Pembuatan Pepton Kacang Tanah dengan Enzim Papain Kasar untuk Media Pertumbuhan Bakteri
PEMBUATAN PEPTON KACANG TANAH
DENGAN ENZIM PAPAIN KASAR
UNTUK MEDIA PERTUMBUHAN BAKTERI
NINUK GILANG WIRANTI
DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERRTANIAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Pembuatan Pepton
Kacang Tanah dengan Enzim Papain Kasar untuk Media Pertumbuhan Bakteri
adalah benar karya saya dengan arahan dari dosen pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Ninuk Gilang Wiranti
NIM F34100120
ABSTRAK
NINUK GILANG WIRANTI. Pembuatan Pepton Kacang Tanah dengan Enzim
Papain Kasar untuk Media Pertumbuhan Bakteri. Dibimbing oleh MULYORINI
RAHAYUNINGSIH.
Pepton merupakan komponen penting dalam media pertumbuhan mikroba
yang berperan sebagai sumber nitrogen. Rata-rata impor pepton yang mencapai
US $17.84 juta per tahun dalam lima tahun terakhir merupakan peluang tersendiri
untuk pengembangan pepton dengan memanfaatkan bahan sumber protein yang
tersedia di Indonesia, seperti kacang tanah. Tujuan penelitian ini adalah untuk
menghasilkan pepton kacang tanah dengan hidrolisis enzimatis menggunakan
enzim papain kasar, menentukan kondisi hidrolisis terbaik (waktu hidrolisis,
konsentrasi enzim, dan suhu hidrolisis), dan mengujicobakan pepton kacang tanah
sebagai media pertumbuhan bakteri. Kadar protein kacang tanah yang digunakan
adalah 21.84% dan aktivitas enzim papain kasar yang digunakan sebesar 5057.47
U/g.menit. Proses hidrolisis berlangsung dengan menggunakan substrat kacang
tanah dan air dengan perbandingan 1:2. Kondisi hidrolisis terbaik untuk
menghasilkan pepton kacang tanah dicapai dengan menggunakan enzim papain
sebesar 0.4% dengan hidrolisis selama 4 jam pada suhu 55 oC. Pepton yang
dihasilkan merupakan produk cair berwarna kuning kecoklatan, supernatan dari
proses sentrifugasi. Rendemen proses hidrolisis ini adalah 1.23 ml/g kacang tanah.
Kandungan asam amino tertinggi pepton ini adalah asam glutamat. Hasil
pengujian pertumbuhan pada Escherichia coli dan Staphylococcus aureus
menunjukkan bahwa pepton kacang tanah dapat digunakan sebagai komponen
dalam media pertumbuhan bakteri.
Kata kunci: Escherichia coli, hidrolisis enzimatis, papain, pepton kacang tanah,
Staphylococcus aureus
ABSTRACT
NINUK GILANG WIRANTI. Peanut Peptone Production by Crude Papain for the
Bacterial Growth Media. Supervised by MULYORINI RAHAYUNINGSIH.
Peptone is an important component in the microbial growth media which
is a nitrogen source. The average imported peptone which reaches US $17.84
milion per year in the last five years become an open chance for peptone
development using protein source material that is available in Indonesia, such as
protein of peanuts. The objectives of this research were to produce peanut peptone
by enzymatic hydrolysis using crude papain, to determine the best hydrolysis
condition (hydrolysis time, papain concentration, and hydrolysis temperature), and
use peanut peptone as microbial growth media. Protein content of peanut was
21.84% and the activity of papain used in this experiment was 5057.47 U/g·min.
Hydrolysis process have taken place by using peanut and water with ratio 1:2. The
best hydrolysis condition of peanut peptone was achieved by using 0.4% papain
for 4 hours incubation in temperature 55 oC. The obtained peptone was brownish
yellow and liquid form as supernatant from the sentrifugation process. The yield
of the hydrolysis process to produce peanut peptone was 1.23 ml/g peanut. Peanut
peptone had high glutamic acid as amino acid content. Growth test with
Escherichia coli and Staphylococcus aureus showed that peanut peptone could be
used as component for microbial growth media.
Keywords: Enzymatic hydrolysis, Escherichia coli, papain, peanut peptone,
Staphylococcus aureus
PEMBUATAN PEPTON KACANG TANAH
DENGAN ENZIM PAPAIN KASAR
UNTUK MEDIA PERTUMBUHAN BAKTERI
NINUK GILANG WIRANTI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Teknologi Pertanian
pada
Departemen Teknologi Industri Pertanian
DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Pembuatan Pepton Kacang Tanah dengan Enzim Papain Kasar
untuk Media Pertumbuhan Bakteri
Nama
: Ninuk Gilang Wiranti
NIM
: F34100120
Disetujui oleh
Dr. Ir. Hj. Mulyorini Rahayuningsih, M.Si
Pembimbing I
Diketahui oleh
Prof. Dr. Ir. Nastiti Siswi Indrasti
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang
dipilih dalam penelitian ini adalah Pembuatan Pepton Kacang Tanah dengan
Enzim Papain Kasar untuk Media Pertumbuhan Bakteri. Penelitian ini
dilaksanakan di Laboratorium Bioindustri dan Laboratorium DIT, Departemen
Teknologi Industri Pertanian IPB, mulai bulan Februari hingga Mei 2014 dengan
sumber pendanaan dari Ditjen DIKTI melalui Program Kreativitas Mahasiswa
(PKM).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Hj. Mulyorini Rahayuningsih,
M.Si selaku pembimbing akademik yang selalu membimbing dan mengarahkan
penulis selama penelitian dan penyusunan skripsi. Penulis juga berterima kasih
kepada Dr. Ir. Muslich, M.Si dan Drs. Purwoko, M.Si selaku dosen penguji atas
saran yang diberikan. Selain itu, kepada staf laboratorium, kelompok PKM dan
keluarga TIN 47 yang banyak memberikan bantuan teknis kepada penulis.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada bapak, ibu, serta seluruh
keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2014
Ninuk Gilang Wiranti
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
ix
DAFTAR GAMBAR
ix
DAFTAR LAMPIRAN
ix
DAFTAR GAMBAR
x
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
Ruang Lingkup Penelitian
2
METODE
2
Bahan
2
Alat
3
Prosedur Percobaan
3
Rancangan Percobaan
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
6
Enzim Papain Kasar
6
Komposisi Kimia Bahan Baku
7
Waktu Hidrolisis dan Konsentrasi Enzim Terbaik
7
Suhu Hidrolisis Terbaik
9
Asam Amino Pepton Kacang Tanah
10
Aplikasi Pepton Kacang Tanah sebagai Media Pertumbuhan Bakteri
11
SIMPULAN DAN SARAN
13
Simpulan
13
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
16
RIWAYAT HIDUP
23
DAFTAR TABEL
1 Data perolehan enzim papain kasar dari getah buah pepaya
6
2 Komposisi kimia kacang tanah
7
DAFTAR GAMBAR
1 Diagram alir pembuatan pepton kacang tanah
4
2 Pengaruh waktu hidrolisis dan konsentrasi enzim terhadap nilai NTT/NTB
8
3 Pengaruh suhu hidrolisis terhadap nilai NTT/NTB
9
4 Kandungan asam amino pepton kacang tanah perlakuan terbaik ( ) dan
pepton komersial ( )
10
5 Nilai pertumbuhan Escherichia coli pada (a) media cair dan (b) media padat 11
6 Nilai pertumbuhan Staphylococcus aureus pada (a) media cair dan (b) media
padat
12
DAFTAR LAMPIRAN
1 Analisis ragam penentuan waktu hidrolisis dan konsentrasi enzim terbaik
16
2 Hasil uji lanjut Duncan pengaruh interaksi waktu hidrolisis dan konsentrasi
enzim terhadap nilai NTT/NTB
16
3 Analisis ragam penentuan suhu hidrolisis terbaik
16
4 Hasil uji lanjut Duncan pengaruh suhu terhadap nilai NTT/NTB
17
5 Kadar asam amino beberapa jenis pepton
17
6 Nilai kekeruhan media cair Escherichia coli setelah 24 jam
18
7 Hasil analisis ragam pertumbuhan Escherichia coli pada medium cair
18
8 Hasil uji lanjut Duncan data kekeruhan media Escherichia coli
19
9 Hasil uji TPC Escherichia coli
19
10 Hasil analisis ragam TPC Escherichia coli
20
11 Nilai kekeruhan media cair Staphylococcus aureus setelah 24 jam
20
12 Hasil analisis ragam nilai kekeruhan media Staphylococcus aureus
20
13 Hasil uji lanjut Duncan data kekeruhan media Staphylococcus aureus
21
14 Hasil TPC Staphylococcus aureus
21
15 Hasil analisis ragam TPC Staphylococcus aureus
22
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pepton merupakan hidrolisat protein yang banyak digunakan sebagai salah
satu komponen nutrisi dalam media pertumbuhan mikroorganisme. Pepton dalam
media pertumbuhan mikroba, berfungsi sebagai sumber nitrogen bagi
mikroorganisme. Penggunaan pepton sangat luas mencakup penggunaan pada
laboratorium mikrobiologi hingga pada industri berbasis bioteknologi. Selama ini
kebutuhan pepton di Indonesia masih dipenuhi melalui impor dengan jumlah dan
harga yang sangat tinggi. Impor produk ini dilakukakan karena industri pepton
Indonesia belum dikembangkan. Pada tahun 2013, impor pepton di Indonesia
mencapai nilai sebesar US $20.76 juta dengan jumlah sebesar 5 102 ton. Nilai
tersebut meningkat dibanding tahun 2012 yaitu US $12.15 juta dengan kuantitas
sebesar 3 296 ton (BPS 2014). Tingginya nilai impor tersebut dapat menjadi
peluang untuk melakukan pengembangan pepton dengan memanfaatkan bahan
sumber protein yang tersedia di Indonesia, seperti protein kacang tanah.
Menurut Dwivedi et al. (1996), kacang tanah memiliki kandungan protein
sekitar 22-30% sehingga potensial dikembangkan, termasuk untuk memproduksi
pepton. Potensi kacang tanah ini pun dinilai semakin besar berdasarkan data
produktivitas kacang tanah yang meningkat di tahun 2013. Produktivitas tersebut
mencapai 13.52 ku/ha dibanding tahun 2012 sebesar 12.74 ku/ha. Selain itu,
pengembangan protein kacang tanah sebagai bahan baku produksi pepton belum
pernah dikaji sehingga penelitian ini sangat penting untuk dilakukan. Berdasarkan
data konsumsi kacang tanah pada tahun 2006-2011 (Kementerian Pertanian 2013),
diketahui bahwa rata-rata konsumsi kacang tanah lepas kulit sebesar 739 167 ton
dari rata-rata penyediaan dalam negeri sebesar 883 000 ton. Dengan demikian
terdapat rata-rata 143 833 ton kacang tanah yang tersedia (tidak dikonsumsi) dan
dapat dikembangkan. Pengembangan pepton kacang tanah diharapkan dapat
memberikan nilai tambah dalam pemanfaatan protein kacang tanah di Indonesia,
terutama dalam memanfaatkan limbah bungkil kacang tanah pada industri yang
memproduksi minyak kacang tanah. Pengembangan pepton dari protein kacang
tanah ini diharapkan dapat mengurangi ketergantungan impor pepton di Indonesia
yang selama ini masih dilakukan.
Penelitian mengenai produksi pepton secara hidrolisis enzimatis telah
banyak dilakukan. Akan tetapi, penelitian tersebut umumnya menggunakan
sumber protein hewani sebagai bahan baku. Nurhayati et al. (2007) dan Wijayanti
(2009) telah meneliti mengenai produk hidrolisat ikan selar dengan enzim papain.
Selain itu, Suhandana (2010) meneliti tentang produksi pepton dari jeroan ikan
tongkol dan Fitra (2013) menggunakan ikan hasil tangkap sampingan busuk.
Pepton pada penelitian ini dibuat dengan memanfaatkan kacang tanah sebagai
sumber protein nabati dengan menggunakan dasar metode penelitian Nurhayanti
et al. (2007) dan Wijayanti (2009).
Produksi pepton dapat dilakukan dengan cara hidrolisis enzimatis
menggunakan enzim protease. Kelebihan proses enzimatis adalah tidak
memerlukan suhu tinggi, proses hidrolisis berlangsung secara spesifik, dan dapat
mengkonservasi semua asam amino yang ada. Proses hidrolisis dengan cara asam
2
dapat merusak sebagian atau semua asam-asam amino tertentu karena kondisi
proses yang berlangsung pada suhu tinggi. Selain itu, produk pepton yang
diperoleh dari proses hidrolisis asam memiliki kandungan garam yang tinggi
karena adanya pembentukan garam pada proses netralisasi (BD 2009).
Faktor yang mempengaruhi kecepatan hidrolisis enzimatis adalah waktu, pH,
suhu, konsentrasi, dan perbandingan enzim dengan protein (Kirk et al. 1953).
Oleh karena itu dalam memproduksi pepton kacang tanah secara enzimatis
diperlukan penggunaan kondisi hidrolisis terbaik sehingga produk dapat
dihasilkan secara optimal. Pada penelitian ini dilakukan penentuan kondisi
hidrolisis terbaik dalam memproduksi pepton kacang tanah. Kondisi yang dikaji
meliputi waktu hidrolisis, konsentrasi enzim, dan suhu hidrolisis.
Tujuan Penelitian
-
Tujuan penelitian ini adalah untuk:
menghasilkan pepton nabati dari kacang tanah menggunakan enzim papain
kasar;
menentukan waktu hidrolisis, konsentrasi enzim, dan suhu hidrolisis terbaik
dalam proses pembuatan pepton kacang tanah;
mengujicobakan produk pepton kacang tanah sebagai media pertumbuhan
bakteri.
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah memberikan alternatif pemanfaatan protein
kacang tanah untuk dikembangkan menjadi produk dengan potensi pengembangan
dan nilai ekonomis yang tinggi.
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini adalah memproduksi pepton kacang tanah
dalam bentuk cair, yang merupakan cairan/supernatan hasil sentrifugasi. Pepton
ini kemudian diujicobakan sebagai media pertumbuhan untuk bakteri Escherichia
coli dan Staphylococcus aureus dan dibandingkan dengan pepton komersial
(BactoTMpeptone).
METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kacang tanah, getah
pepaya, natrium metabisulfit, natrium klorida, yeast extract, BactoTMpeptone
(pepton komersial), agar bakteriologis, alkohol, biakan Escherichia coli
Staphylococcus aureus, Nutrient Broth dan akuades.
3
Alat
Alat-alat yang digunakan untuk preparasi enzim papain meliputi pisau,
wadah penampung getah, neraca, kertas saring, oven, dan blender. Peralatan untuk
hidrolisis meliputi erlenmeyer, termometer, water bath, inkubator, penyaring
ukuran 225 mesh berbahan monyl, tabung setrifugasi, alat sentrifugasi, dan
aluminium foil. Peralatan lain yang digunakan antara lain yaitu bunsen, jarum
inokulasi/ose, tabung reaksi bertututp ulir, cawan petri, colony counter quebec,
autoklaf, clean bench, dan spektrofotometer.
Prosedur Percobaan
Preparasi Enzim Papain Kasar (Hasbullah 2001 )
Enzim papain kasar yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari
penyadapan getah buah pepaya muda. Waktu yang tepat untuk melakukan
penyadapan adalah pagi hari (05.30-08.00) atau sore hari (17.30-18.30).
Penyadapan dilakukan terhadap buah muda yang berdiameter 6-7 cm atau
berumur 2.5-3 bulan, dengan menoreh kulit buah mulai pangkal menuju ujung
buah sedalam 1-2 mm. Tetesan getah ditampung dalam wadah plastik.
Penyadapan dapat dilakukan setiap dua atau tiga hari. Sementara itu larutan
pengaktif disiapkan, dengan melarutkan 14 gram natrium metabisulfit dan 3 gram
natrium klorida dalam 1 liter air. Getah pepaya hasil penyadapan dicampurkan
dalam pengaktif dengan perbandingan 1:1 (b/v) kemudian diaduk hingga
terbentuk bubur. Bubur disaring menggunakan penyaring untuk memisahkan
kotoran. Getah tersebut dituang ke piring porselen untuk dikeringkan pada oven
bersuhu ±55 oC. Setelah kering, getah diubah menjadi serbuk dengan
penggilingan. Bubuk enzim yang diperoleh dikarakterisasi untuk mengetahui nilai
aktivitas enzim.
Preparasi Kacang Tanah
Kacang tanah digiling agar diperoleh kacang tanah yang berukuran lebih
kecil dan seragam. Bahan ini dilakukan karakterisasi untuk mengetahui komposisi
kimia seperti kandungan protein.
Penentuan Waktu Hidrolisis dan Konsentrasi Enzim Terbaik
Pada tahap ini ditentukan kondisi hidrolisis terbaik pada pembuatan pepton,
dengan perlakuan konsentrasi enzim dan waktu hidrolisis. Kacang tanah
ditambahkan akuades dengan perbandingan 1:2 (b/v) dan enzim pada berbagai
konsentrasi (0.2%; 0.4%; dan 0.6%). Campuran tersebut dicampurkan dalam
erlenmeyer lalu diaduk sampai tercampur rata. Sampel diberikan perlakuan waktu
hidrolisis selama 4, 6, dan 8 jam. Hidrolisis ini dilakukan pada suhu 60 oC dengan
menggunakan inkubator. Hidrolisis dihentikan dengan inaktivasi enzim pada suhu
85 oC selama 15 menit dalam water bath. Setelah itu, sampel disaring dengan
penyaring berukuran 225 mesh dan disentrifugasi (4000 rpm selama 15 menit)
untuk memperoleh fraksi terlarut berupa supernatan.
Kondisi hidrolisis terbaik dalam produksi pepton kacang tanah dapat
dinilai berdasarkan pengujian total nitrogen dengan metode Kjeldahl. Rasio
4
nitrogen total terlarut dan nitrogen total bahan (NTT/NTB) tertinggi menunjukkan
kodisi hidrolisis terbaik untuk memperoleh pepton kacang tanah. Selain itu,
dilakukan pula pengujian untuk mengetahui kandungan asam amino pepton,
dengan metode HPLC di Laboratorium Terpadu IPB.
Penentuan Suhu Hidrolisis Terbaik
Pada tahap ini proses hidrolisis untuk memperoleh pepton dilakukan
menggunakan waktu hidrolisis dan konsentrasi enzim terbaik berdasarkan hasil
percobaan sebelumnya. Langkah percobaan dilakukan dengan mempersiapkan
kacang tanah dan enzim dengan konsentrasi terbaik dan dengan penambahan air
1:2 (bahan:air). Hidrolisis dilakukan pada suhu 50, 55, dan 60 oC. Hidrolisat
protein yang dihasilkan dapat diuji seperti pada tahap penelitian sebelumnya.
Percobaan ini dilakukan dengan dua kali ulangan. Diagram alir proses pembuatan
pepton dapat merujuk pada Gambar 1.
Kacang
tanah
Air
Pencampuran
Enzim
papain
Hidrolisis pada inkubator
Inaktivasi enzim
(85 oC, 15 menit)
Penyaringan dan
sentrifugasi
Minyak,
Padatan
Pepton
Gambar 1 Diagram alir pembuatan pepton kacang tanah
(Nurhayati et al. (2008); Wijayanti (2009))
Pengujian Pepton sebagai Media Cair Pertumbuhan Bakteri
Pada tahap ini, pepton kacang tanah yang dihasilkan, diujicobakan sebagai
media pertumbuhan bakteri dan membandingkan dengan pepton komersial
(BactoTMpeptone). Pengujian dilakukan untuk dua jenis bakteri yaitu Escherichia
coli dan Staphylococcus aureus.
Biakan bakteri terlebih dahulu disegarkan pada media nutrient broth
selama 24 jam sebelum dipindahkan ke media mengandung pepton hasil
percobaan. Medium pertumbuhan dibuat dengan menyiapkan larutan yang
mengandung yeast extract 0.5%, dan NaCl 1%. Campuran ini dimasukkan
sebanyak 9 ml ke dalam tabung ulir. Setiap sampel pepton diujikan ke dalam tiga
5
tabung media cair (diinokulasikan baketeri) dan disiapkan juga satu tabung media
cair tanpa diinokulasi (blanko). Pepton komersial sebagai pembanding disiapkan
terpisah dalam bentuk larutan dengan konsentrasi 10%. Pepton komersial tersebut
dipipet sebanyak 1 ml ke dalam tabung ulir berisi campuran yeast extract dan
NaCl sehingga konsentrasi pepton dalam media sebesar 1%. Sementara itu,
pepton kacang tanah ditambahkan sebanyak ±1 ml dengan menyetarakan nilai
total nitrogen pepton kacang tanah dengan pepton komersial (pengaturan volume).
Medium ini disterilisasi pada suhu 121 oC selama 15 menit sebelum diinokulasi.
Inokulasi bakteri dilakukan dengan memasukkan masing-masing 1 ml
kultur hasil penyegaran ke dalam tabung ulir berisi media steril. Setelah itu,
dilakukan inkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Pengamatan pertumbuhan
bakteri secara kualitatif dilakukan dengan mengukur perubahan kekeruhan
medium cair setelah 24 jam dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 620 nm. Pada setiap sampel uji, media cair yang tidak diinokulasikan
digunakan sebagai blanko sampel tersebut.
Pengujian Pepton sebagai Media Padat Pertumbuhan Bakteri
Medium yang digunakan untuk uji ini memiliki komposisi yang sama
seperti komposisi medium cair dengan penambahan agar bakteriologi sebanyak
1.5%. Inokulasi dilakukan dengan teknik tuang (pour plate). Bakteri pada tingkat
pengenceran tertentu dipipet 0.5-1 ml ke dalam cawan. Setelah itu, medium
dituang ke dalam cawan dan didiamkan hingga memadat. Cawan kemudian
diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam. Jumlah bakteri yang tumbuh dihitung
dengan colony counter quebec sebagai nilai pertumbuhan kuantitatif.
Rancangan Percobaan
Data yang diperoleh pada masing-masing tahapan penelitian dianalisis
secara statistik dengan analisis ragam untuk mengetahui pengaruh faktor terhadap
nilai uji tertentu. Analisis ragam ini dilakukan dengan menggunakan software
SPSS 16 dan Microsoft Excel 2010. Rancangan percobaan yang digunakan adalah
rancangan percobaan acak lengkap faktorial, dan hasil analisis yang menunjukkan
berbeda nyata dilakukan uji lanjut Duncan.
Penentuan Waktu Hidrolisis dan Konsentrasi Enzim Terbaik
Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian tahap ini adalah
rancangan percobaan acak lengkap faktorial dengan dua faktor dan dua kali
ulangan. Faktor yang diamati adalah waktu hidrolisis dan konsentrasi enzim,
dengan masing-masing tiga taraf yaitu 4, 6, dan 8 jam untuk faktor waktu
hidrolisis dan 0.2, 0.4, dan 0.6% untuk faktor konsentrasi enzim. Pada rancangan
ini dilihat pengaruh faktor tersebut terhadap nilai NTT/NTB.
Penentuan Suhu Hidrolisis Terbaik
Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian tahap ini adalah
rancangan acak lengkap satu faktor dengan dua ulangan. Faktor yang diamati
adalah suhu hidrolisis dengan tiga taraf yaitu 50, 55, dan 60 oC. Masing-masing
perlakuan diamati pengaruhnya terhadap nilai NTT/NTB.
6
Pengujian Pepton Kacang Tanah sebagai Media Pertumbuhan Bakteri
Data hasil uji pertumbuhan pepton dianalisis dengan analisi ragam satu arah
untuk membandingkan nilai pertumbuhan pepton dari beberapa sampel. Sampel
yang diuji adalah pepton yang diperoleh dari rancangan sebelumnya, yaitu pepton
hasil hidrolisis pada suhu 50, 55, dan 60 oC (dilambangkan dengan S50, S55, dan
S60) ditambah satu pembanding (pepton komersial). Dengan demikian, ada empat
sampel yang dianalisis ragamnya.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Enzim Papain Kasar
Hidrolisis protein secara enzimatis dapat dilakukan dengan menggunakan
enzim pemecah protein atau protease. Enzim yang digunakan berupa papain kasar
yang diperoleh dari penyadapan getah pepaya lalu dikeringkan dan digiling.
Berdasarkan Tabel 1 diketahui bahwa dari 281.1 gram getah pepaya akan
diperoleh 56.33 gram getah kering. Total enzim papain kasar yang telah
dihaluskan adalah 55.7 gram. Dengan demikian, rendemen papain kasar yang
diperoleh adalah sebesar 19.8%. Nilai aktivitas enzim ini sebesar 5057.47
U/g·menit dalam substrat kasein. Nilai tersebut menunjukkan bahwa setiap 1 gram
protein enzim papain dapat mengkatalisis reaksi hidrolisis untuk mengkorversi
5057.47 µmol substrat protein per menit.
Tabel 1 Data perolehan enzim papain kasar dari getah buah pepaya
Perolehan
Jumlah (gram)
Getah segar
281.1
Getah kering
56.3
Getah halus
55.7
Enzim merupakan protein atau komplek protein yang mengkatalis reaksi
kimia dengan menurunkan energi aktivasi reaksi sehingga reaksi dapat
berlangsung lebih cepat. Dalam klasifikasinya, papain termasuk enzim hidrolase,
yaitu enzim yang bekerja menghidrolisis suatu ikatan. Aktivator papain antara lain
adalah sistein, sulfida, dan sulfit sedangkan inhibitor papain yaitu logam berat,
karbonil, dan p-kloromerkurobenzoat (Rathi et al. 2007).
Sodium metabisulfit yang ditambahkan sebagai bahan pengaktif pada getah
sebelum pengeringan diketahui merupakan bahan yang dapat menjaga kestabilan
aktivitas proteolitik enzim papain kasar, terutama pada proses pengeringan (Mac
Kinney et al. 1988). Bahan ini juga merupakan pengawet yang banyak digunakan
dalam industri. Adapun natrium klorida diketahui merupakan bahan pengawet
yang berperan sebagai bahan antimikroba. Dongoran (2004) mengemukakan
bahwa penambahan natrium klorida pada konsentrasi 0.7% dapat meningkatkan
aktivitas papain sebesar 57.7%.
7
Papain merupakan protease sulfihidril yang merupakan protein sederhana
dengan sebuah rantai tunggal polipeptida yang terdiri dari 212 residu asam amino
dengan sistein-25 sebagai tempat gugus aktif tiol (-SH) esensial. Titik isoelektrik
papain adalah 8.75 dengan bobot molekul 21 000 - 23 700 dalton dan dengan
kandungan sulfur sebesar 1.2%. Kualitas papain kasar bergantung pada proses
pengeringan. Pengeringan dalam waktu singkat pada temperatur di bawah 50 oC
dapat menghasilkan produk yang lebih aktif. Selain itu, aktivitas papain
dipengaruhi juga oleh jenis buah, umur buah, dan penanganan pascapanennya
(Muchtadi et al. 1992; Leung 1996)
Komposisi Kimia Bahan Baku
Kacang tanah yang digunakan sebagai bahan baku produksi pepton
memiliki komposisi kimia seperti yang tercantum dalam Tabel 3. Kandungan
protein sebesar 21.84% menjadikannya sebagai sumber protein potensial yang
dapat digunakan untuk memproduksi pepton.
Tabel 2 Komposisi kimia kacang tanah
Parameter (%)
Nilai
Kadar air
7.37 ± 0.09
Kadar abu
2.58 ± 0.11
Kadar protein
21.84 ± 0.08
Kadar lemak
36.83 ± 0.03
Kadar serat kasar
19.33 ± 0.86
Kandungan lemak yang tinggi pada kacang tanah dapat menjadi dasar
pemilihan proses pemisahan yang tepat untuk memperoleh produk yang lebih
murni. Pemisahan minyak dilakukan dengan proses sentrifugasi sehingga minyak
terpisah di bagian atas. Minyak ini kemudian dipisahkan secara manual dengan
menggunakan sendok atau pipet. Tingginya kandungan minyak ini dapat juga
menjadi dasar baru untuk memanfaatkan bungkil kacang tanah pada industri yang
memproduksi minyak kacang tanah sebagai bahan baku pepton.
Waktu Hidrolisis dan Konsentrasi Enzim Terbaik
Penentuan kondisi hidrolisis terbaik ditentukan berdasarkan nilai uji
kandungan nitrogen total terlarut yang dibandingkan dengan nitrogen total bahan
sehingga diperoleh nilai NTT/NTB. Semakin tinggi nilai NTT/NTB menunjukkan
kondisi hidrolisis yang semakin baik (Wijayanti 2009). Waktu hidrolisis yang
digunakan pada penelitian ini mengacu pada penelitian Saputra (2008). Pada
penelitian tersebut, dilakukan penentuan waktu hidrolisis terbaik (4, 6, dan 8 jam)
pada pembuatan pepton ikan selar kuning. Konsentrasi enzim yang digunakan
adalah 0.2% pada suhu 60 oC. Pada penelitian ini dilakukan penentuan konsentrasi
8
enzim terbaik dengan perlakuan konsentrasi enzim 0.2, 0.4, dan 0.6% untuk
mengetahui pengaruh peningkatan konsentrasi tersebut terhadap nilai nitrogen
pepton yang dihasilkan.
Gambar 2 memperlihatkan pengaruh waktu hidrolisis dan konsentrasi enzim
terhadap nilai NTT/NTB. Berdasarkan analisis ragam (Lampiran 1), waktu
hidrolisis, konsentrasi enzim, dan interaksi dua faktor tersebut berpengaruh nyata
terhadap nilai NTT/NTB. Nilai NTT/NTB tertinggi dicapai pada waktu hidrolisis
4 jam dengan konsentrasi enzim 0.4%, yaitu 0.41. Hasil uji Duncan (Lampiran 2)
menunjukkan bahwa sampel tersebut berbeda nyata dengan sampel lainnya.
Dengan demikian, kondisi tersebut dapat dipilih sebagai kondisi hidrolisis terbaik
untuk memperoleh pepton kacang tanah. Nilai NTT/NTB merupakan nilai yang
menunjukkan rendemen perolehan pepton kacang tanah berdasarkan nilai total
nitrogen pada produk (persen nitrogen per gram pepton) dibanding nilai total
nitrogen bahan awal (persen nitrogen per gram kacang tanah). Nilai NTT/NTB
sebesar 0.41 menunjukkan bahwa setiap satu persen nitrogen per gram kacang
tanah, dapat diperoleh 0.41 persen nitrogen per gram pepton cair.
0.45
0.40
0.41e 0.39d
0.37c
0.33a
NTT/NTB
0.35
0.34ab 0.36
bc
0.35ab 0.34ab a
0.33
0.30
0.25
Enzim 0.2%
0.20
Enzim 0.4%
0.15
Enzim 0.6%
0.10
0.05
0.00
4 jam
6 jam
8 jam
Waktu hidrolisis
Gambar 2 Pengaruh waktu hidrolisis dan konsentrasi enzim terhadap
nilai NTT/NTB (superkrip berbeda menunjukkan
perbedaan nyata; p
DENGAN ENZIM PAPAIN KASAR
UNTUK MEDIA PERTUMBUHAN BAKTERI
NINUK GILANG WIRANTI
DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERRTANIAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Pembuatan Pepton
Kacang Tanah dengan Enzim Papain Kasar untuk Media Pertumbuhan Bakteri
adalah benar karya saya dengan arahan dari dosen pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Ninuk Gilang Wiranti
NIM F34100120
ABSTRAK
NINUK GILANG WIRANTI. Pembuatan Pepton Kacang Tanah dengan Enzim
Papain Kasar untuk Media Pertumbuhan Bakteri. Dibimbing oleh MULYORINI
RAHAYUNINGSIH.
Pepton merupakan komponen penting dalam media pertumbuhan mikroba
yang berperan sebagai sumber nitrogen. Rata-rata impor pepton yang mencapai
US $17.84 juta per tahun dalam lima tahun terakhir merupakan peluang tersendiri
untuk pengembangan pepton dengan memanfaatkan bahan sumber protein yang
tersedia di Indonesia, seperti kacang tanah. Tujuan penelitian ini adalah untuk
menghasilkan pepton kacang tanah dengan hidrolisis enzimatis menggunakan
enzim papain kasar, menentukan kondisi hidrolisis terbaik (waktu hidrolisis,
konsentrasi enzim, dan suhu hidrolisis), dan mengujicobakan pepton kacang tanah
sebagai media pertumbuhan bakteri. Kadar protein kacang tanah yang digunakan
adalah 21.84% dan aktivitas enzim papain kasar yang digunakan sebesar 5057.47
U/g.menit. Proses hidrolisis berlangsung dengan menggunakan substrat kacang
tanah dan air dengan perbandingan 1:2. Kondisi hidrolisis terbaik untuk
menghasilkan pepton kacang tanah dicapai dengan menggunakan enzim papain
sebesar 0.4% dengan hidrolisis selama 4 jam pada suhu 55 oC. Pepton yang
dihasilkan merupakan produk cair berwarna kuning kecoklatan, supernatan dari
proses sentrifugasi. Rendemen proses hidrolisis ini adalah 1.23 ml/g kacang tanah.
Kandungan asam amino tertinggi pepton ini adalah asam glutamat. Hasil
pengujian pertumbuhan pada Escherichia coli dan Staphylococcus aureus
menunjukkan bahwa pepton kacang tanah dapat digunakan sebagai komponen
dalam media pertumbuhan bakteri.
Kata kunci: Escherichia coli, hidrolisis enzimatis, papain, pepton kacang tanah,
Staphylococcus aureus
ABSTRACT
NINUK GILANG WIRANTI. Peanut Peptone Production by Crude Papain for the
Bacterial Growth Media. Supervised by MULYORINI RAHAYUNINGSIH.
Peptone is an important component in the microbial growth media which
is a nitrogen source. The average imported peptone which reaches US $17.84
milion per year in the last five years become an open chance for peptone
development using protein source material that is available in Indonesia, such as
protein of peanuts. The objectives of this research were to produce peanut peptone
by enzymatic hydrolysis using crude papain, to determine the best hydrolysis
condition (hydrolysis time, papain concentration, and hydrolysis temperature), and
use peanut peptone as microbial growth media. Protein content of peanut was
21.84% and the activity of papain used in this experiment was 5057.47 U/g·min.
Hydrolysis process have taken place by using peanut and water with ratio 1:2. The
best hydrolysis condition of peanut peptone was achieved by using 0.4% papain
for 4 hours incubation in temperature 55 oC. The obtained peptone was brownish
yellow and liquid form as supernatant from the sentrifugation process. The yield
of the hydrolysis process to produce peanut peptone was 1.23 ml/g peanut. Peanut
peptone had high glutamic acid as amino acid content. Growth test with
Escherichia coli and Staphylococcus aureus showed that peanut peptone could be
used as component for microbial growth media.
Keywords: Enzymatic hydrolysis, Escherichia coli, papain, peanut peptone,
Staphylococcus aureus
PEMBUATAN PEPTON KACANG TANAH
DENGAN ENZIM PAPAIN KASAR
UNTUK MEDIA PERTUMBUHAN BAKTERI
NINUK GILANG WIRANTI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Teknologi Pertanian
pada
Departemen Teknologi Industri Pertanian
DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Pembuatan Pepton Kacang Tanah dengan Enzim Papain Kasar
untuk Media Pertumbuhan Bakteri
Nama
: Ninuk Gilang Wiranti
NIM
: F34100120
Disetujui oleh
Dr. Ir. Hj. Mulyorini Rahayuningsih, M.Si
Pembimbing I
Diketahui oleh
Prof. Dr. Ir. Nastiti Siswi Indrasti
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang
dipilih dalam penelitian ini adalah Pembuatan Pepton Kacang Tanah dengan
Enzim Papain Kasar untuk Media Pertumbuhan Bakteri. Penelitian ini
dilaksanakan di Laboratorium Bioindustri dan Laboratorium DIT, Departemen
Teknologi Industri Pertanian IPB, mulai bulan Februari hingga Mei 2014 dengan
sumber pendanaan dari Ditjen DIKTI melalui Program Kreativitas Mahasiswa
(PKM).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Hj. Mulyorini Rahayuningsih,
M.Si selaku pembimbing akademik yang selalu membimbing dan mengarahkan
penulis selama penelitian dan penyusunan skripsi. Penulis juga berterima kasih
kepada Dr. Ir. Muslich, M.Si dan Drs. Purwoko, M.Si selaku dosen penguji atas
saran yang diberikan. Selain itu, kepada staf laboratorium, kelompok PKM dan
keluarga TIN 47 yang banyak memberikan bantuan teknis kepada penulis.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada bapak, ibu, serta seluruh
keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2014
Ninuk Gilang Wiranti
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
ix
DAFTAR GAMBAR
ix
DAFTAR LAMPIRAN
ix
DAFTAR GAMBAR
x
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
Ruang Lingkup Penelitian
2
METODE
2
Bahan
2
Alat
3
Prosedur Percobaan
3
Rancangan Percobaan
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
6
Enzim Papain Kasar
6
Komposisi Kimia Bahan Baku
7
Waktu Hidrolisis dan Konsentrasi Enzim Terbaik
7
Suhu Hidrolisis Terbaik
9
Asam Amino Pepton Kacang Tanah
10
Aplikasi Pepton Kacang Tanah sebagai Media Pertumbuhan Bakteri
11
SIMPULAN DAN SARAN
13
Simpulan
13
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
16
RIWAYAT HIDUP
23
DAFTAR TABEL
1 Data perolehan enzim papain kasar dari getah buah pepaya
6
2 Komposisi kimia kacang tanah
7
DAFTAR GAMBAR
1 Diagram alir pembuatan pepton kacang tanah
4
2 Pengaruh waktu hidrolisis dan konsentrasi enzim terhadap nilai NTT/NTB
8
3 Pengaruh suhu hidrolisis terhadap nilai NTT/NTB
9
4 Kandungan asam amino pepton kacang tanah perlakuan terbaik ( ) dan
pepton komersial ( )
10
5 Nilai pertumbuhan Escherichia coli pada (a) media cair dan (b) media padat 11
6 Nilai pertumbuhan Staphylococcus aureus pada (a) media cair dan (b) media
padat
12
DAFTAR LAMPIRAN
1 Analisis ragam penentuan waktu hidrolisis dan konsentrasi enzim terbaik
16
2 Hasil uji lanjut Duncan pengaruh interaksi waktu hidrolisis dan konsentrasi
enzim terhadap nilai NTT/NTB
16
3 Analisis ragam penentuan suhu hidrolisis terbaik
16
4 Hasil uji lanjut Duncan pengaruh suhu terhadap nilai NTT/NTB
17
5 Kadar asam amino beberapa jenis pepton
17
6 Nilai kekeruhan media cair Escherichia coli setelah 24 jam
18
7 Hasil analisis ragam pertumbuhan Escherichia coli pada medium cair
18
8 Hasil uji lanjut Duncan data kekeruhan media Escherichia coli
19
9 Hasil uji TPC Escherichia coli
19
10 Hasil analisis ragam TPC Escherichia coli
20
11 Nilai kekeruhan media cair Staphylococcus aureus setelah 24 jam
20
12 Hasil analisis ragam nilai kekeruhan media Staphylococcus aureus
20
13 Hasil uji lanjut Duncan data kekeruhan media Staphylococcus aureus
21
14 Hasil TPC Staphylococcus aureus
21
15 Hasil analisis ragam TPC Staphylococcus aureus
22
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pepton merupakan hidrolisat protein yang banyak digunakan sebagai salah
satu komponen nutrisi dalam media pertumbuhan mikroorganisme. Pepton dalam
media pertumbuhan mikroba, berfungsi sebagai sumber nitrogen bagi
mikroorganisme. Penggunaan pepton sangat luas mencakup penggunaan pada
laboratorium mikrobiologi hingga pada industri berbasis bioteknologi. Selama ini
kebutuhan pepton di Indonesia masih dipenuhi melalui impor dengan jumlah dan
harga yang sangat tinggi. Impor produk ini dilakukakan karena industri pepton
Indonesia belum dikembangkan. Pada tahun 2013, impor pepton di Indonesia
mencapai nilai sebesar US $20.76 juta dengan jumlah sebesar 5 102 ton. Nilai
tersebut meningkat dibanding tahun 2012 yaitu US $12.15 juta dengan kuantitas
sebesar 3 296 ton (BPS 2014). Tingginya nilai impor tersebut dapat menjadi
peluang untuk melakukan pengembangan pepton dengan memanfaatkan bahan
sumber protein yang tersedia di Indonesia, seperti protein kacang tanah.
Menurut Dwivedi et al. (1996), kacang tanah memiliki kandungan protein
sekitar 22-30% sehingga potensial dikembangkan, termasuk untuk memproduksi
pepton. Potensi kacang tanah ini pun dinilai semakin besar berdasarkan data
produktivitas kacang tanah yang meningkat di tahun 2013. Produktivitas tersebut
mencapai 13.52 ku/ha dibanding tahun 2012 sebesar 12.74 ku/ha. Selain itu,
pengembangan protein kacang tanah sebagai bahan baku produksi pepton belum
pernah dikaji sehingga penelitian ini sangat penting untuk dilakukan. Berdasarkan
data konsumsi kacang tanah pada tahun 2006-2011 (Kementerian Pertanian 2013),
diketahui bahwa rata-rata konsumsi kacang tanah lepas kulit sebesar 739 167 ton
dari rata-rata penyediaan dalam negeri sebesar 883 000 ton. Dengan demikian
terdapat rata-rata 143 833 ton kacang tanah yang tersedia (tidak dikonsumsi) dan
dapat dikembangkan. Pengembangan pepton kacang tanah diharapkan dapat
memberikan nilai tambah dalam pemanfaatan protein kacang tanah di Indonesia,
terutama dalam memanfaatkan limbah bungkil kacang tanah pada industri yang
memproduksi minyak kacang tanah. Pengembangan pepton dari protein kacang
tanah ini diharapkan dapat mengurangi ketergantungan impor pepton di Indonesia
yang selama ini masih dilakukan.
Penelitian mengenai produksi pepton secara hidrolisis enzimatis telah
banyak dilakukan. Akan tetapi, penelitian tersebut umumnya menggunakan
sumber protein hewani sebagai bahan baku. Nurhayati et al. (2007) dan Wijayanti
(2009) telah meneliti mengenai produk hidrolisat ikan selar dengan enzim papain.
Selain itu, Suhandana (2010) meneliti tentang produksi pepton dari jeroan ikan
tongkol dan Fitra (2013) menggunakan ikan hasil tangkap sampingan busuk.
Pepton pada penelitian ini dibuat dengan memanfaatkan kacang tanah sebagai
sumber protein nabati dengan menggunakan dasar metode penelitian Nurhayanti
et al. (2007) dan Wijayanti (2009).
Produksi pepton dapat dilakukan dengan cara hidrolisis enzimatis
menggunakan enzim protease. Kelebihan proses enzimatis adalah tidak
memerlukan suhu tinggi, proses hidrolisis berlangsung secara spesifik, dan dapat
mengkonservasi semua asam amino yang ada. Proses hidrolisis dengan cara asam
2
dapat merusak sebagian atau semua asam-asam amino tertentu karena kondisi
proses yang berlangsung pada suhu tinggi. Selain itu, produk pepton yang
diperoleh dari proses hidrolisis asam memiliki kandungan garam yang tinggi
karena adanya pembentukan garam pada proses netralisasi (BD 2009).
Faktor yang mempengaruhi kecepatan hidrolisis enzimatis adalah waktu, pH,
suhu, konsentrasi, dan perbandingan enzim dengan protein (Kirk et al. 1953).
Oleh karena itu dalam memproduksi pepton kacang tanah secara enzimatis
diperlukan penggunaan kondisi hidrolisis terbaik sehingga produk dapat
dihasilkan secara optimal. Pada penelitian ini dilakukan penentuan kondisi
hidrolisis terbaik dalam memproduksi pepton kacang tanah. Kondisi yang dikaji
meliputi waktu hidrolisis, konsentrasi enzim, dan suhu hidrolisis.
Tujuan Penelitian
-
Tujuan penelitian ini adalah untuk:
menghasilkan pepton nabati dari kacang tanah menggunakan enzim papain
kasar;
menentukan waktu hidrolisis, konsentrasi enzim, dan suhu hidrolisis terbaik
dalam proses pembuatan pepton kacang tanah;
mengujicobakan produk pepton kacang tanah sebagai media pertumbuhan
bakteri.
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah memberikan alternatif pemanfaatan protein
kacang tanah untuk dikembangkan menjadi produk dengan potensi pengembangan
dan nilai ekonomis yang tinggi.
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini adalah memproduksi pepton kacang tanah
dalam bentuk cair, yang merupakan cairan/supernatan hasil sentrifugasi. Pepton
ini kemudian diujicobakan sebagai media pertumbuhan untuk bakteri Escherichia
coli dan Staphylococcus aureus dan dibandingkan dengan pepton komersial
(BactoTMpeptone).
METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kacang tanah, getah
pepaya, natrium metabisulfit, natrium klorida, yeast extract, BactoTMpeptone
(pepton komersial), agar bakteriologis, alkohol, biakan Escherichia coli
Staphylococcus aureus, Nutrient Broth dan akuades.
3
Alat
Alat-alat yang digunakan untuk preparasi enzim papain meliputi pisau,
wadah penampung getah, neraca, kertas saring, oven, dan blender. Peralatan untuk
hidrolisis meliputi erlenmeyer, termometer, water bath, inkubator, penyaring
ukuran 225 mesh berbahan monyl, tabung setrifugasi, alat sentrifugasi, dan
aluminium foil. Peralatan lain yang digunakan antara lain yaitu bunsen, jarum
inokulasi/ose, tabung reaksi bertututp ulir, cawan petri, colony counter quebec,
autoklaf, clean bench, dan spektrofotometer.
Prosedur Percobaan
Preparasi Enzim Papain Kasar (Hasbullah 2001 )
Enzim papain kasar yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari
penyadapan getah buah pepaya muda. Waktu yang tepat untuk melakukan
penyadapan adalah pagi hari (05.30-08.00) atau sore hari (17.30-18.30).
Penyadapan dilakukan terhadap buah muda yang berdiameter 6-7 cm atau
berumur 2.5-3 bulan, dengan menoreh kulit buah mulai pangkal menuju ujung
buah sedalam 1-2 mm. Tetesan getah ditampung dalam wadah plastik.
Penyadapan dapat dilakukan setiap dua atau tiga hari. Sementara itu larutan
pengaktif disiapkan, dengan melarutkan 14 gram natrium metabisulfit dan 3 gram
natrium klorida dalam 1 liter air. Getah pepaya hasil penyadapan dicampurkan
dalam pengaktif dengan perbandingan 1:1 (b/v) kemudian diaduk hingga
terbentuk bubur. Bubur disaring menggunakan penyaring untuk memisahkan
kotoran. Getah tersebut dituang ke piring porselen untuk dikeringkan pada oven
bersuhu ±55 oC. Setelah kering, getah diubah menjadi serbuk dengan
penggilingan. Bubuk enzim yang diperoleh dikarakterisasi untuk mengetahui nilai
aktivitas enzim.
Preparasi Kacang Tanah
Kacang tanah digiling agar diperoleh kacang tanah yang berukuran lebih
kecil dan seragam. Bahan ini dilakukan karakterisasi untuk mengetahui komposisi
kimia seperti kandungan protein.
Penentuan Waktu Hidrolisis dan Konsentrasi Enzim Terbaik
Pada tahap ini ditentukan kondisi hidrolisis terbaik pada pembuatan pepton,
dengan perlakuan konsentrasi enzim dan waktu hidrolisis. Kacang tanah
ditambahkan akuades dengan perbandingan 1:2 (b/v) dan enzim pada berbagai
konsentrasi (0.2%; 0.4%; dan 0.6%). Campuran tersebut dicampurkan dalam
erlenmeyer lalu diaduk sampai tercampur rata. Sampel diberikan perlakuan waktu
hidrolisis selama 4, 6, dan 8 jam. Hidrolisis ini dilakukan pada suhu 60 oC dengan
menggunakan inkubator. Hidrolisis dihentikan dengan inaktivasi enzim pada suhu
85 oC selama 15 menit dalam water bath. Setelah itu, sampel disaring dengan
penyaring berukuran 225 mesh dan disentrifugasi (4000 rpm selama 15 menit)
untuk memperoleh fraksi terlarut berupa supernatan.
Kondisi hidrolisis terbaik dalam produksi pepton kacang tanah dapat
dinilai berdasarkan pengujian total nitrogen dengan metode Kjeldahl. Rasio
4
nitrogen total terlarut dan nitrogen total bahan (NTT/NTB) tertinggi menunjukkan
kodisi hidrolisis terbaik untuk memperoleh pepton kacang tanah. Selain itu,
dilakukan pula pengujian untuk mengetahui kandungan asam amino pepton,
dengan metode HPLC di Laboratorium Terpadu IPB.
Penentuan Suhu Hidrolisis Terbaik
Pada tahap ini proses hidrolisis untuk memperoleh pepton dilakukan
menggunakan waktu hidrolisis dan konsentrasi enzim terbaik berdasarkan hasil
percobaan sebelumnya. Langkah percobaan dilakukan dengan mempersiapkan
kacang tanah dan enzim dengan konsentrasi terbaik dan dengan penambahan air
1:2 (bahan:air). Hidrolisis dilakukan pada suhu 50, 55, dan 60 oC. Hidrolisat
protein yang dihasilkan dapat diuji seperti pada tahap penelitian sebelumnya.
Percobaan ini dilakukan dengan dua kali ulangan. Diagram alir proses pembuatan
pepton dapat merujuk pada Gambar 1.
Kacang
tanah
Air
Pencampuran
Enzim
papain
Hidrolisis pada inkubator
Inaktivasi enzim
(85 oC, 15 menit)
Penyaringan dan
sentrifugasi
Minyak,
Padatan
Pepton
Gambar 1 Diagram alir pembuatan pepton kacang tanah
(Nurhayati et al. (2008); Wijayanti (2009))
Pengujian Pepton sebagai Media Cair Pertumbuhan Bakteri
Pada tahap ini, pepton kacang tanah yang dihasilkan, diujicobakan sebagai
media pertumbuhan bakteri dan membandingkan dengan pepton komersial
(BactoTMpeptone). Pengujian dilakukan untuk dua jenis bakteri yaitu Escherichia
coli dan Staphylococcus aureus.
Biakan bakteri terlebih dahulu disegarkan pada media nutrient broth
selama 24 jam sebelum dipindahkan ke media mengandung pepton hasil
percobaan. Medium pertumbuhan dibuat dengan menyiapkan larutan yang
mengandung yeast extract 0.5%, dan NaCl 1%. Campuran ini dimasukkan
sebanyak 9 ml ke dalam tabung ulir. Setiap sampel pepton diujikan ke dalam tiga
5
tabung media cair (diinokulasikan baketeri) dan disiapkan juga satu tabung media
cair tanpa diinokulasi (blanko). Pepton komersial sebagai pembanding disiapkan
terpisah dalam bentuk larutan dengan konsentrasi 10%. Pepton komersial tersebut
dipipet sebanyak 1 ml ke dalam tabung ulir berisi campuran yeast extract dan
NaCl sehingga konsentrasi pepton dalam media sebesar 1%. Sementara itu,
pepton kacang tanah ditambahkan sebanyak ±1 ml dengan menyetarakan nilai
total nitrogen pepton kacang tanah dengan pepton komersial (pengaturan volume).
Medium ini disterilisasi pada suhu 121 oC selama 15 menit sebelum diinokulasi.
Inokulasi bakteri dilakukan dengan memasukkan masing-masing 1 ml
kultur hasil penyegaran ke dalam tabung ulir berisi media steril. Setelah itu,
dilakukan inkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Pengamatan pertumbuhan
bakteri secara kualitatif dilakukan dengan mengukur perubahan kekeruhan
medium cair setelah 24 jam dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 620 nm. Pada setiap sampel uji, media cair yang tidak diinokulasikan
digunakan sebagai blanko sampel tersebut.
Pengujian Pepton sebagai Media Padat Pertumbuhan Bakteri
Medium yang digunakan untuk uji ini memiliki komposisi yang sama
seperti komposisi medium cair dengan penambahan agar bakteriologi sebanyak
1.5%. Inokulasi dilakukan dengan teknik tuang (pour plate). Bakteri pada tingkat
pengenceran tertentu dipipet 0.5-1 ml ke dalam cawan. Setelah itu, medium
dituang ke dalam cawan dan didiamkan hingga memadat. Cawan kemudian
diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam. Jumlah bakteri yang tumbuh dihitung
dengan colony counter quebec sebagai nilai pertumbuhan kuantitatif.
Rancangan Percobaan
Data yang diperoleh pada masing-masing tahapan penelitian dianalisis
secara statistik dengan analisis ragam untuk mengetahui pengaruh faktor terhadap
nilai uji tertentu. Analisis ragam ini dilakukan dengan menggunakan software
SPSS 16 dan Microsoft Excel 2010. Rancangan percobaan yang digunakan adalah
rancangan percobaan acak lengkap faktorial, dan hasil analisis yang menunjukkan
berbeda nyata dilakukan uji lanjut Duncan.
Penentuan Waktu Hidrolisis dan Konsentrasi Enzim Terbaik
Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian tahap ini adalah
rancangan percobaan acak lengkap faktorial dengan dua faktor dan dua kali
ulangan. Faktor yang diamati adalah waktu hidrolisis dan konsentrasi enzim,
dengan masing-masing tiga taraf yaitu 4, 6, dan 8 jam untuk faktor waktu
hidrolisis dan 0.2, 0.4, dan 0.6% untuk faktor konsentrasi enzim. Pada rancangan
ini dilihat pengaruh faktor tersebut terhadap nilai NTT/NTB.
Penentuan Suhu Hidrolisis Terbaik
Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian tahap ini adalah
rancangan acak lengkap satu faktor dengan dua ulangan. Faktor yang diamati
adalah suhu hidrolisis dengan tiga taraf yaitu 50, 55, dan 60 oC. Masing-masing
perlakuan diamati pengaruhnya terhadap nilai NTT/NTB.
6
Pengujian Pepton Kacang Tanah sebagai Media Pertumbuhan Bakteri
Data hasil uji pertumbuhan pepton dianalisis dengan analisi ragam satu arah
untuk membandingkan nilai pertumbuhan pepton dari beberapa sampel. Sampel
yang diuji adalah pepton yang diperoleh dari rancangan sebelumnya, yaitu pepton
hasil hidrolisis pada suhu 50, 55, dan 60 oC (dilambangkan dengan S50, S55, dan
S60) ditambah satu pembanding (pepton komersial). Dengan demikian, ada empat
sampel yang dianalisis ragamnya.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Enzim Papain Kasar
Hidrolisis protein secara enzimatis dapat dilakukan dengan menggunakan
enzim pemecah protein atau protease. Enzim yang digunakan berupa papain kasar
yang diperoleh dari penyadapan getah pepaya lalu dikeringkan dan digiling.
Berdasarkan Tabel 1 diketahui bahwa dari 281.1 gram getah pepaya akan
diperoleh 56.33 gram getah kering. Total enzim papain kasar yang telah
dihaluskan adalah 55.7 gram. Dengan demikian, rendemen papain kasar yang
diperoleh adalah sebesar 19.8%. Nilai aktivitas enzim ini sebesar 5057.47
U/g·menit dalam substrat kasein. Nilai tersebut menunjukkan bahwa setiap 1 gram
protein enzim papain dapat mengkatalisis reaksi hidrolisis untuk mengkorversi
5057.47 µmol substrat protein per menit.
Tabel 1 Data perolehan enzim papain kasar dari getah buah pepaya
Perolehan
Jumlah (gram)
Getah segar
281.1
Getah kering
56.3
Getah halus
55.7
Enzim merupakan protein atau komplek protein yang mengkatalis reaksi
kimia dengan menurunkan energi aktivasi reaksi sehingga reaksi dapat
berlangsung lebih cepat. Dalam klasifikasinya, papain termasuk enzim hidrolase,
yaitu enzim yang bekerja menghidrolisis suatu ikatan. Aktivator papain antara lain
adalah sistein, sulfida, dan sulfit sedangkan inhibitor papain yaitu logam berat,
karbonil, dan p-kloromerkurobenzoat (Rathi et al. 2007).
Sodium metabisulfit yang ditambahkan sebagai bahan pengaktif pada getah
sebelum pengeringan diketahui merupakan bahan yang dapat menjaga kestabilan
aktivitas proteolitik enzim papain kasar, terutama pada proses pengeringan (Mac
Kinney et al. 1988). Bahan ini juga merupakan pengawet yang banyak digunakan
dalam industri. Adapun natrium klorida diketahui merupakan bahan pengawet
yang berperan sebagai bahan antimikroba. Dongoran (2004) mengemukakan
bahwa penambahan natrium klorida pada konsentrasi 0.7% dapat meningkatkan
aktivitas papain sebesar 57.7%.
7
Papain merupakan protease sulfihidril yang merupakan protein sederhana
dengan sebuah rantai tunggal polipeptida yang terdiri dari 212 residu asam amino
dengan sistein-25 sebagai tempat gugus aktif tiol (-SH) esensial. Titik isoelektrik
papain adalah 8.75 dengan bobot molekul 21 000 - 23 700 dalton dan dengan
kandungan sulfur sebesar 1.2%. Kualitas papain kasar bergantung pada proses
pengeringan. Pengeringan dalam waktu singkat pada temperatur di bawah 50 oC
dapat menghasilkan produk yang lebih aktif. Selain itu, aktivitas papain
dipengaruhi juga oleh jenis buah, umur buah, dan penanganan pascapanennya
(Muchtadi et al. 1992; Leung 1996)
Komposisi Kimia Bahan Baku
Kacang tanah yang digunakan sebagai bahan baku produksi pepton
memiliki komposisi kimia seperti yang tercantum dalam Tabel 3. Kandungan
protein sebesar 21.84% menjadikannya sebagai sumber protein potensial yang
dapat digunakan untuk memproduksi pepton.
Tabel 2 Komposisi kimia kacang tanah
Parameter (%)
Nilai
Kadar air
7.37 ± 0.09
Kadar abu
2.58 ± 0.11
Kadar protein
21.84 ± 0.08
Kadar lemak
36.83 ± 0.03
Kadar serat kasar
19.33 ± 0.86
Kandungan lemak yang tinggi pada kacang tanah dapat menjadi dasar
pemilihan proses pemisahan yang tepat untuk memperoleh produk yang lebih
murni. Pemisahan minyak dilakukan dengan proses sentrifugasi sehingga minyak
terpisah di bagian atas. Minyak ini kemudian dipisahkan secara manual dengan
menggunakan sendok atau pipet. Tingginya kandungan minyak ini dapat juga
menjadi dasar baru untuk memanfaatkan bungkil kacang tanah pada industri yang
memproduksi minyak kacang tanah sebagai bahan baku pepton.
Waktu Hidrolisis dan Konsentrasi Enzim Terbaik
Penentuan kondisi hidrolisis terbaik ditentukan berdasarkan nilai uji
kandungan nitrogen total terlarut yang dibandingkan dengan nitrogen total bahan
sehingga diperoleh nilai NTT/NTB. Semakin tinggi nilai NTT/NTB menunjukkan
kondisi hidrolisis yang semakin baik (Wijayanti 2009). Waktu hidrolisis yang
digunakan pada penelitian ini mengacu pada penelitian Saputra (2008). Pada
penelitian tersebut, dilakukan penentuan waktu hidrolisis terbaik (4, 6, dan 8 jam)
pada pembuatan pepton ikan selar kuning. Konsentrasi enzim yang digunakan
adalah 0.2% pada suhu 60 oC. Pada penelitian ini dilakukan penentuan konsentrasi
8
enzim terbaik dengan perlakuan konsentrasi enzim 0.2, 0.4, dan 0.6% untuk
mengetahui pengaruh peningkatan konsentrasi tersebut terhadap nilai nitrogen
pepton yang dihasilkan.
Gambar 2 memperlihatkan pengaruh waktu hidrolisis dan konsentrasi enzim
terhadap nilai NTT/NTB. Berdasarkan analisis ragam (Lampiran 1), waktu
hidrolisis, konsentrasi enzim, dan interaksi dua faktor tersebut berpengaruh nyata
terhadap nilai NTT/NTB. Nilai NTT/NTB tertinggi dicapai pada waktu hidrolisis
4 jam dengan konsentrasi enzim 0.4%, yaitu 0.41. Hasil uji Duncan (Lampiran 2)
menunjukkan bahwa sampel tersebut berbeda nyata dengan sampel lainnya.
Dengan demikian, kondisi tersebut dapat dipilih sebagai kondisi hidrolisis terbaik
untuk memperoleh pepton kacang tanah. Nilai NTT/NTB merupakan nilai yang
menunjukkan rendemen perolehan pepton kacang tanah berdasarkan nilai total
nitrogen pada produk (persen nitrogen per gram pepton) dibanding nilai total
nitrogen bahan awal (persen nitrogen per gram kacang tanah). Nilai NTT/NTB
sebesar 0.41 menunjukkan bahwa setiap satu persen nitrogen per gram kacang
tanah, dapat diperoleh 0.41 persen nitrogen per gram pepton cair.
0.45
0.40
0.41e 0.39d
0.37c
0.33a
NTT/NTB
0.35
0.34ab 0.36
bc
0.35ab 0.34ab a
0.33
0.30
0.25
Enzim 0.2%
0.20
Enzim 0.4%
0.15
Enzim 0.6%
0.10
0.05
0.00
4 jam
6 jam
8 jam
Waktu hidrolisis
Gambar 2 Pengaruh waktu hidrolisis dan konsentrasi enzim terhadap
nilai NTT/NTB (superkrip berbeda menunjukkan
perbedaan nyata; p