Optimasi Dan Analisis Kadar Campuran Amoksisilin Dan Kalium Klavulanat Dengan Metode Spektrofotometri Derivatif
OPTIMASI DAN ANALISIS KADAR CAMPURAN
AMOKSISILIN DAN KALIUM KLAVULANAT
DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI DERIVATIF
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
OLEH:
HUSNAYANI SARAGIH
NIM 111501068
PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
(2)
(3)
OPTIMASI DAN ANALISIS KADAR CAMPURAN
AMOKSISILIN DAN KALIUM KLAVULANAT
DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI DERIVATIF
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
OLEH:
HUSNAYANI SARAGIH
NIM 111501068
PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
(4)
(5)
PENGESAHAN SKRIPSI
OPTIMASI DAN ANALISIS KADAR CAMPURAN
AMOKSISILIN DAN KALIUM KLAVULANAT
DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI DERIVATIF
OLEH:
HUSNAYANI SARAGIH
NIM 111501068
Dipertahankan di Hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara
Pada Tanggal: 1 Juni 2015
Disetujui oleh : Pembimbing I,
Prof. Dr. Muchlisyam, M.Si., Apt. NIP 195006221980021001
Pembimbing II,
Prof. Dr. Siti Morin Sinaga, M.Sc., Apt. NIP 195008281976032002
Panitia Penguji,
Prof. Dr. Ginda Haro, M.Sc., Apt. NIP 195108161980031002
Dra. Siti Nurbaya, M.Si., Apt. NIP 195008261974122001
Prof. Dr. Muchlisyam, M.Si., Apt. NIP 195006221980021001
Dra. Tuty Roida Pardede, M.Si., Apt. NIP 195401101980032001
Medan, Juni 2015 Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara Wakil Dekan I,
Prof. Dr. Julia Reveny, M.Si., Apt. NIP 195807101986012001
(6)
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis haturkan kehadirat Allah SWT atas segala limpahan
rahmat dan karunia kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penelitian dan
penyusunan skripsi ini. Skripsi yang berjudul “Optimasi dan Analisis Campuran
Amoksisilin dan Kalium Klavulanat dengan Metode Spektrofotometri Derivatif”
disusun sebagai salah satu syarat mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas
Farmasi Universitas Sumatera Utara.
Pada kesempatan ini penulis hendak menyampaikan rasa hormat dan
terima kasih kepada Prof. Dr. Julia Reveny, M.Si., Apt., selaku Pembantu Dekan I
Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan fasilitas dan
masukan selama masa pendidikan dan penelitian, kepada Prof. Dr. Muchlisyam,
M.Si., Apt. dan Prof. Dr. Siti Morin Sinaga, M.Sc., Apt. selaku dosen
pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan dan arahan selama masa
penelitian dan penulisan skripsi ini berlangsung. Penulis juga menyampaikan rasa
terima kasih kepada Prof. Dr. Ginda Haro, M.Sc., Apt., Dra. Tuty Roida Pardede,
M.Si., Apt., dan Dra. Siti Nurbaya, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah
memberikan masukan dalam penyusunan skripsi ini serta kepada Prof. Dr. Ginda
Haro, M.Sc., selaku dosen penasehat akademik yang telah banyak memberikan
bimbingan selama masa pendidikan.
Penulis juga ingin menyampaikan rasa terima kasih serta penghargaan
yang tulus kepada kedua orang tua penulis yang tercinta, ayahanda Muhammad
(7)
teman-v
teman saya Nanda, Tari, Silvia, Arie, Eka, Tiwi, dan Fhatma atas doa dan
dukungan baik moril maupun materil dalam penyelesaian skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan yang terdapat dalam
skripsi ini. Untuk itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun
dari semua pihak guna perbaikan skripsi ini. Akhir kata penulis berharap semoga
skripsi ini dapat bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya dalam bidang
farmasi.
Medan, Juni 2015
Penulis,
Husnayani Saragih
(8)
vi
OPTIMASI DAN ANALISIS KADAR CAMPURAN AMOKSISILIN DAN KALIUM KLAVULANAT DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI DERIVATIF
ABSTRAK
Saat ini banyak beredar sediaan obat dengan lebih dari satu komponen zat aktif. Salah satu kombinasi yang sering digunakan adalah amoksisilin dan kalium klavulanat yang tersedia dalam bentuk sediaan tablet dan beredar dengan berbagai merek dagang. Kombinasi amoksisilin dan kalium klavulanat merupakan
kombinasi antibakteri golongan β-laktam dan penghambat β-laktamase.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengoptimasi metode analisis kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dengan menggunakan spektrofotometri derivatif dengan metode zero crossing dalam pelarut metanol.
Panjang gelombang analisis untuk menetapkan kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat pada spektrum serapan derivat kedua masing-masing pada panjang gelombang 279,20 nm dan 338,40 nm.
Penentuan linieritas kurva kalibrasi menghasilkan koefisien korelasi, r = 0,9993 dengan persamaan regresi Y = (59X + 7).10-6 untuk amoksisilin dan r = 0,9999 dengan persamaan regresi Y= (160X – 1).10-6 untuk kalium klavulanat. Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) untuk amoksisilin berturut-turut adalah 0,8608 mcg/ml dan 2,8694 mcg/ml sedangkan untuk kalium klavulanat adalah 0,0864 mcg/ml dan 0,2881 mcg/ml.
Hasil penetapan kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat yang dianalisis dalam tablet di pasaran menunjukkan bahwa semua memenuhi persyaratan sesuai dengan persyaratan yang tertera pada USP 30 dan NF 25 (2007) dan Farmakope Indonesia Edisi V (2014). Hasil uji validasi yang dilakukan terhadap tablet memenuhi persyaratan validasi metode, untuk amoksisilin diperoleh % recovery = 99,93% dengan Relative Standard Deviation
(RSD) = 1,11% dan untuk kalium klavulanat diperoleh % recovery = 99,46% dengan RSD = 0,22%. Dari hasil di atas dapat disimpulkan bahwa spektrofotometri derivatif metode zero crossing dapat digunakan untuk analisis campuran amoksisilin dan kalium klavulanat.
Kata-kata kunci : amoksisilin, kalium klavulanat, spektrofotometri derivatif, zero crossing, derivat kedua, validasi
(9)
vii
OPTIMIZATION AND DETERMINATION OF
AMOXICILLIN AND CLAVULANATE POTASSIUM MIXTURE USING DERIVATIVE SPECTROPHOTOMETRY METHOD
ABSTRACT
Nowadays many dosage form of drug which contain more than one active ingredient. One of combinations which is often used is amoxicillin and clavulanate pottasium in tablet form. The mixture of amoxicillin and clavulanate
pottasium is a combination of the β-lactam antibiotic and β-lactamase inhibitor. The purpose of this research is to optimize the method for determining amoxicillin and clavulanate pottasium mixture using derivative spectrophotometry with zero crossing method in methanol. Amoxicillin and clavulanate pottasium mixture were determined by measuring the second derivative ratio amplitudes, at 279.20 nm and at 338.40 nm respectively.
The determination of calibration curve linearity showed the correlation coefficient, r = 0.9993 with the regression Y = (59X + 7).10-6 for amoxicillin and r = 0.9999 with the regression Y = (160X – 1).10-6 for clavulanate pottasium. Limit of Detection (LOD) and Limit of Quantitation (LOQ) of amoxicillin 0.8608 mcg/ml and 2.8694 mcg/ml. LOD and LOQ of clavulanate pottasium 0.0864 mcg/ml and 0.2881 mcg/ml.
The result of determination of amoxicillin and clavulanate pottasium mixture the requirement of the thirtieth edition United States Pharmacopoeia and the twenty fifth edition National Formulary (2007) and the fifth edition of
Farmakope Indonesia (2014). The validation test of tablet showed amoxicillin has % recovery = 99.93%, Relative Standard Deviation (RSD) = 1.11% and
clavulanate pottasium has % recovery = 99.46% with RSD = 0.22%. From the result above concluded that derivative spectrophotometry with zero crossing method can be used for analyzing in determination amoxicillin and clavulanate pottasium.
Keywords : amoxicillin, clavulanate pottasium, derivative spectrophotometry, zero crossing, second order, validation
(10)
viii DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ... i
LEMBAR PENGESAHAN ... iii
KATA PENGANTAR ... iv
ABSTRAK ... vi
ABSTRACT ... vii
DAFTAR ISI ... viii
DAFTAR TABEL ... xii
DAFTAR GAMBAR ... xii
DAFTAR LAMPIRAN ... xv
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Perumusan Masalah ... 3
1.3 Hipotesis ... 3
1.4 Tujuan Penelitian ... 4
1.5 Manfaat Penelitian ... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 5
2.1 Amoksisilin dan Kalium Klavulanat ... 5
2.1.1 Amoksisilin ... 5
2.1.2 Kalium Klavulanat ... 6
2.2 Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel ... 7
(11)
ix
2.2.2 Pembagian Metode Analisis Spektrofotometri
Ultraviolet-Visibel ... 7
2.2.3 Proses Penyerapan Radiasi pada Spektrofotometer Ultraviolet-Visibel ... 7
2.2.4 Kegunaan Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel ... 10
2.2.5 Komponen Spektrofotometer Ultraviolet-Visibel ... 11
2.3 Spektrofotometri Derivatif ... 12
2.3.1 Pengertian Spektrofotometri Derivatif ... 12
2.3.2 Metode Evaluasi Spektra pada Spektrofotometri Derivatif ... 14
2.3.3 Kegunaan Spektrofotometri Derivatif ... 15
2.4 Validasi Metode ... 16
2.4.1 Akurasi ... 17
2.4.2 Presisi ... 17
2.4.3 Spesifitas ... 18
2.4.4 Batas Deteksi dan Batas Kuantifikasi ... 18
2.4.5 Linieritas ... 18
2.4.6 Rentang ... 18
BAB III METODOLOGI PENELITIAN ... 19
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ... 19
3.2 Alat ... 19
3.3 Bahan ... 19
3.4 Pengambilan Sampel ... 19
3.5 Prosedur Penelitian ... 20
3.5.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Amoksisilin ... 20
(12)
x
3.5.3 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum
Amoksisilin ... 21
3.5.4 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Kalium Klavulanat ... 21
3.5.5 Pembuatan Larutan Standar Amoksisilin ... 21
3.5.6 Pembuatan Larutan Standar Kalium Klavulanat ... 21
3.5.7 Pembuatan Spektrum Serapan ... 22
3.5.8 Pembuatan Spektrum Serapan Derivat Pertama dan Kedua ... 22
3.5.9 Penentuan Zero Crossing ... 22
3.5.10 Penentuan Panjang Gelombang Analisis ... 22
3.5.11 Pembuatan dan Penentuan Linieritas Kurva Kalibrasi Amoksisilin ... 23
3.5.12 Pembuatan dan Penentuan Linieritas Kurva Kalibrasi Kalium Klavulanat ... 24
3.5.13 Penentuan Kadar Amoksisilin dan Kalium Klavulanat dalam Sediaan Tablet ... 24
3.5.14 Uji Validasi ... 25
3.5.14.1 Uji Akurasi ... 25
3.5.14.2 Uji Presisi ... 26
3.5.15 Analisis Data Penetapan Kadar secara Statistik ... 26
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 28
4.1 Penentuan Kurva Serapan Maksimum ... 28
4.2 Penentuan Kurva Serapan ... 29
4.3 Penentuan Kurva Serapan Derivat ... 30
(13)
xi
4.3.2 Penentuan Kurva Serapan Derivat Kedua ... 30
4.4 Penentuan Zero Crossing pada Serapan Derivat ... 30
4.4.1 Penentuan Zero Crossing pada Serapan Derivat Pertama ... 30
4.4.2 Penentuan Zero Crossing pada Serapan Derivat Kedua ... 32
4.5 Penentuan Panjang Gelombang Analisis ... 33
4.6 Pembuatan dan Penentuan Linieritas Kurva Kalibrasi ... 40
4.7 Penentuan Kadar Amoksisilin dan Kalium Klavulanat dalam Sediaan Tablet ... 41
4.8 Uji Validasi ... 42
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 45
5.1 Kesimpulan ... 45
5.2 Saran ... 45
DAFTAR PUSTAKA ... 46
(14)
xii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1 Perbandingan antara transisi n→π* dan transisiπ→π* ... 10 Tabel 4.2 Data hasil serapan amoksisilin, kalium klavulanat, dan
campuran amoksisilin dan kalium klavulanat pada derivat kedua ... 40
Tabel 4.3 Data hasil perhitungan kadar obat setelah dilakukan uji statistik ... 41
Tabel 4.4 Data hasil pengujian perolehan kembali amoksisilin dan kalium klavulanat dengan metode penambahan baku (standard addition methode) pada tablet dagang Claneksi® .. 44
(15)
xiii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Rumus struktur amoksisilin ... 5
Gambar 2. Rumus struktur kalium klavulanat ... 6
Gambar 3. Spektrum serapan normal sampai derivat keempat ... 13
Gambar 4. Kurva aplikasi metode evaluasi spektrum derivatif ... 14
Gambar 5. Kurva sederhana aplikasi zero crossing ... 15
Gambar 6. Kurva serapan amoksisilin 18 mcg/ml ... 28
Gambar 7. Kurva serapan kalium klavulanat 100 mcg/ml ... 28
Gambar 8. Kurva tumpang tindih serapan maksimum amoksisilin dan kalium klavulanat ... 29
Gambar 9. Kurva tumpang tindih serapan amoksisilin ... 29
Gambar 10. Kurva tumpang tindih serapan kalium klavulanat ... 30
Gambar 11. Zero crossing amoksisilin pada serapan derivat pertama .. 31
Gambar 12. Zero crossing kalium klavulanat pada serapan derivat pertama ... 31
Gambar 13. Zero crossing amoksisilin pada serapan derivat kedua ... 32
Gambar 14. Zero crossing kalium klavulanat pada serapan derivat kedua ... 33
Gambar 15. Kurva tumpang tindih serapan amoksisilin dan kalium klavulanat ... 34
Gambar 16. Kurva tumpang tindih serapan amoksisilin, kalium klavulanat, dan campuran amoksisilin dan kalium klavulanat ... 35
Gambar 17. Kurva tumpang tindih serapan derivat pertama amoksisilin dan kalium klavulanat ... 35
(16)
xiv
Gambar 18. Kurva tumpang tindih serapan derivat pertama amoksisilin, kalium klavulanat, dan campuran
amoksisilin dan kalium klavulanat ... 36
Gambar 19. Kurva tumpang tindihserapan derivat kedua amoksisilin dan kalium klavulanat ... 36
Gambar 20. Kurva tumpang tindihserapan derivat kedua amoksisilin, kalium klavulanat, dan campuran amoksisilin dan kalium klavulanat ... 37
Gambar 21. Zero crossing amoksisilin ... 37
Gambar 22. Zero crossing kalium klavulanat ... 38
Gambar 23. Panjang gelombang analisis untuk amoksisilin ... 38
(17)
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran1. Kurva Serapan Amoksisilin dan Kalium Klavulanat pada
Derivat Pertama ... 49
Lampiran 2. Kurva tumpang tindih Amoksisilin dan Kalium Klavulanat pada Derivat Kedua ... 50
Lampiran 3. Kurva Serapan Penentuan Panjang Gelombang Analisis .. 51
Lampiran 4. Kurva Kalibrasi Amoksisilin dan Kalium Klavulanat ... 53
Lampiran 5. Perhitungan Regresi Kalibrasi Amoksisilin ... 54
Lampiran 6. Perhitungan Batas Deteksi/Limit of Detection (LOD) dan Batas Kuantitasi/Limit of Quantitation (LOQ) Amoksisilin ... 55
Lampiran 7. Perhitungan Regresi Kalibrasi Kalium Klavulanat ... 56
Lampiran 8. Perhitungan Batas Deteksi/Limit of Detection (LOD) dan Batas Kuantitasi/Limit of Quantitation (LOQ) Kalium Klavulanat ... 57
Lampiran 9. Contoh Perhitungan Penetapan Kadar Amoksisilin dan Kalium Klavulanat ... 58
Lampiran 10. Kurva Serapan Penetapan Kadar Tablet Coamoxiclav® ... 60
Lampiran 11. Kurva Serapan Penetapan Kadar Tablet Claneksi® ... 63
Lampiran 12. Kurva Serapan Penetapan Kadar Tablet Augmentin® ... 66
Lampiran 13. Data Kadar Amoksisilin dalam Tablet ... 69
Lampiran 14. Data Kadar Kalium Klavulanat dalam Tablet ... 70
Lampiran 15. Perhitungan Statistik Amoksisilin pada Tablet Coamoxiclav® ... 71
Lampiran 16. Perhitungan Statistik Kalium Klavulanat pada Tablet Coamoxiclav® ... 73
(18)
xvi
Lampiran 18. Perhitungan Statistik Kalium Klavulanat pada Tablet
Claneksi® ... 77
Lampiran 19. Perhitungan Statistik Amoksisilin pada Tablet
Augmentin® ... 79
Lampiran 20. Perhitungan Statistik Kalium Klavulanat pada Tablet
Augmentin® ... 81
Lampiran 21. Contoh Perhitungan Persentase Perolehan Kembali
(%Recovery) ... 83
Lampiran 22. Kurva Serapan Claneksi® pada Uji Perolehan Kembali .... 88
Lampiran 23. Data Hasil Persen Perolehan Kembali Amoksisilin pada Tablet Dagang Claneksi® dengan Metode Penambahan
Baku (Standard Addition Methode) ... 93
Lampiran 24. Data Hasil Persen Perolehan Kembali Kalium Klavulanat pada Tablet Dagang Claneksi® dengan Metode
Penambahan Baku (Standard Addition Methode) ... 94
Lampiran 25. Perhitungan Rata-rata, Standar Deviasi, dan Relatif Standar Deviasi Perolehan Kembali Amoksisilin pada
Tablet Claneksi® ... 95
Lampiran 26. Perhitungan Rata-rata, Standar Deviasi, dan Relatif Standar Deviasi Perolehan Kembali Kalium Klavulanat
pada Tablet Claneksi® ... 96
Lampiran 27. Daftar Distribusi Nilai T ... 97
Lampiran 28. Sertifikat Bahan Baku Amoksisilin BPFI dan Kalium
Klavulanat (Phiexia Company) ... 98
Lampiran 29. Daftar Sertifikasi Sampel ... 100
(19)
vi
OPTIMASI DAN ANALISIS KADAR CAMPURAN AMOKSISILIN DAN KALIUM KLAVULANAT DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI DERIVATIF
ABSTRAK
Saat ini banyak beredar sediaan obat dengan lebih dari satu komponen zat aktif. Salah satu kombinasi yang sering digunakan adalah amoksisilin dan kalium klavulanat yang tersedia dalam bentuk sediaan tablet dan beredar dengan berbagai merek dagang. Kombinasi amoksisilin dan kalium klavulanat merupakan
kombinasi antibakteri golongan β-laktam dan penghambat β-laktamase.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengoptimasi metode analisis kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dengan menggunakan spektrofotometri derivatif dengan metode zero crossing dalam pelarut metanol.
Panjang gelombang analisis untuk menetapkan kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat pada spektrum serapan derivat kedua masing-masing pada panjang gelombang 279,20 nm dan 338,40 nm.
Penentuan linieritas kurva kalibrasi menghasilkan koefisien korelasi, r = 0,9993 dengan persamaan regresi Y = (59X + 7).10-6 untuk amoksisilin dan r = 0,9999 dengan persamaan regresi Y= (160X – 1).10-6 untuk kalium klavulanat. Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) untuk amoksisilin berturut-turut adalah 0,8608 mcg/ml dan 2,8694 mcg/ml sedangkan untuk kalium klavulanat adalah 0,0864 mcg/ml dan 0,2881 mcg/ml.
Hasil penetapan kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat yang dianalisis dalam tablet di pasaran menunjukkan bahwa semua memenuhi persyaratan sesuai dengan persyaratan yang tertera pada USP 30 dan NF 25 (2007) dan Farmakope Indonesia Edisi V (2014). Hasil uji validasi yang dilakukan terhadap tablet memenuhi persyaratan validasi metode, untuk amoksisilin diperoleh % recovery = 99,93% dengan Relative Standard Deviation
(RSD) = 1,11% dan untuk kalium klavulanat diperoleh % recovery = 99,46% dengan RSD = 0,22%. Dari hasil di atas dapat disimpulkan bahwa spektrofotometri derivatif metode zero crossing dapat digunakan untuk analisis campuran amoksisilin dan kalium klavulanat.
Kata-kata kunci : amoksisilin, kalium klavulanat, spektrofotometri derivatif, zero crossing, derivat kedua, validasi
(20)
vii
OPTIMIZATION AND DETERMINATION OF
AMOXICILLIN AND CLAVULANATE POTASSIUM MIXTURE USING DERIVATIVE SPECTROPHOTOMETRY METHOD
ABSTRACT
Nowadays many dosage form of drug which contain more than one active ingredient. One of combinations which is often used is amoxicillin and clavulanate pottasium in tablet form. The mixture of amoxicillin and clavulanate
pottasium is a combination of the β-lactam antibiotic and β-lactamase inhibitor. The purpose of this research is to optimize the method for determining amoxicillin and clavulanate pottasium mixture using derivative spectrophotometry with zero crossing method in methanol. Amoxicillin and clavulanate pottasium mixture were determined by measuring the second derivative ratio amplitudes, at 279.20 nm and at 338.40 nm respectively.
The determination of calibration curve linearity showed the correlation coefficient, r = 0.9993 with the regression Y = (59X + 7).10-6 for amoxicillin and r = 0.9999 with the regression Y = (160X – 1).10-6 for clavulanate pottasium. Limit of Detection (LOD) and Limit of Quantitation (LOQ) of amoxicillin 0.8608 mcg/ml and 2.8694 mcg/ml. LOD and LOQ of clavulanate pottasium 0.0864 mcg/ml and 0.2881 mcg/ml.
The result of determination of amoxicillin and clavulanate pottasium mixture the requirement of the thirtieth edition United States Pharmacopoeia and the twenty fifth edition National Formulary (2007) and the fifth edition of
Farmakope Indonesia (2014). The validation test of tablet showed amoxicillin has % recovery = 99.93%, Relative Standard Deviation (RSD) = 1.11% and
clavulanate pottasium has % recovery = 99.46% with RSD = 0.22%. From the result above concluded that derivative spectrophotometry with zero crossing method can be used for analyzing in determination amoxicillin and clavulanate pottasium.
Keywords : amoxicillin, clavulanate pottasium, derivative spectrophotometry, zero crossing, second order, validation
(21)
1 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Kombinasi amoksisilin dan asam klavulanat merupakan kombinasi
antibakteri yang terdiri dari senyawa turunan β-laktam dan penghambat
β-laktamase. Kombinasi ini diberikan untuk mengatasi bakteri yang dapat
merusak β-laktam (penghasil β-laktamase). Asam klavulanat biasanya diberikan dalam bentuk garamnya yaitu kalium klavulanat bila diberikan secara oral
(Sweetman, 2009).
Kondisi optimum pada penentuan kadar amoksisilin dengan metode
kromatografi cair kinerja tinggi dan dideteksi oleh spektrofotometer ultraviolet
pada panjang gelombang 230 nm diperoleh dengan perbandingan pelarut dapar
posfat pH 5-asetonitril (96:4) (Harianto, dkk., 2006).
Campuran amoksisilin dan kalium klavulanat yang telah ditentukan
kadarnya dengan metode spektrofotometri ultraviolet nonderivatif dan derivatif
dengan menggunakan pelarut air diperoleh pada derivatif pertama pada panjang
gelombang masing-masing 244,9 nm dan 272 nm (Huong dan Hoang, 2009).
Menurut penelitian yang dilakukan Martina (2010), hasil optimasi pelarut
campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dengan menggunakan metode
kromatografi cair kinerja tinggi dan dideteksi oleh spektrofotometer ultraviolet
pada panjang gelombang 220 nm diperoleh dengan perbandingan dapar posfat
pH-4,4-metanol (91:9). Penggunaan kromatografi cair kinerja tinggi ini
membutuhkan waktu analisis yang lama dan biaya yang relatif mahal sehingga
(22)
2
dan biaya dengan variabel pelarut dan panjang gelombang deteksi
(Rohman, 2007).
Metode spektrofotometri derivatif adalah salah satu metode
spektrofotometri yang dapat digunakan untuk analisis campuran beberapa zat
secara langsung tanpa harus melakukan pemisahan terlebih dahulu walaupun
dengan panjang gelombang yang berdekatan. Fasilitas ini memungkinkan analisis
multikomponen dalam campuran yang spektranya saling tumpang tindih
(Nurhidayati, 2007).
Metode zero crossing adalah prosedur yang paling umum untuk menentukan
campuran biner yang spektranya saling tumpang tindih. Metode zero crossing
dapat digunakan pada derivatif pertama dan kedua dengan pemilihan panjang
gelombang untuk pengukuran (Nurhidayati, 2007).
Beberapa keuntungan dari spektrum derivatif antara lain spektrum derivatif
memberikan gambaran struktur yang terinci dari spektrum serapan dan gambaran
ini makin jelas dari spektra derivatif pertama ke derivatif keempat. Selain itu,
dapat dilakukan analisis kuantitatif suatu komponen dalam campuran dengan
bahan yang panjang gelombangnya saling berdekatan. Bila dibandingkan dengan
kromatografi cair kinerja tinggi, metode spektrofotometri derivatif relatif lebih
sederhana, alat dan biaya operasionalnya relatif lebih murah dan waktu
analisisnya lebih cepat (Nurhidayati, 2007).
Metode spektrofotometri derivatif telah diaplikasikan secara luas di dalam
kimia analisis kuantitatif, farmasetik, klinik, forensik, biomedik, dan industri
(Skujins dan Varian, 2006). Beberapa contoh aplikasinya antara lain penetapan
(23)
3
2011), penetapan kadar amoksisilin dan kloksasilin dalam kapsul (Giang Do dan
Hoang Vu, 2010), analisis kadar benzofenon dan fenitoin dalam tablet (Walash,
dkk., 2011), dan penetapan kadar campuran triprolidina hidroklorida dan
pseudoefedrina hidroklorida dalam tablet (Hayun, dkk., 2006).
Berdasarkan hal tersebut, penulis tertarik untuk melakukan optimasi
spektrofotometri derivatif dengan metode zero crossing dalam pelarut metanol
dalam penetapan kadar amoksisilin dan kalium klavulanat dalam tablet.
1.2 Perumusan Masalah
1. Apakah pelarut metanol dapat digunakan untuk analisis kadar campuran
amoksisilin dan kalium klavulanat dengan menggunakan spektrofotometri
derivatif pada panjang gelombang zero crossing ?
2. Apakah kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dalam sediaan
tablet yang ditetapkan dengan metode spektrofotometri derivatif pada
panjang gelombang zero crossing memenuhi persyaratan kadar yang
ditetapkan USP 30 dan NF 25 (2007) dan Farmakope Indonesia Edisi V
(2014) ?
3. Apakah metode spektrofotometri derivatif yang digunakan memenuhi
persyaratan validasi metode ?
1.3 Hipotesis
1. Pelarut metanol dapat digunakan untuk analisis kadar campuran
amoksisilin dan kalium klavulanat dengan menggunakan spektrofotometri
(24)
4
2. Kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dalam sediaan tablet
yang ditetapkan menggunakan spektrofotometri derivatif pada panjang
gelombang zero crossing memenuhi persyaratan USP 30 dan NF 25
(2007) dan Farmakope Indonesia Edisi V (2014).
3. Metode yang digunakan memenuhi persyaratan validasi metode.
1.4 Tujuan Penelitian
1. Melakukan analisis kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat
dengan pelarut metanol menggunakan spektrofotometri derivatif pada
panjang gelombang zero crossing.
2. Membandingkan hasil yang diperoleh pada penetapan kadar campuran
amoksisilin dan kalium klavulanat mengunakan spektrofotometri derivatif
pada panjang gelombang zero crossing dengan persyaratan USP 30 dan
NF 25 (2007) dan Farmakope Indonesia Edisi V (2014).
3. Melakukan uji validasi terhadap metode spektrofotometri derivatif yang
digunakan.
1.5 Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian adalah untuk memperoleh panjang gelombang zero
crossing dalam menetapkan kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat
dalam sediaan tablet menggunakan spektrofotometri derivatif yang dapat
(25)
5 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Amoksisilin dan Kalium Klavulanat
Amoksisilin dan kalium klavulanat merupakan kombinasi antibakteri oral
yang terdiri dari senyawa turunan β-laktam dan penghambat β-laktamase (Bebrone, dkk., 2010). Kalium klavulanat melindungi amoksisilin agar tidak
terhidrolisis oleh enzim β-laktamase sehingga dapat mengatasi kerja amoksisilin (Sweetman, 2009).
Kombinasi amoksisilin dan kalium klavulanat dapat digunakan untuk
mengatasi infeksi pada saluran pernafasan seperti sinusitis, bronkopneumonia,
faringolaringitis, dan tonsilitis (Kuroki, dkk., 2013; Wald, dkk., 2008). Selain itu
juga dapat digunakan untuk membantu dalam mengobati otitis media akut, ulkus
peptik, infeksi saluran kemih, dan lain-lain (Casey, dkk., 2012; Sweetman, 2009).
Kombinasi amoksisilin dan kalium klavulanat dapat menimbulkan gangguan
fungsi hati seperti hepatitis serta gangguan saluran cerna seperti mual, muntah,
nyeri perut, dan diare (Sweetman, 2009).
2.1.1 Amoksisilin
(26)
6
Amoksisilin memiliki rumus molekul C16H19N3O5S.3H2O dengan berat
molekul 419,45. Pemeriannya berupa serbuk hablur, putih, praktis tidak berbau,
stabil pada pH 3,5-6,0. Senyawa ini sukar larut dalam air dan metanol, tidak larut
dalam benzena, dalam karbon tetraklorida, dan dalam kloroform (Ditjen BKAK,
2014; USP 30 dan NF 25, 2007).
Amoksisilin merupakan turunan penisilin berspektrum luas yang bekerja
dengan menghambat biosintesis dinding sel (Mutschler, 1986). Amoksisilin
digunakan untuk mengatasi berbagai infeksi pada saluran pernafasan, saluran
cerna, dan saluran kemih (Sweetman, 2009).
2.1.2 Kalium Klavulanat
Gambar 2. Rumus Struktur Kalium Klavulanat (USP 30 dan NF 25, 2007)
Kalium klavulanat memiliki rumus molekul C8H8KNO5 dengan berat
molekul 237,25. Pemeriannya berupa serbuk putih, berasa pahit, stabil pada pada
pH 5,5-8. Senyawa ini mudah larut dalam alkohol dan air (Ditjen BKAK, 2014;
Gelone dan O’Donnel, 2005; USP 30 dan NF 25, 2007).
Kalium klavulanat merupakan bentuk garam dari asam klavulanat. Asam
klavulanat mempunyai kerja antimikroba yang sangat lemah, tetapi dapat
(27)
7
gram negatif dengan mengikat pusat aktif enzim tersebut. Oleh karena itu,
senyawa ini digunakan dalam kombinasi bersama antibiotik β-laktam yang tidak stabil terhadap β-laktamase (Mutschler, 1986; Sweetman, 2009).
2.2 Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel
2.2.1 Pengertian Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel
Spekrofotometri ultraviolet-visibel merupakan salah satu teknik analisis
spektrofotometri yang menggunakan sumber radiasi elektromagnetik sinar
ultraviolet dan sinar tampak dengan memakai instrumen spektrofotometer
(Rohman, 2007). Sinar ultraviolet memiliki panjang gelombang antara
200-400 nm sedangkan sinar tampak memiliki panjang gelombang antara
400-800 nm (Moffat, dkk., 2005).
2.2.2 Pembagian Metode Analisis Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel
Spektrofotometri ultraviolet-visibel dibagi atas empat metode analisis yaitu
analisis zat tunggal, analisis multikomponen, spektrofotometri perbedaan
(Difference Spectrophotometry), dan spektrofotometri derivatif
(Moffat, dkk., 2005).
2.2.3 Proses Penyerapan Radiasi pada Spektrofotometer Ultraviolet-Visibel Radiasi di daerah ultraviolet atau visibel diserap melalui eksitasi elektron
yang terlibat dalan ikatan antara atom-atom pembentuk molekul (Rohman, 2007;
Watson, 2005).
Jika suatu berkas radiasi dikenakan pada larutan sampel maka intensitas
sinar radiasi yang diteruskan dapat diukur besarnya. Radiasi yang diserap oleh
cuplikan ditentukan dengan membandingkan intensitas sinar yang diteruskan
(28)
8
dapat terjadi jika radiasi yang mengenai larutan sampel memiliki energi yang
sama dengan energi yang dibutuhkan untuk menyebabkan perubahan energi.
Kekuatan radiasi juga mengalami penurunan dengan adanya penghamburan dan
pemantulan cahaya, akan tetapi penurunan hal ini sangat kecil dibandingkan
dengan proses penyerapan (Rohman, 2007).
Sinar ultraviolet dan sinar tampak (visibel) memberikan energi yang cukup
untuk terjadinya transisi elektron (Rohman, 2007). Elektron yang energinya
tertinggi dalam molekul, berada dalam tingkat energi elektron dasar, terdapat
dalam orbital δ, π, atau n, masing-masing mempunyai keadaan tereksitasi sesuai dengan energi elektron terendah. Transisi elektron yang terkait dengan absorbsi
radiasi ultraviolet dan sinar tampak adalah δ→δ*, n→δ*, n→π*, dan π→π*
(Satiadarma, dkk., 2004).
Penyerapan radiasi ultraviolet dan sinar tampak dibatasi oleh sejumlah
gugus fungsional (yang disebut dengan kromofor) yang mengandung elektron
valensi dengan tingkat energi eksitasi yang relatif rendah. Elektron yang terlibat
pada penyerapan radiasi ultraviolet dan visibel ini ada tiga, yaitu elektron sigma,
elektron phi, dan elektron bukan ikatan (non bonding electron) (Rohman, 2007).
Menurut Rohman (2007), transisi-transisi elektronik yang terjadi di antara
tingkat-tingkat energi di dalam suatu molekul ada empat yaitu transisi δ→δ*, transisi n→δ*, transisi n→π*, dan transisi π→π*. Berikut akan diuraikan keempat jenis transisi :
(29)
9 1. Transisi δ→δ*
Energi yang diperlukan untuk transisi ini besarnya sesuai dengan energi
sinar yang frekuensinya terletak di antara ultraviolet vakum (kurang dari 180 nm).
Jenis transisi ini terjadi pada daerah ultraviolet vakum sehingga kurang begitu
bermanfaat untuk analisis dengan cara spektrofotometri ultraviolet-visibel.
2. Transisi n→δ*
Jenis transisi ini terjadi pada senyawa organik jenuh yang mengandung
atom-atom yang memiliki elektron bukan ikatan (elektron n). Energi yang
diperlukan untuk transisi jenis ini lebih kecil dibandingkan transisi δ→δ*
sehingga sinar yang diserap pun mempunyai panjang gelombang lebih panjang,
yakni sekitar 150-250 nm. Kebanyakan transisi ini terjadi pada panjang
gelombang kurang dari 200 nm.
3. Transisi n→π* dan transisi π→π*
Untuk memungkinkan terjadinya transisi ini, maka molekul organik harus
mempunyai gugus fungsional yang tidak jenuh sehingga ikatan rangkap dalam
gugus tersebut memberikan orbital phi yang diperlukan. Jenis transisi ini
merupakan transisi yang paling cocok untuk analisis sebab dengan panjang
gelombang 200-700 nm, dan panjang gelombang ini secara teknis dapat
diaplikasikan pada spektrofotometer ultraviolet-visibel. Perbedaan antara transisi
(30)
10
Tabel 1. Perbedaan antara transisi n→π* dan transisi π→π*
Transisi n→π* Transisi π→π*
Absorptivitas molar (ε) antara
10-100 Lcm-1mol-1
Absorptivitas molar (ε) antara 1000-10000 Lcm-1mol-1
Biasanya pelarut yang polar
menyebabkan pergeseran biru atau
hypsocromic shift (pergeseran pita
serapan ke arah panjang gelombang
yang lebih pendek)
Biasanya pelarut yang polar
menyebabkan pergeseran merah atau
bathocromic shift (pergeseran pita
serapan ke arah panjang gelombang
yang lebih panjang)
2.2.3 Kegunaan Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel
Data spektrum ultraviolet-visibel secara tersendiri tidak dapat digunakan
untuk identifikasi kualitatif obat karena rentang daerah radiasi yang relatif sempit
hanya dapat menghasilkan sedikit sekali puncak absorbsi maksimum dan
minimum. Akan tetapi jika digabung dengan cara lain seperti spektrofotometri
inframerah, resonansi magnet inti, dan spektrometri massa, maka dapat digunakan
untuk maksud identifikasi kualitatif suatu senyawa tersebut. Penggunaannya
terbatas pada konfirmasi identitas dengan menggunakan parameter panjang
gelombang maksimum, nilai absorptivitas, nilai absorptivitas molar, nilai
koefisien ekstingsi yang khas untuk senyawa yang dilarutkan dalam suatu pelarut
tertentu (Satiadarma, dkk., 2004; Rohman, 2007).
Kegunaan utama spektrofotometri ultraviolet-visibel adalah analisis
kuantitatif (Satiadarma, dkk., 2004). Beberapa kegunaannya dalam analisis
(31)
11
penetapan kadar tablet levofloksasin (Desai, dkk., 2011), penetapan kadar
ranitidin hidroklorida (Basavaiah dan Nagegowda, 2004), dan penetapan kadar
tablet kombinasi parasetamol, fenileprin, dan klorfeniramin (Khoshayand, dkk.,
2010).
Menurut Rohman (2007), Hukum Lambert-Beer menjadi dasar aspek
kuantitatif spektrofotometri ultraviolet-visibel. Menurut Hukum Lambert-Beer,
serapan berbanding lurus terhadap konsentrasi dan ketebalan sel, yang dapat
ditulis dengan persamaan :
A = a.b.c (g/liter) atau A = ε. b. c (mol/liter) atau A = A1
1.b.c (g/100 ml) Dimana:
A = serapan
a = absorptivitas
b = ketebalan sel
c = konsentrasi
ε = absorptivitas molar
A11= absorptivitas spesifik
2.2.4 Komponen Spektrofotometer Ultraviolet-Visibel
Biasanya spektrofotometer telah mempunyai software untuk mengolah data
yang dapat dioperasikan melalui komputer yang telah terhubung dengan
spektrofotometer (Moffat, dkk., 2005).
Menurut Satiadarma, dkk., (2004) dan Rohman (2007), komponen
spektrofotometer UV-Vis adalah sebagai berikut:
1. Sumber-sumber lampu: lampu deuterium digunakan untuk daerah UV pada
panjang gelombang dari 190-350 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau
lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel pada panjang gelombang antara
(32)
12
2. Monokromotor: digunakan untuk memperoleh sumber sinar yang
monokromatis.
3. Optik-optik: dapat didesain untuk memecah sumber sinar melewati 2
kompartemen.
4. Detektor: digunakan sebagai alat yang menerima sinyal dalam bentuk radiasi
elektromagnetik, mengubah, dan meneruskannya dalam bentuk sinyal listrik ke
rangkaian sistem penguat elektronika. Respon tiap jenis detektor terhadap
bagian dari spektrum radiasi tidak sama, sehingga setiap spektrofotometer
menggunakan detektor yang paling cocok untuk daerah pengukurannya.
2.3 Spektrofotometri Derivatif
2.3.1 Pengertian Spektrofotometri Derivatif
Spektrofotometri derivatif merupakan transformasi spektrum serapan
menjadi spektrum derivatif pertama, kedua, atau spektrum derivatif orde lebih
tinggi (Ditjen POM, 1995). Spektrofotometri derivatif merupakan metode
manipulatif terhadap spektrum pada spektrofotometri ultraviolet-visibel
(Moffat, dkk., 2005).
Menurut Moffat, dkk., (2005), pada spektrofotometri konvensional,
spektrum serapan merupakan plot serapan (A) terhadap panjang gelombang (λ).
Pada spektrofotometri derivatif, plot A lawan λ, ditransformasikan menjadi plot
dA/dλ lawan λ untuk derivatif pertama, dan d2A/ dλ2 lawan λ untuk derivatif kedua, dan seterusnya.
A = f(λ), order nol
dA/dλ = f′(λ), order pertama
(33)
13
Gambar 3. Spektrum serapan normal sampai derivat keempat (Talsky, 1994)
Gambar (a) menunjukkan spektrum serapan normal yang diderivatisasi
sampai spektrum derivat keempatnya, sedangkan Gambar (b) menunjukkan
spektrum yang saling tumpang tindih yang diderivatisasi mulai dari spektrum
serapan normal hingga spektrum derivat keempat (Talsky, 1994).
Menurut Talsky (1994), spektrum derivatif merupakan sebuah plot
perubahan serapan dengan panjang gelombang. Spektrum derivatif pertama
dilambangkan dengan dA/dλ, spektrum derivatif kedua dilambangkan dengan dA2/dλ2, dan seterusnya (Ditjen POM, 1995). Hal ini dapat dilihat dari persamaan menurut hukum Lambert-Beer berikut ini :
dA/dλ =
bc x d cm dA λ ) 1 %, 1 (
dA2/dλ2 =
bc x d cm A d 2 2 ) 1 %, 1 ( λ
dn =
bc x d cm A d n n λ ) 1 %, 1 (
(34)
14
2.3.2 Metode Evaluasi Spektra pada Spektrofotometri Derivatif
Ada empat metode umum yang digunakan untuk evaluasi spektra pada
spektrofotometri derivatif yaitu metode peak-peak, metode peak-tangent, metode
peak-zero (zero crossing), metode peak-peak ratio (rasio spektra) (Talsky, 1994;
Nurhidayati, 2007).
Pada metode peak-peak, absorbsinya diukur dari puncak maksimum sampai
minimum yang ditunjukkan P1, P2, dan P3 pada gambar (a) sedangkan pada
metode peak-tangent, absorbsinya diukur dari puncak maksimum sampai
pertengahan puncak minimum yang dapat ditunjukkan pada t1, t2, dan t3 pada
gambar (b). Pada metode peak-zero, absorbsinya diukur dari puncak maksimum
sampai titik nol kurva yang ditunjukkan pada z1, z2, z3, z4, dan z5 pada gambar (c)
sedangkan pada metode peak-peak ratio, absorbsinya diukur sebagai
perbandingan antara P1 dengan P2 yang ditunjukkan pada gambar (d) (Talsky,
1994). Kurva aplikasi metode evaluasi spektra derivatif dapat dilihat pada
gambar 4.
Gambar 4. Kurva aplikasi metode evaluasi spektra derivatif (Talsky, 1994) (a) Kurva aplikasi metode peak-peak (b) Kurva aplikasi metode peak-tangent
(35)
15
Metode zero crossing merupakan metode yang paling umum digunakan
dalam pemilihan panjang gelombang analisis untuk campuran biner (Aziz, 2006).
Panjang gelombang zero crossing adalah panjang gelombang dimana senyawa
tersebut mempunyai serapan nol dan menjadi panjang gelombang analisis untuk
zat lain dalam campurannya. Pengukuran pada metode zero crossing tiap
komponen dalam campuran merupakan fungsi tunggal konsentrasi dari yang
lainnya (Nurhidayati, 2007). Kurva sederhana aplikasi zero crossing dapat dilihat
pada Gambar 5.
Gambar 5. Kurva sederhana aplikasi zero crossing (Talsky, 1994)
2.3.3 Kegunaan Spektrofotometri Derivatif
Metode spektrofotometri derivatif dapat digunakan untuk analisis
kuantitatif zat dalam campuran yang spektrumnya mungkin tersembunyi dalam
suatu bentuk spektrum besar yang saling tumpang tindih dengan mengabaikan
proses pemisahan zat yang bertingkat-tingkat (Nurhidayati, 2007).
Dalam bidang farmasi, karena terkait terapi, penetapan kadar obat adalah
kontrol kualitas pada industri farmasi. Metode spektrofotometri derivatif adalah
teknik analisis dengan kemampuan memisahkan campuran obat yang memiliki
(36)
16 2.4.Validasi metode
Validasi metode adalah suatu proses yang menunjukkan bahwa prosedur
analitik telah sesuai dengan penggunaan yang dikehendaki. Proses validasi
metode untuk prosedur analitik dimulai dengan pengumpulan data validasi oleh
pelaksana guna mendukung prosedur analitiknya (Bliesner, 2006). Validasi
metode yang sempurna hanya dapat terjadi jika metode tersebut sudah
dikembangkan dan sudah dioptimasi (Rohman, 2007).
Hasil validasi metode dapat digunakan untuk memutuskan kualitas,
reabilitas, dan konsistensi dari hasil analisis (Huber, 2007). Adapun karakteristik
dalam validasi metode menurut USP 30 dan NF 25 (2007) yaitu akurasi, presisi,
spesifisitas, batas deteksi, batas kuantitasi, linieritas, rentang, dan
kekuatan/ketahanan.
2.4.1 Akurasi
Akurasi adalah kedekatan nilai hasil uji yang diperoleh melalui metode
analisis dengan nilai yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan dengan persen
perolehan kembali (% recovery). Akurasi dapat ditentukan dengan dua metode,
yaitu spiked-placebo recovery atau metode simulasi dan standard addition method
(metode penambahan baku). Pada metode spiked-placebo recovery, analit murni
ditambahkan (spiked) ke dalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi, lalu
campuran tersebut dianalisis dan jumlah analit yang dianalisis dibandingkan
dengan jumlah analit yang telah diketahui konsentrasinya dapat ditambahkan
langsung ke dalam sediaan farmasi. Metode ini dinamakan metode penambahan
baku atau standard addition method (USP 30 dan NF 25, 2007; Ermer dan
(37)
17
Menurut Harmita (2004), dalam metode penambahan baku, sejumlah
sampel yang dianalisis ditambah analit dengan konsentrasi biasanya 80% sampai
120% dari kadar analit yang diperkirakan, dicampur, dan dianalisis kembali.
Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya. Dalam kedua
metode tersebut, persen perolehan kembali dinyatakan sebagai rasio antara hasil
yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya.
2.4.2 Presisi
Presisi adalah ukuran keterulangan metode analisis, termasuk di antaranya
kemampuan instrumen dalam melakukan hasil analisis yang reprodusibel. Presisi
dinyatakan sebagai standar deviasi relatif.Berdasarkan rekomendasi ICH (the
International Conference on the Harmonisation), karakteristik presisi ada tiga
tingkatan, yaitu keterulangan (repeatability), presisi antara (intermediate
precision), dan reprodusibilitas (reproducibility). Keterulangan dilakukan dengan
cara menganalisis sampel yang sama oleh analis yang sama menggunakan
instrumen yang sama dalam periode waktu yang singkat. Presisi antara dikerjakan
oleh analis yang berbeda sedangkan reprodusibilitas dikerjakan oleh analis yang
berbeda dan di laboratorium yang berbeda (USP 30 dan NF 25, 2007;
Satiadarma, dkk., 2004).
2.4.3 Spesifisitas
Spesifitas adalah suatu ukuran seberapa mampu metode tersebut mengukur
analit saja dengan adanya senyawa-senyawa lain yang terkandung di dalam
sampel (Watson, 2005). Secara umum, spesifitas dapat ditunjukkan oleh
minimalnya gangguan oleh senyawa lain terhadap hasil analisis misalnya
(38)
18
Pendekatan tidak langsung adalah lewat pengamatan karakteristik akurasi dari
metode tersebut. Bila akurasi metode telah dapat diterima maka metode tersebut
otomatis telah masuk kriteria sebagai metode yang spesifik (Ermer dan
McB. Miller, 2005).
2.4.4 Batas Deteksi dan Batas Kuantifikasi
Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam
sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak dapat dikuantifikasi. Batas
deteksi merupakan batas uji yang spesifik menyatakan apakah analit di atas atau
dibawah nilai tertentu (Rohman, 2007).
Batas Kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam
sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima
pada kondisi operasional metode yang digunakan (Rohman, 2007).
2.4.5 Linieritas
Linieritas adalah kemampuan suatu metode untuk memperoleh nilai hasil uji
langsung atau setelah diolah secara matematika proporsional dengan konsentrasi
analit dalam sampel dalam batas rentang konsentrasi tertentu
(Satiadarma, dkk., 2004). Linieritas dapat ditentukan secara langsung dengan
pengukuran analit pada konsentrasi sekurang-kurangnya lima titik konsentrasi
yang mencakup seluruh rentang konsentrasi kerja (Ermer dan McB. Miller, 2005).
2.4.6 Rentang
Rentang adalah interval antara batas konsentrasi tertinggi dan terendah
analit yang terbukti dapat ditentukan menggunakan prosedur analisis, dengan
presisi, akurasi, dan linieritas yang baik. Rentang biasanya dinyatakan dalam
(39)
19 BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian deskriptif dan penelitian ini
dilaksanakan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera
Utara pada bulan Oktober 2014 sampai dengan Desember 2014.
3.2 Alat
Alat–alat yang digunakan dalam penelitian adalah spektrofotometer
ultraviolet (Shimadzu 1800) yang dilengkapi dengan komputer dengan software
UV Probe 2.34, sonikator (Branson 1510), neraca analitik (Boeco), kuvet,
lumpang dan alu, alat-alat gelas (Oberoi) dan alat-alat lainnya yang diperlukan
dalam penyiapan sampel dan larutan.
3.3 Bahan
Bahan yang digunakan adalah metanol p.a, amoksisilin trihidrat BPFI,
kalium klavulanat baku Phiexia Company, tablet Coamoxiclav® (PT. Indofarma),
tablet Claneksi® (PT. Sanbe), dan tablet Augmentin® (PT. Glaxo Smith Kline).
3.4Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu ditentukan atas dasar
pertimbangan bahwa sampel yang terambil mempunyai karakteristik yang sama
dengan yang diteliti yang ditunjukkan dengan nomor bets yang sama. Sampel
yang digunakan yaitu tablet yang masing-masing mengandung amoksisilin
(40)
20
(PT. Indofarma), tablet Claneksi® (PT. Sanbe), dan tablet Augmentin® (PT. Glaxo
Smith Kline) yang diperoleh dari apotek Kalimas.
3.5 Prosedur Penelitian
3.5.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Amoksisilin
Larutan induk amoksisilin dibuat dengan menimbang secara seksama serbuk
amoksisilin BPFI setara 50 mg, kemudian dilarutkan dengan pelarut metanol di
dalam labu tentukur 50 mL dan dicukupkan dengan pelarut yang sama sehingga
didapatkan larutan dengan konsentrasi 1000 mcg/mL (LIB I). Dari larutan ini
dipipet 10 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, diencerkan dengan
metanol sampai garis tanda, dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan
dengan konsentrasi 100 mcg/ml (LIB II).
3.5.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Kalium Klavulanat
Larutan induk kalium klavulanat dibuat dengan menimbang secara seksama
serbuk kalium klavulanat setara 50 mg, kemudian dilarutkan dengan pelarut
metanol di dalam labu tentukur 50 mL dan dicukupkan dengan pelarut yang sama
sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 1000 mcg/mL (LIB I). Dari
larutan ini dipipet 10 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, diencerkan
dengan metanol sampai garis tanda, dikocok sampai homogen sehingga diperoleh
larutan dengan konsentrasi 100 mcg/ml (LIB II). Larutan induk baku ini dapat
(41)
21
3.5.3 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Amoksisilin
Dipipet 1,8 ml larutan induk baku II (LIB II) amoksisilin, dimasukkan ke
dalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan metanol hingga garis tanda,
dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi
18 mcg/ml, kemudian diukur serapan pada panjang gelombang 200-400 nm.
3.5.4 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Kalium Klavulanat
Dipipet 1 ml larutan induk baku I (LIB I) kalium klavulanat, dimasukkan ke
dalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan metanol hingga garis tanda,
dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi
100 mcg/ml, kemudian diukur serapan pada panjang gelombang 200 – 400 nm.
3.5.5 Pembuatan Larutan Standar Amoksisilin
Dipipet larutan induk baku II (LIB II) amoksisilin sebanyak 0,9 ml; 1,3 ml;
1,8 ml; 2,2 ml ; dan 2,6 ml. Masing-masing dimasukkan ke dalam labu tentukur
10 ml, diencerkan dengan metanol hingga garis tanda. Dikocok sampai homogen
sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 9 mcg/ml; 13 mcg/ml; 18 mcg/ml;
22 mcg/ml; dan 26 mcg/ml.
3.5.6 Pembuatan Larutan Standar Kalium Klavulanat
Dipipet larutan induk baku II (LIB II) kalium klavulanat sebanyak 0,45 ml;
0,5 ml; 0,55 ml; 0,6 ml; dan 0,65 ml. Masing-masing dimasukkan ke dalam labu
tentukur 10 ml, diencerkan dengan metanol hingga garis tanda. Dikocok sampai
homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 4,5 mcg/ml; 5 mcg/ml;
(42)
22 3.5.7 Pembuatan Spektrum Serapan
Larutan standar amoksisilin dengan konsentrasi 9 mcg/ml; 13 mcg/ml;
18 mcg/ml; 22 mcg/ml; dan 26 mcg/ml dan kalium klavulanat dengan konsentrasi
4,5 mcg/ml; 5 mcg/ml; 5,5 mcg/ml; 6 mcg/ml; dan 6,5 mcg/ml dibuat spektrum
serapan (tanpa diderivatkan) pada panjang gelombang 200-400 nm.
3.5.8 Pembuatan Spektrum Serapan Derivat Pertama dan Kedua
Spektrum serapan amoksisilin dan kalium klavulanat yang diperoleh
ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat pertama dengan ∆λ 2 nm. Kemudian ditransformasikan lagi menjadi spektrum serapan kedua.
3.5.9 Penentuan Zero Crossing
Penentuan zero crossing diperoleh dengan menumpangtindihkan spektrum
serapan pada masing-masing derivat dari berbagai konsentrasi larutan. Zero
crossing masing-masing zat ditunjukkan oleh panjang gelombang yang memiliki
serapan nol pada berbagai konsentrasi.
3.5.10 Penentuan Panjang Gelombang Analisis
Dibuat larutan amoksisilin dengan konsentrasi 22 mcg/ml, kalium
klavulanat dengan konsentrasi 5,5 mcg/ml, dan larutan campuran kedua zat itu
sehingga di dalamnya terdapat amoksisilin dengan konsentrasi 22 mcg/ml dan
kalium klavulanat dengan konsentrasi 5,5 mcg/ml. Kemudian dibuat spektrum
serapan derivat pertama dari masing-masing larutan zat tunggal dan campuran zat.
Spektrum serapan derivat pertama dari larutan zat tunggal dan campuran
keduanya ditumpangtindihkan. Demikian juga untuk spektrum serapan derivat
kedua, yang dipilih untuk menjadi panjang gelombang analisis adalah pada saat
(43)
23
sama atau persis sama, karena pada panjang gelombang tersebut dapat secara
selektif mengukur serapan zat tersebut.
3.5.11 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi Amoksisilin Dipipet larutan induk baku II amoksisilin sebanyak 0,9 ml; 1,3 ml; 1,8 ml;
2,2 ml; dan 2,6 ml. Masing-masing dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml,
diencerkan dengan metanol hingga garis tanda. Dikocok sampai homogen
sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 9 mcg/ml; 13 mcg/ml; 18 mcg/ml;
22 mcg/ml; dan 26 mcg/ml. Kemudian diukur serapan pada derivat kedua
(∆λ = 2 nm) pada panjang gelombang analisis yang telah ditentukan. Kemudian dilakukan analisis hubungan antara konsentrasi dengan serapan sehingga
diperoleh persamaan regresi linear y = ax + b, dan berdasarkan nilai serapan pada
panjang gelombang analisis, dilakukan pula perhitungan batas deteksi / Limit of
Detection (LOD) dan batas kuantitasi / Limit of Quantitation (LOQ). Menurut
Watson (2005), untuk menentukan LODdan LOQdapat digunakan rumus:
SB =�∑(y-yi) 2
n-2
LOD= 3 × SB
Slope
LOQ= 10 × SB
Slope
Keterangan :
SB = simpangan baku
LOD = limit of detection
(44)
24
3.5.12 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi Kalium Klavulanat
Dipipet larutan induk baku II kalium klavulanat sebanyak 0,45 ml; 0,5 ml;
0,55 ml; 0,6 ml; dan 0,65 ml. Masing-masing dimasukkan kedalam labu tentukur
10 ml, diencerkan dengan metanol hingga garis tanda. Dikocok sampai homogen
sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 4,5 mcg/ml; 5 mcg/ml; 5,5 mcg/ml;
6 mcg/ml; dan 6,5 mcg/ml. Kemudian diukur serapan pada derivat kedua
(∆λ= 2 nm) pada panjang gelombang analisis yang telah ditentukan. Kemudian dilakukan analisis hubungan antara konsentrasi dengan nilai serapan sehingga
diperoleh persamaan regresi linear y = ax + b dan berdasarkan nilai serapan pada
panjang gelombang analisis, dilakukan pula perhitungan batas deteksi / Limit of
Detection (LOD) dan batas kuantitasi / Limit of Quantitation (LOQ). Perhitungan
menentukan batas deteksi dan batas kuantitasi seperti rumus di atas.
3.5.13 Penentuan Kadar Amoksisilin dan Kalium Klavulanat dalam Sediaan Tablet
Dua puluh tablet ditimbang, digerus dalam lumpang sampai halus dan
homogen. Kemudian serbuk dipisahkan dari selaputnya dan disimpan dalam botol
gelap untuk mengurangi proses oksidasi yang terjadi. Kemudian ditimbang
sejumlah serbuk setara dengan 50 mg amoksisilin. Kemudian dari berat analit
yang ditimbang setara 50 mg amoksisilin ini dihitung kesetaraan kalium
klavulanat yang terkandung didalamnya (penimbangan serbuk sebanyak enam kali
pengulangan), dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, ditambahkan metanol
sampai garis tanda sambil dikocok. Larutan kemudian dihomogenkan dengan
pengaduk ultrasonik selama 15 menit. Larutan tersebut kemudian disaring, lebih
(45)
25
dari larutan filtrat ini, dipipet 0,2 ml dan dimasukkan ke dalam labu tentukur
10 ml dan diencerkan dengan metanol hingga garis tanda (konsentrasi 20 mcg/ml
untuk amoksisilin dan konsentrasi 5 mcg/ml untuk kalium klavulanat). Larutan
diukur serapannya dengan rentang waktu satu sampai dua jam lalu
ditransformasikan ke derivat kedua pada panjang gelombang analisis yang telah
ditentukan untuk amoksisilin dan kalium klavulanat.
3.5.14 Uji Validasi 3.5.14.1 Uji Akurasi
Uji akurasi dilakukan dengan metode penambahan baku (standard
addition method), yaitu dengan membuat tiga konsentrasi analit sampel dengan
rentang spesifik 80%, 100%, 120%, dimana masing-masing dilakukan sebanyak
tiga kali pengulangan. Setiap rentang spesifik mengandung 70% analit dan 30%
baku pembanding, kemudian dianalisis dengan perlakuan yang sama seperti pada
penetapan kadar sampel (Harmita, 2004).
Menurut Harmita (2004), persen perolehan kembali dapat dihitung dengan
menggunakan rumus sebagai berikut:
% perolehan kembali = (�� - ��)
CA∗ × 100%
Keterangan :
CF = konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan baku
CA = konsentrasi sampel sebelum penambahan bahan baku
(46)
26 3.5.14.2 Uji Presisi
Menurut Rohman dan Sudjadi (2007), uji presisi (keseksamaan) ditentukan
dengan parameter RSD(RelativeStandard Deviation) dengan rumus :
RSD = SD
X × 100%
Menurut Rohman dan Sudjadi (2007), untuk menghitung Standard Deviation
(SD) digunakan rumus :
SD =�∑(xi – x )2 n - 1
Keterangan :
RSD = relative standard deviation
SD = standard deviation
X = kadar rata-rata amoksisilin atau kalium klavulanat dalam sampel
3.5.15 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik
Data perhitungan kadar amoksisilin dan asam klavulanat dianalisis secara
statistik dengan menggunakan uji T (Sudjana, 2005).
Menurut Rohman dan Sudjadi (2007), rumus yang digunakan adalah :
SD =
(
)
1 -n
X -Xi 2
∑
Menurut Sudjana (2005), untuk mencari t hitung digunakan rumus:
t hitung = SD n X Xi
/ −
(47)
27
Menurut Sudjana (2005), data diterima jika -ttabel < thitung < ttabel pada interval
kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01.
Keterangan :
SD = standard deviation / simpangan baku
Xi = kadar dalam satu perlakuan
X = kadar rata-rata dalam satu sampel
n = jumlah pengulangan
α = tingkat kepercayaan
Menurut Sudjana (2005), untuk menghitung kadar amoksisilin dan kalium
klavulanat dalam sampel secara statistik menggunakan rumus :
μ = X ± (t1-1/2 α, dk) x SD / √n) Keterangan :
µ = interval kepercayaan
X = kadar rata-rata sampel
X = kadar sampel
t = harga ttabel sesuai dengan dk = n-1
α = tingkat kepercayaaan dk = derajat kebebasan
SD = standard deviation
(48)
28 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penentuan Kurva Serapan Maksimum
Hasil penentuan kurva serapan maksimum amoksisilin dan kalium
klavulanat masing-masing dapat dilihat dari gambar 6 dan 7. Kurva tumpang
tindih serapan maksimum amoksisilin dan kalium klavulanat dapat dilihat pada
gambar 8.
Gambar 6. Kurva serapan amoksisilin 18 mcg/ml
Dari gambar 6 diatas dapat dilihat serapan maksimum amoksisilin terdapat
pada panjang gelombang 229 nm.
Gambar 7. Kurva serapan maksimum kalium klavulanat 100 mcg/ml
Dari gambar 7 diatas dapat dilihat serapan maksimum kalium klavulanat
(49)
29
Gambar 8. Kurva tumpang tindih serapan maksimum amoksisilin dan kalium klavulanat
4.2 Penentuan Kurva Serapan
Hasil penentuan kurva serapan dibuat dengan membuat larutan amoksisilin
dengan konsentrasi 9 mcg/ml; 13 mcg/ml; 18 mcg/ml; 22 mcg/ml; dan 26 mcg/ml
dan larutan kalium klavulanat dengan konsentrasi 4,5 mcg/ml; 5 mcg/ml;
5,5 mcg/ml; 6 mcg/ml; dan 6,5 mcg/ml kemudian dibuat kurva serapan pada
panjang gelombang 200-400 nm. Kurva serapan dari masing-masing zat pada
berbagai konsentrasi tersebut ditumpangtindihkan. Kurva tumpang tindih serapan
amoksisilin dan kalium klavulanat masing-masing dapat dilihat pada gambar 9
dan 10.
Gambar 9. Kurva tumpang tindih serapan amoksisilin
Amoksisilin 22 mcg/ml K.Klavulanat 5,5 mcg/ml
9 mcg/ml 13 mcg/ml 18 mcg/ml 22 mcg/ml 26 mcg/ml
(50)
30
Gambar 10. Kurva tumpang tindihserapan kalium klavulanat.
Dari gambar 9 dan gambar 10 dapat dilihat bahwa hasil tumpang tindih
serapan amoksisilin terdapat pada panjang gelombang 229 nm dan kalium
klavulanat terdapat pada panjang gelombang 272 nm.
4.3 Penentuan Kurva Serapan Derivat
4.3.1 Penentuan Kurva Serapan Derivat Pertama
Hasil kurva tumpang tindih serapan amoksisilin dan kalium klavulanat
derivat pertama dapat dilihat pada lampiran 1. Selanjutnya kurva serapan
diderivatkan ke derivat kedua.
4.3.2 Penentuan Kurva Serapan Derivat Kedua
Hasil kurva tumpang tindih serapan amoksisilin dan kalium klavulanat
derivat kedua dapat dilihat pada lampiran 2.
4.4 Penentuan Zero crossing pada Serapan Derivat
4.4.1 Penentuan Zero crossing pada Serapan Derivat Pertama
Hasil penentuan zero crossing pada derivat pertama diperoleh dengan
menumpangtindihkan spektrum serapan derivat pertama pada masing-masing zat
dari berbagai konsentrasi larutan. Zero crossing pada spektrum derivat pertama
dari masing-masing zat ditunjukkan oleh panjang gelombang yang memiliki 4,5 mcg/ml
5 mcg/ml 5,5 mcg/ml
6 mcg/ml 6,5 mcg/ml
(51)
31
serapan nol pada berbagai konsentrasi. Zero crossing amoksisilin dan kalium
klavulanat pada kurva serapan derivat pertama masing-masing dapat dilihat pada
gambar 11 dan 12.
Gambar 11. Zero crossing amoksisilin pada serapan derivat pertama
Gambar 12. Zero crossing kalium klavulanat pada serapan derivat pertama
231,34
311,11 - 400
275,21 218,23
270,09 339,74
317,95
9 mcg/ml 13 mcg/ml 18 mcg/ml 22 mcg/ml 26 mcg/ml
4,5 mcg/ml 5 mcg/ml 5,5 mcg/ml
6 mcg/ml 6,5 mcg/ml
(52)
32
Dari gambar 11 dapat dilihat hasil zero crossing kalium klavulanat pada
serapan derivat pertama yang diperoleh yaitu pada 218,23 nm, 231,34 nm,
275,21 nm, dan 311,11 – 400 nm. Sedangkan dari gambar 12 dapat dilihat hasil
zero crossing kalium klavulanat pada serapan derivat pertama yang diperoleh
yaitu pada 270,09 nm, 317,95 nm, dan 339,74 nm.
4.4.2 Penentuan Zero crossing pada Serapan Derivat Kedua
Hasil penentuan kurva serapan derivat kedua dibuat dengan terlebih
dahulu membuat kurva serapan dari larutan amoksisilin dengan konsentrasi
9 mcg/ml; 13 mcg/ml; 18 mcg/ml; 22 mcg/ml; dan 26 mcg/ml dan larutan kalium
klavulanat dengan konsentrasi 4,5 mcg/ml; 5 mcg/ml; 5,5 mcg/ml; 6 mcg/ml; dan
6,5 mcg/ml pada panjang gelombang 200-400 nm. Kurva serapan yang telah
diperoleh ditransformasikan menjadi kurva serapan derivat kedua dengan
∆λ 2 nm. Kurva serapan derivat kedua dari masing-masing zat pada berbagai konsentrasi tersebut ditumpangtindihkan. Zero crossing amoksisilin dan kalium
klavulanat pada serapan derivat kedua dapat dilihat pada gambar 13 dan 14.
Gambar 13. Zero crossing amoksisilin pada serapan derivat kedua
223,93
240,46 280,91
284,90
266,1 006
299,15 – 400 277,49
9 mcg/ml 13 mcg/ml 18 mcg/ml 22 mcg/ml 26 mcg/ml
(53)
33
Gambar 14. Zero crossing kalium klavulanat pada serapan derivat kedua
Dari gambar 13 dapat dilihat hasil zero crossing pada serapan derivat kedua
terdapat pada panjang gelombang 223, 93 nm, 240,46 nm, 266,10 nm, 277,49 nm,
280,91 nm, 284,90 nm, dan 299,15-400 nm. Dari gambar 14 hasil zero crossing
kalium klavulanat pada serapan derivat kedua terdapat pada panjang gelombang
214,81 nm, 229,09 nm, 251,85 nm, 279,20 nm, dan 292,88 nm.
4.5 Penentuan Panjang Gelombang Analisis
Hasil penentuan panjang gelombang analisis dilakukan dengan cara
membuat larutan amoksisilin dengan konsentrasi 22 mcg/ml, kalium klavulanat
dengan konsentrasi 5,5 mcg/ml, dan larutan campuran amoksisilin dengan
konsentrasi 22 mcg/ml dan kalium klavulanat dengan konsentrasi 5,5 mcg/ml.
Kurva tumpang tindih serapan amoksisilin dan kalium klavulanat dapat dilihat
pada gambar 15 sedangkan kurva tumpang tindih serapan amoksisilin, kalium
klavulanat, dan campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dapat dilihat pada
214,81
229,09
251,85
292,88 279,20
4,5 mcg/ml 5 mcg/ml 5,5 mcg/ml
6 mcg/ml 6,5 mcg/ml
(54)
34
gambar 16. Kemudian dibuat spektrum serapan derivat pertama dari
masing-masing larutan zat tunggal dan campuran zat. Spektrum serapan derivat pertama
dari larutan zat tunggal dan campuran keduanya ditumpangtindihkan. Demikian
juga untuk spektrum serapan derivat kedua. Kurva tumpang tindihserapan derivat
pertama amoksisilin dan kalium klavulanat dapat dilihat pada gambar 17
sedangkan kurva tumpang tindih serapan derivat pertama amoksisilin, kalium
klavulanat, dan campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dapat dilihat pada
gambar 18. Kurva tumpang tindih serapan derivat kedua amoksisilin dan kalium
klavulanat dapat dilihat pada gambar 19 sedangkan kurva tumpang tindih serapan
derivat kedua amoksisilin, kalium klavulanat, dan campuran amoksisilin dan
kalium klavulanat dapat dilihat pada gambar 20. Penentuan panjang gelombang
analisis dilakukan berdasarkan pengamatan pada kurva serapan masing-masing
derivat, kemudian dilanjutkan pengukuran absorbansi pada masing-masing zero
crossing. Zero crossing amoksisilin dan kalium klavulanat dapat dilihat pada
gambar 21 dan 22. Hasil penentuan panjang gelombang analisis amoksisilin dan
kalium klavulanat masing-masing dapat dilihat pada gambar 23 dan 24.
Gambar 15. Kurva tumpang tindih serapan amoksisilin dan kalium klavulanat Amoksisilin 22 mcg/ml
(55)
35
Gambar 16. Kurva tumpang tindih serapan amoksisilin, kalium klavulanat dan campuran amoksisilin dan kalium klavulanat.
Gambar 17. Kurva tumpang tindih serapan derivat pertama amoksisilin dan kalium klavulanat
Amoksisilin 22 mcg/ml K.Klavulanat 5,5 mcg/ml Amoksisilin 22 mcg/ml K.Klavulanat 5,5 mcg/ml
Campuran amoksisilin 22 mcg/ml dan K.Klavulanat 5,5 mcg/ml
(56)
36
Gambar 18. Kurva tumpang tindih serapan derivat pertama amoksisilin, kalium klavulanat, dan campuran amoksisilin dan kalium klavulanat.
Gambar 19. Kurva tumpang tindih serapan derivat kedua amoksisilin dan kalium klavulanat.
Amoksisilin 22 mcg/ml K.Klavulanat 5,5 mcg/ml Amoksisilin 22 mcg/ml
K.Klavulanat 5,5 mcg/ml
Campuran amoksisilin 22 mcg/ml dan K.Klavulanat 5,5 mcg/ml
(57)
37
Gambar 20. Kurva tumpang tindih serapan derivat kedua amoksisilin, kalium klavulanat, dan campuran amoksisilin dan kalium klavulanat.
Gambar 21. Zero crossing amoksisilin
338,40 Amoksisilin 22 mcg/ml
K.Klavulanat 5,5 mcg/ml
Amoksisilin 22 mcg/ml K.Klavulanat 5,5 mcg/ml
Campuran amoksisilin 22 mcg/ml dan K.Klavulanat 5,5 mcg/ml
(58)
38 Gambar 22. Zero crossing kalium klavulanat
Gambar 23.Panjang gelombang analisis amoksisilin 279,20 279,20
Amoksisilin 22 mcg/ml K.Klavulanat 5,5 mcg/ml
Amoksisilin 22 mcg/ml K.Klavulanat 5,5 mcg/ml
Campuran Amoksisilin 22 mcg/ml dan K.Klavulanat 5,5 mcg/ml
(59)
39
Gambar 24.Panjang gelombang analisis kalium klavulanat
Dari gambar dapat dilihat bahwa panjang gelombang analisis untuk
penetapan kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat adalah pada serapan
derivat kedua. Untuk mengetahui lebih tepatnya dilakukan pemilihan panjang
gelombang analisis. Amoksisilin dan kalium klavulanat memiliki banyak zero
crossing pada serapan derivat kedua yaitu pada panjang gelombang 338,40 nm
(zero crossing dari amoksisilin) dan 220 nm, 258,60 nm, 261 nm, 263,20 nm,
279,20 nm, dan 291 nm (zero crossing dari kalium klavulanat). Kurva serapan
penentuan panjang gelombang analisis dapat dilihat pada lampiran 3. Dasar
pemilihan panjang gelombang analisis adalah pada saat serapan senyawa
pasangannya dan campurannya hampir sama atau persis sama, karena pada
panjang gelombang tersebut dapat secara selektif mengukur serapan senyawa
pasangannya dan pada saat serapan yang paling besar (Nurhidayati, 2007). Data
hasil serapan amoksisilin, kalium klavulanat, dan campuran amoksisilin dan
kalium klavulanat pada derivat kedua dapat dilihat pada tabel 2. 338,40 Amoksisilin 22 mcg/ml
K.Klavulanat 5,5 mcg/ml
Campuran Amoksisilin 22 mcg/ml dan K.Klavulanat 5,5 mcg/ml
(60)
40
Tabel 2. Data hasil serapan amoksisilin, kalium klavulanat, dan campuran amoksisilin dan kalium klavulanat pada derivat kedua.
Dari tabel di atas, diperoleh panjang gelombang analisis adalah pada
279,20 nm dan pada 338,40 nm. Panjang gelombang analisis untuk amoksisilin
adalah pada 279,20 nm (lihat gambar 23), karena pada panjang gelombang ini
serapan kalium klavulanat adalah nol, sedangkan amoksisilin dan campuran
keduanya mempunyai nilai serapan sama dan maksimum yaitu 0,0013. Demikian
juga panjang gelombang analisis untuk kalium klavulanat adalah pada 338,40 nm
(lihat gambar 24), karena pada panjang gelombang ini serapan amoksisilin adalah
nol, sedangkan kalium klavulanat dan campuran keduanya mempunyai nilai
serapan sama dan maksimum yaitu 0,0009.
4.6 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi
Penentuan linieritas kurva kalibrasi menunjukkan hubungan yang linier
antara absorbansi dengan konsentrasi, untuk amoksisilin dengan koefisien
korelasi, r = 0,9993 dan persamaan regresi Y = (59X + 7).10-6; untuk kalium
klavulanat dengan koefisien korelasi, r = 0,9999 dan persamaan regresi Serapan Derivat
Kedua
Panjang gelombang (nm)
220,00 258,60 261,00 263,20 279,20 291,00 338,40
Amoksisilin
(22 mcg/ml) 0,0043 0,0006 0,0005 0,0007 0,0013 0,0010 0
Kalium klavulanat
(5,5 mcg/ml) 0 0 0 0 0 0 0,0009
Campuran amoksilin dan
(61)
41
Y = (160X – 1).10-6. Kurva kalibrasi amoksisilin dan kalium klavulanat dapat
dilihat pada lampiran 4 dan perhitungan regresi kalibrasi amoksisilin dan kalium
klavulanat masing masing dapat dilihat pada lampiran 5 dan 7.
4.7 Penentuan Kadar Amoksisilin dan Kalium Klavulanat dalam Sediaan Tablet
Penetapan kadar amoksisilin dan kalium klavulanat dilakukan dengan
menggunakan tablet yang mengandung amoksisilin 500 mg dan kalium klavulanat
125 mg. Dibuat larutan uji sehingga didalamnya terdapat amoksisilin dan kalium
klavulanat kemudian diukur serapannya pada derivat kedua pada panjang
gelombang analisis 279,20 nm dan 338,40 nm. Contoh perhitungan penetapan
kadar amoksisilin dan kalium klavulanat dapat dilihat pada lampiran 9.
Kurva serapan penetapan kadar amoksisilin dan kalium klavulanat pada
tablet Coamoxiclav® dapat dilihat pada lampiran 10, tablet Claneksi® pada
lampiran 11, dan untuk tablet Augmentin® pada lampiran 12. Data hasil
perhitungan kadar amoksisilin dan kalium klavulanat setelah dilakukan uji
statistik (data dan perhitungan dapat dilihat pada lampiran 13–20) dapat dilihat
pada tabel 3.
Tabel 3. Data hasil perhitungan kadar amoksisilin dan kalium klavulanat setelah dilakukan uji statistik
No Nama Tablet Kadar Amoksisilin (%)
Kadar Kalium Klavulanat (%)
1. Coamoxiclav ®
(PT. Indofarma)
99,76 ± 0,61 97,28 ± 0,83
2. Claneksi® (PT. Sanbe ) 104,94 ± 1,09 94,65 ± 0,77
3. Augmentin ®
(PT. Glaxo
(62)
42
Persyaratan kadar untuk sediaan tablet amoksisilin dan kalium klavulanat
menurut USP 30 dan NF 25 (2007) dan Farmakope Indonesia Edisi V (2014)
yaitu mengandung amoksisilin dan kalium klavulanat tidak kurang dari 90,0% dan
tidak lebih dari 120,0% dari jumlah yang tertera pada etiket. Dari tabel 2 dapat
dilihat bahwa kadar amoksisilin dan kalium klavulanat pada ketiga tablet telah
memenuhi persyaratan kadar menurut USP 30 dan NF 25 (2007) dan Farmakope
Indonesia Edisi V (2014).
Tablet kombinasi amoksisilin dan kalium klavulanat merupakan tablet salut
yang bertujuan untuk menghindari proses oksidasi pada zat aktif tablet tersebut
yaitu kalium klavulanat. Kalium klavulanat memiliki gugus alkohol primer yang
apabila terkena zat pengoksidasi yaitu pengaruh oksigen di lingkungan analisis
akan berubah menjadi aldehid kemudian asam karboksilat (Ditjen POM, 1995;
Fessenden dan Fessenden, 1986). Proses oksidasi ini dapat menyebabkan
penguraian pada tablet sehingga mampu mempengaruhi kadar tablet
(Martin, dkk., 1983).
Cara mengatasi oksidasi ini dapat dengan menambahkan antioksidan,
menghindari oksigen, mendapar larutan pada pH yang sesuai, menggunakan
pelarut bebas logam, dan menyimpan pada temperatur rendah agar dapat
meminimalisir penguraian zat aktif pada tablet (Martin, dkk., 1983).
4.8 Uji Validasi
Parameter validasi yang diuji adalah akurasi (kecermatan), presisi
(keseksamaan), batas deteksi dan batas kuantitasi. Akurasi (kecermatan) metode
dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery) yang ditentukan dengan
(63)
43
validasi dengan metode penambahan bahan baku (standard addition method)
terhadap tablet Claneksi® (PT. Sanbe) yang meliputi uji akurasi dengan parameter
persen perolehan kembali (% recovery) dan uji presisi dengan parameter RSD
(Relative Standard Deviation).
Uji akurasi dengan parameter % recovery dilakukan dengan membuat tiga
konsentrasi sampel dengan rentang spesifik 80%, 100%, dan 120% dihitung dari
kesetaraan penimbangan pada penetapan kadar sampel, masing-masing dengan
tiga kali pengulangan dan setiap rentang spesifik mengandung 70% sampel dan
30% baku pembanding. Contoh perhitungan persentase perolehan kembali (%
recovery) dapat dilihat pada lampiran 21, kurva serapan pada persentase perolehan
kembali dapat dilihat pada lampiran 22, dan data hasil persentase perolehan
kembali amoksisilin dan kalium klavulanat pada tablet Claneksi® dengan metode
penambahan baku (standard addition method) masingmasing dapat dilihat pada
lampiran 23 dan 24.
Batas deteksi dan batas kuantitasi dihitung dari persamaan regresi yang
diperoleh dalam kurva kalibrasi. Batas deteksi dan batas kuantitasi analisis yang
amoksisilin diperoleh berturut-turut adalah 0,8608 mcg/ml dan 2,8694 mcg/ml,
sedangkan untuk kalium klavulanat diperoleh berturut-turut adalah
0,0864 mcg/ml dan 0,2881 mcg/ml. Perhitungan dapat dilihat pada lampiran dan.
Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi kerja amoksisilin (20 mcg/ml) dan
kalium klavulanat (5 mcg/ml) dapat terdeteksi dan terkuantitasi dengan metode
spektrofotometri derivatif yang digunakan.
Rata-rata persen perolehan kembali yang diperoleh telah memenuhi
(64)
44
rentang 98-102% yaitu 99,93% untuk amoksisilin dan 99,46% untuk kalium
klavulanat (Harmita, 2004). Simpangan baku relatif yang diperoleh telah
memenuhi syarat presisi untuk validasi prosedur analitik karena lebih kecil dari
2% yaitu 1,11% untuk amoksisilin dan 0,22% untuk kalium klavulanat (Harmita,
2004). Perhitungan rata-rata, standar deviasi, dan simpangan baku relatif
amoksisilin dan kalium klavulanat pada persen perolehan kembali masing-masing
dapat dilihat pada lampiran 25 dan 26. Dari hasil di atas, disimpulkan bahwa
prosedur analisis yang dilakukan dalam penelitian dapat digunakan untuk analisis
kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dalam tablet karena telah
memenuhi persyaratan validasi metode.Data hasil pengujian perolehan kembali
amoksisilin dan kalium klavulanat dengan metode penambahan baku standar
(standard addition method) pada tablet Claneksi® dapat dilihat pada tabel 4.
Tabel 4. Data hasil pengujian perolehan kembali amoksisilin dan kalium klavulanat dengan metode penambahan baku standar (standard addition method) pada tablet Claneksi®.
Rentang Spesifik (%)
Perolehan kembali Amoksisilin (%) Perolehan kembali Kalium Klavulanat (%) 80
101,41 99,25 101,41 99,25 101,41 99,25
100
99,25 99,39
99,25 99,39
99,25 99,39
120
99,12 99,75
99,12 99,75
99,12 99,75
Rata-rata % recovery 99,93 99,46
Standard Deviation (SD) 1,1139 0,2234
(65)
45 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
4.1 Kesimpulan
Kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dalam bentuk sediaan
tablet yang beredar di pasaran dapat ditetapkan dengan menggunakan
spektrofotometri derivatif dengan pelarut metanol pada kurva serapan derivat
kedua pada panjang gelombang zero crossing yaitu pada panjang gelombang
279,20 nm untuk analisis amoksisilin dan pada panjang gelombang 338,40 nm
untuk analisis kalium klavulanat.
Kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat yang dianalisis dalam 3
tablet di pasaran yang diperoleh dengan metode spektrofotometri derivatif
menggunakan pelarut metanol memenuhi persyaratan USP 30 dan NF 25 (2007)
dan Farmakope Indonesia Edisi V (2014).
Hasil uji validasi yang diperoleh dari batas deteksi, batas kuantitasi, persen
perolehan kembali, dan Relative Standard Deviation (RSD) untuk amoksisilin dan
kalium klavulanat menunjukkan bahwa metode yang digunakan memenuhi syarat
validasi.
4.2 Saran
Disarankan untuk penelitian berikutnya untuk menetapkan
kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat menggunakan
spektrofotometri derivatif dengan pelarut metanol:dapar posfat pH 4,4 untuk uji
perbandingan metode kromatografi cair kinerja tinggi dan spektrofotometri
(66)
46
DAFTAR PUSTAKA
Azis, A. (2005). Recent Development of Derivative Spectrophotometry and Their Analytical Applications. Analytical Sciences. 21(1): 595-614.
Basavaiah, K., dan Nagegowda, P. (2004). Determination of Ranitidine Hydrochloride in Pharmaceutical Preparations by Titrimetri and Visible Spectrophotometry using Bromate and Acid Dyes. Il Farmako. 59(2): 147-153.
Bebrone, C., Lassaux, P., Vercheval, L., Sohier, J.S., Jehaes, A., Sauvage, E., dan Galleni, M. (2010). Current Challenges in Antimicrobial Chemotheraphy.
Drugs. 70(6): 651-679.
Bliesner, D.M. (2006). Validating Chromatographic Methods A Practical Guide. New Jersey: John Wiley and Sons, Inc. Hal.1.
Casey, J.R., Block, S., Hedrick, J., Almudevar, A., dan Pichichero, M.E. (2012). Comparison of Amoxicillin/Clavulanic Acid High Dose with Cefdinir in the Treatment of Acute Otitis Media. Drugs. 72(15): 1991-1997.
Desai, V.N., Afieroho, O.E., Dagunduro, D.O., Okonkwo., dan Ndu, C.C. (2011). A simple UV Spectrophotometric Method for the Determination of Levofloxacin in Dosage Formulations. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 10(1) : 75-79.
Ditjen POM. (1995). Farmakope Indonesia. Edisi Keempat. Jakarta : Departemen Kesehatan RI. Hal. 1067.
Ditjen BKAK. (2014). Farmakope Indonesia. Edisi Kelima. Jakarta : Departemen Kesehatan RI. Hal. 120, 125, 651-652.
Ermer, J., dan McB., J.H.M. (2005). Method Validation in Pharmaceutical Analysis, A Guide to Best Practice. Weinheim: Wiley-VCH. Hal. 63,80, 86.
Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S. (1986). Kimia Organik. Jakarta: Penerbit Erlangga. Hal. 285-289.
Gelone, S. dan O’Donnel, J.A. (2005). Anti-Infectives. In: D.Troy (ed).
Remington the Science and Practice of Pharmacy. 21th edition. Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins. Hal. 1638.
Giang Do, T., dan Hoang Vu, D. (2010). Comparative Study of RP-HPLC and UV Sphectrophotometric Techniques for the Simultaneous Determination of Amoxicillin and Cloxacillin in Capsules. J. Young Pharm. 2(2) : 190-195.
(67)
47
Hariyanto., Sabarijah, W., dan Transitawuri, F. (2006). Perbandingan Mutu dan Harga Tablet Amoksisilin 500 mg Generik dengan Non Generik yang Beredar di Pasaran. Majalah Ilmu Kefarmasian. 3(3): 127-142.
Harmita. (2004). Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian.1(3): 117-135.
Hayun., Hariyanto., dan Yenti. (2006). Penetapan Kadar Triprolidina Hidroklorida dan Pseudoefedrina Hidroklorida dalam Tablet Antiinfluenza secara Spektrofotometri Derivatif. Majalah Ilmu kefarmasian.3(1): 94-105.
Huong, V.T., dan Hoang, V.D. (2009). Simultaneous Determination of Amoxicillin and Clavulanate in combined tablets by non-derivative and derivative UV spectropotometric techniques. International Journal of Pharmtech Research. 1(4): 1173-1181.
Huber, L. (2007). Validation and Qualification in Analytical Laboratories. 2nd Edition. New York : Informa Healthcare USA,Inc. Hal. 125.
Khoshayand, M.R., Abdollahi, H., Ghaffari, A., Shariatpanahi, M., dan Farzanegan, H. (2010). Simultaneous Spectrophotometric Determination of Paracetamol, Phenylephrine, and Chlorpheniramine in Pharmaceutical Using Chemometric Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 18(4): 292-297.
Kuroki, H., Ishiwada, N., Inoue, N., Ishikawa, N., dan Suzuki, H. (2013). Comparison of Clinical Efficacy Between 3-Day Combined Clavulanate/Amoxicillin Preparation Treatment 10-Day Amoxicillin Treatment in Children with Pharyngolaryngitis or Tonsilitis. Journal of Cystic Fibrosis. 12(6): 780-783.
Martin, A., Swarbrick, J., dan Cammarata, A. (1983). Physical Pharmacy. Penerjemah: Yoshita. (1990). Farmasi Fisik. Jakarta: UI Press. Hal. 794, 796, 806.
Martina, A. (2010). Optimasi Fase Gerak Dapar Fosfat pH 4,4-Metanol pada Penetapan Kadar Campuran Amoksisilin dan Asam Klavulanat dalam Tablet dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Skripsi. Medan : Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Hal. 1-40.
Moffat, A.C., Osselton, M.D., dan Widdop, B. (2005). Clarke’s Analysis of Drug and Poisons. 3rd edition. London: Pharmaceutical Press. Electronic version.
Mutschler, E. (1986). Arzneimittelwirkungen. Penerjemah: Widianto, M.B., dan Ranti, A.S. (1991). Dinamika Obat. Bandung : Penerbit ITB. Hal.641-643.
(1)
96
Lampiran 26. Perhitungan Rata-rata, Standar Deviasi dan Relatif Standar Deviasi Perolehan Kembali Kalium Klavulanat pada Tablet Claneksi®
No Kadar Perolehan Kembali
[Xi] (%) Xi ‒ X̄ (Xi ‒ X̄)
2
1 99,25 -0,21 0,0441
2 99,25 -0,21 0,0441
3 99,25 -0,21 0,0441
4 99,39 -0,07 0,0049
5 99,39 -0,07 0,0049
6 99,39 -0,07 0,0049
7 99,75 0,29 0,0841
8 99,75 0,29 0,0841
9 99,75 0,29 0,0841
X̄ = 99,46 ∑ = 0,3993
SD = �∑(��−�)2
�−1 = � 0.3393
9−1 = 0,2234
RSD = ��
� × 100% = 0,2234
(2)
97
(3)
98
Lampiran 28. Sertifikat Bahan Baku Amoksisilin BPFI dan Kalium Klavulanat (Phiexia Company)
(4)
99
(5)
100
Lampiran 29. Daftar Spesifikasi Sampel
1. Coamoxiclav® (PT. Indofarma)
No. Reg : GKL96209200617 B1 No. Batch : AC71125
Expire Date : Juli 2016
Komposisi : Amoksisilin 500 mg Kalium Klavulanat 125 mg
2. Claneksi® (PT. Sanbe)
No. Reg : DKL9322214509A1 No. Batch : PB4226 B
Expire Date : Februari 2016
Komposisi : Amoksisilin 500 mg Kalium Klavulanat 125 mg
3. Augmentin ® (PT. Glaxo Smith Kline) No. Reg : DKL8728100717B1 No. Batch : 1373128 C
Expire Date : November 2015
Komposisi : Amoksisilin 500 mg Kalium Klavulanat 125 mg
(6)
101
Lampiran 30. Alat yang Digunakan
Spektrofotometer UV (Shimadzu 1800) beserta seperangkat komputer
Sonikator (Branson 1510)