Irisan paradermal Irisan transversal

161 Lampiran 8. Proses pembuatan preparat irisan paradermal dan transversal daun manggis

a. Irisan paradermal

Irisan paradermal dibuat dalam bentuk preparat semi permanen dengan pewarnaan safranin 1 , tahapan kerja sebagai berikut : 1. daun difiksasi dalam alkohol 70 , kemudian dicuci dengan akuades. 2. daun direndam dalam larutan HNO 3 25 selama 15-30 menit dan dicuci dengan akuades. 3. epidermis disayat dengan menggunakan pisau silet, untuk menghilangkan klorofil dari mesofil yang terikat, sayatan epidermis direndam dalam larutan bayclean selama 3 menit dan dicuci dengan akuades. 4. sayatan epidermis diwarnai dengan pewarna safranin 1 selama 3-5 menit. 5. sediaan diberi gliserin 10 dan ditutup dengan gelas penutup.

b. Irisan transversal

Sayatan transversal mengikuti metode parafin dengan menggunakan larutan seri Johansen dengan TBA sebagai dehidran, tahapan kerja sebagai berikut : 1. Daun difiksasi selama 24 jam dalam larutan FAA dengan komposisi Alkohol 70 : asam asetat glasial : Formaldehida dengan perbandingan 90 : 5 : 5. 2. Larutan fiksasi dibuang dan dicuci dengan etanol 50 sebanyak 4 kali dengan waktu penggantian mansing- masing 1 jam. 3. Dehidrasi dan penjernihan dilakukan secara bertahap dengan merendam bahan dalam larutan seri Johansen I-VII dengan komposisi sebagai berikut : Larutan Johansen Komposisi larutan I II III IV V VI VII Air 50 30 15 - - - - Etanol 95 40 50 50 45 - - - Etanol 100 - - - - 25 - - Tertierbutyl alkohol 10 20 35 55 75 100 50 Minyak parafin - - - - - - 50 162 waktu perendaman untuk masing- masing tahap sebagai berikut : Johansen I 2 jam, Johansen II 24 jam, Johansen III 2 jam, Johansen IV 2 jam, Johansen V 2 jam, Johansen VI 24 jam, Johansen VI 2 jam, Johansen VII dalam botol yang berisi 13 bagian parafin beku. 4. Infiltrasi: wadah berisi material daun dan campuran TBA, minyak parafin serta 13 bagian paraffin disimpan dalam oven 58 o C selama 12 jam dan dituang seluruh paraffin diganti dengan parafin cair baru dilakukan 3 kali penggantian setiap 6 jam dan disimpan pada suhu 58 o C. 5. Penanaman dalam blok: menuang semua cairan paraffin ganti dengan parafin cair murni disimpan di oven 58 o C selama 1 jam, selanjutnya material siap diblok. 6. Penyayatan: blok yang sudah dirapikan ditempel pada holder dan disayat dengan mikrotom putar setebal 10 ìm. 7. Perekatan: sayatan direkatkan pada gelas objek yang telah diolesi albumin gliserin dan ditetesi air. Kemudian gelas berisi pita paraffin dipanaskan pada hot-plate dengan suhu 45 o C selama 3-5 jam. 8. Pewarnaan dilakukan pewarnaan ganda safranin 2 dalam air dan fastgreen 0,5 dalam etanol 95 . Berturut-turut gelas objek direndam ke dalam larutan berikut: Xilol 1 5-10 menit Xilol 2 5-10 menit Etanol- xilol 3:1 2-5 menit Etanol- xilol 1:1 2-5 menit Etanol- xilol 3:1 2-5 menit Etanol absolut 2-5 menit Etanol 95 2-5 menit Etanol 70 2-5 menit Etanol 50 2-5 menit Etanol 30 2-5 menit Akuades 1-2 menit Safranin 2 12-24 j am Akuades 1-2 menit Etanol 30 2-5 menit Etanol 50 2-5 menit Etanol 70 2-5 menit 163 Etanol 95 2-5 menit Fastgreen 0,5 3 menit Etanol absolut 2-5 menit Etanol- xilol 3:1 2-5 menit Etanol- xilol 1:1 2-5 menit Etanol- xilol 3:1 2-5 menit Xilol 1 5-10 menit Xilol 2 5-10 menit 9. Penutupan: objek gelas diberi tetesan entellen dan ditutupi dengan gelas penutup. 10. Diberi label pada sisi kiri dan dikeringkan oven. 164 Lampiran 9. Komposisi larutan dan bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA, Analisis RAPD dan elektroforesis I. EkstraksiIsolasi DNA 1. Larutan CTAB 10 NaCl : 4,1 g CTAB : 10 g Larutkan dengan akuades hingga 100 ml 2. Buffer Tris-HCl 1 M pH 8.0 Tris base : 12,11 g HCl pekat : 4,2 ml Akuades : 80 ml Atur pH larutan hingga 8.0, volume total 100 ml dan sterilisasi autoklap 3. Larutan EDTA 0,5 M pH 8.0 EDTA` : 18,61 ml NaOH : 2,0 Akuades : 80 ml Atur pH larutan hingga 8.0, volume total 100 ml dan sterilisasi autoklap 4. NaCl 5 M NaCl ; 29,22 g Larutkan dengan akuades hingga volume 100 ml dan sterilisasi dengan autoklap. 5. Etanol 70 Etanol : 70 ml Akuades : 30 ml Simpan dalam lemari es 6. Isopropanol dingin 7. Buffer ekstrak Doyle Doyle, 1987 untuk 25 ml Laruran CTAB 10 : 5 ml Larutan EDTA 0,5 M pH 8.0 : 1 ml Buffer Tris-HCl 1 M pH 8.0 : 2,5 ml NaCl 5 M : 7,5 ml Akuades steril : 8,25 ml Mercaptoetanol : 0,75 ml 8. Kloroform : Isoamil alkohol 24:1 kloroform : 48 ml isoamil alkohol : 2 ml 165 9. Natrium asetat 3 M pH 5.2 10. Buffer phenol 0,2 gram – hidroquinon dalam 20 ml phenol, kloroform : isoamil alkohol 24:1 ke dua bahan dicampur dengan perbandingan 1 : 1 11. Pembuatan RNAse 10 mgml dalam Na-asetat 0,01 M pH 5.2 timbang 0,01 g Rnase SIGMA masukan ke dalam tabung 1,5 ml. tambahkan 3,3 µl Na-asetat 0,01 M pH 5,2 dan 996,7 µl H 2 O. kocok dan panaskan pada suhu 100 o C Selma 15 menit. Dinginkan pada suhu kamar dan tambahkan 100 µl 110v Tris-Cl pH 7,4 Simpan pada -20 o C.

II. RAPD berbasis PCR