161 Lampiran 8. Proses pembuatan preparat irisan paradermal dan transversal daun
manggis
a. Irisan paradermal
Irisan paradermal dibuat dalam bentuk preparat semi permanen dengan pewarnaan safranin 1 , tahapan kerja sebagai berikut :
1. daun difiksasi dalam alkohol 70 , kemudian dicuci dengan akuades. 2. daun direndam dalam larutan HNO
3
25 selama 15-30 menit dan dicuci dengan akuades.
3. epidermis disayat dengan menggunakan pisau silet, untuk menghilangkan klorofil dari mesofil yang terikat, sayatan epidermis direndam dalam larutan bayclean
selama 3 menit dan dicuci dengan akuades. 4. sayatan epidermis diwarnai dengan pewarna safranin 1 selama 3-5 menit.
5. sediaan diberi gliserin 10 dan ditutup dengan gelas penutup.
b. Irisan transversal
Sayatan transversal mengikuti metode parafin dengan menggunakan larutan seri Johansen dengan TBA sebagai dehidran, tahapan kerja sebagai berikut :
1. Daun difiksasi selama 24 jam dalam larutan FAA dengan komposisi Alkohol 70 : asam asetat glasial : Formaldehida dengan perbandingan 90 : 5 : 5.
2. Larutan fiksasi dibuang dan dicuci dengan etanol 50 sebanyak 4 kali dengan waktu penggantian mansing- masing 1 jam.
3. Dehidrasi dan penjernihan dilakukan secara bertahap dengan merendam bahan dalam larutan seri Johansen I-VII dengan komposisi sebagai berikut :
Larutan Johansen Komposisi larutan
I II
III IV
V VI
VII Air
50 30
15 -
- -
- Etanol 95
40 50
50 45
- -
- Etanol 100
- -
- -
25 -
- Tertierbutyl alkohol
10 20
35 55
75 100 50
Minyak parafin -
- -
- -
- 50
162 waktu perendaman untuk masing- masing tahap sebagai berikut :
Johansen I 2 jam, Johansen II 24 jam, Johansen III 2 jam, Johansen IV 2 jam, Johansen V 2 jam, Johansen VI 24 jam, Johansen VI 2 jam, Johansen
VII dalam botol yang berisi 13 bagian parafin beku. 4. Infiltrasi: wadah berisi material daun dan campuran TBA, minyak parafin serta 13
bagian paraffin disimpan dalam oven 58
o
C selama 12 jam dan dituang seluruh paraffin diganti dengan parafin cair baru dilakukan 3 kali penggantian setiap 6
jam dan disimpan pada suhu 58
o
C. 5. Penanaman dalam blok: menuang semua cairan paraffin ganti dengan parafin cair
murni disimpan di oven 58
o
C selama 1 jam, selanjutnya material siap diblok. 6. Penyayatan: blok yang sudah dirapikan ditempel pada holder dan disayat dengan
mikrotom putar setebal 10 ìm. 7. Perekatan: sayatan direkatkan pada gelas objek yang telah diolesi albumin gliserin
dan ditetesi air. Kemudian gelas berisi pita paraffin dipanaskan pada hot-plate dengan suhu 45
o
C selama 3-5 jam. 8. Pewarnaan dilakukan pewarnaan ganda safranin 2 dalam air dan fastgreen 0,5
dalam etanol 95 . Berturut-turut gelas objek direndam ke dalam larutan berikut:
Xilol 1 5-10 menit
Xilol 2 5-10 menit
Etanol- xilol 3:1 2-5 menit
Etanol- xilol 1:1 2-5 menit
Etanol- xilol 3:1 2-5 menit
Etanol absolut 2-5 menit
Etanol 95 2-5 menit
Etanol 70 2-5 menit
Etanol 50 2-5 menit
Etanol 30 2-5 menit Akuades
1-2 menit Safranin 2
12-24 j am Akuades
1-2 menit Etanol 30
2-5 menit Etanol 50
2-5 menit Etanol 70
2-5 menit
163 Etanol 95 2-5 menit
Fastgreen 0,5 3 menit
Etanol absolut 2-5 menit
Etanol- xilol 3:1 2-5 menit
Etanol- xilol 1:1 2-5 menit
Etanol- xilol 3:1 2-5 menit
Xilol 1 5-10 menit
Xilol 2 5-10 menit
9. Penutupan: objek gelas diberi tetesan entellen dan ditutupi dengan gelas penutup. 10. Diberi label pada sisi kiri dan dikeringkan oven.
164 Lampiran 9. Komposisi larutan dan bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA,
Analisis RAPD dan elektroforesis
I. EkstraksiIsolasi DNA
1. Larutan CTAB 10 NaCl
: 4,1 g CTAB
: 10 g Larutkan dengan akuades hingga 100 ml
2. Buffer Tris-HCl 1 M pH 8.0 Tris base : 12,11 g
HCl pekat : 4,2 ml Akuades
: 80 ml Atur pH larutan hingga 8.0, volume total 100 ml dan sterilisasi autoklap
3. Larutan EDTA 0,5 M pH 8.0 EDTA`
: 18,61 ml NaOH
: 2,0 Akuades
: 80 ml Atur pH larutan hingga 8.0, volume total 100 ml dan sterilisasi autoklap
4. NaCl 5 M NaCl
; 29,22 g Larutkan dengan akuades hingga volume 100 ml dan sterilisasi dengan autoklap.
5. Etanol 70 Etanol
: 70 ml Akuades
: 30 ml Simpan dalam lemari es
6. Isopropanol dingin 7. Buffer ekstrak Doyle Doyle, 1987 untuk 25 ml
Laruran CTAB 10
: 5 ml Larutan EDTA 0,5 M pH 8.0
: 1 ml Buffer Tris-HCl 1 M pH 8.0
: 2,5 ml NaCl 5 M
: 7,5 ml Akuades steril
: 8,25 ml Mercaptoetanol
: 0,75 ml 8. Kloroform : Isoamil alkohol 24:1
kloroform : 48 ml
isoamil alkohol : 2 ml
165 9. Natrium asetat 3 M pH 5.2
10. Buffer phenol 0,2 gram – hidroquinon dalam 20 ml phenol, kloroform : isoamil alkohol 24:1
ke dua bahan dicampur dengan perbandingan 1 : 1 11. Pembuatan RNAse 10 mgml dalam Na-asetat 0,01 M pH 5.2
timbang 0,01 g Rnase SIGMA masukan ke dalam tabung 1,5 ml. tambahkan 3,3 µl Na-asetat 0,01 M pH 5,2 dan 996,7 µl H
2
O. kocok dan panaskan pada suhu 100
o
C Selma 15 menit. Dinginkan pada suhu kamar dan tambahkan 100 µl 110v Tris-Cl pH 7,4
Simpan pada -20
o
C.
II. RAPD berbasis PCR