Penuntun Pratikum Biokimia

PEN U N TU N PRAKTI KU M BI OKI M I A M . T . SI M AN JU N T AK

J. SI LALAH I

Fa k u lt a s M a t e m a t ik a d a n I lm u Pe n g e t a h u a n Ala m Ju r u sa n Fa r m a si

U n iv e r sit a s Su m a t e r a U t a r a

I . PROTEI N A. REAKSI U JI PROTEI N

1 . PEN GEN D APAN PROTEI N OLEH GARAM- GARAM AN ORGAN I K

Kelar ut an pr ot ein ak an ber k ur ang bila k edalam lar ut an pr ot ein dit am bahk an gar am- gar am anor ganik . Pengendapan t er us t er j adi k ar ena k em am puan ion gar am unt uk m enghidr asi, sehingga t er j adi k om pet isi ant ar a gar am anor ganik dengan m olek ul pr ot ein unt uk m engik at air . Kar ena gar am anor ganik lebih m enar ik air m ak a j um lah air y ang t er sedia unt uk m olek ul pr ot ein ak an ber k ur ang.

Pereaksi:

a. am m onium sulfat

b. per eak si Millon ( 150 gr / l lar ut an m er k ur i sulfat dalam 15% v / v asam su lf at )

c . per eaksi Biur et Cara Kerj a:

1. Jenuhk an 10 m l lar ut an pr ot ein dengan am m onium sulfat , dengan car a penam bahan am m onium sulfat k r ist al sedik it dem i sedik it , aduk hingga lar ut . Tam bah dan aduk lagi sehingga sedik it gar am am m onium y ang t er t inggal t idak lar ut lagi ( t er bent uk lar ut an lew at j enuh) . Sar ing.

2. uj i k elar ut an endapan dalam per eak si Millon dan pada f ilt r at n y a t am bahk an per eak si Biur et .

Pe n g e n d a p a n Pr o t e in o le h g a r a m a n o r g a n ik

T a b u n g Pe r e a k si H a sil Ke t e r a n g a n

I ( endapan ) I I ( filt r at )

Millon Biuret

………… …………

………. . ………

2 . U JI KOAGU LASI

Pr ot ein dengan penam bahan asam at au pem anasan ak an t er j adi k oagulasi. Pada pH iso- elek t r ik ( pH lar ut an t er t ent u biasany a ber k isar 4 – 4 , 5 dim an a pr ot ein m em pu n y ai m u at an posit if dan n egat if sam a, seh in gga salin g m enet r alk an) k elar ut an pr ot ein sangat m enur un at au m engendap. Pada t em per at ur diat as 60oC k elar ut an pr ot ein ak an ber k ur ang ( k oagulasi) k ar ena pada t em per at ur y ang t inggi ener gi k inet ik m olek ul pr ot ein m eningk at sehingga t er j adi get ar an y ang cuk up k uat unt uk m er usak ik at an at au st r uk t ur sek under , t ert ier dan k uar t ener y ang m eny ebabk an k oagulasi.

a. asam aset at 1 M b. per eak si Millon Cara Kerj a:

1. k e dalam t abung r eak si y ang ber isi 5 m l lar ut an pr ot ein dit am bahk an dua t et es asam aset at 1 M.

2. let ak k an t abung dalam air m endidih selam a lim a m enit .

3. am bil endapan dan uj ilah k elar ut anny a dalam air dan per eak si m illon.

U j i Koa g u la si

T a b u n g Pe r e a k si H a sil Ke t e r a n g a n I ( e n d a p a n )

I I ( e n d a p a n )

Air M illon

………… …………

………. . ………

3 . PEN GEN D APAN D EN GAN ALKOH OL

Pr ot ein dapat diendapk an den gan pen am bah an alk oh ol. Pelar u t or gan ik ak an m engubah ( m engur angi) k onst ant a dielek t r ik a dar i air , sehingga k elar ut an pr ot ein ber k ur ang, dan j uga k ar ena alk ohol ak an ber k om pet isi dengan pr ot ein t er hadap air .

Pereaksi:

a. HCl 0,1 M b. NaOH 0,1 M

c . Bu ffer asesat 1M ( pH 4,7) d. Et an ol 9 5 %

Cara Kerj a:

1. Sediak an 3 t abung r eak si dan isi m asing- m asing t abung r eak si dengan 5m l lar ut an pr ot ein.

2. Ke dalam t abung I : t am bahk an 1m l HCl 0, 1M dan 6m l et anol 95% I I : 1m l NaOH 0, 1M dan 6m l et anol 95%

I I I : 1m l Buffer aset at dan 6m l et anol 95% 3. Lihat t abung- t abung m ana y ang t idak lar ut .

Pe n g e n d a p a n d e n g a n a lk o h o l

T a b u n g Pe r e a k si H a sil Ke t e r a n g a n

I ( 5 m l Prot ein )

I I ( 5 m l Prot ein )

I I I ( 5 m l Prot ein )

1 m l HCl 0,1 N 6 m l et anol 95 % 1 m l NaOH 0,1 N 6 m l et anol 95 % 1 m l buffer aset at 6 m l et anol 95 %

……….

……….

………

………

………

4 . D EN ATU RASI PROTEI N

Denat ur asi dapat diar t ik an suat u pr oses t er pecahny a ik at an hidr ogen, ik at an gar am at au bila susunan r uang at au r ant ai polipet ida suat u m olek ul prot ein ber ubah. Dengan per k at aan lain denat ur asi adalah t er j adi k er usak an st r uk t ur sek under , t er t ier dan k uar t ener , t et api st r uk t ur pr im er ( ik at an pept ida) m asih ut uh.

Pereaksi:

a. buffer aset at 1M ( pH 4,7) b. HCl 0,1M

c . NaOH 0,1M Cara Kerj a:

1. Sediak an t iga t abu ng r eak si m asing- m asing t abung diisi dengan 9m l lar ut an pr ot ein.

2. Ke dalam t abung I : t am bahk an 1m l HCl 0,1M I I : 1m l NaOH 0,1M

I I I : 1m l Buffer aset at

3. Tem pat k an k et iga t abung dalam air m endidih selam a 15 m enit dan dingink an pada t em per at ur k am ar .

4. Lihat k e dalam t abung m ana t er j adi endapan.

5. Lanj ut k an per cobaan di at as t er hadap t abung I dan I I dengan m enam bahk an 10m l buffer aset at .

D e n a t u r a si Pr ot e in a )

T a b u n g Pe r e a k si H a sil Ke t e r a n g a n

I ( 9 m l larut an Pr ot ein ) I I ( 9 m l larut an

Pr ot ein ) I I I ( 9 m l lar ut an Pr ot ein )

1 m l HCl 0,1 N

1 m l NaOH 0,1 N

1 m l buffer acet at

……….

……….

………

………

………

………

b )

T a b u n g Pe r e a k si H a sil Ke t e r a n g a n

I ( Hasil a )

I I ( Hasil a )

10 m l buffer acet at

10 m l Buffer aset at

……….

……….

………

………

B. PEN EN TU AN KAD AR CASEI N

Casein m er upak an pr ot ein y ang t er dapat dalam susu. Ham pir 80% pr ot ein dalam susu t er dir i dar i casein di sam ping Lak t album in dan lak t oglobulin.

Per eak si:

a. Asam aset at 1 N dan 0,25 N b. NaOH 0,1 N

c . For m aldeh ide 4 0 % d. Fenolft alein

Cara kerj a :

1. 20 m l sam pel m asuk k an dalam beak er glas, panask an di penangas air pada suhu 40oC. bila digunak an sam pel susu k en t al dien cer k an den gan aqu ades per ban din gan 1 : 2 dan su su bubuk dit am bahk an aquades 1: 9.

2. Tam bahk an 1, 5 m l asam aset at 1 N, aduk hom ogen dan diam k an selam a 2 0 m enit . Tam bah lagi 4 , 5 m l asam aset at 0 , 2 5 N ( unt uk m encapai pH isoelek t r ik dar i casein) aduk dan diam k an selam a 1 j am .

3. Dek ant er k edalam cor ong dengan k er t as sar ing. Cuci endapan dengan aquades sam pai air cucian ber sifat net r al.

4. Kem udian k er t as sar ing dan endapan m asuk k an k edalam bek er sem u la dan t am bah k an aqu ades sam pai den gan v olu m e ± 2 0 ml.

5. Tam bahk an 4 m l lar ut an NaOH 0,1 M, panask an diat as pen an gas air sam pai lar u t seper t i su su dan din gin k an sam pai suhu 2 1- 24oC, t et esk an 3 t et es fenolft alein.

6. Tam bahk an 4 m l for m aldehide 40% ( w ar na r ose hilang) , t it r asi dengan NaOH 0,1 N sam pai t er bent uk w ar na r ose k em bali. Kadar Casein = m l NaOH 0,1 N × 0,9 %

Cat at an :

Pr ot ein ber sifat am fot er seh in gga su lit dit it r asi sebagai asam m au pu n sebagai basa. Supay a dapat dit it r asi sebagai asam , m ak a sifat basa dar i gugus am ino dapat dihilangk an dengan m er eak sik anny a dengan for m aldehide sehingga ion H +dapat dit it r asi dengan NaOH.

Reaksi:

+

H3N- - COO- + 2 HCOH ( HOCH2)2 NH+ - - COO-

Pr ot ein For m aldehide

( HOCH2)2 NH+ - - COO- + NaOH ( HOCH2)2 NH+ - - COO- + Na+

+ H2O

Pe n e n t u a n Ka d a r Ca se in

Volum e NaOH 0, 1 N V1 = …….. m l

V2 = …….. m l

V3 = …….. m l

V r at a – rat a = ……… m l

Kadar Casein = Vol r at a – r at a NaOH 0,1 N x 0,9 %

I I . KARBO H I D RAT C. REAKSI U M U M KARBO H I D RAT

1. Reak si Molish

Pr insip: ik at an glik osida pada k ar bohidr at ak an t er hy dr olisa oleh H2SO4

( pek at ) m enghasilk an m onosak ar ida y ang k em udian dihy dr asi m em bent uk Fur t ur al. Dan bila dir eak sik an dengan Alpha Naft ol ak an m em ber ik an w ar na ungu.

Bahan/ Alat : - Lar ut an k ar bohidr at

- Asam sulfat pek at

- Lar ut an alpha naft hol 5% dalam et anol. ( dibuat bar u)

Cara Ker j a : 1. Dalam t abung r eak si y ang ber sih dan k er ing dim asuk k an 2 m l lar ut an k ar bohy dr at dan 3 t et es lar ut an alpha naft hol

2. Melalui dinding t abung t am bah secar a per lahan-lahan lar ut an asam sulfat pek at sam pai

t er bent uk cincin cok lat . 3. Ulangi per cobaan di at as dengan

m em per gunak an 2 m l air sebagai penggant i

2 m l lar ut an k ar bohy dr at . ( per cobaan blank o) . Am at i apa yang t erj adi.

Ket er angan : Disak ar ida y ang dalam suasana asam ak an t er hidr olisa dan m eny ebabk an r eak si posit if. Reak si posit if. Dit unj uk k an dengan adany a Endapan Cu2O y ang ber w ar na m er ah bat a. Re a k si M o l i sh

T a b u n g Ba h a n Pe r e a k si H a sil Ke t e r a n g a n I

I I

2 m l Ka r b oh y d r a t 3 t t s a lp h a n a p t h o l 2 m l a ir , 3 t t s la r . Alp h a n a p t h ol

H2SO4 P

H2SO4 P

………

………

…………. .

… … … … .

2. Reak si Yodium

Pr insip : Seny aw a polisak ar ida ak an m em ber ik an w ar na y an g spesif ik dengan y odium .

Bahan dan alat :

- _{Lar ut an am y ulum} - _{Lar ut an dek st r in} - _{Lar ut an Yodium} - _{Spot plat e}

Lar ut an y odium t er dir i dar i: Kr ist al y odium k alium y odida dan aquades Cara kerj a :

1. Pada plat t et es y ang ber sih dan k er ing dim asuk k an 3 t et es lar ut an y ang diper ik sa.

2. Cam pur dengan 2 t et es lar ut an y odium

3. Ter bent uk w ar na bir u unt uk am y lum dan w ar na m er ah anggur unt uk dek st r in.

Re a k si Yod iu m

Pla t t e t e s Ba h a n Pe r e a k si H a sil Ke t e r a n g a n

Lobang I Loban g I I

3 t et es sam pel 3 t et es sam pel

2 t et es Yodiu m 2 t et es Yodiu m

……… ………

…………. . …………. .

3. Reak si Ben ed ict

Prinsip: Cu 2 + akan direduksi ole h gula m enj adi Cu+. Dalam hal ini t er ben t u k en dapan Cu2O. r eak si diny at ak an posit if apabila t er bent uk

endapan ber w ar na bir u k ehij auan sam pai m er ah bat u bat a. ( t er gant ung pada k adar gula r eduk si y ang t er sedia) .

Bahan dan alat :

- Lar ut an suk r osa ( Lar . . . ) - Lar ut an lak t osa ( Lar . . . ) - Lar ut an Benedict

- Tabung r eak si

Cara kerj a:

1. Ke dalam t abung r eak si y ang ber sih dan k er ing dim asuk k an 1 m l lar ut an y ang ak an diselidik i k em udian dicam pur dengan 2 m l lar ut an Benedict . Kocok .

2. Didihk an selam a 2 m enit at au m asuk k an dalam air y ang m endidih selam a 5 m enit .

3. Per hat ik an w ar na r eak si y ang t er j adi. Lar ut an Benedict t er dir i dar i;

- _{CuSO4. 5H2O. . .} - _{Na2 CO3 6 H2O. . .} - _{Nat r ium Cit r at . . .} - _{Aquades. . .} Re a k si Be n e d ict

T a b u n g Pe r e a k si H a sil Ke t e r a n g a n

I ( 1 m l sam pel) 2 m l Benedict ……… ………

D . PEN EN TU AN KAD AR GLU KOSA

1 . Yodim et r i Pr insip:

Gluk osa adalah t er m asuk gula r eduk si k ar ena m onosak ar ida y ang m em ilik i gugus OH lak t ol bebas dan dapat ber obah m enj adi gluk osa alifat is dengan gugus aldehide sebagai r eduk t or lem ah dan k em udian dapat dioksidasi oleh ok sidat or lem ah seper t i Yodium m em bent uk asam gluk onat .

Pereaksi:

a. I ndik at or lar ut an k anj i

b. Lar ut an nat r ium k ar bonat 14, 3 % c . Lar ut an Yodium 0, 1 N

d. HCl encer

e. Lar ut an nat r ium t iosulfat 0, 1 N Cara kerj a:

Dit im bang sek sam a sam pel padat y ang m engandung kira - kira 100 m g gluk osa y ang t idak m engandung r eduk t or lainny a, dilar ut k an di dalam 50 m l air suling di dalam er lenm ey er ber t ut up. Dit am bahk an 25 m l y odium 0, 1 N dan 10 m l lar ut an nat r ium k ar bonat 14, 3 % , dit ut up dan dibiar k an selam a 30 m enit ditem p at gelap. Kem u dian dit am bah k an 1 5 m l asam k lor ida en cer dan y odiu m y an g t er sisa den gan lar u t an n at r iu m t iosu lfat 0 , 1 N sam pai t er j adi w ar n a k u n in g lem ah. Dit am bahk an lagi indik at or k anj i dan lanj ut k an t it r asi sam pai w ar na bir u hilang. Dilak uk an t it r asi blank o. Tiap m l y odium 0,1 N set ar a dengan 9,9185 m g gluk osa.

Pe n e n t u a n Ka d a r Glu k osa

Volum e lar ut an 0,1 N y odium V1 = …….. m l

V2 = …….. m l

V3 = …….. m l

I I I . LI PI D A

Lipida adalah seny aw a or ganik y ang t er dapat dalam m ah lu k h idu p y an g lar ut di dalam pelar ut non- polar t et api t idak lar ut di dalam air . Lipida t er dir i dar i lem ak ( sek it ar 95% ) , st er oida, k ar ot enoida, v it am in y ang lar ut dalam lem ak .

E. PEM ERI KSAAN KELARU T AN LEM AK

Pr insip:

Jik a m iny ak dik ocok kuat dengan air ak an t er j adi em ulsi y ang t idak m ant ap k ar en a bu t ir- but ir m iny ak k ecil ak an m em isah dar i air . Penam bahan em ulgat or m isaln y a, pr ot ein , gom , sabu n ak an t er ben t u k em u lsi y an g st abil. Lem ak lar u t dalam pelar ut non- polar seper t i et er , hek san, bens in, k lor ofor m , t et api t idak lar ut didalam pelar ut polar . Lem ak dalam lar ut an NaOH at au KOH ak an t er j adi peny abunan.

Bahan dan alat :

- _{Miny ak gor eng, m ent ega}

- _{Bensin, air , et er , alk ohol 95% , NaOH 1 N} - _{Tabung r eak si, pipet uk ur}

Cara kerj a :

1. Siapkan 5 bua h t abung r eak si y ang ber sih dan k er ing

2. Tanbahk an pada m asing- m asing t abung r eak si 1 m l m iny ak gor eng, k enudian dicam pur k an dengan bahan sebagai ber ik ut :

- _{Tabung I : dit am bah 1 m l air} - _{Tabung I I : dit am bah 1 m l bensin} - _{Tabung I I I : dit am bah 1 m l alkoho l 9 6 %} - _{Tabung I V : dit am bah 1 m l et er}

- _{Tabung V : dit am bah 1 m l NaOH 1N}

3. Adu k- aduk sam pai hom ogen. Diam k an beber apa m enit dan am at i ser t a cat at per ubahan y ang t er j adi.

4. Ulangi per cobaan di at as dengan m em ak ai m ent ega sebagai sum ber lipida.

T a b u n g M in y a k g o r e n g

Pe r e a k si H a sil Ke t e r a n g a n

I I I I I I IV V

1 m l 1 m l 1 m l 1 m l 1 m l

1 m l air 1 m l Bensin 1 m l alk ohol 96% 1 m l et er

1 m l NaOH

……… ……… ……… ……… ………

…………. . ……… …………. . …………. ………….

F. REAKSI P EN Y ABU N AN D AN SI FAT- SI FAT ASAM LEM AK

Pr insip:

Sabun m er upak an gar am alk ali dar i asam lem ak r ant ai panj ang y ang ber sum ber dar i m iny ak at au lem ak , dim ana j um lah r ant ai k ar bon m ulai dar i asam lem ak pem bent uk sabun dar i at om C- 10- C- 16. Kebany ak an sabun dibuat dengan j alan peny abunan ant ar a lem ak dengan suat u basa m onov alen seper t i nat r ium hidr ok sida m elalui r eak si peny abunan.

Bahan dan alat :

- _{Lar ut an NaOH 1N, HCl 1N, et anol 96% , bensin}

- Bek er glas, er lenm ey er , bat ang pengaduk - m iny ak gor eng k elapa saw it

Cara kerj a :

1. 5 gr am m iny ak gor eng dim asuk k an k e dalam bek er glas k em udian dit am bahk an NaOH 1 N sedik it dem i sedik it sam bil dipanask an pada suhu 70oC sebany ak 5x 0, 142 g = 1, 71 g ( y ang t er dapat dalam sek it ar 42 m l 1N NaOH) . Pem anasan dilanj ut k an sam pai t er bent uk sabun. Ke dalam lar ut an sabun y ang t elah t er bent uk dit am bahk an HCl 1N k em udian am at i apa y ang t erj adi.

2. Kedalam cam pur an y ang t elah dit am bahk an HCl dit am bahk an bensin at au alkohol 96 % dan am at i apa yang t er j adi.

Re a k si Pe n y a b u n a n

T a b u n g N a OH 1 N Pe m a n a sa n H Cl 1 N Hasil

I 42 m l 30 m enit 5 m l ……….

+ bensin - - - - >

+ alk ohol 9 6 % - - - - >

G. PEN EN TU AN KAD AR LEM AK SU SU

Met ode ini digunak an unt uk penet apan k adar lem ak susu. Met ode ini bany ak digunak an di Er opa sebagai analisa r ut in.

Pr insip:

Su su dicam pur dengan H2SO4 dan am il alk ohol dalam t abung Ger ber

k husus lalu disent r ifuse sehingga lem ak susu t er pisah dan m enem pat i bagian at as t abung. Lem ak y ang t er pisah ini dapat dit ent uk an k adar ny a dengan m elihat panj ang k olom lem ak y ang t er bent uk .

Per eak si:

1. Asam sulfat 90% ( w / w ) , BJ 1, 815 2. Am il alk oh ol

Per alat an:

1. Tabung but ir om et er Ger ber

2. Sent r ifuse Ger ber ber diam et er 5 0 cm 3. Pipet v olum et r i 10, 75 m l ( lihat cat at an 1) Cara kerj a:

1. Masukkan 10 m l H2SO4 k e dalam t abung but ir om et er dengan t anpa

m em basahi leher t abung.

2. Pipet 10, 75 m l susu, m asuk k an k e dalam t abung but ir om et er dengan t anpa m em basahi leher t abung.

3. Tam bahk an 1 m l am il alk ohol. Tut up t abung dengan penut upny a, k ocok m er at a, sent r ifuge selam a 4 m enit pada 1100 r pm .

4. Tem pat k an t abung dalam penangas air 65oC, selam a 3 m enit .

5. Baca per sent ase k adar lem ak ( w / w ) , sesuai dengan panj ang k olom t abung y ang t elah dik alibr asi.

Cat at an :

1. Jum lah sam pel y ang diam bil unt uk analisa ini ber beda- beda unt uk set iap negar a, sebagai cont oh:

I ndia 10,75 m l

Belanda 10,66 m l

Hon g aria 10,80 m l I nggris 10,94 m l

AS 11,00 m l

2. Jangan t am bahk an am il alk ohol sedem ik iam r upa sehingga k ont ak langsung dengan asam .

3. Per siapk an k ain dan sodium bik ar bonat . Kedua bahan ini ber guna j ik a t abung but ir om et er y ang ber isi H2SO4 pek at pecah.

H . PEN EN TU AN KAD AR PROTEI N D EN GAN M ETOD A LOW RY.

1. Pr insip : Dialam pr ot ein t er dapat dalam 3 ( t iga ) bent uk , y ait u ; a. Pr ot ein bebas.

b. Pr ot ein y ang t idak t er lar ut , t er dapat dalam t ulang, ot ot , r am but dan gum palan dar ah.

c . Pr ot ein t er lar ut , t er dapat bany ak dalam bahan pangan seper t i susu, t elur dan daging.

Penent uan k adar pr ot ein t er lar ut ini ber dasar k an pada ber bagai m et oda , m isalny a : t it r asi for m ol, spek t r ofot om et r i dan sebagainy a.

2. Tuj uan : Unt uk m enent uk an k adar pr t ein t er lar ut dalam suat u bahan secar a cep at .

3. Bahan & Alat :

Lar ut an pr ot ein y ang diselidik i Per eaksi Low r y A dan Low r y B. Lar ut an buffer aset at pH 5. 0

Tabung reaksi 20 m l.

Seper angk at spek t r ofot om et er 4. Cara kerj a :

1. Penent uan panj ang gelom bang m ak sim um .

a. Siapk an lar ut an pr ot ein dalam k onsent r asi t er t ent u dalam t abung r eak si y ang ber sih dan k er ing.

b. Tam bahk an 8 m L per eak si Low r y A, diam k an selam a 10 m enit . c . Kem udian t am bahk an 1 m L per eak si Low r y B, diam k an selam a

1 0 m enit . Jum lah selur uh v olum e 10 m L.

d. Uk ur absor bansi sam pel dar i panj ang gelom bang 400 nm - 800 nm , pada alat spek t r ofot om et er .

e. Bent uk k ur v a absor bansi Vs panj ang gelom bang. 2. Pem buat an k ur v a k alibr asi lar ut an pr ot ein.

a. Tim bang t elit i 300 m g album in ( pr ot ein ) , lar ut k an dalam 1lit er air ( konsent rasi = 300 m g/ L = 300 µg / m L) .

b. Siapk an lar ut an pr ot ein t er sebut dalam 10 t abung r eak si Sehingga k adar ny a ber t ingk at dar i 30 – 300 m g / m L Car a pengencer an dapat dilak uk an sebagai ber ik ut :

c . Tam bahk an k edalam m asing m asing t abung r eak si diat as 8 m L per eak si Low r y A, diam k an selam a 10 m enit .

d. Kem udian t am bahk an 1 m L lar ut an per eak si Low r y B, diam k an selam a 10 m enit . Volum e ak hir set iap t abung adalah 10 m L Sehingga k onsent r asi pr ot ein per lu diper hit ungk an dengan pengencer anny a.

e. Dengan alat spek t r ofot om et er diuk ur absor bansi m asing m asing t bg t er sebut pada panj ang gelom bang m ak sim um . ( 600 nm )

f . Buat k ur v a k alibr asi pada k er t as gr afik dengan m enunj uk k an hubungan ant ar a absor bansi dan k onsent r asi

T a b u n g No

m L la r u t a n p r o t e in ( 3 0 0 µ g / m L )

m L H20 µ g p r o t e i n / m L

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0 , 1 0 , 2 0 , 3 0 , 4 0 , 5 0 , 6 0 , 7 0 , 8 0 , 9

1 , 0 0 , 9 0 , 8 0 , 7 0 , 6 0 , 5 0 , 4 0 , 3 0 , 2 0 , 1

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270

3. Penguk ur an sa m pel.

a. Lar ut an pr ot ein y ang t er lar ut dar i sam pel, m isalny a enzy m e, album in, dan lain lain diendapk an t er lebih dahulu dengan k r ist al am m onium sulfat ( j um lahny a t er gant ung pada j um lah pr ot ein dalam sam pel, sam pai m engendap sem pur na ) . b. Lar ut an disent r ifugasi de ngan k ecepat an 1500 r pm selam a 15

m enit . Super nat an dipisahk an.

c . Endapan ber upa pr ot ein dilar ut k an k em bali dalam lar ut an buffer aset at pH 5,0 sebany ak 5 m l.

d. Pipet 1 m L dar i lar ut an pr ot ein pH 5 , 0 , m asuk k an k edalam m asing m asing t abung r eak si y ang ber sih dan k er ing ( 3 buah ) . Cam pur dengan 8 m L lar ut an per eak si Low r y A, diam k an selam a 10 m enit .

e. Kem udian k edalam t abung t er sebut dit am bahk an 1 m L lar ut an per eak si Low r y B, diam ak an selam a 10 m enit . Volum e ak hir set iap t abung adalah 1 0 m L, sehingga k onsent r asi prot ein dalam sam pel per lu diper hit ungk an dengan pengencer an ( dalam hal ini 1 : 10 ) .

5. Dat a : 1. Kur v a Kalibr asi ( 600 nm )

T a b u n g No

µ g p r o t e i n / m L Ab so r b a n si

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 3 , 0 6 , 0 9 , 0 12, 0 15, 0 18, 0 21, 0 24, 0 27, 0 ………. ………. ………. ………. ………. ………. ………. ………. ………. ……….

2. Penguk ur an sam pel

T a b u n g No

Ab so r b a n si

1 2 3 4 5 6 7

………. ………. ………. ………. ………. ………. ……….

6. Per hit ungan : 7 . Cat at an .

a. Per eak si Low r y A

- _{Asam ph osph ot u n gst at – phosphom olibdat dalam air ( 1 : 1 )}

b. Per eak si Low r y B

- _{Na2CO3 2 % 100 m L dalam lar ut an NaOH 0, 1 N, t am bahk an 1m L}

CuSO4 dan 1 m L K Na Tart rat 2 %

c. Lar ut an dapar aset at pH 5, 0.

- _{Lar ut an I : 0, 2 M lar ut an asam aset at}

Lar ut an I I : 2 M lar ut an Na - aset at

Cam pur lar ut an I 14,8 m L + lar ut an I I 35,2 m L encer k an sam pai 100 m L.

Bahan dan alat :

- Lar ut an suk r osa ( Lar . . . ) - Lar ut an lak t osa ( Lar . . . ) - Lar ut an Benedict

- Tabung r eak si

Cara kerj a:

1. Ke dalam t abung r eak si y ang ber sih dan k er ing dim asuk k an 1 m l lar ut an y ang ak an diselidik i k em udian dicam pur dengan 2 m l lar ut an Benedict . Kocok .

2. Didihk an selam a 2 m enit at au m asuk k an dalam air y ang m endidih selam a 5 m enit .

3. Per hat ik an w ar na r eak si y ang t er j adi. Lar ut an Benedict t er dir i dar i;

- _{CuSO4. 5H2O. . .} - _{Na2 CO3 6 H2O. . .} - _{Nat r ium Cit r at . . .} - _{Aquades. . .}

Re a k si Be n e d ict

T a b u n g Pe r e a k si H a sil Ke t e r a n g a n

I ( 1 m l sam pel) 2 m l Benedict ……… ………

D . PEN EN TU AN KAD AR GLU KOSA 1 . Yodim et r i

Pr insip:

Gluk osa adalah t er m asuk gula r eduk si k ar ena m onosak ar ida y ang m em ilik i gugus OH lak t ol bebas dan dapat ber obah m enj adi gluk osa alifat is dengan gugus aldehide sebagai r eduk t or lem ah dan k em udian dapat dioksidasi oleh ok sidat or lem ah seper t i Yodium m em bent uk asam gluk onat .

Pereaksi:

a. I ndik at or lar ut an k anj i

b. Lar ut an nat r ium k ar bonat 14, 3 % c . Lar ut an Yodium 0, 1 N

d. HCl encer

e. Lar ut an nat r ium t iosulfat 0, 1 N Cara kerj a:

Dit im bang sek sam a sam pel padat y ang m engandung kira - kira 100 m g gluk osa y ang t idak m engandung r eduk t or lainny a, dilar ut k an di dalam 50 m l air suling di dalam er lenm ey er ber t ut up. Dit am bahk an 25 m l y odium 0, 1 N dan 10 m l lar ut an nat r ium k ar bonat 14, 3 % , dit ut up dan dibiar k an selam a 30 m enit ditem p at gelap. Kem u dian dit am bah k an 1 5 m l asam k lor ida en cer dan y odiu m y an g t er sisa den gan lar u t an n at r iu m t iosu lfat 0 , 1 N sam pai t er j adi w ar n a k u n in g lem ah. Dit am bahk an lagi indik at or k anj i dan lanj ut k an t it r asi sam pai w ar na bir u hilang. Dilak uk an t it r asi blank o. Tiap m l y odium 0,1 N set ar a dengan 9,9185 m g gluk osa.

Pe n e n t u a n Ka d a r Glu k osa Volum e lar ut an 0,1 N y odium

V1 = …….. m l

V2 = …….. m l

I I I . LI PI D A

Lipida adalah seny aw a or ganik y ang t er dapat dalam m ah lu k h idu p y an g lar ut di dalam pelar ut non- polar t et api t idak lar ut di dalam air . Lipida t er dir i dar i lem ak ( sek it ar 95% ) , st er oida, k ar ot enoida, v it am in y ang lar ut dalam lem ak . E. PEM ERI KSAAN KELARU T AN LEM AK

Pr insip:

Jik a m iny ak dik ocok kuat dengan air ak an t er j adi em ulsi y ang t idak m ant ap k ar en a bu t ir- but ir m iny ak k ecil ak an m em isah dar i air . Penam bahan em ulgat or m isaln y a, pr ot ein , gom , sabu n ak an t er ben t u k em u lsi y an g st abil. Lem ak lar u t dalam pelar ut non- polar seper t i et er , hek san, bens in, k lor ofor m , t et api t idak lar ut didalam pelar ut polar . Lem ak dalam lar ut an NaOH at au KOH ak an t er j adi peny abunan.

Bahan dan alat :

- _{Miny ak gor eng, m ent ega}

- _{Bensin, air , et er , alk ohol 95% , NaOH 1 N} - _{Tabung r eak si, pipet uk ur}

Cara kerj a :

1. Siapkan 5 bua h t abung r eak si y ang ber sih dan k er ing

2. Tanbahk an pada m asing- m asing t abung r eak si 1 m l m iny ak gor eng, k enudian dicam pur k an dengan bahan sebagai ber ik ut :

- _{Tabung I : dit am bah 1 m l air} - _{Tabung I I : dit am bah 1 m l bensin} - _{Tabung I I I : dit am bah 1 m l alkoho l 9 6 %} - _{Tabung I V : dit am bah 1 m l et er}

- _{Tabung V : dit am bah 1 m l NaOH 1N}

3. Adu k- aduk sam pai hom ogen. Diam k an beber apa m enit dan am at i ser t a cat at per ubahan y ang t er j adi.

4. Ulangi per cobaan di at as dengan m em ak ai m ent ega sebagai sum ber lipida.

T a b u n g M in y a k g o r e n g

Pe r e a k si H a sil Ke t e r a n g a n

I I I I I I IV V

1 m l 1 m l 1 m l 1 m l 1 m l

1 m l air 1 m l Bensin 1 m l alk ohol 96% 1 m l et er

1 m l NaOH

……… ……… ……… ……… ………

…………. . ……… …………. . …………. ………….

F. REAKSI P EN Y ABU N AN D AN SI FAT- SI FAT ASAM LEM AK Pr insip:

Sabun m er upak an gar am alk ali dar i asam lem ak r ant ai panj ang y ang ber sum ber dar i m iny ak at au lem ak , dim ana j um lah r ant ai k ar bon m ulai dar i asam lem ak pem bent uk sabun dar i at om C- 10- C- 16. Kebany ak an sabun dibuat dengan j alan peny abunan ant ar a lem ak dengan suat u basa m onov alen seper t i nat r ium hidr ok sida m elalui r eak si peny abunan.

Bahan dan alat :

- _{Lar ut an NaOH 1N, HCl 1N, et anol 96% , bensin}

- Bek er glas, er lenm ey er , bat ang pengaduk - m iny ak gor eng k elapa saw it

Cara kerj a :

1. 5 gr am m iny ak gor eng dim asuk k an k e dalam bek er glas k em udian dit am bahk an NaOH 1 N sedik it dem i sedik it sam bil dipanask an pada suhu 70oC sebany ak 5x 0, 142 g = 1, 71 g ( y ang t er dapat dalam sek it ar 42 m l 1N NaOH) . Pem anasan dilanj ut k an sam pai t er bent uk sabun. Ke dalam lar ut an sabun y ang t elah t er bent uk dit am bahk an HCl 1N k em udian am at i apa y ang t erj adi.

2. Kedalam cam pur an y ang t elah dit am bahk an HCl dit am bahk an bensin at au alkohol 96 % dan am at i apa yang t er j adi.

Re a k si Pe n y a b u n a n

T a b u n g N a OH 1 N Pe m a n a sa n H Cl 1 N Hasil

I 42 m l 30 m enit 5 m l ……….

+ bensin - - - - >

+ alk ohol 9 6 % - - - - >

G. PEN EN TU AN KAD AR LEM AK SU SU

Met ode ini digunak an unt uk penet apan k adar lem ak susu. Met ode ini bany ak digunak an di Er opa sebagai analisa r ut in.

Pr insip:

Su su dicam pur dengan H2SO4 dan am il alk ohol dalam t abung Ger ber

k husus lalu disent r ifuse sehingga lem ak susu t er pisah dan m enem pat i bagian at as t abung. Lem ak y ang t er pisah ini dapat dit ent uk an k adar ny a dengan m elihat panj ang k olom lem ak y ang t er bent uk .

Per eak si:

1. Asam sulfat 90% ( w / w ) , BJ 1, 815 2. Am il alk oh ol

Per alat an:

1. Tabung but ir om et er Ger ber

2. Sent r ifuse Ger ber ber diam et er 5 0 cm 3. Pipet v olum et r i 10, 75 m l ( lihat cat at an 1) Cara kerj a:

1. Masukkan 10 m l H2SO4 k e dalam t abung but ir om et er dengan t anpa

m em basahi leher t abung.

2. Pipet 10, 75 m l susu, m asuk k an k e dalam t abung but ir om et er dengan t anpa m em basahi leher t abung.

3. Tam bahk an 1 m l am il alk ohol. Tut up t abung dengan penut upny a, k ocok m er at a, sent r ifuge selam a 4 m enit pada 1100 r pm .

4. Tem pat k an t abung dalam penangas air 65oC, selam a 3 m enit .

5. Baca per sent ase k adar lem ak ( w / w ) , sesuai dengan panj ang k olom t abung y ang t elah dik alibr asi.

Cat at an :

1. Jum lah sam pel y ang diam bil unt uk analisa ini ber beda- beda unt uk set iap negar a, sebagai cont oh:

I ndia 10,75 m l Belanda 10,66 m l Hon g aria 10,80 m l I nggris 10,94 m l

AS 11,00 m l

3. Per siapk an k ain dan sodium bik ar bonat . Kedua bahan ini ber guna j ik a t abung but ir om et er y ang ber isi H2SO4 pek at pecah.

H . PEN EN TU AN KAD AR PROTEI N D EN GAN M ETOD A LOW RY.

1. Pr insip : Dialam pr ot ein t er dapat dalam 3 ( t iga ) bent uk , y ait u ; a. Pr ot ein bebas.

b. Pr ot ein y ang t idak t er lar ut , t er dapat dalam t ulang, ot ot , r am but dan gum palan dar ah.

c . Pr ot ein t er lar ut , t er dapat bany ak dalam bahan pangan seper t i susu, t elur dan daging.

Penent uan k adar pr ot ein t er lar ut ini ber dasar k an pada ber bagai m et oda , m isalny a : t it r asi for m ol, spek t r ofot om et r i dan sebagainy a.

2. Tuj uan : Unt uk m enent uk an k adar pr t ein t er lar ut dalam suat u bahan secar a cep at .

3. Bahan & Alat :

Lar ut an pr ot ein y ang diselidik i Per eaksi Low r y A dan Low r y B. Lar ut an buffer aset at pH 5. 0

Tabung reaksi 20 m l.

Seper angk at spek t r ofot om et er 4. Cara kerj a :

1. Penent uan panj ang gelom bang m ak sim um .

a. Siapk an lar ut an pr ot ein dalam k onsent r asi t er t ent u dalam t abung r eak si y ang ber sih dan k er ing.

b. Tam bahk an 8 m L per eak si Low r y A, diam k an selam a 10 m enit . c . Kem udian t am bahk an 1 m L per eak si Low r y B, diam k an selam a

1 0 m enit . Jum lah selur uh v olum e 10 m L.

d. Uk ur absor bansi sam pel dar i panj ang gelom bang 400 nm - 800 nm , pada alat spek t r ofot om et er .

e. Bent uk k ur v a absor bansi Vs panj ang gelom bang. 2. Pem buat an k ur v a k alibr asi lar ut an pr ot ein.

a. Tim bang t elit i 300 m g album in ( pr ot ein ) , lar ut k an dalam 1lit er air ( konsent rasi = 300 m g/ L = 300 µg / m L) .

b. Siapk an lar ut an pr ot ein t er sebut dalam 10 t abung r eak si Sehingga k adar ny a ber t ingk at dar i 30 – 300 m g / m L Car a pengencer an dapat dilak uk an sebagai ber ik ut :

c . Tam bahk an k edalam m asing m asing t abung r eak si diat as 8 m L per eak si Low r y A, diam k an selam a 10 m enit .

d. Kem udian t am bahk an 1 m L lar ut an per eak si Low r y B, diam k an selam a 10 m enit . Volum e ak hir set iap t abung adalah 10 m L Sehingga k onsent r asi pr ot ein per lu diper hit ungk an dengan pengencer anny a.

e. Dengan alat spek t r ofot om et er diuk ur absor bansi m asing m asing t bg t er sebut pada panj ang gelom bang m ak sim um . ( 600 nm )

f . Buat k ur v a k alibr asi pada k er t as gr afik dengan m enunj uk k an hubungan ant ar a absor bansi dan k onsent r asi

T a b u n g No

m L la r u t a n p r o t e in ( 3 0 0 µ g / m L )

m L H20 µ g p r o t e i n / m L

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0 , 1 0 , 2 0 , 3 0 , 4 0 , 5 0 , 6 0 , 7 0 , 8 0 , 9

1 , 0 0 , 9 0 , 8 0 , 7 0 , 6 0 , 5 0 , 4 0 , 3 0 , 2 0 , 1

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270

3. Penguk ur an sa m pel.

a. Lar ut an pr ot ein y ang t er lar ut dar i sam pel, m isalny a enzy m e, album in, dan lain lain diendapk an t er lebih dahulu dengan k r ist al am m onium sulfat ( j um lahny a t er gant ung pada j um lah pr ot ein dalam sam pel, sam pai m engendap sem pur na ) . b. Lar ut an disent r ifugasi de ngan k ecepat an 1500 r pm selam a 15

m enit . Super nat an dipisahk an.

c . Endapan ber upa pr ot ein dilar ut k an k em bali dalam lar ut an buffer aset at pH 5,0 sebany ak 5 m l.

d. Pipet 1 m L dar i lar ut an pr ot ein pH 5 , 0 , m asuk k an k edalam m asing m asing t abung r eak si y ang ber sih dan k er ing ( 3 buah ) . Cam pur dengan 8 m L lar ut an per eak si Low r y A, diam k an selam a 10 m enit .

e. Kem udian k edalam t abung t er sebut dit am bahk an 1 m L lar ut an per eak si Low r y B, diam ak an selam a 10 m enit . Volum e ak hir set iap t abung adalah 1 0 m L, sehingga k onsent r asi prot ein dalam sam pel per lu diper hit ungk an dengan pengencer an ( dalam hal ini 1 : 10 ) .

5. Dat a : 1. Kur v a Kalibr asi ( 600 nm ) T a b u n g

No

µ g p r o t e i n / m L Ab so r b a n si 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 3 , 0 6 , 0 9 , 0 12, 0 15, 0 18, 0 21, 0 24, 0 27, 0 ………. ………. ………. ………. ………. ………. ………. ………. ………. ……….

2. Penguk ur an sam pel T a b u n g

No

Ab so r b a n si 1

2 3 4 5 6 7

………. ………. ………. ………. ………. ………. ……….

6. Per hit ungan : 7 . Cat at an .

a. Per eak si Low r y A

- _{Asam ph osph ot u n gst at – phosphom olibdat dalam air ( 1 : 1 )}

b. Per eak si Low r y B

- _{Na2CO3 2 % 100 m L dalam lar ut an NaOH 0, 1 N, t am bahk an 1m L}

CuSO4 dan 1 m L K Na Tart rat 2 %

c. Lar ut an dapar aset at pH 5, 0.

- _{Lar ut an I : 0, 2 M lar ut an asam aset at}

Lar ut an I I : 2 M lar ut an Na - aset at

Cam pur lar ut an I 14,8 m L + lar ut an I I 35,2 m L encer k an sam pai 100 m L.