidroaskorbatDHA-kasein
dan DHA-ovalbumin 385; 512
Namiki et al 1983 kasein-glukosa
glisin-xilosa glukosa-glisin
280 320
326; 347 Hofmann 1998b
Motai Inoue 1974 Yaylayan Kaminsky
1998 Spektrum uv-vis fraksi-fraksi tiap produk M, MP, KGM dan KGP diduga bukan
spektrum dari senyawa fenol atau asam amino karena senyawa aromatik golongan fenol memiliki puncak serapan sekunder pada panjang gelombang 270 nm dan
peptida pada 214 nm Pavia et al 1996. Serapan senyawa aromatik pada panjang
77
gelombang 240 nm, asam amino tirosin, phenilalanin, triptofan pada 280 nm dan asam glutamat 185 nm Bollag Edelstein 1991.
Kemampuan senyawa produk reaksi Maillard dapat lebih unggul aktivitas antioksidannya daripada senyawa fenol dapat dilihat dari hasil penelitian Supriyanto
et al 2006 yang mendapatkan aktivitas penghambatan oksidasi asam lemak linoleat oleh ekstrak polifenol dari kakao yang disangrai lebih tinggi dibandingkan
dengan yang tidak disangrai. Telah disebutkan di atas bahwa pada fraksi F3 dan F4 khususnya pada produk
KGP dan KGM mempunyai aktivitas antioksidan cukup kuat terutama dalam menghambat oksidasi lemak atau asam lemak terutama dengan metode rancimat
dan linoleat-tiosianat, pada awalnya diduga penyebab utama disebabkan oleh senyawa fenol karena senyawa fenol banyak terkonsentrasi pada fraksi F3 dan F4
tetapi dari pendapat Hammerschmidt dan Pratt 1978 flavonoid potensial sebagai antioksidan pada sistem aqueous tetapi kurang efektif mencegah autooksidasi pada
minyak kedelai, sedangkan dengan metode rancimat media yang digunakan adalah minyak kedelai dan metode-tiosianat adalah asam linoleat sehingga diduga tetap
yang berperan adalah senyawa produk reaksi Maillard sebagai antioksidan atau ada efek sinergis senyawa produk reaksi Maillard dengan fenol atau asam amino atau
peptida. Aktivitas antioksidan kecap manis diduga juga tetap mendapat sumbangan dari
senyawa fenolik. Kurang kuatnya peran senyawa fenolik sebagai antioksidan dalam penelitian ini diduga karena banyak yang rusak atau bergabung dengan senyawa
produk reaksi Maillard untuk memberikan aktivitas sebagai antioksidan. Senyawa fenolik mendonorkan residu dari gugus karbonilnya untuk fase awal reaksi Maillard
Morales Babbel 2002. Hasil penelitian dari Misnawi et al 2002 didapakan bahwa dengan adanya proses pemanasanpenyangraian pada suhu 120
o
C selama 45 menit menyebabkan penurunan total polifenol sebesar 3.
Ada beberapa senyawa fenolik yang memiliki potensi aktivitas antioksidan, salah satunya adalah flavonoid. Flavonoid kedelai kebanyakan berupa isoflavon.
Isoflavon untuk produk-produk kedelai yang difermentasi berupa 6,7,4’ – trihidroksiisoflavon Pratt 1992. Menurut Shahidi dan Naczk 1995, selain isoflavon,
produk kedelai merupakan sumber berbagai macam senyawa antioksidan yang
78
merupakan golongan dari turunan asam sinamat, fosfolipida, tokoferol, asam amino dan peptida.
Untuk lebih menguatkan dugaan bahwa senyawa yang dominan dalam fraksi- fraksi produk maka dilanjutkan dengan melewatkan fraksi-fraksi produk M, MP, KGM
dan KGP pada TLC thin layer chromatografi dan HPLC high performance liquid chromatografi. Hasil analisis dengan TLC yang memberikan pemisahan cukup baik
dengan menggunakan komposisi pelarut: khloroform:etil asetat:etanol:air 1:2:2:2. Hasil TLC pada fraksi F1 dari produk M, KGM dan KGP memberikan nilai Rf yang
hampir sama, yaitu 0.3, hanya pada produk MP yang mempunyai nilai Rf 0.4. Sedangkan pada fraksi F4, nilai Rf produk M dan MP hampir sama 0.4, pada
produk KGM 0.3 dengan KGP 0.5 sangat berbeda nilai Rf nya Tabel 4.11. Hasil spot-spot dari TLC ini dilanjutkan dengan menginjeksikan pada HPLC dan hasilnya
fraksi-fraksi relatif dapat terpisah cukup baik. Nilai Rf yang didapatkan dari tiap fraksi-fraksi produk M, MP, KGM dan KGP
mendekati hasil yang didapatkan oleh Arnoldi et al 1997 yang mereaksikan antara silosa dan lisin dan dipanaskan selama 1 jam pada suhu 100
o
C dan pH 2.66 untuk mendapatkan senyawa produk reaksi Maillard dengan komposisi pelarut yang
dipergunakan untuk melewatkan pada plat TLC adalah khloroform:etil asetat:etanol 15:2:2. Band dapat terpisah cukup baik dengan nilai Rf sebesar 0.28 dan 0.38.
Sedangkan Kurata 1973 mendapatkan hasil reaksi DHA dehidro-L-ascorbic acid dengan leusin menghasilkan pigmen merah yang dengan TLC didapatkan nilai Rf
sebesar 0.12 dengan sistem solven n-butanol-etanol-air 4:1:4. Tabel 4.11 Nilai Rf dari fraksi BM100 kDa dan BM 10 kDa tiap produk
Fraksi Moromi
kecap manis tanpa
pemanasan dengan
pemanasan dengan gula
kelapa dengan
gula pasir
F1 0.38
0.41 0.34
0.36 F4
0.41 0.47
0.32 0.58
Keterangan: F1: fraksi dengan berat molekul 100 kDa; F4: fraksi dengan berat molekul 10 kDa;
79
Hasil yang didapatkan dengan HPLC, pada fraksi F4, produk M mempunyai waktu retensi 2.63 dengan persen luas area 90 pada panjang gelombang
maksimal 307 nm, produk MP dengan waktu retensi 2.51 26.52 dan 2.81 73.48 pada panjang gelombang 420 nm, produk KGM waktu retensinya 15.04
100 pada panjang gelombang 460 nm dan produk KGP waktu retensinya 2.1 100 pada panjang gelombang 403 nm.
Pada fraksi dengan berat molekul yang lebih besar, F3M mempunyai waktu retensi 2.68 15.58 dan 2.93 7.57 pada panjang gelombang 307 nm dan F1
pada produk MP waktu retensinya 1.81 94.57 dan 2.5 5.43 pada panjang gelombang 420 nm, produk KGM waktu retensinya 2.79 menit 100 pada panjang
gelombang 460 nm dan produk KGP waktu retensinya 1.77 9.5 dan 2.203 56.78 pada panjang gelombang 420 nm. Jadi Hasil yang didapatkan dengan
HPLC, pada fraksi F4 dan F3 peak yang cukup intens muncul dengan menggunakan panjang gelombang 307 nm, 403 nm dan 420 dengan waktu retensi pada kisaran 2
– 3 menit Beberapa hasil penelitian berikut memberikan kontribusi bahwa pada kecap
banyak mengandung
senyawa produk
reaksi Maillard
dan mempunyai
kecenderungan kuat sebagai antioksidan. Senyawa nitrogen merupakan salah satu komponen penting pada sifat antioksidan kecap, komponen utama warna coklat dari
kecap seperti melanoidin sebagai produk akhir reaksi Maillard juga memegang peranan penting terhadap kekuatan aktivitas antioksidannya Moon et al 2002.
Hasil analisis warna kecap manis profilnya mirip dengan komponen berwarna yang dihasilkan dari reaksi model glisin dan xilosa Apriyantono et al 1997.
Penelitian sebelumnya dari Wiratma 1995 diketahui bahwa sebagian besar komponen volatil yang terdapat dalam kecap manis adalah hasil reaksi Maillard.
Terjadinya reaksi Maillard ini melibatkan asam-asam amino dan gula pereduksi dimana sebagian besar gula pereduksi disumbangkan oleh gula yang ditambahkan.
Menurut Nurhayati 1996 kecap manis dan gula merah gula kelapa mengandung komponen volatil: aldehid, keton, alkohol, asam, furan, pirazin, pirol, tiazol, turunan
benzen, ester, hidrokarbon, piran dan fenol. Nurhayati menyimpulkan bahwa sebagian besar komponen volatil gula merah merupakan penyusun komposisi
komponen volatil kecap manis. Penambahan senyawa volatil pada kecap manis dibandingkan dengan jenis komponen volatil gula merah terdapat pada senyawa
80
aldehid, asam, furan, pirol, turunan benzen dan ester. Adanya penambahan senyawa volatil ini disebabkan karena pengaruh proses pemasakan kecap manis
dan dari moromi. Proses yang terjadi selama pemasakan kecap manis yaitu reaksi Maillard.
Senyawa aldehid atau keton dapat dihasilkan dari senyawa -dkarbonil dari reaksi Maillard yang mengalami degradasi strecker Yokotsuka 1986. Senyawa
furan yang teidentifikasi dalam kecap manis dengan gula merah adalah 5- hidroksimetil-2-furaldehid Nurhayati 1996. Senyawa furan juga merupakan hasil
degradasi gula Shibamoto 1983 dan dapat dihasilkan dari interaksi antara gula dan asam amino Vermin Parkanyi 1982. Senyawa pirazin berasal dari degradasi
panas protein dan asam amino atau berasal dari reaksi kimia gula dan protein Yokotsuka 1986. Senyawa pirol dapat dihasilkan dari reaksi degradasi strecker
yang melibatkan asam amino prolin dan hidroksi prolin Maga 1981. Selain itu juga dapat dihasilkan dari interaksi antara hasil fragmentasi gula pada suhu tinggi dengan
hasil degradasi asam amino selain prolin dan hidroksi prolin Shibamoto1983. Senyawa tiazol terdapat pada makanan yang mengalami proses pemanasan
sehingga terjadi reaksi Maillard.
E. Mekanisme Senyawa Produk Reaksi Maillard sebagai Antioksidan
