Aktivitas Antibakteri Fraksi Semi Murni Dari Kapang Endofit Mangrove Bar1.5 Dan Pengaruh Ekstraknya Terhadap Morfologi Sel Bakteri

AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI SEMI-MURNI DARI
KAPANG ENDOFIT MANGROVE BAR1.5 DAN PENGARUH
EKSTRAKNYA TERHADAP MORFOLOGI SEL BAKTERI

ALIF KHOLIFATUL JANNAH

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul aktivitas antibakteri
fraksi semi-murni dari kapang endofit mangrove BAR1.5 dan pengaruh
ekstraknya terhadap morfologi sel bakteri adalah benar karya saya dengan arahan
dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada

Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Juni 2016

Alif Kholifatul Jannah
NRP C351130031

RINGKASAN
ALIF KHOLIFATUL JANNAH. Aktivitas Antibakteri Fraksi Semi-murni dari
Kapang Endofit Mangrove BAR1.5 dan Pengaruh Ekstraknya terhadap Morfologi
Sel Bakteri. Dibimbing oleh KUSTIARIYAH TARMAN dan DESNIAR.
Tumbuhan mangrove di Indonesia khususnya di Sulawesi Selatan telah
banyak dimanfaatkan oleh masyarakat pesisir sebagai sumber obat-obatan.
Hampir semua spesies tanaman di dunia termasuk mangrove memiliki satu atau
lebih mikroba endofit. Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup di dalam
jaringan tumbuhan dan mampu membentuk koloni tanpa membahayakan
inangnya. Kapang endofit mampu memproduksi senyawa bioaktif yang sama
dengan inangnya. Endofit di dalam mangrove sebagai tanaman inangnya yang
sangat beranekaragam di Indonesia telah diteliti dalam jumlah yang sedikit.
Kapang endofit telah berhasil diisolasi dari daun mangrove R. stylosa di perairan

Barru, Sulawesi Selatan yang diberi kode BAR1.5. Ekstrak kasarnya diketahui
memiliki aktivitas penghambatan terhadap bakteri B. subtilis. Penemuan tersebut
perlu diteliti lebih lanjut terutama mengenai fraksi yang aktif sebagai antibakteri
dan pengaruh yang dihasilkan dari ekstrak terhadap morfologi sel bakteri.
Penelitian ini dilakukan dalam 5 tahap. Tahapan pertama adalah kultivasi
kapang endofit mangrove BAR1.5, selanjutnya tahap yang kedua yaitu
mengekstrak media kultur kapang. Tahap ketiga, ekstrak yang diperoleh dilakukan
uji bioautografi. Hasil bioautografi berupa fraksi aktif. Fraksi yang aktif sebagai
antibakteri tersebut dijadikan acuan untuk pengambilan fraksi semi-murni pada
KLTP sebagai tahapan yang keempat. Fraksi yang diperoleh dari KLTP kemudian
diuji menggunakan KLT untuk mengetahui apakah fraksi yang diperoleh adalah
fraksi tunggal. Fraksi tunggal yang didapatkan kemudian dilakukan uji aktivitas
antibakteri dan uji komponen bioaktif. Tahap kelima yaitu mengidentifikasi
pengaruh ekstrak terhadap morfologi sel bakteri menggunakan SEM.
Fraksi antibakteri dari kapang endofit BAR1.5 dapat diperoleh dengan
menggunakan KLTP. Fraksi semi-murni antibakteri yang diperoleh adalah
sebanyak tiga fraksi (F1, F2, dan F3). Aktivitas antibakteri F1 dan F2 lebih tinggi
dibandingkan dengan ekstrak kasar yang memiliki zona hambat masing-masing 19
mm dan 20 mm terhadap B. subtilis. F3 tidak memiliki aktiviitas antibakteri yang
baik dalam bentuk fraksi tunggal. Komponen bioaktif pada F1 adalah flavonoid,

F2 polifenol, dan F3 triterpenoid. Senyawa antibakteri dalam kapang endofit
BAR1.5 menyebabkan pembengkakan, pengerutan dan lisis pada morfologi sel B.
subtilis, sedangkan pada morfologi sel P. aeruginosa menyebabkan pengerutan,
sel transparan dan lisis.
Kata kunci: antibakteri, fraksinasi, kapang endofit, marine fungi, morfologi sel

SUMMARY
ALIF KHOLIFATUL JANNAH. Antibacterial Activity of semipurified Fraction
from Mangrove Endophytic Fungus BAR1.5 and Effects of its Extract on Bacteria
Cell Morphology. Supervised by KUSTIARIYAH TARMAN dan DESNIAR.

Mangroves in Indonesia, especially in Southern Sulawesi has been used
widely by coastal communities as sources of medicines. Almost all plant species
in the world, including mangroves have one or more endophytic microbes.
Endophytic microbes are microbes that live inside plant tissues and it is able to
form colonie without harming the host. One of the superiority endophytic
microbes is its ability producing bioactive compounds that same as its host.
Endophytes in mangrove as host plant that very diverse in Indonesia has been
explored in a lesser extent. Endophytic fungi of mangrove plant Rhizopora
stylosa in Barru waters, South Sulawesi was isolated and coded BAR1.5. Crude

extract of endophytic fungus BAR1.5 had antimicrobial activity against Bacillus
subtilis. The invention need further study, especially regarding the active fractions
as antibacterial and effects of its extract on bacteria cell morphology.
This research had been conducted in five stages. The first step was to
cultivate of mangrove endophytic fungi BAR1.5. The second step was to extract
the culture broth. The third step was bioautography test of extract. The result of
bioautography test was active fraction. The active fraction was used as a reference
for obtain antimicrobial fraction at KLTP as the fourth step. The antimicrobial
fraction was tested by thin layer cromatography (TLC) and observed under UV
light, for confirmation as a single fraction. The single fraction from endophytic
fungus BAR1.5 was tested the antimicrobial activity and the bioactive compound.
The fifth step was to identify the effects of its extract on bacteria cell morphology
by SEM.
The result showed that 3 fractions obtained by P-TLC showed antimicrobial
activity. The antimicrobial activity of fractions F1 and F2 were higher than the
crude extracts against Gram-positive bacteria. The diameter of inhibitory zone of
F1 and F2 were 19 mm and 20 mm respectively. The content of
the bioactive compound in F1, F2 and F3 were flavonoids, polyphenols, and
triterpenoids respectively. Antibacterial compounds in endophytic fungi BAR1.5
caused swelling, wrinkle and lysis on B. subtilis cell morphology, however on

P. aeruginosa cell morphology caused wrinkle, transparent and lysis.
Keywords: antibacterial, endophytic fungus, fractionation, marine fungi, cell
morphology.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI SEMI-MURNI DARI
KAPANG ENDOFIT MANGROVE BAR1.5 DAN PENGARUH
EKSTRAKNYA TERHADAP MORFOLOGI SEL BAKTERI

ALIF KHOLIFATUL JANNAH

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Teknologi Hasil Perairan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof. Dr. Ir. Linawati Hardjito, MS.

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2014 sampai
dengan November 2015 ini ialah penelitian lanjutan dari kapang endofit mangrove
BAR1.5 yang potensial, dengan judul Aktivitas Antibakteri Fraksi Semi-Murni
dari Kapang Endofit Mangrove BAR1.5 dan Pengaruh Ekstraknya terhadap

Morfologi Sel Bakteri.
Terima kasih penulis ucapkan kepada kepada Dr Kustiariyah Tarman S.Pi,
M.Si dan Dr Desniar, S.Pi, M.Si selaku dosen pembimbing yang telah banyak
membagikan ilmunya serta memberikan saran dan masukan selama penelitian dan
penyusunan tesis ini. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr Ir Wini
Trilaksani, M.Sc selaku ketua Program Studi Teknologi Hasil Perairan. Penulis
juga menyampaikan terimakasih kepada Prof. Dr. Ir. Linawati Hardjito, MS yang
telah bersedia menjadi dosen penguji dalam sidang akhir tesis ini sehingga
menambah khazanah keilmuan dan nasehat untuk kebaikan tesis ini, terimakasih
juga disampaikan kepada Dr. Ir. Iriani Setyaningsih, MS yang bersedia
memberikan masukan dalam penulisan tesis ini.
Terimakasih juga disampaikan kepada Direktorat Jenderal Dikti yang telah
memberikan beasiswa selama penulis belajar di pascasarjana IPB, dan kepada
LPDP (Lembaga Pengelola Dana Pendidikan) yang telah memberikan beasiswa
untuk penelitian tesis. Penulis juga berterimakasih kepada staf pengajar, staf
adiministrasi dan staf laboratorium yang telah membantu atas kelancaran
penelitian ini. Ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada orang tua penulis
Ayahanda Khoirul Anam dan ibu Sri Marliyah, serta seluruh keluarga atas segala
doa, motivasi, dan kasih sayang yang telah diberikan, dan juga kepada
teman-teman pascasarjana THP 2013 atas semangat yang selama ini selalu

membersamai. Dengan segala kerendahan hati, penulis memohon maaf atas segala
kekurangan selama pelaksanaan maupun penyusunan tesis. Semoga karya ilmiah
ini bermanfaat.

Bogor, Juni 2016
Alif Kholifatul Jannah

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN

vi
vi
vi

1

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
2
3
3
3

2

METODE
Waktu dan Tempat
Bahan dan Alat
Prosedur Penelitian
Kultivasi Kapang Endofit BAR1.5

Ekstraksi Media Kultur Kapang Endofit
Pengujian bioautografi
Fraksinasi menggunakan KLTP
Uji aktivitas antibakteri
Uji komponen bioaktif
Analisis kerusakan sel bakteri menggunakan SEM
Analisis Data

3

HASIL DAN PEMBAHASAN
Fraksi Semi-Murni kapang endofit BAR1.5
Fraksi pada KLT
Fraksi aktif pada uji bioautografi
Fraksi pada KLTP
Fraksi tunggal
Aktivitas Antibakteri Fraksi Semi-Murni
Komponen Bioaktif Fraksi Semi-Murni
Komponen F1
Komponen F2

Komponen F3
Pengaruh Ekstrak terhadap Morfologi Sel Bakteri
Pengaruh ekstrak terhadap morfologi bakteri B. subtilis
Pengaruh ekstrak terhadap morfologi bakteri P. aerogenosa

9
9
9
10
11
11
12
15
15
16
18
19
19
20

4

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

22
22
22

DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP

4
4
4
4
6
6
6
7
7
8
8
8

23
29
33

DAFTAR TABEL

1
2
3
4

Aktivitas antibakteri fraksi kapang endofit BAR1.5
Hasil pengujian komponen bioaktif F1
Hasil pengujian komponen bioaktif F2
Hasil pengujian komponen bioaktif F3

14
16
17
18

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7

Diagram alir proses penelitian
Kromatogram fraksinasi ekstrak pada KLT dan bioautografi
Kromatograf fraksinasi ekstrak pada KLTP
Kromatogram fraksi antibakteri
Hasil uji antibakteri F1, F2, dan F3
Morfologi sel bakteri B. subtilis pada pengamatan SEM
Morfologi sel bakteri P. aeruginosa pada pengamatan SEM

5
10
11
12
13
20
21

DAFTAR LAMPIRAN

1
2
3
4
5
6

Isolat kapang endofit mangrove BAR1.5 pada media PDA
Kultur kapang endofit mangrove BAR1.5 pada media PDB
Ekstrak kasar kapang endofit mangrove BAR1.5
Data nilai Rf fraksi
Perolehan fraksi kapang endofit mangrove BAR1.5 dari KLTP
Perhitungan rendemen fraksi

31
31
31
32
32
32

11

I

PENDAHULUAN
Latar Belakang

Tumbuhan mangrove di Indonesia merupakan yang terbanyak di dunia, baik
dari segi luasan maupun jumlah spesies (Spalding et al. 2001). Ekstrak tumbuhan
mangrove telah digunakan berabad-abad oleh masyarakat pesisir untuk mengobati
berbagai penyakit (Amudha et al. 2013). Banyak obat-obatan yang berasal dari
mangrove untuk menyembuhkan luka, diare, sakit kepala, gigitan ular, penyakit
kulit, rematik dan pendarahan (Selvaraj et al. 1995). Masyarakat Indonesia seperti
di Sulawesi Selatan memanfaatkan tumbukan daun mangrove (Rhizopora sp.)
sebagai obat luka, sedangkan rebusannya sebagai obat diare (Gunawan 2004).
Kombinasi kulit, bunga, daun dan akar dari Rhizopora sp. digunakan untuk
pengobatan hepatitis (Purnobasuki 2004). Abeysingher et al. (2003) melaporkan
bahwa ekstrak mangrove memiliki aktivitas antibakteri yang dapat melawan
bakteri patogen Staphylococcus sp. E.coli dan Pseudomonas sp.
Hampir semua spesies tanaman yang ada di bumi memiliki satu atau lebih
mikroba endofit (Strobel dan Daisy 2003). Mikroba endofit adalah mikroba yang
hidup di dalam jaringan tumbuhan dan mampu membentuk koloni tanpa
membahayakan inangnya. Keunggulan mikroba endofit adalah kemampuannya
dalam memproduksi senyawa bioaktif yang sama dengan inangnya (Tan dan Zou
2001). Mikroba endofit dapat berupa bakteri atau jamur, tetapi yang lebih banyak
dieksplorasi adalah jamur endofit seperti kapang endofit (Sinaga et al. 2009).
Jumlah metabolit sekunder yang diproduksi kapang endofit lebih banyak
dibandingkan kelas mikroorganisme endofit lain dan telah banyak dilaporkan
memproduksi senyawa antibakteri (Schulz et al. 2002), oleh karena itu kapang
endofit pada tumbuhan mangrove merupakan sumber antibakteri yang
menjanjikan.
Penemuan senyawa antibakteri yang efektif telah banyak dilaporkan dari
kapang endofit mangrove yang diisolasi dari perairan luar negeri, sedangkan di
Indonesia kapang endofit yang potensial tersebut jarang diteliti. Bharathidsan dan
Panneerselvam (2015) melaporkan bahwa ekstrak kapang endofit yang diisolasi
dari mangrove di perairan India memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri
patogen Baillus substilis, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis
Escherichia coli and Klebsiella oxytoca. Bai et al. (2014) mendapatkan senyawa
antibakteri flavipesins A dan flavipesins B dari kapang endofit mangrove yang
diisolasi dari perairan Cina dengan efektifitasnya dalam melawan bakteri patogen
Staphylococcus aureus dan B. subtilis. Tarman dan dela Cruz (2014) telah
berhasil mengisolasi 40 isolat kapang endofit mangrove Rhizopora stylosa dengan
kode BAR dari Perairan Indonesia. Kode BAR diambil dari nama tempat
pengambilan mangrove yaitu perairan Barru, Sulawesi Selatan. Beberapa jenis
kapang endofit BAR dalam laporannya menunjukkan adanya aktivitas antibakteri
yang potensial, salah satunya yaitu kapang endofit BAR1.5. Sabiliilaika et al.
2015 melaporkan bahwa ekstrak kasar kapang endofit BAR1.5 memiliki aktivitas
antibakteri terhadap B. subtilis.
Mikroba B. subtilis merupakan jenis bakteri utama yang berperan dalam
pembusukan roti yang menjadikan roti menjadi lengket, berserabut dan berlendir

2

(Collins et al. 1991). Spora B. subtilis tahan terhadap panas dan dapat
bertahan selama pembakaran dengan suhu maksimum 97°C sampai 101°C
(Rocken et al. 1995; Rosenkvist et al. 1995). Anggota dari kelompok B. subtilis
dilaporkan menghasilkan zat-zat beracun pada sel mamalia seperti lichenysin A.
(Salkinoja-Salonen et al. 1999). Anggota dari kelompok B. subtilis juga telah
dilaporkan menghasilkan peptida beracun ionophoric, amylosin, yang
menyebabkan keracunan makanan (Constantin et al. 2008). Bakteri lain yang
merugikan adalah Pseudomonas aeruginosa, Breidensein et al. (2011) melaporkan
P. aeruginosa dapat menyebabkan pneumonia, infeksi saluran kemih serta
menyebabkan morbiditas dan mortalitas tinggi pada pasien dengan fibrosis kistik
karena infeksi kronis yang akhirnya menyebabkan kerusakan paru. Spencer
(1993) melaporkann bahwa P. aeruginosa sebagai penyebab infeksi dari mata.
Dennis et al. (1980) melaporkan P. aeruginosa merupakan salah satu bakteri
penyebab utama kerusakan kornea mata manusia.
Penemuan antibakteri dengan memanfaatkan hasil perairan berupa kapang
endofit mangrove terhadap kedua bakteri merugikan tersebut m enjadi fokus dalam
penelitian ini. Elias et al. (2006) menyatakan produk yang berasal dari
mikroorganisme merupakan sumber yang menarik untuk bahan obat sehingga
banyak industri yang tertarik dalam penggunaan bioteknologi mikrobial modern,
oleh karena itu penelitian lebih lanjut dari ekstrak kasar kapang endofit mangrove
BAR1.5 mengenai fraksinasi sangat dibutuhkan untuk memperoleh kelompok
senyawa yang berperan sebagai antibakteri.
Penelitian lebih lanjut dari ekstrak kasar tersebut juga diperlukan untuk
menentukan bagimana pengaruh ekstrak kapang endofit BAR1.5 terhadap
kerusakan morfologi kedua sel bakteri yang merugikan tersebut. Pengaruh
antibakteri terhadap pertumbuhan bakteri terdapat berbagai macam, sementara
jenis pengaruh ekstrak kapang endofit BAR1.5 terhadap kerusakan sel bakteri
belum diketahui. Madigan et al. (2000) menyatakan bahwa senyawa antibakteri
mempunyai beberapa efek terhadap sel, diantaranya memberikan efek dengan cara
membunuh sel tetapi tidak terjadi lisis atau pecah, tetapi ada yang menyebabkan
dinding sel lisis atau pecah. Burt dan Reinders (2003) melaporkan kerusakan
dinding sel bakteri akibat interaksi dengan senyawa antibakteri dapat dipelajari
dengan SEM (scanning electron microscope).

Perumusan Masalah
Tumbuhan mangrove di Indonesia khususnya di Sulawesi selatan telah
banyak dimanfaatkan oleh masyarakat pesisir sebagai sumber obat-obatan.
Hampir semua spesies tanaman di dunia termasuk mangrove memiliki satu atau
lebih mikroba endofit. Kapang endofit mampu memproduksi senyawa bioaktif
yang sama dengan inangnya. Penemuan senyawa antibakteri yang efektif telah
banyak dilaporkan dari kapang endofit mangrove yang diisolasi dari perairan luar
negeri, sedangkan di Indonesia jarang diteliti. Kapang endofit telah berhasil
diisolasi dari daun mangrove R. stylosa di perairan Barru, Sulawesi Selatan yang
diberi kode BAR1.5. Ekstrak kasarnya diketahui memiliki aktivitas penghambatan
terhadap bakteri B. subtilis. Penemuan tersebut perlu diteliti lebih lanjut terutama

3

mengenai fraksi yang aktif sebagai antibakteri dan pengaruh yang dihasilkan dari
ekstraknya terhadap morfologi sel bakteri.

Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan fraksi semi murni
antibakteri kapang endofit mangrove BAR1.5 dan aktivitasnya serta menentukan
pengaruh dari ekstraknya terhadap morfologi sel bakteri.

Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah memberikan informasi cara mendapatkan
fraksi antibakteri dari kapang endofit mangrove BAR1.5 beserta aktivitas
antibakteri dan komponen bioaktifnya. Manfaat yang lain yaitu memberikan
informasi mengenai pengaruh ekstrak kapang endofit mangrove BAR1.5 terhadap
kerusakan sel bakteri. Informasi ini dapat dijadikan sebagai rujukan dalam
penelitian selanjutnya. Manfaat penelitian ini juga sebagai informasi bahwa hasil
produk perairan berupa mikroba dapat menjadi sumber bahan baku farmasi yang
potensial.

Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan dari Sabililaika et al (2015)
yang melaporkan bahwa ekstrak kasar kapang endofit mangrove BAR1.5
memiliki aktivitas antibakteri yang dapat menghambat B. subtilis. Ruang lingkup
penelitian ini dimulai dari ekstrak kasar kapang endofit BAR1.5 dilakukan uji
bioautografi untuk menentukan fraksi yang aktif sebagai antibakteri. Fraksi
antibakteri diperoleh dengan menggunakan kromatografi lapis tipis preparatif
(KLTP) untuk mendapatkan fraksi tunggal. Fraksi tunggal yang diperoleh diuji
aktivitas antibakterinya dan ditentukan komponen bioaktifnya. Ekstrak kasar juga
diidentifikasi pengaruhnya terhadap morfologi sel bakteri.

4

2

METODE

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Desember 2014 sampai November
2015 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Departemen
Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut
Pertanian Bogor; Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi
Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor;
Laboratorium Terpadu, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian
Bogor; Laboratorium Kimia Analitik, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Institut Pertanian Bogor; Laboratorium Biologi, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor; Laboratorium Pusat Penelitian
Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Cibinong.

Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah isolat kapang endofit BAR1.5 yang
merupakan hasil isolasi dari daun mangrove R. stylosa dari Perairan Barru,
Sulawesi Selatan, koleksi Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Departemen
Teknologi Hasil Perairan. Bahan utama lainnya yaitu Potato Dextrose Agar
(PDA) (BD company), Potato Dextrose Broth (PDB) (BD company), Media
Nutrient Agar (NA) (Oxoid), Nutrient Broth (NB) (Oxoid), dan Mueller Hinton
Agar (MHA) (Oxoid), etil asetat, n-heksana, diklorometana, alkohol 70%,
akuades, paper dish, pereaksi warna, plat silika gel PF254 (Merck), silica gel
bubuk 60 GF 254 (Merck), dan antibiotik kloramfenikol. Bakteri uji yang
digunakan yaitu B. subtilis dan P. aeruginosa.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah clean bench (Thermo
Scientific 1300 Series A2), oven, autoklaf (Yamato SM52), inkubator
(Thermolyne type 42000), vacum rotary evaporator, shaker (Heidolph VV2000),
vortex (Pasolina type NS-8), pipet mikro (Eppendorf), timbangan digital (Sartorius
TE214S), scanning electron microscopy (SEM) (JSM 5000), pisau steril, corong
pemisah, kertas saring, kaca kromatografi lapis tipis preparatif, dan alat-alat gelas
yaitu cawan petri, gelas ukur, labu Erlenmeyer, pipet volumetrik dan tabung
reaksi.

Prosedur Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam 5 tahap. Tahapan pertama adalah kultivasi
kapang endofit mangrove BAR1.5, selanjutnya ekstraksi media kultur kapang.
Ekstrak yang diperoleh dilakukan uji bioautografi. Hasil bioautografi berupa
fraksi aktif. Fraksi yang aktif sebagai antibakteri tersebut kemudian dijadikan
acuan untuk pengambilan fraksi semi-murni pada KLTP sebagai tahapan yang

5

keempat. Fraksi yang diperoleh dari KLTP kemudian diuji menggunakan KLT
untuk mengetahui apakah fraksi yang diperoleh adalah fraksi tunggal. Fraksi
tunggal yang didapatkan kemudian dilakukan uji aktivitas antibakteri dan uji
komponen bioaktif. Tahap kelima yaitu mengidentifikasi pengaruh ekstrak
terhadap morfologi sel bakteri. Diagram alir proses penelitian dapat dilihat pada
Gambar 1.

Kapang Koleksi BAR1.5

Peremajaan
Kultivasi kapang pada media PDB
dengan menggunakan shaker kecepatan
120 rpm selama 15 hari
Pemanenan

Media kultur

Miselia

Ekstraksi menggunakan
etil asetat 1:1 (v/v)

Ekstrak kasar kapang
endofit BAR1.5
Bioautografi
Fraksi aktif

Identifikasi pengaruh ekstrak
terhadap morfologi sel
menggunakan SEM

Fraksinasi menggunakan KLTP

Fraksi semi-murni

1 Uji aktivitas antibakteri
2 Uji komponen bioaktif

Gambar 1 Diagram alir proses penelitian

6

Kultivasi Kapang Endofit (Srikandace et al. 2007)
Kapang endofit terlebih dahulu dilakukan peremajaan dengan cara
memotong kapang koleksi yang telah dikultur di media PDA dan telah disimpan
pada suhu 4°C, kemudian dipindahkan ke media PDA baru. Proses tersebut
dilakukan dengan steril di dalam clean bench, kemudian diinkubasi pada suhu
ruang selama 7 hari. Setelah 7 hari akan dihasilkan kultur kapang yang ditandai
dengan pertumbuhan miselium. Isolat yang dihasilkan kemudian siap untuk
dikultivasi skala kecil atau prekultur pada media PDB. Isolat kapang endofit
mangrove BAR1.5 pada media PDA dapat dilihat pada Lampiran 1.
Kapang endofit yang telah diremajakan di PDA kemudian dilakukan pre
kultur dalam media PDB 50 mL dan diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari.
Sebanyak 10 mL hasil prekultur dipindahkan ke dalam labu erlenmeyer 500 mL
yang berisi 200 mL media PDB untuk kultur masal. Waktu yang digunakan untuk
kultur masal yaitu sesuai dengan waktu optimal dalam menghasilkan aktvitas
antibakteri terbaik. Sabiliilaika et al. (2015) melaporkan hasil ekstrak yang
memiliki aktivitas terbaik yaitu pada hari ke15, oleh karena itu kultur masal
kapang endofit BAR1.5 yaitu selama 15 hari. Kultur kapang endofit mangrove
BAR1.5 selama 15 hari dapat dilihat pada Lampiran 2.
Semua proses pemindahan baik pre kultur dan kultur masal dilakukan secara
steril dalam clean bench, dilakukan dalam keadaan digoyang menggunakan
shaker dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruang. Pemanenan dilakukan
dengan cara menggunakan kertas saring untuk memisahkan biomassa dan media
kultur. Media kultur yang diperoleh kemudian diekstraksi untuk mendapatkan
ekstrak kasar.
Ekstraksi Media Kultur Kapang Endofit (Nursid et al. 2010).
Pertama yang dilakukan yaitu media dievaporasi untuk meminimalisir air
yang ada di dalam media kultur (ekstraseluler), kemudian dilakukan ekstraksi
secara maserasi menggunakan pelarut etil asetat dengan perbandingan 1:1 (v/v).
Proses maserasi dilakukan menggunakan shaker dengan kecepatan 120 rpm
selama 15 hari pada suhu ruang. Hasil maserasi akan terlihat antara lapisan etil
asetat dan lapisan media kultur, kemudian kedua lapisan tersebut dipisahkan
menggunakan corong pisah. Lapisan etil asetat ditampung untuk dikumpulkan,
lapisan media kultur dimaserasi kembali dengan menggunakan pelarut dan
perbandingan yang sama yaitu etil asetat 1:1 (v/v). Hal tersebut dilakukan
sebanyak 3x24 jam.
Lapisan etil asetat yang ditampung kemudian dievaporasi menggunakan
vacum rotary evaporator suhu 45°C untuk menguapkan pelarut yang digunakan.
Hasil yang didapatkan dalam bentuk pekatan yang merupakan ekstrak kasar.
Perolehan ekstrak kasar dapat dilihat pada Lampiran 3.
Pengujian Bioautografi (Betina 1972)
Pertama yang dilakukan dalam uji bioautografi yaitu menyiapkan ekstrak
kasar yang telah difraksinasi menggunakan KLT. Fraksinasi pada plat KLT yaitu
menggunakan eluen terbaik yang mampu menghasilkan banyak fraksi. Fraksinasi

7

ekstrak kapang endofit BAR1.5 menggunakan eluen terbaik yang telah ditentukan
pada penelitian Sabiliilaika et al. (2016) yaitu etil asetat: diklorometana: heksana
dengan perbandingan 3:2:1 (v/v/v).
Media MHA steril sebanyak 10 ml dituang ke cawan petri steril kemudian
ditunggu hingga memadat, setelah memadat lalu diletakkan plat KLT yang
mengandung ekstrak terfraksinasi. Plat KLT yang berada di atas media MHA
steril kemudian dituangi media MHA yang berisi bakteri sebanyak 20 µL dengan
OD 0.5-0.8. Fraksi aktif dapat ditandai dengan adanya zona bening di sekitar
fraksi.
Fraksinasi Menggunakan KLT-Preparatif
Hasil bioautografi tersebut hanya digunakan untuk menentukan fraksi yang
memiliki aktivitas antibakteri namun tidak bisa digunakan untuk memperoleh
fraksi yang terbentuk. Penelitian ini menggunakan KLT-preparatif untuk
memperoleh tiga fraksi yang telah ditentukan. Devmurari et al. (2010)
menyatakan bahwa jumlah mikrogram dari campuran komponen organik yang
dipisahkan oleh TLC dapat ditingkatkan jumlahnya dalam jumlah miligram (1050 mg) dengan menggunakan KLTP.
Fraksi dari KLT yang memiliki aktivitas antibakteri selanjutnya diisolasi
dengan metode KLT-preparatif menggunakan fase diam silika gel. Prosedur kerja
mengacu pada Gritter et al. (1991) yaitu menggunakan KLT-preparatif ukuran 20
x 20 cm2 dengan menggunakan fase diam silika gel PF254, yang telah diaktifkan
dengan cara pemanasan selama 1 jam pada suhu 110 oC. Ekstrak kasar ditotol
memanjang pada lempeng plat KLT-preparatif kemudian dielusi menggunakan
eluen terpilih sebagai fase gerak. Pita-pita yang terbentuk diamati dengan sinar
UV 254 nm atau 366 nm. Pengambilan fraksi hasil KLT-preparatif dengan cara
dikerik dan hasilnya dilarutkan dengan pelarut awal ekstrak yaitu etil asetat,
kemudian dikeringkan. Fraksi yang terpilih dikumpulkan kemudian diuji
menggunakan KLT dan dilihat di bawah UV, untuk mengkonfirmasi bahwa fraksi
antibakteri yang didapatkan adalah fraksi tunggal. Fraksi tunggal yang diperoleh
merupakan fraksi semi-murni yang kemudian dilakukan pengujian aktivitas
antibakteri.
Uji Aktivitas Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri fraksi semi-murni dilakukan terhadap bakteri
P.aurogenosa dan B.subtilis. Uji dilakukan dengan menggunakan metode disc
diffusion dengan mengacu Qaralleh et al. (2010) yaitu pertama yang dilakukan
adalah bakteri uji dikultur di media NA dengan inkubasi selama 24 jam pada suhu
37°C. Bakteri yang telah dikultur kemudian disuspensikan ke dalam media NB
steril dan diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°C. Sebanyak 20 µL NB yang
berisi bakteri uji dengan OD berkisar 0.5-0.8 dimasukkan ke dalam 20 mL media
MHA steril. Proses selanjutnya yaitu dihomogenisasi menggunakan vortex,
dituang ke dalam cawan petri steril, ditunggu hingga memadat. Paper disc steril
disiapkan kemudian diberi senyawa antibakteri sebanyak 1 mg/disc .
Konsentrasi yang digunakan berdasarkan Saad et al. (2012); Kowti et al.
(2010) bahwa konsentrasi pada antibiotik yang digunakan sebagai kontrol yaitu
berdasarkan Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), sedangkan pada

8

senyawa yang masih campuran atau belum murni yaitu dengan konsentrasi 1.0
sampai 1.5 mg/disc.
Penelitian ini menggunakan fraksi yang masih mengandung campuran atau
semi-murni sehingga dalam penelitian ini dipilih konsentrasi 1 mg/disc. Kontrol
positif yang digunakan yaitu antibiotik kloramfenikol dengan konsentrasi 30
µg/disc dan kontrol negatif yaitu etil asetat. Paper disc yang telah diberi
perlakuan kemudian diletakkan di atas media MHA yang telah memadat,
kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Pengukuran diameter zona
hambat yang terbentuk di sekeliling paper disc dilakukan dengan cara mengurangi
diameter zona hambat yang terbentuk dengan diameter paper disc (6 mm).
Uji Komponen Bioaktif (Wagner 1996)
Pengujian polifenol dilakukan dengan menggunakan pereaksi semprot
FeCl3. Pereaksi FeCl3 dibuat dengan cara melarutkan 0.1 gram FeCl3 ke dalam 10
mL akuades. Pereaksi ini kemudian siap untuk disemprotkan ke KLT yang
mengandung fraksi. Kandungan fraksi dinyatakan positif mengandung polifenol
jika terbentuk warna hitam. Pereaksi semprot lain yang digunakan yaitu pereaksi
anisaldehid asam sulfat untuk mendeteksi senyawa terpenoid. Hasil positif apabila
terdapat noda berwarna ungu-merah atau ungu. Uap amonia digunakan untuk
mendeteksi senyawa flavonoid, hasil positif dapat ditunjukkan dengan adanya
noda warna kuning atau orange kecoklatan.
Analisis Kerusakan Sel Bakteri Menggunakan SEM
Pengamatan dengan SEM dilakukan untuk mempelajari pola perubahan
morfologi dan struktur sel bakteri patogen B. subtilis dan P. aeruginosa akibat
dari pemberian ekstrak kapang endofit BAR1.5. Pengamatan ini mengacu pada
Jeol (1995) yaitu suspensi bakteri uji dikontakkan dengan ekstrak selama 4 jam.
Suspensi bakteri dilakukan proses sentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama
20 menit, cairan dibuang untuk mendapatkan masa sel bakteri berupa pellet,
selanjutnya pellet dicuci dengan buffer sebanyak 2 kali.
Pelet direndam dengan glutaraldehid 2% selama semalam, lalu ditambahkan
chocodylate buffer, dan direndam selama 20 menit. Larutan uji dilakukan proses
sentrifugasi dan supernatan dipisahkan. Pelet ditambahkan osmium tetraoksida
1% dan direndam selama 1 jam, selanjutnya dikeringkan dengan alkohol berturut
turut 70%, 80%, 95% dan alkohol absolut masing masing selama 20 menit. Pellet
disuspensikan dengan penambahan butanol, kemudian suspensi diletakkan diatas
cover slip yang telah mengering kemudian dilapisi dengan emas melalui proses
vakum selama 20 menit dan diamati dengan SEM perbesaran 5000x.

Analisis Data
Data kuantitatif dari aktivitas antibakteri dari penelitian ini diolah
menggunakan rata-rata dan standar deviasi. Data-data kualitatif diolah dengan
melihat perbedaan sampel akibat pengaruh faktor-faktor yang telah ditentukan.
Data
tersebut
kemudian
dianalisis
secara
deksriptif.

9

3

HASIL DAN PEMBAHASAN

Fraksi Semi-Murni Kapang Endofit BAR1.5
Fraksi antibakteri kapang endofit BAR1.5 diperoleh dengan uji bioautografi
terlebih dahulu. Pengujian dilakukan untuk menentukan fraksi yang aktif sebagai
antibakteri. Pengujian bioautografi membutuhkan proses fraksinasi ekstrak kasar
pada KLT. Nilai Rf yang dihasilkan pada KLT untuk uji bioautogrfi penelitian ini
dicocokan dengan nilai Rf fraksi pada KLT di penelitian sebelumnya. Pencocokan
hasil nilai Rf pada penelitian ini dengan penelitian sebelumnya dilakukan untuk
mengkonfirmasi kebenaran fraksi yang dihasilkan. Ketentuan Fraksi aktif yang
dihasilkan pada uji bioautografi menjadi pedoman untuk pengambilan fraksi di
KLTP sebagai fraksi semi murni antibakteri.
Fraksi pada KLT
Fraksinasi ekstrak kasar kapang endofit pada KLT dilakukan karena pada
pengujian bioautografi dibutuhkan KLT yang sudah mengandung ekstrak
terfraksinasi. Fraksinasi pada KLT dalam penelitian ini menghasilkan 7 fraksi.
Nilai Rf yang dihasilkan dari bawah ke atas yaitu 0.27; 0.35; 0.56; 0.60; 0.85;
0.89; 0.94 (Gambar 2A). Perhitungan nilai Rf dapat dilihat pada Lampiran 4.
Jumlah fraksi yang sama yaitu sebanyak 7 dan nilai Rf yang tidak jauh berbeda
dari penelitian sebelumnya Sabiliilaika et al. (2015) yaitu dari bawah ke atas 0.27;
0.32; 0.54; 0.58; 0.86; 0.90; 0.96. Hasil tersebut menunjukkan bahwa fraksinasi
pada KLT yang dilakukan dalam penelitian ini adalah benar.
Fraksi Aktif pada Uji Bioautografi
Fraksi aktif dari hasil uji bioautografi yaitu ditandai dengan adanya zona
penghambatan di sekitar fraksi. Hasil bioautografi dapat dilihat pada (Gambar
2B). Zona penghambatan yang dihasilkan yaitu sebanyak 3, seperti yang
ditunjukkan dengan panah merah. Tiga zona penghambatan tersebut terbentuk
pada fraksi yang memiliki ciri-ciri yaitu fraksi pertama (F1) merupakan fraksi
urutan pertama dari bawah yang memiliki warna merah. Fraksi kedua (F2) adalah
fraksi urutan kedua yang berwarna orange. Fraksi ketiga (F3) yaitu fraksi urutan
kelima yang berwarna kuning.
Urutan susunan fraksi yang terpisah dari bawah ke atas menunjukkan
tingkat kepolaritasan dari senyawa yang ada di dalam fraksi. Hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa urutan fraksi berdasarkan tingkat polaritasnya dari polar ke
nonpolar adalah F1, F2, kemudian F3. Spangenberg et al. (2011) menyatakan
bahwa suatu pelarut yang bersifat relatif polar dapat membuat pelarut yang tidak
polar menjauh dari ikatannya dengan silica gel. Prinsipnya yaitu berdasarkan “like
dissolved like”, semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka
semakin terbawa oleh fase gerak.

10

Rf 0.94

Rf 0.89

Rf 0.85
Rf 0.56

Rf 0.60

F3

3

F2
F1
Rf 0.35
Rf2 0.27
1

(A)

(B)

Gambar 2 Kromatogram fraksinasi ekstrak kapang endofit mangrove BAR1.5 etil
asetat: diklorometana: heksana (3:2:1) (A) pada KLT di bawah sinar
UV 254 nm, (B) hasil uji bioautografi terhadap B. subtilis
Fraksi pada KLTP
Hasil bioautografi hanya digunakan untuk menentukan fraksi yang memiliki
aktivitas antibakteri namun tidak bisa digunakan untuk mengambil fraksi yang
terdeteksi antibakteri. Ciri-ciri warna dan urutan fraksi pada F1, F2, dan F3
menjadi ketentuan untuk pengambilan fraksi. Penelitian ini menggunakan KLTP
untuk mengambil tiga fraksi yang telah ditentukan. Hasil KLTP pada penelitian
ini dapat dilihat pada Gambar 3. Kromatogram dari KLTP menunjukkan bahwa
terdapat 7 fraksi dari hasil elusidasi etil asetat: diklorometana: n-heksana (3:2:1).
Tujuh fraksi tersebut sesuai dengan jumlah fraksi pada KLT. Tiga fraksi (F1, F2,
dan F3) dengan ciri-ciri yang telah ditentukan pada penentuan fraksi aktif juga
muncul pada KLTP. Kromatogram KLTP menunjukkan bahwa F1 adalah urutan
fraksi pertama dari bawah yang memiliki warna merah. F2 adalah urutan fraksi
kedua yang memiiki warna orange. Fraksi 3 (F3) adalah urutan fraksi kelima yang
memiliki warna kuning.
Tiga fraksi tersebut berdasarkan urutan dan warna fraksi sesuai dengan
ketentuan 3 fraksi aktif hasil dari uji bioautografi. Hasil tersebut menunjukkan
bahwa untuk memperoleh 3 fraksi aktif antibakteri dari kapang endofit mangrove
BAR1.5 dapat dilakukan dengan menggunakan KLTP. Perolehan tiga fraksi
antibakteri kapang endofit mangrove BAR1.5 dapat dilihat pada Lampiran 5.
Rendemen terbanyak yaitu pada F1 sebesar 25%, nilai rendemen pada F2 dan F3
masing-masing memiliki nilai rendemen sebesar 20%. Hasil ini menunjukkan
bahwa ekstrak kasar sebesar 100 mg dapat menghasilkan fraksi antibakteri sekitar
20-25%. Perhitungan nilai rendemen dapat dilihat pada Lampiran 6.

11

F3

F2
F1

Gambar 3 Kromatogram fraksinasi ekstrak kapang endofit mangrove BAR1.5 etil
asetat: diklorometana: heksana (3:2:1) pada KLTP di bawah sinar UV
254 nm
Noda fraksi yang diperoleh terlihat nyata perbedaan warna di setiap
fraksinya. Hal tersebut menandakan bahwa komponen yang ada di dalam setiap
fraksi memiliki fungsi bioaktif yang berbeda. Tujuh fraksi yang dihasilkan tidak
semua memiliki senyawa bioaktif sebagai antibakteri, melainkan terdapat 3 fraksi
yang aktif sebagai antibakteri. Hasil yang sama juga dilaporkan oleh
Sugijanto et al. (2014) dari 17 fraksi yang didapatkan pada pemisahan ekstrak etil
asetat endofit AgOt hanya 5 fraksi yang aktif sebagai antibakteri.
Fraksi Tunggal
Tiga fraksi antibakteri yang ditunjukkan pada KLTP walaupun sudah sesuai
dengan ketentuan fraksi aktif yang dituju, tetapi perlu dilakukan pengujian
kembali. Sarker et al. (2006) menyatakan bahwa untuk mendapatkan komponen
tunggal dari pemisahan ekstrak kasar sangat sulit untuk dilakukan, sehingga
dibutuhkan fraksinasi komponen dari persamaan polaritasnya, oleh karena itu
pada penelitian ini walaupun telah dilakukan fraksinasi dari persamaan
polaritasnya, fraksi yang diperoleh dari KLTP tetap diuji untuk memastikan
bahwa fraksi yang diperoleh adalah fraksi tunggal. Fraksi yang tidak tunggal atau
tercampur fraksi lain sangat dapat dimungkinkan terjadi pada saat proses
pengambilan di KLTP terutama pada antar fraksi yang memiiki jarak berdekatan.
Pengujian fraksi tunggal dilakukan di KLT. Hasil pengujian fraksi tunggal
terhadap 3 fraksi antibakteri dalam penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 4.
Tiga fraksi antibakteri pada KLT yang diamati di bawah UV  366 nm
memperlihatkan adanya satu noda tunggal di setiap fraksi yang dujikan.
Sapar et al. (2004) menyatakan bahwa KLT dilakukan untuk memastikan bahwa
fraksi tunggal yang diperoleh ditunjukkan dengan adanya satu noda tunggal yang
terlihat di bawah UV.

12

F3
Rf 0,85

F1
Rf 0,25

F2
Rf 0,35

(A)
(C)
(B)
Gambar 4 Kromatogram fraksi antibakteri isolat kapang endofit BAR1.5 (A) F1,
(B) F2, (C) F3
Noda tunggal yang ditunjukkan pada KLT dalam penelitian ini juga berada
di sekitar nilai Rf hasil fraksinasi di KLT. F1 pada Rf 0,25; F2 pada Rf 0,35 dan
F3 pada Rf 0,85. Nilai Rf pada hasil fraksinasi di KLT dapat dijadikan landasan
tepat tidaknya fraksi tunggal yang diperoleh. Hal tersebut dikarenakan jenis eluen,
ketebalan, kerapatan lapisan penyerap atau jenis plat silica gel yang digunakan
sama. Nilai Rf pada F1 dan F2 fraksi tunggal tidak sama persis dengan nilai Rf F1
(0,27), dan F2 (0,34) pada hasil fraksinasi. Hal tersebut dimungkinkan karena
jumlah totolan yang diberikan sedikit berbeda. Perbedan nilai Rf tersebut tidak
memiliki rentang yang jauh, karenanya dapat dipastikan bahwa fraksi yang
diperoleh pada penelitian ini bukan hanya tunggal tetapi juga fraksi aktif yang
tepat dituju. Touchstone (1992) menyatakan bahwa faktor-faktor yang
mempengaruhi nilai Rf pada KLT yaitu kerapatan lapisan penyerap, sifat
penyerap atau jenis silica gel, kemurnian eluen, struktur kimia senyawa,
ditambahkan Sastrohamidjojo (1991) faktor lain yang mempengaruhi adalah
derajat kejenuhan sampel dan jumlah sampel yang digunakan.

Aktivitas Atibakteri Fraksi Semi-Murni
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan pada semua fraksi yang telah
diperoleh (F1, F2, dan F3) terhadap B. subtiilis, P. aeruginosa. Hasil uji aktivitas
antibakteri 3 fraksi kapang endofit BAR1.5 menggunakan metode paper disk
diffusion dengan konsentrasi 1 mg (Gambar 5). Hasil uji aktivitas antibakteri
terhadap B. subtiilis menunjukkan adanya zona bening yang lebih besar
dibandingkan dengan zona bening yang terbentuk pada bakteri uji P. aeruginosa.
Hal tersebut menunujukkan bahwa aktivitas penghambatan terhadap B. subtiilis
lebih besar daripada P. aeruginosa.

13

F2
F1
F2

F1

+

+

F3

F3

(A)

(B)

Gambar 5 Hasil uji antibakteri F1, F2, F3 dengan masing-masing konsentrasi
1mg/disc, (+) kloramfenikol, (-) etil asetat (A) terhadap B. subtilis, (B)
terhadap P. aeruginosa.
Kontrol positif yang digunakan pada penelitian ini yaitu kloramfenikol
dengan menghasilkan zona penghambatan yang paling luas terhadap semua
bakteri uji. Pelczar dan Chan (2008) menyatakan kloramfenikol masuk dalam
golongan antibiotik yang memiliki spektrum luas dan dapat menghambat bakteri
Gram-positif maupun Gram-negatif. Kontrol negatif yang digunakan dalam
penelitian ini yaitu pelarut etil asetat, dimana pelarut tersebut digunakan sebagai
pembawa fraksi tunggal ke paper disc. Gambar 5 menunjukkan bahwa pelarut etil
asetat terhadap semua bakteri uji tidak menghasilkan zona penghambatan. Hasil
tersebut menunjukkan bahwa etil asetat tidak memiliki pengaruh dan tidak
memiliki peran atas terbentuknya zona hambat pada setiap fraksi yang diujikan.
Pengujian fraksi tunggal terhadap bakteri uji B. subtilis pada F1 dan F2
(Gambar 5 A) yang memiliki luas zona penghambatan hampir sama dengan
kloramfenikol. Diameter yang terbentuk pada F1 adalah 19 mm, pada F2 adalah
20 mm. Nilai besarnya diameter zona penghambatan dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Aktivitas antibakteri fraksi kapang endofit BAR1.5
Diameter zona hambat (mm)
Sampel yang diuji
B. subtilis
P. aeruginosa
F1
19.00±0,00
F2
20.00±0,00
5.00±0,00
F3
02.00±0,00
Kontrol positif
24.00
21.00
Kontrol negatif
Keterangan: Kontrol positif: kloramfenikol, kontrol negatif: etil asetat, -: tidak adanya
zona penghambatan

Diameter pada zona bening yang dihasilkan oleh F1 dan F2 (Tabel 1)
dengan konsentrasi 1 mg lebih besar dibandingkan ekstrak kasarnya pada
penelitian sebelumnya oleh Sabiliilaika et al. (2015) yang menghasilkan diameter
12 mm dengan konsentrasi 2 mg. Hal tersebut dimungkinkan karena fraksi yang
didapat adalah fraksi target yang berperan khusus sebagai senyawa antibakteri.

14

Senyawa di dalam fraksi tersebut semakin besar aktivitasnya ketika berperan
sendiri karena tidak bersinergi dengan senyawa yang ada di dalam fraksi lain yang
belum tentu memiliki aktivitas antibakteri. Hasil penelitian ini menunjukkan
bahwa senyawa antibakteri di dalam F1 dan F2 lebih besar aktivitasnya dalam
bentuk fraksi tunggal, sehingga berpeluang untuk dimurnikan. Beberapa
penelitian juga telah melaporkan bahwa dengan dimurnikannya senyawa
antibakteri yang terkandung dalam bahan alami, maka akan semakin besar
efektifitasnya. Komponen atau golongan senyawa apa yang ada di dalam fraksi
tunggal tersebut menjadi sangat penting untuk diketahui.
Silva et al. (2013) mengisolasi senyawa murni antibakteri dari kapang
endofit mangrove Paecilomyces variotii yaitu senyawa viriditoxin dengan
spektrum yang sangat luas. Konsentrasi terendah untuk menghambat S. aureus
yang resisten methicilin adalah 0,5 μg/mL dan 2 μg/mL untuk menghambat
Enterococcus sp. yang resisten vancomicine. Hussain et al. (2015) melaporkan
pada pencarian komponen fitokimia dari kapang endofit Phoma sp. diperoleh
senyawa murni atrovenetione dan sclerodione. Senyawa tersebut menghasilkan
aktivitas antijamur dengan diameter zona hambat sebesar 15 mm dengan
konsentrasi minimal 10 mg/mL. Jouda et al. (2014) telah menemukan tiga
senyawa baru yang spesifik dengan aktivitas antibakteri yang kuat pada
konsentrasi minimal 10 μg/mL dan 5 μg/mL.
Fraksi tunggal pada F3 memiliki aktivitas yang lebih rendah dibandingkan
dengan ekstrak kasar. Hal tersebut dimungkinkan karena F3 memiliki jarak yang
sangat dekat dengan fraksi lain, dimana fraksi lain di sekitar F3 tidak ikut
diisolasi. F3 yang diisolasi menjadi fraksi tunggal dimungkinkan kehilangan
sinergitas dengan senyawa lain, sehingga mengakibatkan luas daya hambatnya
lebih rendah. Senyawa antibakteri di dalam F3 dimungkinkan akan lebih kuat
aktivitas antibakterinya apabila bersinergi dengan senyawa yang ada di dalam
fraksi terdekatnya.
Aires et al. (2009) melaporkan bahwa hidrolisis glucosinolate memiliki
aktivitas antibakteri yang signifikan dalam melawan bakteri Gram-positif, bakteri
Gram-negatif dan jamur karena pengaruh sinergitas dari kombinasi komponen
lain. Tafesh et al. (2011) juga telah melaporkan kombinasi dari komponen fenolik
dapat membuat pengaruh antibakteri dalam sinergitas yang berkontribusi untuk
membuat reaksi antibakteri lebih baik dibandingkan dengan reaksi dari komponen
tunggal. Paiva et al. (2010) telah menyatakan sejumlah publikasi walaupun telah
difokuskan pada isolasi dan identifikasi bioaktif, namun senyawa tunggal yang
didapatkan mungkin tidak bertanggung jawab atas aktivitas yang diamati, tetapi
dapat disebabkan karena kombinasi dari senyawa yang berinteraksi secara sinergis
atau aditif.
Hasil tiga fraksi semi-murni antibakteri yang didapatkan dari penelitian ini
menunjukkan bahwa F1 dan F2 memiliki aktivitas antibakteri yang lebih besar
dibanding ekstrak kasarnya terhadap B. subtilis. Fraksi 3 (F3) memiliki aktivitas
antibakteri yang lebih rendah dibanding ekstrak kasarnya.
Semua fraksi yang diujikan terhadap B.subtilis memiliki diameter zona
hambat lebih besar dibandingkan dengan P.aeruginosa. Sabiliilaika et al. (2015)
melaporkan pada ekstrak kasar kapang endofit BAR1.5 juga memiliki aktivitas
penghambatan yang lebih efektif terhadap B. subtilis. Hasil tersebut menunjukkan
bahwa pada ekstrak dan fraksi sama-sama lebih efektif menghambat bakteri

15

B. subtilis. Kapang endofit BAR1.5 diduga memiliki senyawa antibakteri yang
aktif berperan dalam menghambat bakteri B. subtilis yang merupakan bakteri
Gram-positif. Paiva et al. (2010) menjelaskan bahwa sensitivitas bakteri terkait
dengan tingkatan lapisan luar peptidoglikan. Arias et al. (2004) menyatakan
bahwa bakteri Gram-positif memiliki satu lapisan luar peptidoglikan yang bukan
merupakan penghalang permeabilitas yang efektif. Hal tersebut membuat bakteri
Gram-positif lebih rentan daripada bakteri Gram-negatif. Bakteri Gram-negatif
memiliki lapisan luar yang lebih dari satu, seperti membran fosfolipid, komponen
lipopolisakarida dan protein. Lapisan luar tersebut merupakan penghalang yang
selektif.
Faktor lain yang dimungkinkan berpengaruh pada besarnya aktivitas
antibakteri terhadap B. subtilis yaitu karena komponen bioaktif yang bertanggung
jawab sebagai antibakteri. Senyawa bioaktif yang paling berperan sebagai
antibakteri di dalam kapang endofit BAR1.5 adalah senyawa bioaktif yang ada di
dalam F1 dan F2, karena kedua fraksi tersebut memiliki zona penghambatan
paling besar dibanding fraksi lain dan ektrak kasarnya. Campos et al. (2009) telah
melaporkan bahwa kerusakan membran sel bakteri asam laktat karena adanya
pengaruh komponen bioaktif asam fenolik. Rauha et al. (2000) juga melaporkan
bahwa kandungan bioaktif flavonoid yang ada di dalam ekstrak tanaman bilberry
dapat menghambat semua bakteri uji Gram-positif sedangkan pada bakteri Gramnegatif tidak ada aktivitas penghambatan.

Komponen Bioaktif Fraksi Semi-Murni
Komponen bioaktif yang terdekteksi pada ketiga fraksi memiliki komponen
bioaktif dari golongan senyawa yang berbeda-beda. Perbedaan komponen bioaktif
tersebut dimungkinkan sebagai salah satu faktor yang ikut berperan dalam
perbedaan aktivitas antibakteri dari setiap fraksi yang dihasilkan, dan juga akan
mempengaruhi penghambatannya secara morfologi. Sabiliilaika et al. (2015)
melaporkan bahwa dari hasil uji fitokimia, diduga senyawa yang paling dominan
dalam ekstrak kasar kapang endofit mangrove BAR1.5 adalah terpenoid,
polifenol dan flavonoid.
Komponen F1
Fraksi 1 (F1) menampakkan adanya noda berwarna kuning sampai orange
setelah diberi uap amonia, yang menunjukkan bahwa F1 positif mengandung
senyawa flavonoid. F1 dimungkinkan memiliki satu jenis komponen bioaktif yang
berasal dari golongan senyawa flavonoid. Hal tersebut dikarenakan pada F1 tidak
menunjukkan adanya komponen bioaktif polifenol dan triterpenoid. Hasil
pengujian komponen bioaktif F1 dapat dilihat pada Tabel 2.

16

Jenis Fraksi

Tabel 2. Hasil pengujian komponen bioaktif F1
Flavonoid
Polifenol
Triterpenoid

+

-

-

F1

Keterangan: + : menunjukkan positif adanya komponen bioaktif uji, - : menunjukkan tidak adanya
komponen bioaktif uji.

Keberadaan flavonoid pada F1 semakin dikuatkan dengan hubungan letak
kenampakkan noda yang berada di daerah bawah pada KLT. Noda kuning-orange
berada pada Rf 0,26, dimana nilai Rf tersebut berada di sekitar ketentuan nilai Rf
F1. Letak munculnya noda tersebut menegaskan bahwa flavonoid yang dihasilkan
bukan hanya saja positif keberadaanya, tetapi juga tepat milik F1. Terdeteksinya
letak noda kunig-orange pada KLT yang berada di bawah juga menunjukkan
bahwa komponen bioaktif yang terdeteksi harus polar. Spangenberg et al. (2011)
menyatakan bahwa senyawa polar pada KLT memiliki Rf yang dekat dengan
angka 0 atau bercak yang ditampakkan pada KLT berada di daerah bawah. Rijke
(2005) melaporkan bahwa flavonoid merupakan senyawa polar karena memiliki
sejumlah gugus hidroksil yang tidak tersubtitusi.
Flavonoid merupakan zat fitokimia yang paling besar ditemukan di jaringan
tanaman (Carlo et al. 1999). Banyak kajian yang telah melaporkan bahwa adanya
aktivitas antibakteri karena ketersediaan senyawa flavonoid dalam suatu ekstrak
(Xu dan lee 2001; Ogundipe et al. 2001), bahkan flavonoid dalam kandungaan
antibakteri dari Ouratea sulcata dilaporkan aktif dalam melawan S. aureus,
B. subtilis, Vibrio anguillarium dan E. coli yang keefektifannya hampir sama
dengan standar antibiotik streptomycin (Souza et al. 2010).
Komponen flavonoid dari suatu ekstrak tanaman tertentu juga telah
dilaporkan sebagai bioaktif yang paling mendominasi dalam aktivitas antibakteri
melawan bakteri Gram-positif dibandingkan pada bakteri Gram-negatif
(Contini et al. 2003). Flavonoid dalam mekanisme antibakteri dilaporkan sebagai
penyebab terganggunya integeritas dinding sel dan membran sel bakteri (Jalil dan
Ismail 2008). Penelitian lain yang mengisolasi flavonoid dari tanaman obat juga
melaporkan bahwa kandungan flavonoid efektif sebagai antibakteri dengan
mekanisme merusak fungsi membran atau dinding sel bakteri (Sohn et al. 2004).
Komponen F2
Fraksi 2 (F2) menampakkan adanya noda hitam setelah dilakukan
penyemprotan FeCl3 yang menunjukkan positif terdapat kandungan polifenol.

17

Hasil pengujian yang lain yaitu pada