Penapisan dan Pemanfaatan Kapang Endofit dalam Pembuatan Bioetanol dari Limbah Pengolahan Agar-agar

1

PENAPISAN DAN PEMANFAATAN KAPANG ENDOFIT
DALAM PEMBUATAN BIOETANOL DARI LIMBAH
PENGOLAHAN AGAR-AGAR

AULIA ANDHIKAWATI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

2

3

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul “Penapisan dan
Pemanfaatan Kapang Endofit dalam Pembuatan Bioetanol dari Limbah

Pengolahan Agar-Agar” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi
manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, September 2014
Aulia Andhikawati
NIM C351110091

4

RINGKASAN
AULIA ANDHIKAWATI. Penapisan dan Pemanfaatan Kapang Endofit dalam
Pembuatan Bioetanol dari Limbah Pengolahan Agar-agar. Dibimbing oleh
BUSTAMI IBRAHIM dan KUSTIARIYAH TARMAN.
Sumber bahan bakar minyak di Indonesia yang semakin berkurang tetapi
kebutuhannya semakin meningkat, mendorong berbagai kalangan untuk mencari

sumber-sumber energi baru untuk menggantikan minyak bumi, seperti bahan
bakar dari sumberdaya hayati. Salah satu contoh bahan bakar dari sumberdaya
hayati adalah bioetanol. Bahan bakar bioetanol dapat berasal dari limbah
pengolahan rumput laut. Limbah yang masih memiliki kandungan lignin, selulosa
dan hemiselulosa sangat potensial untuk dimanfaatkan menjadi bioetanol.
Selulosa yang terkandung pada limbah sebesar 15-25%. Salah satu cara untuk
mengkonversikan komponen pati dan selulosa menjadi etanol yaitu dengan
hidrolisis enzim yang diikuti dengan fermentasi. Degradasi selulosa dapat
dilakukan dengan menggunakan aktivitas mikroba potensial contohnya kapang
untuk menghasilkan gula dan selanjutnya khamir Saccharomyces cerevisiae untuk
produksi etanol.
Penelitian ini bertujuan untuk: (1) menentukan kapang laut endofit
selulolitik yang berpotensi; (2) menentukan umur kapang, konsentrasi kapang dan
waktu hidrolisis terbaik; dan (3) menentukan waktu fermentasi terpilih untuk
menghasilkan etanol.
Penelitian ini menunjukkan hasil isolasi kapang endofit pada rumput laut
dan daun mangrove diperoleh masing-masing dua isolat kapang yaitu isolat RL6,
RL9, D1 dan D2. Keempat jenis isolat kapang yang telah diisolasi dan isolat
kapang koleksi (Isolat EN, KT19 dan SMH) dapat tumbuh pada berbagai media
dengan salinitas NaCl 3%, air laut dan air tawar. Media dengan penambahan air

laut dan air tawar, semua isolat kapang dapat menghasilkan zona bening,
sedangkan pada media dengan penambahan NaCl 3% hanya isolat D1 yang tidak
menghasilkan zona bening. Isolat EN memiliki nisbah zona bening terbesar yaitu
1,36.
Proses hidrolisis limbah pengolahan agar-agar selama tiga hari dengan
perlakuan konsentrasi kapang 20% menghasilkan nilai gula pereduksi sebesar
0,04% (b/b). Umur kapang yang digunakan pada proses hidrolisis yaitu 9 hari.
Fermentasi terpilih untuk uji crude etanol yaitu fermentasi selama 3 hari. Jumlah
kepadatan ragi komersial dan nilai glukosa selama fermentasi 3 hari yaitu sebesar
5,02x109 CFU dan 0,04% (b/b). Nilai pH yang terukur yaitu 3,9. Konsentrasi
crude etanol pada proses fermentasi dianalisis dengan menggunakan HPLC.
Crude etanol yang didapat pada fermentasi hari ketiga yaitu sebesar 3892 ppm.
Kata kunci: bioetanol, kapang endofit, limbah agar-agar, penapisan, selulosa

5

SUMMARY
AULIA ANDHIKAWATI. Screening and Utilization of Endophytic Marine Fungi
for Bioethanol Production from Agar Extraction Waste. Supervised by
BUSTAMI IBRAHIM and KUSTIARIYAH TARMAN.

The increase in fossil fuel prices, issues of national security and
environmental concerns have led to an overwhelming interest among researchers
to develop economically viable process for production of alternative
transportation fuels. Alternative fuel is renewable source of energy. Biological
resources based energy are expected to reduce the problem caused on fossil fuels,
such as fuel shortage and environmental pollution since renewable source is more
environmental friendly. Bioethanol, a renewable source of energy, can be derived
from materials that contain sugar, starch or cellulose. Bioethanol can also derived
from processing industrial waste. Industrial waste that still containing lignin,
cellulose and hemicelluloses can be utilized as bioethanol. One of the components
in seaweed (cellulose) is a component that can be converted into bioethanol.
Cellulose contained in the seaweed waste reaches 15-25%. One of methods of
converting cellulose to ethanol is enzyme hydrolysis followed by fermentation.
Cellulose degradation and fermentation process can be running due to potential
microbial activity, such as fungi and yeast.
This study has three main objectives that include the following: (1) to
determine the potential of cellulolytic marine fungi; (2) to determine the influence
of harvest time of fungi, concentration of fungi and hydrolysis time; and (3) to
determine the fermentation time for bioethanol production.
Endophytic fungi were obtained four isolates of fungi from seaweed and

mangrove leaves including RL6, RL9, D1 and D2. These four isolates of fungi
and isolates from collection (EN, KT19 and SMH isolates) can grow in different
salinity of medium, such as NaCl 3%, marine water and fresh water. All isolates
of fungi can produce a clear zone in medium with salinity of marine water and
fresh water, while D1 isolates can not produce a clear zone in salinity of medium
3% NaCl. EN isolate showed the largest ratio of clear zone (1.35).
Hydrolysis process of agar extraction waste for three days with 20% of
fungi concentration yielded 0.04% (w/w) of reducing sugar value. Cultivation
time of fungi used in the hydrolysis process was 9 days cultivation. Fermentation
for 3 days was optimum for production of ethanol. The number of yeast colonies
and the value of reducing sugars during fermentation 3 days was 5.02x109 CFU
and 0.04% (w/w), respectively. pH value in third days of fermentation was 3.9.
Crude ethanol concentration in the fermentation process was analyzed using
HPLC. Crude ethanol obtained on the third day of fermentation was 3892 ppm.
Keywords: agar extraction waste, bioethanol, cellulose, endophytic fungi,
screening

6

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

7

PENAPISAN DAN PEMANFAATAN KAPANG ENDOFIT
DALAM PEMBUATAN BIOETANOL DARI LIMBAH
PENGOLAHAN AGAR-AGAR

AULIA ANDHIKAWATI

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains

pada
Program Studi Teknologi Hasil Perairan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

8

Penguji luar komisi pada ujian tesis : Dr Ir Iriani Setyaningsih, MS

9

Judul Tesis
Nama
NIM
Program Studi

: Penapisan dan Pemanfaatan Kapang Endofit dalam Pembuatan

Bioetanol dari Limbah Pengolahan Agar-agar
: Aulia Andhikawati
: C351110091
: Teknologi Hasil Perairan

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr Ir Bustami Ibrahim, MSc
Ketua

Dr Kustiariyah Tarman, SPi, MSi
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Teknologi Hasil Perairan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Wini Trilaksani, MSc

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian : 20 Juni 2014

Tanggal Lulus:

10

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala
rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan tesis dengan judul
Penapisan dan Pemanfaatan Kapang Endofit dalam Pembuatan Bioetanol dari
Limbah Pengolahan Agar-agar. Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua
pihak yang telah membantu dalam menyelesaikan tesis ini, terutama kepada:
1 Dr Ir Bustami Ibrahim, MSc dan Dr Kustiariyah Tarman, SPi, MSi. sebagai
dosen pembimbing tesis yang telah senantiasa memberikan arahan dan
bimbingan selama menyelesaikan tesis ini.

2 Bapak yang saya banggakan Dr. M. Sukardjo, MPd, ibu yang saya cintai Dedeh
Rosidah, SPd, adik-adik yang saya sayangi Ari Ameliani Utami, SSt dan M.
Waliyya Amananto.
3 Keluarga besar mahasiswa sekolah pascasarjana Teknologi Hasil Perairan, yang
telah memberikan dorongan semangat baik selama penelitian maupun saat
penyusunan tesis ini.
4 Teman-teman dan semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu.
5 Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementerian Pendidikan dan
Kebudayaan Republik Indonesia yang telah membiayai penelitian ini melalui
Program Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi atas nama Ketua Peneliti
Dr Kustiariyah Tarman, SPi, MSi dengan judul Pengembangan Teknologi
Produksi Bioetanol melalui Pemanfaatan Limbah Industri Rumput Laut dengan
Kapang Endofit Indigenous Laut Indonesia (No. 58/IT3.41.2/L1/SPK/2013).
Penulis menyadari bahwa masih terdapat kekurangan dalam penyusunan
tesis ini. Penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun.
Semoga tulisan ini bermanfaat bagi pihak-pihak yang memerlukan.

Bogor, September 2014
Aulia Andhikawati

xi

DAFTAR ISI
Halaman
xii

DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR

xii

DAFTAR LAMPIRAN

xii

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Permasalahan
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

1
1
2
2
3

2 METODE
Lokasi dan Waktu Penelitian
Alat dan Bahan
Pelaksanaan Penelitian
Tahap Isolasi dan Penapisan Kapang
Tahap Hidrolisis
Tahap Fermentasi
Prosedur Pengujian
Uji Kadar Selulosa (SNI 0444; 2009)
Uji Kadar Lignin (SNI 0492:2008)
Penentuan Nilai Glukosa Metode DNS (Miller 1959)
Penentuan Kadar Etanol
Analisis Data

5
5
5
5
5
6
8
8
8
9
9
10
10

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Tahap Isolasi dan Penapisan Kapang
Isolat Kapang Endofit
Penapisan Kapang Selulolitik
Pertumbuhan Isolat Kapang EN
Tahap Hidrolisis
Konsentrasi Kapang dan Waktu Hidrolisis
Umur Kapang
Tahap Fermentasi
Waktu Fermentasi
Konsentrasi Crude etanol

11
11
11
13
15
17
18
20
21
21
24

4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

24
24
25

DAFTAR PUSTAKA

25

LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP

Error! Bookmark not defined.
36

xii

DAFTAR TABEL
1 Deskripsi kapang endofit yang digunakan
2 Hasil karakterisasi limbah padat agar-agar kertas (%)
3 Komposisi selulosa setelah proses hidrolisis

Halaman
12
17
21

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Road map penelitian
4
2 Tahap isolasi dan penapisan kapang
7
3 Proses persiapan bahan baku
7
4 Proses penelitian tahap hidrolisis
8
5 Penapisan kapang selulolitik dengan salinitas media yang berbeda
13
6 Isolat EN (a) pada media PDA, (b) konidia yang tumbuh pada miselia
15
7 Isolat kapang EN pada media PDB
16
8 Kurva pertumbuhan isolat kapang EN selama 27 hari
16
9 Pengaruh konsentrasi kapang dan lama waktu hidrolisis terhadap total
gula pereduksi
19
10 Pengaruh umur kapang terhadap nilai total glukosa
20
11 Kurva pertumbuhan ragi komersial selama fermentasi 7 hari
21
12 Kurva pengaruh waktu fermentasi terhadap total gula pereduksi
22
13 Kurva nilai pH selama fermentasi 7 hari
23

DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi media hidrolisis
2 Penyiapan starter Saccharomyces cerevisiae
3 Analisis ragam Univariate Analysis of Variance penapisan kapang
4 Uji lanjut Duncan pada penapisan kapang
5 Analisis ragam Univariate Analysis of Variance hidrolisis
6 Uji lanjut Duncan pada proses hidrolisis
7 Analisis ANOVA umur kapang terhadap nilai glukosa
8 Uji lanjut Duncan umur kapang
9 Analisis ANOVA waktu fermentasi
10 Uji lanjut Duncan waktu fermentasi

Halaman
28
29
29
30
32
32
34
34
35
35

1

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Sumber bahan bakar minyak di Indonesia yang semakin berkurang tetapi
kebutuhannya semakin meningkat, mendorong berbagai kalangan untuk mencari
sumber-sumber energi baru untuk menggantikan minyak bumi. Salah satunya
adalah bahan bakar dari sumberdaya hayati. Bahan bakar berbasis sumberdaya
hayati diharapkan dapat mengurangi terjadinya kelangkaan bahan bakar yang
berasal dari bahan baku fosil dan juga mengurangi pencemaran lingkungan,
sehingga lebih ramah lingkungan. Salah satu contoh bahan bakar dari sumberdaya
hayati adalah bioetanol. Bioetanol dapat dibuat dari bahan-bahan bergula, berpati,
atau berserat. Bahan baku yang biasa digunakan sebagai bioetanol antara lain
adalah singkong atau ubi kayu, tebu, nira, sorgum, ubi jalar, ganyong, rumput laut
dan lain-lain (Hambali et al. 2007). Bahan bakar bioetanol juga dapat berasal dari
limbah industri pengolahan. Limbah yang masih memiliki kandungan lignin,
selulosa dan hemiselulosa sangat potensial untuk dimanfaatkan menjadi bioetanol.
Pemanfaatan limbah akan mengurangi dampak terjadinya konflik atau kompetisi
terhadap pemenuhan bahan pangan.
Produksi rumput laut di Indonesia meningkat yaitu 2,791 juta ton pada
tahun 2009 dan 3,399 juta ton pada tahun 2010 (KKP 2012). Kandungan limbah
yang dihasilkan oleh pengolahan rumput laut tersebut salah satunya adalah selulosa.
Selulosa yang terkandung di limbah tersebut mencapai 15-25 % (Kim et al. 2008).
Selulosa merupakan komponen yang dapat dikonversi menjadi bioetanol. Etanol
yang diproduksi secara selulolitik dapat digunakan sebagai bahan bakar alternatif
yang dapat diperbaharui. Salah satu cara untuk mengkonversikan komponen pati
dan selulosa menjadi etanol yaitu dengan hidrolisis yang diikuti dengan
fermentasi (Samsuri et al. 2007).
Proses degradasi selulosa atau fermentasi menggunakan aktivitas mikroba
potensial contohnya kapang untuk menghasilkan gula dan selanjutnya khamir
Saccharomycess cerevisiae untuk produksi etanol. Produksi selulase dapat
diperoleh dari mikroorganisme terpilih melalui proses sakarifikasi. Proses
penapisan aktivitas enzim dan pre-treatment dapat meningkatkan kerja enzim dan
meningkatkan hasil akhir proses hidrolisis. Hidrolisis selulosa pada rumput laut
selama ini menggunakan larutan asam dan aktivitas enzim contohnya pada
penelitian Candra et al. (2011), hidrolisis rumput laut Eucheuma cotonii yang
menggunakan H2SO4 5%, sedangkan pada penelitian Kumar et al. (2013)
hidrolisis rumput laut coklat Sargassum spp menggunakan enzim selulase dan
β-glukosidase komersial. Hidrolisis kimiawi dan fisik akan menyebabkan
terjadinya peningkatan kandungan produk hasil samping sehingga kualitas
produk akhir akan lebih rendah dan sifat fungsionalnya akan berubah
(Sunarti et al. 2004). Penggunaan enzim komersial dalam proses hidrolisis akan
mengurangi efisiensi proses pembuatan bioetanol karena harga enzim yang mahal
sehingga diperlukan suatu alternatif untuk menghidrolisis rumput laut yaitu salah
satunya menggunakan mikroorganisme kapang.

2

Kemampuan kapang dalam mendegradasi komponen polisakarida menjadi
gula dibantu oleh enzim yang dimilikinya, contohnya enzim selulase dan xilanase.
Gula yang dihasilkan oleh kapang, selanjutnya diolah lebih lanjut untuk
menghasilkan etanol melalui proses fermentasi. Kapang sangat berperan dalam
industri fermentasi. Hal ini disebabkan kemampuannya dalam menghasilkan
etanol yang paling komersial saat ini (Sari et al. 2008). Selama ini kapang yang
digunakan dalam sakarifikasi pembentukan gula sederhana yaitu kapang darat
contohnya Trichoderma harzianum yang diisolasi dari tanah dan hasil pelapukan
kayu yang berasal dari hutan hujan tropis Amazon (Delabona et al. 2012).
Kapang endofit yang telah diisolasi berjumlah sekitar 6500 yaitu berasal
dari tanaman herbal dan pohon serta alga untuk mengetahui aktivitas biologis dan
profil kimianya. Proporsi kapang endofit yang diisolasi dari tanaman, alga dan
tanah untuk menghasilkan aktivitas biologis masing-masing sebesar 80%, 83%
dan 64% (Schulz et al. 2002). Kapang laut endofit umumnya diisolasi dari daun
mangrove, cangkang hewan laut, sedimen laut, alga dan koral. Beberapa tanaman
laut menghasilkan metabolit sekunder yang berpotensi sebagai antibakteri,
antifungi, antimalaria, antibakteri dan antitumor (Raghukumar 2008). Kapang
endofit menghasilkan aktivitas metabolit sekunder yang lebih aktif, sehingga
kapang endofit dari organisme maupun tumbuhan laut juga memiliki potensi
dalam mendegradasi selulosa namun keberadaannya belum banyak dikaji lebih
lanjut. Oleh karena itu, sangat penting untuk mengetahui potensi kapang endofit
dari laut dalam proses pembuatan bioetanol dengan limbah rumput laut. Penelitian
ini bertujuan untuk menentukan kapang selulolitik yang berpotensi, konsentrasi
kapang, umur kapang, waktu hidrolisis dan fermentasi terbaik dalam pembuatan
bioetanol.

Perumusan Masalah
Pada tahun 2010 produksi industri rumput laut meningkat sebesar 607.749
ton per tahun. Adanya peningkatan produksi rumput laut tersebut dapat
menyebabkan peningkatan limbah industri rumput laut yang dihasilkan. Limbah
yang dihasilkan pada setiap pengolahan rumput laut sekitar 65-75%. Limbah yang
tidak ditangani secara baik dan benar akan dapat mencemari lingkungan. Salah
satu cara mengurangi pencemaran limbah produksi rumput laut yaitu dengan
memanfaatkan limbah tersebut menjadi produk yang bernilai tambah. Limbah
pengolahan rumput laut (agar-agar kertas) dapat dimanfaatkan sebagai substrat
pembuatan bioetanol karena adanya kandungan selulosa yang terdapat pada
limbah rumput laut. Pembuatan bioetanol dilakukan dengan metode hidrolisis
enzimatis dan fermentasi sehingga perlu dilakukan optimasi pada proses hidrolisis
dan fermentasi untuk dapat menghasilkan kadar etanol yang tinggi.

Tujuan
1 Menentukan isolat kapang selulolitik terbaik
2 Menentukan konsentrasi kapang, umur kapang dan waktu hidrolisis terbaik
3 Menentukan waktu fermentasi terbaik

3

Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini yaitu tersedianya informasi tentang proses
hidrolisis limbah agar-agar dengan menggunakan isolat kapang laut endofit yang
dapat membantu optimasi proses hidrolisis dan dapat difermentasi menjadi etanol.

Hipotesis
Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
1 Penggunaan isolat kapang dan salinitas media yang berbeda memberikan
pengaruh terhadap nilai zona bening.
2 Penggunaan konsentrasi kapang, umur kapang dan waktu hidrolisis yang
berbeda memberikan pengaruh terhadap nilai glukosa.
3 Penggunaan waktu fermentasi yang berbeda memberikan pengaruh terhadap
nilai glukosa, pH dan pertumbuhan ragi komersial.

4

Road map mengenai kajian literatur penelitian bioetanol yang telah ada dan
perkembangan penelitian yang telah dilakukan dapat dilihat pada Gambar 1.
BIOETANOL

Bahan baku

Wiratmaja et al. (2011)
pemanfaatan limbah
rumput laut Eucheuma
cotonii

Sari et al. (2011)
pemanfaatan selulosa
dari limbah pengolahan
alginat

Borines et al. (2013)
pemanfaatan alga coklat
(Sargassum spp)

Proses

Hidrolisis

Fermentasi

Candra et al. (2011)
hidrolisis alga merah
menggunakan H2SO4

Idral et al. (2012)
proses fermentasi
menggunakan
Saccharomyces
cerevisiae

Kumar et al. (2013)
hidrolisis alga merah
(Glacilaria verrucosa)
menggunakan enzim
dari Trichoderma
reesei dan Aspergillus
niger

Azizah et al. (2012)
proses fermentasi
menggunakan ragi

Hidrolisis limbah agaragar dengan
menggunakan kapang
laut endofit untuk
mengoptimasi proses
hidrolisis
Gambar 1 Road map penelitian.
Penelitian yang telah dilakukan,
penelitian yang dilakukan

5

2 METODE

Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan mulai Bulan November 2012 sampai April 2014 di
Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Laboratorium Bioteknologi Hasil
Perairan II, dan Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi
Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan; Laboratorium Nutrisi
Pakan, Fakultas Peternakan; Laboratorium Pendidikan dan Layanan, Fakultas
Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor; Laboratorium Balai Pengkajian
Bioteknologi, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi, Serpong.

Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan untuk pembuatan bioetanol termasuk untuk
analisisnya adalah limbah agar-agar kertas di Pameungpeuk, kapang koleksi dari
Kustiariyah Tarman (Dosen Teknologi Hasil Perairan Fakultas Perikanan dan
Ilmu Kelautan IPB) yaitu Isolat EN dari Enhalus di Pulau Karya Kepulauan
Seribu, Veronaea sp. KT19 dari pasir laut, dan Isolat SMH dari spons; kapang
hasil isolasi dari rumput laut dan daun mangrove, ragi komersial (Fermipan),
Potato Dextrose Agar (Difco), Potato Dextrose Broth (Difco), reagen Asam 3,5dinitrosalisilat (DNS) (Sigma), glukosa (Merck), NaCl (Merck), Carboxyl Methyl
Cellulose (CMC), congo red (Sigma), media Andreoti dapat dilihat pada
Lampiran 1, dan media Cellulolysis Basal Medium (CBM).
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini yaitu mikroskop (Cole
Palmer), inkubator (Thermoline 42000), autoclave (YamatoSM 52), sentrifuse
(Himac CR 21G), pipet mikro (Gilson), Clean Banch (Thermo Scientific 1300
series A2), pH-meter, spektrofotometer (Yamato), oven (Yamato SH 62), orbital
shaker, High Performance Liquid Chromatography (HPLC).

Pelaksanaan Penelitian
Penelitian ini terdiri dari tiga tahap, yaitu tahap pertama yaitu isolasi dan
penapisan kapang. Tahap kedua yaitu optimasi hidrolisis dengan menentukan
konsentrasi kapang, umur kapang dan waktu hidrolisis terbaik. Tahap ketiga yaitu
optimasi waktu proses fermentasi berdasarkan nilai gula pereduksi dan jumlah
kepadatan ragi selama proses fermentasi sehingga mendapatkan konsentrasi etanol
yang tinggi.
Tahap Isolasi dan Penapisan Kapang
Isolasi Kapang Endofit (Tarman 2011)
Isolasi kapang laut endofit dilakukan dengan cara sterilisasi permukaan.
Sampel dipotong sebesar ±1 cm dan ditanam di dalam media PDA yang telah
ditambahkan kloramfenikol 1 mg/L dan diinkubasi pada suhu ruang selama 3 hari.

6

Penapisan Kapang Selulolitik (Purwadaria et al. 2003)
Penapisan kapang selulolitik dengan metode zona bening dilakukan
dengan menggunakan pewarnaan merah kongo 0,1%. Proses isolasi dan penapisan
kapang dapat dilihat pada Gambar 2. Isolat kapang ditumbuhkan pada media
Cellulolysis Basal Medium (CBM) yang berbeda (air tawar, air laut dan NaCl 3%)
dengan sumber karbonnya yaitu CMC. Kapang diinkubasi selama 6 hari pada
suhu ruang. Penentuan kapang selulolitik dilihat dari indeks selulolitik zona
bening yang terbentuk. Indeks selulolitik merupakan nisbah antara diameter zona
bening dengan diameter koloni. Semakin besar indeks selulolitik yang dihasilkan
maka semakin besar enzim yang dihasilkan oleh koloni kapang tersebut. Indeks
selulolitik diperoleh dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
Indeks selulolitik =

Diameter zona bening (mm)
Diameter koloni (mm)

Pengukuran Pertumbuhan Kapang (Subowo 2010)
Isolat kapang endofit rumput laut yang terpilih berdasarkan uji zona bening
ditumbuhkan pada media cair PDB. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu ruang
selama 21 hari. Pengukuran bobot biomassa kapang dilakukan setiap 3 hari.
Miselium kapang yang tumbuh di dalam media PDB kemudian disaring dengan
menggunakan kertas saring Whatman No 1 dan dikeringkan dalam oven selama
24 jam pada suhu 80oC. Bobot kering miselium ditentukan dengan menghitung
selisih bobot antara kertas saring kosong dengan kertas saring yang berisi
miselium.
Tahap Hidrolisis
Bahan baku yang digunakan yaitu limbah padat agar-agar yang didapatkan
dari industri agar-agar kertas Cap Apel di daerah Pameungpeuk, Garut. Skema
persiapan bahan baku dapat dilihat pada Gambar 3. Pada penelitian tahap
hidrolisis ini terdiri dari penentuan jumlah konsentrasi kapang, umur kapang dan
lama waktu hidrolisis. Proses penelitian tahap hidrolisis dapat dilihat pada
Gambar 4.
Penentuan Konsentrasi Kapang dan Waktu Hidrolisis
Hidrolisis enzimatis dilakukan dengan modifikasi metode Sari et al. (2011)
dan media Andreoti yang digunakan mengacu pada Muthuvelayudham dan
Viruthagiri (2006). Limbah agar-agar kering dihidrolisis pada pH 5,66 secara
enzimatis dengan menggunakan kapang terpilih dengan konsentrasi yang berbeda
(2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20%). Konsentrasi limbah yang digunakan adalah
1,5%. Lama waktu hidrolisis yang digunakan yaitu 3, 6, dan 9 hari dan ditentukan
berdasarkan nilai gula pereduksi (Miller et al. 1960).

7

Rumput laut

Sterilisasi permukaan
rumput laut
Tanam pada media PDA +
Kloramfenikol
Isolat kapang
Uji selulolitik [(salinitas
media CBM berbeda
(NaCl 3%, air laut dan
air tawar)]

Isolat kapang terpilih

Kultivasi kapang
Pengukuran biomassa
kapang

Pertumbuhan
kapang
Gambar 2 Tahap isolasi dan penapisan kapang
Limbah padat agar-agar

Pengeringan (3-4 hari)
Penepungan
Pengayakan (80-100 mesh)

Limbah agar-agar kering

Analisis:
- Kadar selulosa
- Kadar hemiselulosa
- Kadar lignin
- Kadar air
- Kadar abu

Gambar 3 Proses persiapan bahan baku

8

Limbah kering agar-agar

Penambahan media Andreoti
Pengaturan pH 5 dengan penambahan HCl dan NaOH
Sterilisasi (121 oC, 20 menit)
Hidrolisis (30 oC, 120 rpm) selama 3, 6, 9 hari
(Konsentrasi dan umur kapang yang berbeda)

-

Gula pereduksi
Selulosa

Gambar 4 Proses penelitian tahap hidrolisis
Penentuan Umur Kapang
Hidrolisis enzimatis dilakukan dengan modifikasi metode Sari et al. (2011)
dan modifikasi media Andreoti (Muthuvelayudham dan Viruthagiri 2006).
Limbah agar-agar kering dihidrolisis secara enzimatis dengan menggunakan
kapang dengan konsentrasi yang terpilih (20% b/v) dengan lama waktu hidrolisis
yang terbaik (3 hari). Kapang yang digunakan yaitu dengan umur 3, 6, 9, 12, 15,
18, dan 21 hari. Umur kapang ditentukan berdasarkan nilai gula pereduksi yang
dihasilkan (Miller et al.1960).
Tahap Fermentasi
Proses fermentasi dilakukan berdasarkan modifikasi metode Azizah et al.
(2012). Hidrolisat yang akan digunakan diset menjadi pH 5,01; kemudian
disterilisasi pada suhu 121 oC selama 20 menit. Inokulasi ragi komersial (10%)
(Lampiran 2) ditambahkan ke dalam media. Proses fermentasi berlangsung selama
7 hari pada suhu 32 oC. Pengambilan sampel dilakukan selama 24 jam untuk
dianalisis tingkat pertumbuhan yeast berdasarkan nilai Total Plate Count (TPC)
dan pH. Pengujian etanol dilakukan pada sampel yang terbaik berdasarkan nilai
gula pereduksi dan pertumbuhan ragi komersial selama fermentasi.
Prosedur Pengujian
Uji Kadar Selulosa (SNI 0444; 2009)
Kadar Holoselulosa (Hemiselulosa dan Selulosa)
Limbah agar-agar sebanyak 2,5 gram ditambahkan dengan 100 mL akuades,
1 gram natrium klorit dan 1 mL asam asetat glasial kemudian dipanaskan pada
suhu 80 oC. Selama pemanasan dilakukan penambahan 1 gram natrium klorit dan

9

0,2 mL asam asetat setiap 1 jam hingga 4 kali. Limbah disaring dan dicuci dengan
air panas kemudian ditambahkan 25 mL asam asetat 10% selanjutnya dicuci
kembali hingga bebas asam. Limbah yang telah bebas asam (holoselulosa)
kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105 oC selama 6 jam.
Holoselulosa, % = (A/B) x 100%
dengan:
A = bobot holoselulosa (gram)
B = bobot kering sampel (gram)
Kadar Selulosa
Limbah agar-agar sebanyak 2,5 gram ditambahkan dengan 125 mL larutan
asam sitrat 3,5% kemudian dipanaskan selama 12 jam pada suhu 80 oC. Limbah
disaring hingga tidak berwarna dan dikeringkan pada suhu ruang, kemudian
ditambahkan 125 mL larutan campuran NaOH dan Na2SO3 dan dipanaskan
selama 2 jam pada suhu 50 oC. Limbah disaring dan selanjutnya dicuci kembali
dengan air hingga filtrat tidak berwarna. Filtrat limbah kemudian ditambah 50 mL
larutan natrium klorit 10% dan dilakukan pencucian dengan menggunakan air
hingga diperoleh endapan berwarna putih kemudian ditambahkan 100 mL asam
asetat 10% dan dilakukan pencucian hingga bebas asam. Untuk mendapatkan
kadar selulosa maka filtrat dikeringkan pada suhu 105 oC selama 6 jam.
Selulosa, % = (A/B) x 100%
A = bobot selulosa, gram
B = bobot kering sampel, gram
Kadar Hemiselulosa
Kadar hemiselulosa diperoleh dari pengurangan
holoselulosa dengan kadar selulosa.
Hemiselulosa (%) = holoselulosa (%) – selulosa (%)

persentase

kadar

Uji Kadar Lignin (SNI 0492:2008)
Limbah agar-agar sebanyak 2 gram diekstraksi dengan alkohol benzen (1:2).
Ekstrak limbah direndam selama 2 jam dalam asam sulfat 72% sebanyak 40 mL
pada suhu 20 °C kemudian dimaserasi selama 2-3 menit. Ekstrak limbah
dipanaskan hingga mendidih selama 4 jam kemudian didinginkan hingga endapan
lignin mengendap sempurna. Endapan lignin disaring dan dicuci dengan air panas
hingga bebas asam kemudian dikeringkan pada suhu 105 oC selama 6 jam.
Berat sampel kering (g)
x 100%
Kadar lignin (%) = Berat endapan lignin (g)
Penentuan Nilai Glukosa Metode DNS (Miller 1959)
Penyiapan Pereaksi DNS
Pereaksi DNS dibuat dengan melarutkan 10,6 g asam 3,5 dinitrolisilat dan
19,8 NaOH ke dalam 1416 mL air. Setelah itu ditambahkan 306 g Na-K Tatrat,
7,6 g fenol yang dicairkan pada suhu 50 oC dan 8,3 g Na-Metabisulfit. Larutan ini
diaduk rata, kemudian 3 mL larutan ini dititrasi dengan HCl 0,1 N dengan
indikator fenolftalein. Banyaknya titran berkisar 5–6 mL, jika kurang dari itu
harus ditambahkan 2 g NaOH untuk setiap mL kekurangan HCl 0,1 N.

10

Penentuan Kurva Standar
Kurva standar dibuat dengan mengukur nilai gula pereduksi (glukosa)
dengan interval 0,2–0,5 mg/L. Kemudian nilai glukosa dicari dengan metode
DNS. Hasil yang didapatkan diplotkan dalam grafik secara linear.
Penetapan Nilai Glukosa
Pengujian glukosa menggunakan kurva standar DNS adalah sebagai berikut:
1 mL sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 3 mL
pereaksi DNS. Larutan tersebut ditempatkan dalam air mendidih selama 5 menit
kemudian didinginkan pada suhu ruang. Pengukuran absorbansi sampel pada
panjang gelombang 550 nm.
Penentuan Kadar Etanol
Analisis crude etanol sampel dilakukan menggunakan HPLC (High
Performance Liquid Chromatography). Water 1525EF Binary HPLC Pump
dengan spesifikasi sebagai berikut:
 Fase gerak
: H2SO4 0.008 N
 Kolom
: Aminex® HPX-87H, 300 mm x 7.8 mm
 Detektor
: Reactive Index
 Laju aliran
: 1 mL/min
 Volume injeksi : 20 µL
 Suhu kolom
: 35 oC
 Back Pressure : 1176 psi
Perhitungan kadar etanol (g/L) yaitu sebagai berikut:
Jumlah etanol (g/L) =

Konsentrasi standar (g/L)
Luas area standar

x Luas area sampel

Analisis Data
Data pada perlakuan penapisan kapang selulolitik dan penentuan hidrolisis
terbaik dianalisis dengan menggunakan rancangan percobaan faktorial.
Rancangan percobaan pada penapisan kapang selulolitik yaitu menggunakan
faktorial 7x3 yang terdiri dari jenis kapang sebanyak 7 taraf faktor (isolat kapang
EN, KT19, SMH, D1, D3, RL6, RL9) dan jenis salinitas media sebanyak 3 taraf
faktor (NaCl 3%, air laut, air tawar ). Pada perlakuan hidrolisis menggunakan
rancangan percobaan fakorial 10x3 yang terdiri dari konsentrasi kapang sebanyak
10 taraf faktor (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20%) dan waktu hidrolisis sebanyak 3
taraf faktor (3, 6, 9 hari). Perlakuan ini dianalisis menggunakan Univariate
Analysis of Variance dengan kaidah pengambilan keputusan sebagai berikut (Steel
and Torrie 1993):
Yijk

= µ + αi + βj + (αβ)ij + εijk

11

Keterangan :
Yijk
: Hasil pengamatan pada ulangan ke-k yang menerima taraf ke-i dari
faktor konsentrasi kapang/ jenis isolat kapang dan taraf ke-j dari faktor
waktu hidrolisis/ jenis salinitas media
µ
: Nilai tengah umum
αi
: Pengaruh faktor konsentrasi kapang/ isolat kapang pada taraf ke i
εijk
: Komponen galat pada taraf ke-i, taraf ke-j dan interaksi yang ke-i dan
ke-j, serta pada ulangan ke-k.
Berdasarkan uji Univariate Analysis of Variance, perlakuan pada tahap
penentuan kapang selulolitik yang memberikan pengaruh nyata (p