Potensi Aktivitas Hipokolesterol Bakteri Asam Laktat Yang Diisolasi Dari Dangke Dan Daging Sapi

POTENSI AKTIVITAS HIPOKOLESTEROL BAKTERI ASAM
LAKTAT YANG DIISOLASI DARI DANGKE DAN
DAGING SAPI

HASNIAR BURHAN

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2017

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Potensi Aktivitas
Hipokolesterol Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Dangke dan Daging Sapi”
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2017
Hasniar Burhan
NIM D151140311

RINGKASAN
HASNIAR BURHAN. Potensi Aktivitas Hipokolesterol Bakteri Asam Laktat
yang Diisolasi dari Dangke dan Daging Sapi. Dibimbing oleh IRMA ISNAFIA
ARIEF dan EPI TAUFIK.
Faktor yang mempengaruhi timbulnya penyakit kardiovaskular, diantaranya
adalah peningkatan kadar kolesterol khususnya LDL yang biasa disebut sebagai
hiperkolesterolemia. Usaha yang dilakukan penderita hiperkolestrolemia untuk
menurunkan kolesterol tubuh adalah dengan penggunaan beberapa jenis pangan
fungsional dan obat-obatan antikolesterol. Fungsi Bakteri Asam Laktat (BAL)
untuk jenis strain tertentu belakangan ini dikembangkan untuk membantu
menurunkan kolestrol tubuh. Kemampuan dan sifat yang dimiliki oleh masingmasing strain bervariasi sehingga perlu dilakukan evaluasi mengenai kemampuan
beberapa bakteri asam laktat isolat asal dangke dan daging sapi dalam
menurunkan kolesterol.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan delapan strain BAL
dalam menurunkan kolesterol secara in vitro. Lactobacillus fermentum A323L, L.

fermentum B111K, L. fermentum B323K, L. fermentum C113L, dan L. fermentum
C212L telah berhasil diisolasi dari dangke yang merupakan sejenis keju lunak
yang berasal dari kabupaten Enrekang Provinsi Sulawesi Selatan (Syah et al 2016)
dan Lactobacillus plantarum IIA-2C12, L. plantarum IIA-1A5, dan Lactobacillus
acidophillus IIA-2B4 diisolasi dari daging sapi (Arief et al 2011). Parameter yang
digunakan yaitu uji keberadaan gen Bile Salt Hydrolase (BSH) dengan
Polymerase Chain Reaction (PCR), aktivitas BSH dianalisis secara deskriptif, dan
asimilasi kolesterol dianalisis menggunakan ANOVA dan dilanjut dengan uji
jarak berganda Duncan.
Hasil penelitian menunjukkan delapan strain bakteri asam laktat isolat
dangke dan daging sapi yang berpotensi menurunkan kolesterol yaitu L.
fermentum B111K dan L. plantarum IIA-1A5. L. fermentum B111K dibuktikan
dengan kemampuannya mengasimilasi kolesterol dengan persentase 4.10%
dengan jumlah kolesterol terasimilasi dalam 1010 sel yaitu 0.13 mg. L. plantarum
IIA-1A5 dibuktikan dengan memiliki gen BSH, positif memiliki aktivitas BSH
serta mampu mengasimilasi kolesterol dengan persentase 8.10% dengan jumlah
kolesterol terasimilasi dalam 1010 sel yaitu 0.06 mg. Kesimpulan yang diproses
dari penelitian ini adalah strain bakteri yang berpotensi menurunkan kolesterol
yaitu L. fermentum B111K dan L. plantarum IIA-1A5.
Kata kunci: BAL, bile salt hydrolase, asimilasi, kolesterol

SUMMARY
HASNIAR BURHAN. Potentials of Hipocholesterolemic activities of Lactic Acid
Bacteria Isolated from Dangke and Indonesian Beef. Supervised by IRMA
ISNAFIA ARIEF and EPI TAUFIK.
Increasing cholesterol level primarily LDL (low density lipoprotein), which
is known as hypercholesterolemia, is considered as one of the factors inducing
cardiovascular disease. Consumption of functional food and anti-cholesterol drugs
has been used by people with hypercholesterolemia to attenuate their cholesterol
level. Particular strains from Lactic Acid Bacteria (LAB) have been currently
developed to lower the cholesterol level. These bacteria may have various
properties and dissimilar effectivity, depending on their strains. Therefore,
cholesterol-lowering properties of LAB isolated from dangke and Indonesian beef
need to be observed.
This study was aimed to investigate the ability of eight LAB strains in
lowering cholesterol level by using in vitro study. Those strains were L.
fermentum A323L, L. fermentum B111K, L. fermentum B323K, L. fermentum
C113L, and L. fermentum C212L were successfully isolated from dangke, which
is a soft cheese like product originated from Enrekang, South Sulawesi. In
addition, L. plantarum IIA-2C12, L. plantarum IIA-1A5 and L. acidophillus IIA2B4 were isolated from beef were also used. Variables observed were

identification of Bile Salt Hydrolase (BSH) gene by Polymerase Chain Reaction
(PCR) and BSH activity using descriptive analysis, cholesterol assimilation
statistic evaluated by analysis of variance (ANOVA) and if the differences found
among treatments, Duncan test will be used as post-hoc test.
The results demonstrated that eight strains of LAB isolated from dangke and
beef that potentially showed cholesterol-lowering effects were L. fermentum
B111K and L. plantarum IIA-1A5. L. fermentum B111K was able to assimilate
cholesterol of 4.10% with assimilated cholesterol of 0.13 mg in 1010 cells. In
addition, L. plantarum IIA-1A5 was reported to have BSH gene and BSH activity,
as well as able to assimilate cholesterol of 8.10% with assimilated cholesterol 0.06
mg in 1010 cells. It is concluded that L. fermentum B111K and L. plantarum IIA1A5 have a potential as hyphocholesterol agent.
Keywords: LAB, bile salt hydrolase, assimilation,cholesterol

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2017
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB.

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.

POTENSI AKTIVITAS HIPOKOLESTEROL BAKTERI ASAM
LAKTAT YANG DIISOLASI DARI DANGKE DAN
DAGING SAPI

HASNIAR BURHAN

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
Pada
Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2017

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Irmanida Batubara SSi MSi

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, atas rahmat dan
karunia yang telah diberikan-Nya, Shalawat dan salam semoga senantiasa
dicurahkan kepada nabi Muhammad SAW sehingga penyusunan tesis ini dapat
diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan
Desember 2015 sampai Mei 2016 adalah potensi hipokolesterol bakteri asam
laktat,dengan judul Potensi Aktivitas Hipokolesterol Bakteri Asam Laktat yang
Diisolasi dari Dangke dan Daging Sapi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada pihak-pihak yang telah banyak
membantu dalam proses penyelesaian tesis ini. Dr Irma Isnafia Arief, SPt MSi,
selaku ketua komisi pembimbing, dan Dr Epi Taufik, SPt MVPH MSi, selaku
anggota komisi pembimbing, atas dukungan selama melakukan bimbingan kepada
penulis sejak penyusunan proposal dan pelaksanaan penelitian hingga selesainya
penulisan tesis ini. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Dr Irmanida
Batubara, Ssi Msi dan Dr Ir Salundik Msi yang telah banyak memberikan saran.
Penghargaan kepada Dikti yang telah memberikan Beasiswa Fres Graduate (FG)
kepada penulis dan kepada Dwi Febrianti, Isyana Khairunisa SPt MSi, K Shelvi
dan seluruh staf Laboratorium Teknologi Hasil Ternak dan Laboratorium Fakultas

Peternakan IPB atas bantuannya selama penulis melaksanakan penelitian.
Ungkapan terima kasih kepada Ayahanda Burhan, S.Pd dan Ibu Hasnidah, S.Pd
serta Suamiku Awaluddin Ridwan, AMdPi atas doa dan dukungan yang tiada
henti untuk penulis, serta saudara penulis. Disamping itu, penghargaan kepada
Rajmi Faridah, SPt MSi, Andi Nurul Mukhlisah SPt MSi, Fadliah SPt, Wahyuni
SPt, Setiawan Putra Syah SPt MSi telah membantu dalam teknis, doa, serta
dukunganya. Teman-teman angkatan 2014 Program Studi Ilmu Produksi dan
Teknologi Peternakan atas diskusi dan masukannya selama mengikuti pendidikan.
Semoga tesis ini bermanfaat bagi masyarakat dan perkembangan ilmu
pengetahuan.
Bogor, Februari 2017

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL

xi

DAFTAR GAMBAR

xi

DAFTAR LAMPIRAN

xi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis
Ruang Lingkup
2 METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Bahan dan Perlatan
Prosedur Penelitian
Analisis Data

1

2
2
2
2
3
4
4
4
7

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Keberadaan Gen BSH dengan PCR
Aktivitas BSH (Bile Salt Hydrolase)
Asimilasi Kolesterol
4 SIMPULAN DAN SARAN

7
12
13
15

DAFTAR PUSTAKA

15

LAMPIRAN

18

RIWAYAT HIDUP

23

DAFTAR TABEL
1. Uji aktivitas BSH isolat BAL
2. Jumlah kolesterol dan persentase kolesterol yang diasimilasi oleh isolat
BAL serta jumlah kolesterol terasimilasi dalam 1010 sel bakteri pada
MRS yang mengandung kolesterol PEG 600 (100 µg/mL) selama 24 jam

12

14

DAFTAR GAMBAR
1. Diagram alir penelitian
2. Elektroforesis agarosa gen BSH
3. Pensejajaran gen BSH L. plantarum IIA-1A5 dengan gen BSH
L. plantarum Lp529 kode akses FJ439771 and FJ439775 dari GenBank
4. Pohon pilogeni BSH L. plantarum IIA-1A5 dengan gen BSH
L. plantarum Lp529 kode akses FJ439771 and FJ439775 dari GenBank
5. Pensejajaran sekuen asam amino BSH L. plantarum IIA-1A5 dengan
BSH L. plantarum Lp529 dengan kode akses FJ439775 dan FJ439771
6. Viabilitas bakteri pada media MRSB yang mengandung kolesterol
PEG 600 (100 µg/mL ) selama 24 jam

3
8
10
10
11
13

DAFTAR LAMPIRAN
1.
2.
3.
4.

Elektroforesis ekstraksi DNA isolat BAL dangke dan daging sapi
Hasil blast urutan basa gen BSH L. plantarum IIA-1A5
Hasil blast urutan asam amino BSH L. plantarum IIA-1A5
ANOVA jumlah kolesterol yang diasimilasi oleh isolat BAL pada
MRS yang mengandung kolesterol PEG 600 (100 µg/mL) selama 24 jam
5. ANOVA persentase kolesterol yang diasimilasi oleh isolat BAL pada
MRS yang mengandung kolesterol PEG 600 (100 µg/mL) selama 24 jam
6. ANOVA jumlah kolesterol terasimilasi dalam 1010 sel bakteri pada MRS
yang mengandung kolesterol PEG 600 (100 µg/mL) selama 24 jam
7. Gambar hasil uji aktivitas BSH

19
19
20
21
21
21
22

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kardiovaskular diperkirakan WHO pada tahun 2030 masih penyebab
kematian utama di dunia (FAO/WHO 2002). Faktor yang mempengaruhi
timbulnya penyakit kardiovaskular, diantaranya adalah peningkatan kadar
kolesterol khususnya LDL (Low Density Lipoprotein) yang biasa disebut sebagai
hiperkolesterolemia. Hiperkolesterolemia terjadi jika kadar kolesterol melebihi
batas normal. Penyebab meningkatnya kadar kolesterol dalam tubuh dikarenakan
konsumsi kandungan nutrisi makanan yang mengandung kadar kolesterol yang
tinggi. Kadar kolesterol LDL menjadi berlebih sedangkan kolesterol baik HDL
(High Density Lipoprotein) cukup sedikit sehingga tidak mampu melawannya.
Usaha yang dilakukan penderita hiperkolesterolemia untuk menurunkan kolesterol
tubuh adalah dengan penggunaan beberapa jenis pangan fungsional dan obatobatan antikolesterol. Penggunaan obat-obatan tersebut dilaporkan menimbulkan
efek samping terhadap penderitanya. Fungsi probiotik untuk jenis strain tertentu
belakangan ini dikembangkan untuk membantu menurunkan kolesterol tubuh.
Probiotik yaitu laktobasili mampu menurunkan kolesterol diduga karena adanya
enzim Bile salt hydrolase (BSH) mengkonjugasi garam empedu serta mampu
mengasimilasi kolesterol dalam usus halus. BAL (bakteri asam laktat) yang
mampu menurunkan kolesterol memiliki sifat yaitu tahan terhadap garam empedu.
Sifat probiotik BAL salah satunya yaitu tahan terhadap asam dan garam
empedu (Liévin-Le Moal dan Servin 2014; Setyawardani et al. 2014; Arief et al.
2015). Kemampuan mikroba usus mendekonjugasi asam empedu
dipertimbangkan menjadi salah satu aktivitas probiotik (FAO/WHO 2002). Asam
empedu disintesis di dalam hati dari kolesterol dan disekresi sebagai konjugat dari
glisin maupun taurin ke dalam usus dua belas jari dan akan berperan dalam
memfasilitasi penyerapan lemak dan mengikuti sirkulasi enterohepatik. Selama
disirkulasi dalam saluran pencernaan, garam empedu dapat mengalami modifikasi
oleh mikrobiota usus, yaitu dekonjugasi garam empedu oleh enzim hidrolisis
garam empedu (BSH) dengan melepaskan residu asam amino dan terbentuk asam
empedu terdekonjugasi (asam kolat) (Kumar et al 2012).
Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa beberapa BAL dapat
menurunkan kolesterol secara in vitro maupun in vivo (Usman dan Hosono 1999:
Liong dan Shah 2005; Begley et al., 2006; Kimoto-Nira et al., 2007; Lye et al.
2010). Pada subjek yang hiperlipidemik umumnya efek yang diberikan dari
konsumsi probiotik adalah penurunan kadar kolesterol, sedangkan pada subjek
yang normal, efek yang umumnya terjadi adalah penurunan kadar trigliserida
(Pereira dan Gibson 2002).
Sifat alami BAL ada dalam pangan dan sejarah pemanfaatannya dalam
proses fermentasi yang aman dan bermanfaat terhadap kesehatan menjadikannya
sebagai GRAS (Generally Recognized as Safe) untuk dikonsumsi oleh manusia
(FAO/WHO 2002). BAL yang terdapat dalam pangan tidak semuanya sama dalam
menurunkan kolesterol. Nuraida et al. (2011) yang mengevaluasi dari 13 isolat
BAL air susu ibu yang diuji tidak semua memiliki kemampuan mengasimilasi
kolesterol, hanya Pediococcus pentosaceus I-A31, P. pentosaceus 2-B2 dan

2

P.pentosaceus 2-A16 yang mampu mengasimilasi paling besar. Beberapa BAL
memiliki kemampuan dalam menurunkan kadar kolesterol. Kemampuan dan sifat
yang dimiliki oleh masing-masing strain bervariasi sehingga perlu dilakukan
seleksi keberadaan gen BSH pada isolat asal dangke (sejenis keju lunak yang
berasal dari kabupaten Enrekang Provinsi Sulawesi Selatan) dan daging sapi
(daging sapi yang bersal dari pasar tradisional Bogor Jawa Barat). Evaluasi
mengenai kemampuan beberapa bakteri asam laktat isolat asal dangke dan daging
sapi dalam menurunkan kolesterol, berdasarkan kemampuannya untuk
mengasimilasi kolesterol dan aktivitas enzim BSH yang dimilikinya.
Perumusan Masalah
Pengembangan fungsi probiotik untuk jenis strain tertentu belakangan ini
meluas salah satunya untuk tujuan penurunan kolestrol. Untuk mengetahui
aktivitas fungsional isolat BAL lokal sebagai penurun kolestrol, perlu diketahui:
1. Adakah gen BSH pada isolat BAL asal dangke dan daging sapi?
2. Bagaimana analisis aktivitas enzim BSH dari masing-masing isolat BAL asal
dangke dan daging sapi?
3. Bagaimana analisis kemampuan isolat BAL asal dangke dan sapi dalam
mengasimilasi kolesterol secara in vitro.
Tujuan Penelitian
Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi kemampuan
BAL menurunkan kolestrol. Adapun tujuan khusus dari penelitian ini adalah
sebagai berikut:
1. Seleksi dan mengindentifikasi keberadaan gen BSH pada isolat BAL asal
dangke dan daging sapi
2. Menganalisis aktivitas isolat BAL asal dangke dan daging sapi.
3. Menganalisis kemampuan isolat BAL asal dangke dan daging sapi dalam
mengasimilasi kolesterol.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian diharapkan dapat bermanfaat dan berperan penting dalam
penambahan wawasan ilmu pengetahuan, khususnya dalam bidang mikrobiologi.
Penelitian ini dapat menjadi bahan yang menyediakan informasi tentang
kemampuan BAL dalam menurunkan kolestrol yang diperoleh dari isolat asal
dangke dan daging sapi lokal.
Hipotesis
Hipotesis yang diajukan pada penelitian ini adalah BAL yang diisolasi dari
dangke dan daging sapi memiliki kemampuan untuk menurunkan kolestrol secara
in vitro.

3

Ruang Lingkup
Penelitian ini meliputi seleksi keberadaan gen BSH, uji aktivitas BSH dan
uji asimilasi kolestrol pada isolat BAL asal dangke dan daging sapi. Berikut
disajikan diagram alir penelitian (Gambar 1)
Isolat BAL asal
dangke dan
daging sapi

Uji keberadaan gen
BSH

Uji Aktivitas BSH

Uji Asimilasi
kolestrol

Ekstraksi DNA

Amplifikasi PCR

Analisis: Zona
Perisipitasi pada
Media

Elektroforesis Agarosa
Uji Positif Garam
Sekuensing gen

Isolat BAL
berpotensi sebagai
hipokolestrol

Gambar 1. Diagram alir penelitian

Analisis: Konsentrasi
Kolestrol terasimilasi

4

2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Divisi
Teknologi Hasil Ternak, Laboratorium Genetika Molekuler, Laboratorium
Terpadu Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas
Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Waktu pelaksanaan penelitian ini dari bulan
Desember 2015 – Mei 2016.
Bahan dan Peralatan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas kultur bakteri
asam laktat isolat dangke dan daging, Tris HCl buffer, EDTA, glukosa, NaOH,
SDS, KCH3COO, asam asetat, akuades, cloroform, RNAse, 2-propanol, etanol
70%, Tris EDTA buffer, primer forward, primer reverse, dNTPs, MgCl2, phire hot
start II DNA polymerase, phire buffer reaction 5x, double destilled H2O, gel
agarose, buffer TBE, loading dye, bile salt, CaCl2, de Mann Rogosa Sharpe Broth
(MRSB) (Oxoid), de Mann Rogosa Sharpe Agar (MRSA) (Oxoid), Bakteriologi
Agar (BA), kertas saring, gas generating kit, kolesterol PEG 600 (Sigma-Aldrich
250 mg), KOH, Etanol 90%, hexan, gas N2, o-phthalaldehyde, H2SO4, buffer
pepton water (Oxoid), kertas saring, spiritus, aluminium foil, gloves, alkohol.
Alat-alat yang digunakan terdiri atas sentrifus, mikropipet, vorteks, rak
tabung, mesin PCR, alat elektroforesis, neraca analitik, microwave, tabung reaksi,
tip, waterbath, laminar, inkubator, magnetik stirer, spectrofotometer, bunsen,
autoklaf, vial.
Prosedur Penelitian
Pemilihan BAL yang digunakan yaitu BAL yang memiliki sifat tahan
terhadap garam empedu. Jenis BAL yang dijadikan materi utama dalam penelitian
ini adalah:
1. BAL asal dangke yang dipilih yaitu L. fermentum A323L, L. fermentum
B111K, L. fermentum B323K, L. fermentum C113L, dan L. fermentum C212L
(Syah et al 2016).
2. BAL asal daging sapi: L. plantarum IIA-2C12, L. plantarum IIA-1A5, dan L.
acidophillus IIA-2B4 (Arief et al 2011).
BAL yang dijadikan materi utama kemudian dikultur menggunakan MRSB.
Kultur BAL kemudian diuji meliputi tiga pengujian meliputi seleksi keberadaan
gen BSH dengan PCR, pengujian aktivitas Bile Salt Hydrolase (BSH), serta
pengujian asimilasi kolesterol secara in vitro.

5

Uji Keberadaan Gen BSH dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)
Ekstraksi DNA (Modifikasi Sambrook dan Russell 2001)
Kultur BAL yang diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37 °C
disentrifugasi dengan suhu 4 °C 10.000 x g selama 1 menit dan supernatannya
dibuang. Kemudian endapan ditambahkan 200 µl larutan I (25 mM Tris- HCl
buffer pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 50 mM glukosa) campuran kemudian
diresuspensi dengan mempipet dan diinkubasi selama 5 menit dengan suhu ruang.
Selanjutnya ditambahkan 400 µl larutan II (1.2 N NaOH dan 1% SDS), campur
dengan pelan dan diinkubasi dengan es selama 5 menit. Kemudian ditambahkan
larutan III (60 ml 5 M KCH3COO, 11.5 ml asam asetat, 28.5 ml dH2O) sebanyak
300 µl divorteks dan diinkubasi 5 °C dengan suhu 4 °C 10.000 x g selama 1 menit.
Pindahkan supernatan pada vial yang baru dan ditambahkan 1 µl dengan 1 mg/ml
RNAse, dicampur dengan pelan dan diinkubasi dengan suhu ruang selama 15
menit. Kemudian ditambahkan 2-propanol dan dicampur dengan pelan dan
sentrifugasi selama 10 menit dengan suhu 4 °C 10000 x g supernatan dibuang.
Selanjutnya ditambahkan 500 µl etanol 70% dan dicampur dengan pelan dan
disentrifugasi selama 1 menit dan supernatan dibuang selanjutnya dikeringkan
sampai kering. Kemudian dilarutkan dengan Tris EDTA buffer sebanyak 100 μl
sebelum digunakan untuk PCR.
Amplifikasi PCR (Polymerase Chain Reaction) (Modifikasi Kim et al. 2004)
Seleksi gen BSH dilakukan dengan PCR dengan primer universal yang
digunakan oleh Kim et al. (2004),BSH F 1-24 (5' AGTCCATATGTGCACTGGT
GTCCGTTTCTCC-3') BSH R 951–931(5'-AGTCAAGCTTCAATCGGCGGTG
ATCAGCTCG-3'). Campuran reaksi sebanyak 45 µl yang terdiri dari DNA
template 3 µl, primer forward 0.3 µl, primer reverse 0.3 µl, deoxyribonukleat
trifosfat (dNTPs) 0.9 µl, MgCl2 2.5 µl, Phire Hot Start II DNA Polymerase 0.2 µl,
Phire Buffer Reaction 5X 9µl, double-destilled H2O 28.8 µl. Amplifikasi PCR
dilakukan pada suhu awal 95 °C selama 15 menit, diikuti oleh 35 siklus yang
terdiri dari tahap denaturasi 94 °C selama 1 menit tahap annealing dengan suhu 55
°
C selama 30 detik. Tahap ekstensi dengan suhu 72 °C selama 1 menit. Tahap post
esktensi selama 10 menit pada suhu 72 °C. Produk PCR diambil dan disimpan
pada suhu 4°C untuk selanjutnya diperiksa dengan menggunakan elektroforesis
agarosa 1%.
Elektroforesis Agarosa
Elektroforesis agarosa dengan modifikasi dari Arief et al. (2015). Sebanyak
1% agarosa (b/v) dipanaskan hingga mendidih dengan pelarut buffer Tris asetat
(TAE) 1×. Campuran kemudian didinginkan dan diputar dengan magnetic stearer
pada kecepatan 1000 x g. Larutan yang masih hangat dituangkan ke dalam tray
elektroforesis, lalu dibiarkan sampai dingin dan memadat selama lebih kurang 1
jam, lalu sisir diangkat. Buffer TAE 1× pada elektroforesis dituangkan, kemudian
tray yang berisi agarosa padat ditempatkan pada alat elektroforesis sampai
terendam oleh buffer.
Sebanyak 1 μl loading dye dipersiapkan di atas paraffin, lalu dicampurkan
dengan produk PCR sebanyak 4 μl. Larutan kemudian dituangkan ke dalam sumur
(well) agarosa dengan menggunakan mikropipet, lalu ditambah marker 3 μl. Alat
elektoforesis kemudian ditutup dan dijalankan pada voltase 100 V selama 30

6

menit. Hasil elektroforesis agarosa kemudian direndam di dalam ethidium
bromide selama 10 menit.
Sekuensing
Sekuensing produk PCR sampel BAL gen BSH dilakukan dengan
menggunakan mesin sekuenser (ABI Prims 3100 - Avant Genetic Analyzer) pada
fragmen forward dan reverse melalui jasa dari First Base di Selangor, Malaysia.
Hasil sekuensing dirubah dalam bentuk asam amino dan disejajarkan dengan
menggunakan MEGA 6
Uji Aktivitas Bile Salt Hydrolase (BSH)
Uji aktivitas enzim BSH menggunakan metode modifikasi Sedlackova
(2014). MRSA dengan pH 5.6 (MRSB, BA, bile salt 0.3% w/v) dan CaCl2 (0.375
g/l)). Kemudian cawan petri dinkubasi dengan secara anaerob pada suhu 37 °C
selama 48 jam. BAL diinokulasi pada MRSA dengan cara meletakkan 80 µl
kultur dalam sumuran pada media kontrol dan media uji dan diinkubasi selama 72
jam dengan suhu 37 °C. Adanya aktivitas BSH dalam mengkonjugasi garam
empedu ditandai dengan terbentuknya zona presipitasi (endapan) disekitar koloni
pada media agar yang mengandung CaCl2 dan bile salt, karena asam kolat hasil
dekonjugasi oleh enzim BSH akan bereaksi dengan CaCl2 membentuk garam
yang mengendap.
Uji Asimilasi Kolesterol in vitro
Uji asimilasi dilakukan dengan metode Tomaro-Duchesneau (2014) yaitu
dengan menggunakan kolesterol PEG 600 ditambahkan ke dalam MRSB dengan
konsentrasi akhir 100 µg/ml. Sebanyak 1% (v/v) inokulum BAL probiotik yang
disegarkan selama 24 jam pada suhu 37 °C. Setelah inkubasi 24 jam viabilitas
bakteri diukur dengan metode hitung cawan. Untuk analisis kolesterol, suspensi
probiotik disentrifugasi dengan 4000 x g selama 10 menit pada suhu 4 °C untuk
memperoleh supernatannya.
Supernatan yang diperoleh dipindahkan pada vial baru sebanyak 500 µl
kemudian ditambahkan 500 µl KOH 33% dan 1 ml etanol. Larutan kemudian
divorteks selama 1 menit dan diinkubasi dengan suhu 37 °C selama 15 menit
biarkan dalam suhu ruang. Pada fase separasi larutan ditambahkan 1 ml H2O dan
1.5 ml hexane dan divorteks selama 1 menit. Fase larutan air dan larutan hexane
menjadi dua fase, bagian atas larutan dipindakhan pada vial baru sebanyak 500 µl
untuk kemudian dievaporasi dengan gas Nitrogen. Setelah kering ditambahkan 1
ml 50 mg/dl pereaksi o-phthalaldehyde yang dilarutkan dengan asam asetat dan
dicampukan dengan sampel. Setelah bercampur ditambahkan H2SO4 pekat
sebanyak 250 µl pada sampel dan divorteks selama 1 menit. Sampel kemudian
diinkubasi selama 20 menit pada suhu ruang kemudian absorbansinya diukur
dengan panjang gelombang 570 nm menggunakan spektrofotometer UV.
Kurva standar absorbansi vs konsentrasi kolesterol diukur pada absorbansi
570 nm menggunakan spektrofotometer dengan konsentrasi kolesterol 0; 3.91;

7

7.81; 15.6; 31.25; 62.5; 125; 250; dan kolesterol pada MRSB (R2=0.9875).
Asimilasi kolesterol oleh strain BAL probiotik ditentukan sebagai berikut:
1. Asimilasi kolesterol (µg/ml)=[kolesterol (µg/ml)]0jam–[Kolesterol (µg/ml)]24jam
2. Persentase asimilasi kolesterol =

�

��

�

�

��

µg/

�

µg/

0 �

×

%

Asimilasi Kolesterol (mg/mL)
Viabilitas sel (cfu/mL)×1010
Viabilitas sel BAL (cfu/mL) x
Analisis Data

3. Asimilasi kolesterol dalam 1010 sel =

Analisis data secara deskriptif digunakan pada parameter uji keberadaan gen
BSH dan aktivitas BSH. Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan
Acak Lengkap (RAL) untuk uji asimilasi kolesterol. Data yang diperoleh
dianalisis ragam ANOVA diikuti oleh uji lanjut dengan delapan perlakuan dengan
3 ulangan (Steel dan Torrie,1995). Model statistik yang digunakan yaitu:
Yij = µ + τi + εij;
i = 1, 2, 3,4,5,6,7,8 (Isolat BAL)
j = 1, 2, 3 (ulangan)
Keterangan :
Yij = Variable respon pengamatan
µ = Nilai rata – rata hasil jenis isolat BAL dangke dan daging
τi = Pengaruh strain isolat BAL dangke dan daging ke-i
εij = Pengaruh galat percobaan dari spesies isolat ke-i dan ulangan ke-j

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Keberadaan Gen BSH dengan PCR
Hasil ekstraksi DNA pada isolat BAL menghasilkan konsentrasi DNA yang
berbeda-beda. Ekstraksi DNA dielektroforesis dan hasil elektroforesis
menunjukkan DNA berhasil diisolat, hal ini ditunjukkan adanya pita DNA yang
terdeteksi pada gel agarose. Hal tersebut menunjukkan bahwa metode ekstaksi
DNA yang digunakan baik untuk isolat BAL yang diisolasi dari dangke dan
daging sapi. Hasil elektrforeisis ekstraksi DNA dapat dilihat pada Lampiran 1.
Amplifikasi gen BSH dilakukan pada setiap ekstraksi DNA, dengan
menggunakan suhu annealing 55 ºC. Suhu annealing yang digunakan
berpedoman pada suhu didih (melting temperature/Tm) sebab suhu annealing
yang tidak tepat menyebabkan pita DNA tidak tunggal. Tm dioptimasi sesuai
dengan primer yang telah ditentukan oleh perusahaan produsen primer
GeneDesign. Suhu annealing 55 ºC gen BSH dapat teramplifikasi sempurna
dengan perolehan pita yang tunggal disajikan pada Gambar 2.

8

982 bp

Gambar 2 Elektroforesis agarosa gen BSH. Keterangan:M : Marker (DNA ladder
100 bp)(1) L. fermentum C222L (2) L. plantanrum IIA-1A5 (3) L.
fermentum C113L (4) L. fermentum B111K (5) L. fermentum B323K
(6) L. plantarum IIA-2C12 (7) L. fermentum A323L (8) L.
acidophillus IIA-2B4
Pada Gambar 2 menunjukkan bahwa dari hasil PCR tidak semua BAL yang
diisolasi pada dangke dan daging sapi terlihat pita DNA yang tunggal. Pita DNA
yang terlihat pada hasil uji elektroforesis menunjukkan bahwa hanya L. plantarum
IIA-1A5 yang terlihat pita tunggal. Amplifikasi fragmen L. plantarum IIA-1A5
berada pada kisaran 900-1000 bp. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa
bakteri L. plantarum memiliki gen BSH dan letak pita DNA gen BSH berada
pada kisaran 800-1000 bp (Bin dan Jiang 2011; Kim et al. 2004).
Produk PCR pita DNA yang terlihat, dilanjutkan dengan sekuensing.
Sekuensing merupakan salah satu cara untuk mengidentifikasi suatu gen. Identitas
suatu gen yang telah diketahui sekeunnya dapat ditentukan dengan
membandingkan data sekuen isolat BAL internasional yang terdeposit di GenBank.
Panjang produk DNA gen BSH L. plantarum IIA-1A5 yaitu 982 bp. Analisis
kemiripan dilakukan dengan menggunakan program BLAST NCBI (secara
online) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Hasil blast gen BSH L. plantarum IIA1A5 menunjukkan kedekatannya dengan L. plantarum Lp529 dengan kode akses
FJ439771 and FJ439775 ditunjukkan pada Lampiran 2. Proses selanjutnya adalah
melakukan alignment atau pensejajaran urutan basa gen. Hasil alignment
menunjukkan bahwa urutan basa dari gen BSH L. plantarum IIA-1A5 BAL
mampu disejajarkan dengan baik dan mempunyai susunan basa tetap atau sama
sesuai analisis dengan menggunakan ClustalW. Pensejajaran gen BSH L.
plantarum IIA-1A5 disajikan pada Gambar 3.
BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
5
ATGTGTACTA
ATGTGTACTA
ATGTGTACTA
**********

....|....|
15
GTTTTACGAT
GTTTAACGAT
GTTTAACGAT
**** *****

....|....|
25
TCAAACCACG
TCAAACCACG
TCAAACCACG
**********

....|....|
35
GCGGGTGATC
GCGGGTGATC
GCGGGTGATC
**********

....|....|
45
AGTTTTAAGC
AGTTTTTAGC
AGTTTTTAGC
****** ***

....|....|
55
ACGCACCATG
ACGCACCATG
ACGCACCATG
**********

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
65
GACTTTGCTT
GACTTTGCTT
GACTTTGCTT
**********

....|....|
75
TTGAACTTGG
TTGAACTTGG
TTGAACTTGG
**********

....|....|
85
TGGTCGACCA
TGGTCGACCA
TGGTCGACCA
**********

....|....|
95
GTGGCAATCC
GTGGCAATCC
GTGGCAATCC
**********

....|....|
105
CACGGAATCA
CACGGAATCA
CACGGAATCA
**********

....|....|
115
ACATTTTGAC
CCATTTTGAC
CCATTTTGAC
*********

9

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
125
AGTGTTACCA
AGTGTTACCA
AGTGTTACCA
**********

....|....|
135
ATGCGGACGG
ATGCGGACGG
ATGCGGACGG
**********

....|....|
145
TTTGGATAGC
TTTTGATAGC
TTTTGATAGC
*** ******

....|....|
155
CCGTATAGCT
CCGTATAGCT
CCGTATAGCT
**********

....|....|
165
TTGTTGGAAC
TTGTTGGAAC
TTGTTGGAAC
**********

....|....|
175
GGGCCGTGAC
GGGCCGTGAC
GGGCCGTGAC
**********

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
185
TTAAATGGCT
TTAAATGGCT
TTAAATGGCT
**********

....|....|
195
ATATCTTTGT
ATATCTTTGT
ATATCTTTGT
**********

....|....|
205
CGATGGTGTC
CGATGGTGTC
CGATGGTGTC
**********

....|....|
215
AAGGAGCACG
AATGAGCACG
AATGAGCACG
** *******

....|....|
225
GGGTCAGTGC
GGGTCAGTGC
GGGTCAGTGC
**********

....|....|
235
TGCTGCACTC
TGCTGCACTC
TGCTGCACTC
**********

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
245
TATTTCTCGG
TATTTCTCGG
TATTTCTCGG
**********

....|....|
255
GACAAGCTCA
GACAAGCTCA
GACAAGCTCA
**********

....|....|
265
CTTTACTCAG
CTTTACTCAG
CTTTACTCAG
**********

....|....|
275
CAAACTAAGG
CAGACTAAGG
CAGACTAAGG
** *******

....|....|
285
CTGGCAAGGT
CTGGCAAGGT
CTGGCAAGGT
**********

....|....|
295
TAACTTCGCA
TAACTTGGCA
TAACTTGGCA
****** ***

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
305
CCCCACGAAG
CCCCACGAAG
CCCCACGAAG
**********

....|....|
315
TTTTAATGTG
TTTTAATGTG
TTTTAATGTG
**********

....|....|
325
GATTTTAGGA
GATTTTAGGA
GATTTTAGGA
**********

....|....|
335
ACCGTGAAGA
AACGTGAAGA
AACGTGAAGA
* ********

....|....|
345
GCACCGCTGA
GCACCGCTGA
GCACCGCTGA
**********

....|....|
355
ATTACGCGAA
ATTAGGCGAA
ATTAGGCGAA
**** *****

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
365
CGGATTGCTG
CGGATTGCTG
CGGATTGCTG
**********

....|....|
375
ACTTGAACGT
ACTTGAACGT
ACTTGAACGT
**********

....|....|
385
GATGTAAGCC
GATGGAAGCC
GATGGAAGCC
**** *****

....|....|
395
GCCGCGCCAC
GCCGCGCCAC
GCCGCGCCAC
**********

....|....|
405
TATTGAATAT
TATTGAATAT
TATTGAATAT
**********

....|....|
415
TGTGGTACCA
TGTGGTACCA
TGTGGTACCA
**********

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
425
CTAAACTGGA
CTACACTGGA
CTACACTGGA
*** ******

....|....|
435
TCATTAGTGA
TCATTAGTGA
TCATTAGTGA
**********

....|....|
445
CAAGAGTGGT
CAAGAGTGGT
CAAGAGTGGT
**********

....|....|
455
TCTACTTACG
TCTACTTACG
TCTACTTACG
**********

....|....|
465
TCTTAGAATT
TCTTAGAATT
TCTTAGAATT
**********

....|....|
475
GGAAAATGAC
GGAAAATGAC
GGAAAATGAC
**********

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
485
GGGGTTCACT
GGTGTTCACT
GGTGTTCACT
** *******

....|....|
495
ACATGAAGAA
ACATGAAGAA
ACATGAAGAA
**********

....|....|
505
TCCGGTGGGC
TCCGGTGGGC
TCCGGTGGGC
**********

....|....|
515
GTCATGACGA
GTCATGACGA
GTCATGACGA
**********

....|....|
525
ACACACCAGA
ACACACCAGA
ACACACCAGA
**********

....|....|
535
ATTTGAATGG
TTTTGAATGG
TTTTGAATGG
*********

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
545
CATCTCAAGA
CATCTCAAGA
CATCTCAAGA
**********

....|....|
555
ATTTGAGTAA
ATTTGAGTAA
ATTTGAGTAA
**********

....|....|
565
TTACGTCAAC
TTACGTCAAC
TTACGTCAAC
**********

....|....|
575
TTACAACCCG
TTACAACCCG
TTACAACCCG
**********

....|....|
585
GCCCTCATCC
GCCCTCATCC
GCCCTCATCC
**********

....|....|
595
TAGTCGTCAA
TAGTCGTCAA
TAGTCGTCAA
**********

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
605
TACGGTGACA
TACGGTGACA
TACGGTGACA
**********

....|....|
615
TGACGGTGAA
TGACGGTGAA
TGACGGTGAA
**********

....|....|
625
TCCTTTCGGT
TCCTTTCGGT
TCCTTTCGGT
**********

....|....|
635
CCTGGAACTG
CCTGGAACTG
CCTGGAACTG
**********

....|....|
645
GGGCGTTGGG
GGGCGTTGGG
GGGCGTTGGG
**********

....|....|
655
AATGCCTGGT
AATGCCTGGT
AATGCCTGGT
**********

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
665
GGCTATACGT
GGCTATACGT
GACTATACGT
* ********

....|....|
675
CAGTTGCACG
CAGTTGCACG
CAGTTGCACG
**********

....|....|
685
CTTCGTTCGG
CTTCGTTCGG
CTTCGTTCGG
**********

....|....|
695
ACGGTCTTCA
ACGGTCTTCA
ACGGTCTTCA
**********

....|....|
705
TGCGTGAACA
TGCGTGAACA
TGCGTGAACA
**********

....|....|
715
TACGGATGCA
TACGGATGCA
TACGGATGCA
**********

10

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
725
GGAACGACTG
GTAACGACTG
GTAACGACTG
* ********

....|....|
735
ATGCAGAAGC
ATGCAGAAGC
ATGCAGAAGC
**********

....|....|
745
TGTAAACGCA
TGTCAACGCA
TGTCAACGCA
*** ******

....|....|
755
TTATCACACA
TTATCACACA
TTATCACACA
**********

....|....|
765
TGCTGAACTC
TGCTGAACTC
TGCTGAACTC
**********

....|....|
775
AGTGGAGATT
AGTGGAGATT
AGTGGAGATT
**********

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
785
CCTAAGGGCG
CCTAAGGGCG
CCTAAGGGCG
**********

....|....|
795
TTAAGATGCA
TTAAGATGCA
TTAAGATGCA
**********

....|....|
805
AGATAACGGG
AGATAACGGG
AGATAACGGG
**********

....|....|
815
ACGCCAGATT
ACGCCAGATT
ACGCCAGATT
**********

....|....|
825
ATACCCAGTA
ATACCCAGTA
ATACCCAGTA
**********

....|....|
835
CCGCGCCTAT
CCGCGCCTAT
CCGCGCCTAT
**********

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
845
ATGAGCATGA
ATGAGCATGA
ATGAGCATGA
**********

....|....|
855
ATGAACCAGC
ATGAACCAGC
ATGAACCAGC
**********

....|....|
865
ATTTTACATG
ATTTTACATG
ATTTTACATG
**********

....|....|
875
CAACCATACG
CAACCATACG
CAACCATACG
**********

....|....|
885
GGGATCAGAC
CGGATCAGAC
CGGATCAGAC
*********

....|....|
895
GATTACGCGG
GATTACGCGG
GATTACGCGG
**********

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
905
GTCGAATTGA
GTCGAATTGA
GTCGAATTGA
**********

....|....|
915
CACCAGCTTT
CACCAGCTTT
CACCAGCTTT
**********

....|....|
925
AATGACGGCC
AATGACGGCC
AATGACGGCC
**********

....|....|
935
GCGCAACCGA
GCGCAACCGA
GCGCAACCGA
**********

....|....|
945
CTGAATTTGA
CTGAATTTGA
CTGAATTTGA
**********

....|....|
955
ATTAAAGACA
ATTAAAGACA
ATTAAAGACA
**********

BSH_Lp.IIA
FJ439771.1
FJ439775.1
Clustal Co

....|....|
965
ACCCAACAGT
ACCCAACAGT
ACCCAACAGT
**********

....|....|
975
TCTGGTTAGC
TCCGGTTAGC
TCCGGTTAGC
** *******

....|..
985
AACCTAA
AAACTAA
AAACTAA
** ****

Gambar 3 Pensejajaran gen BSH L. plantarum IIA-1A5 dengan gen BSH L.
plantarum Lp529 kode akses FJ439771 and FJ439775 dari GenBank
Penyusunan pohon filogenetik dilakukan dengan menggunakan program
perangkat lunak MEGA6 . Hasil pohon filogeni disajikan pada Gambar 4. Pohon
filogeni menunjukkan bahwa L.plantarum IIA-IA5 98% homolog dengan gen
BSH L. plantarum Lp529 dengan kode akses FJ439771 and FJ439775 dari
GenBank. Kesamaan antara L.plantarum IIA-IA5 dengan L. plantarum Lp529 bsh
FJ439771 and FJ439775 memiliki nilai boostrap lebih dari 95%. Nilai boostrap
tersebut mempunyai arti bahwa topologi percabangan tersebut sangat akurat,
konsisten atau tidak akan berubah walaupun dilakukan dengan metode
penyusunan pohon filogenetik lainnya (Horiike et al. 2009).

Gambar 4

Pohon pilogeni BSH L. plantarum IIA-1A5 dengan gen BSH L.
plantarum Lp529 kode akses FJ439771 and FJ439775 dari GenBank

11

Gen BSH pada L. plantarum IIA-1A5 dengan panjang produk 982 bp
ditranslate ke urutan asam amino. Hasil blast asam amino tersebut menghasilkan
(Ntn-hydrolase superfamily) menunjukkan bahwa urutan asam amino tersebut
merupakan enzim BSH. Blast dari GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
urutan asam amino L. plantarum IIA-1A5 disajikan pada Lampiran 3. Menurut
Tanaka et al (2000) ikatan C-24 N-acyl dihidrolisis oleh BSH yang terhubung
asam empedu dengan konjugasi asam amino. N-terminal nucleophilic hydrolases
(Ntn) diklarifikasikan sebagai enzim BSH, yang sama dengan penicillin amidases,
keduanya sama-sama memiliki catalytic N-terminal cysteine residu.
Proses selanjutnya adalah melakukan pensejajaran urutan asam amino dari
gen BSH L. plantarum IIA-1A5 dengan urutan asam amino BSH L. plantarum
Lp529 dengan kode akses FJ439771 and FJ439775. Urutan asam amino mampu
disejajarkan dengan baik dan mempunyai susunan asam amino tetap atau sama
sesuai analisis dengan menggunakan ClustalW. Pensejajaran urutan asam amino
BSH L. plantarum IIA-1A5 disajikan pada Gambar 5.
10

20

30

40

50

60

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
BSH Lp IIA 1A5 MCTSGTIQTT AGDQFDARTM DFAFELGGRP VAIPRNSHFD SVTNADAFDS PYSFVGTGRD
BSH FJ439775
MCTSLTIQTT AGDQFLARTM DFAFELGGRP VAIPRNHHFD SVTNADGFDS PYSFVGTGRD
BSH FJ439771
MCTSLTIQTT AGDQFLARTM DFAFELGGRP VAIPRNHHFD SVTNADGFDS PYSFVGTGRD

BSH Lp IIA 1A5
BSH FJ439775
BSH FJ439771

70
80
90
100
110
120
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
LNGYIFVDGL NEHGVSAAAL YFSGQAHFTQ QTKAGKVTLY PHEVLMWILA NVKSTAEEGE
LNGYIFVDGV NEHGVSAAAL YFSGQAHFTQ QTKAGKVNLA PHEVLMWILG NVKSTAELGE
LNGYIFVDGV NEHGVSAAAL YFSGQAHFTQ QTKAGKVNLA PHEVLMWILG NVKSTAELGE

BSH Lp IIA 1A5
BSH FJ439775
BSH FJ439771

130
140
150
160
170
180
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
RIADLNVLEA AAPLLNIVVP LLWIISDKSG STYVLELEND KVHYMKNPVG VMTNTPDTEW
RIADLNVMEA AAPLLNIVVP LHWIISDKSG STYVLELEND GVHYMKNPVG VMTNTPDFEW
RIADLNVMEA AAPLLNIVVP LHWIISDKSG STYVLELEND GVHYMKNPVG VMTNTPDFEW

BSH Lp IIA 1A5
BSH FJ439775
BSH FJ439771

190
200
210
220
230
240
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
HLKNLSNYVN LQPGPHPSRQ YGDMTVNPFG PGTGALGMPG DYTSVARFVR TVFMREHTDA
HLKNLSNYVN LQPGPHPSRQ YGDMTVNPFG PGTGALGMPG DYTSVARFVR TVFMREHTDA
HLKNLSNYVN LQPGPHPSRQ YGDMTVNPFG PGTGALGMPG DYTSVARFVR TVFMREHTDA

BSH Lp IIA 1A5
BSH FJ439775
BSH FJ439771

250
260
270
280
290
300
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
VTTDEEAVNA LSHMLNSVEI PKGVKMQDNG TPDYTQYRAY MSMNEPAFYM QPYADQTITR
VTTDAEAVNA LSHMLNSVEI PKGVKMQDNG TPDYTQYRAY MSMNEPAFYM QPYADQTITR
VTTDAEAVNA LSHMLNSVEI PKGVKMQDNG TPDYTQYRAY MSMNEPAFYM QPYADQTITR

BSH Lp IIA 1A5
BSH FJ439775
BSH FJ439771

310
320
....|....| ....|....| ....|...
VFLTSALMTA AQPTEFELKT TQQFRNAN
VELTPALMTA AQPTEFELKT TQQFRLAN
VELTPALMTA AQPTEFELKT TQQFRLAN

Gambar 5 Pensejajaran sekuen urutan basa BSH L. plantarum IIA-1A5 dengan
BSH L. plantarum Lp529 dengan kode akses pada Gen Bank
FJ439775 dan FJ439771.
Pensejajaran urutan asam amino BSH L. plantarum IIA-1A5 sesuai dengan
sekuen asam amino BSH L. plantarum Lp529 dengan kode akses FJ439775 dan
FJ439771 pada urutan C, D, Y, N, dan R yang menandakan konsistensi yang
sangat tinggi. Ridlon et al. (2016) yang menyatakan bahwa enzim BSH

12

dibuktikan dari kesesuaian urutan asam amino BSH C1, D20, Y82, N175, dan
R228 yang menunjukkan bahwa sangat konsisten serta karakterisasi struktur dan
kesesuaian urutan BSH mendukung peran asam amino di dalam katalisis.
L. plantarum Lp529 merupakan BAL yang diisolasi dari feses manusia yang
memiliki susunan basa gen BSH dengan kode akses FJ439775 dan FJ439771
(Jiang et al. 2010). Enzim BSH pada bakteri memberikan keuntungan khusus bagi
bakteri probiotik yang tumbuh pada lingkungan yang penuh persaingan seperti
saluran pencernaan dengan memberikan daya tahan yang lebih baik terhadap
garam empedu. Hal tersebut membantu menurunkan kolesterol (Begley et al.
2006).
Aktivitas BSH (Bile Salt Hydrolase)
Pengujian aktivitas BSH pada penelitian ini dilakukan secara in vitro,
dengan melihat zona endapan putih yang terbentuk pada media MRSA yang telah
ditambahkan bile salt dan CaCl2. Hasil pengujian aktivitas BSH secara in vitro
pada delapan strain BAL yang disajikan pada Tabel 1:
No.
1
2
3
4
5
6
7
8

Tabel 1 Uji aktivitas BSH isolat BAL
Isolat BAL
Endapan garam
L. fermentum A323L
N
L. fermentum B111K
N
L. fermentum B323K
N
L. fermentum C113L
N
L. fermentum C222L
N
L. plantarum IIA-1A5
P
L. acidophillus IIA-2B4
N
L. plantarum IIA-2C12
N

Keterangan: N = Negatif garam, P = Positif garam

L. plantarum IIA-1A5 yang positif memiliki aktivitas BSH dari 8 isolat
yang diuji. Hal ini ditunjukkan dengan adanya garam yang berwarna putih.
Kondisi ini menandakan adanya aktivitas BSH dapat diketahui dengan
terbentuknya endapan putih disekitar koloni, karena asam empedu hasil
dekonjugasi (garam empedu bebas) oleh enzim BSH akan bereaksi dengan CaCl 2
membentuk garam yang mengendap. Terdeteksinya aktivitas BSH yang terjadi
karena BAL L. plantarum IIA-1A5 menghasilkan BSH. Hasil ini sesuai dengan
pengujian keberadaan gen BSH bahwa L. plantarum IIA-1A5 memiliki gen BSH.
Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian Sedlackova et al. (2014)
Lactobacillus memiliki aktivitas BSH kecuali strain Lactobacillus dari susu sapi
mentah, keju, dan sapi kolostrum tidak menunjukkan aktivitas BSH. Beberapa
penelitian yang menunjukkan bahwa strain Lactobacillus memiliki aktivitas BSH
yang berbeda-beda (Hae-Keun et al. 2008; Mahrous 2011; Sedlackova et al. 2014).
Peneliti Liong dan Shah (2005) dan Lye et al. (2010) melakukan uji
aktivitas BSH secara kuantitatif dengan mengukur kadar asam amino
(glisin/taurin) yang dibebaskan dari garam empedu terkonjugasi, dimana 1 unit
aktivitas BSH (U/mL) didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat

13

membebaskan 1 μmol asam amino per menit dari substrat yangdiberi perlakuan.
Hasil pengujian tersebut menunjukkan adanya aktivitas BSH pada L. acidophilus,
L. casei, dan L. bulgaricus yang berkisar antara 0.25-1.81 U/mL.
Mekanisme penurunan kolesterol oleh aktivitas BSH diketahui mampu
meningkatkan sekresi enzim Bile Salt Hydolase. Hal ini akan mengakibatkan
terjadinya dekonjugasi asam empedu dalam bentuk asam kolat bebas. Zat tersebut
menjadi sulit diabsorsi kembali melalui sirkulasi enterohepatic dan akan lebih
banyak asam empedu yang disekresikan melalui feses. Kondisi ini akan berakibat
kebutuhan kolesterol dalam tubuh meningkat dan akibatnya kadar kolesterol
dalam darah akan berkurang (Surono 2004).
Asimilasi Kolesterol

viabilitas bakteri (log cfu/ml)

Pertumbuhan BAL pada MRSB yang mengandung kolesterol ditunjukkan
pada Gambar 6. BAL mampu tumbuh pada media MRSB yang mengandung
kolesterol PEG 600 selama 24 jam dengan suhu 37 ºC dengan rataan pertumbuhan
dipangkat 109. L. plantanrum IIA-1A5 kemampuan pertumbuhannya lebih tinggi
yaitu sebesar 2.54×109
cfu/mL. L. fermentum B111K kemampuan
pertumbuhannya rendah yaitu sebesar 1.17×109 cfu /mL.
9.5
9.4
9.34

9.4
9.3

9.36
9.33

9.29

9.28

9.23

9.2
9.07

9.1
9
8.9
a

b

c

d

e

f

g

h

Isolat BAL dangke dan Daging Sapi

Gambar 6 Viabilitas bakteri pada media MRSB yang mengandung kolesterol PEG
600 (100 µg/mL ) selama 24 jam. (a) L. fermentum A323L (b) L.
fermentum B111K (c) L. fermentum B323K (d) L. fermentum C113L
(e) L. fermentum C222L (f) L. plantanrum IIA-1A5 (g) L. acidophillus
IIA-2B4 (h) L. plantarum IIA-2C12
Kemampuan mengasimilasi kolesterol pada bakteri dipengaruhi oleh jumlah
pertumbuhan bakteri yang dikultur selama 24 jam pada media MRSB yang
mengandung kolesterol PEG 600. Semakin banyak jumlah bakteri maka semakin
tinggi kemampuam mengasimilasi kolesterol, begitu pula sebaliknya. Pada Tabel
2 ditunjukkan persentase asimilasi kolesterol L. plantarum IIA-1A5 lebih tinggi
dari L. fermentum B111K sedangkan pada jumlah kolesterol terasimilasi dalam
1010 sel L. fermentum B111K lebih tinggi dari L. plantarum IIA-1A5. Hal ini

14

sesuai dengan penelitian (Tomaro-Duchesneau et al., 2014) bahwa persentase
asimilasi kolesterol Lactobacillus reuteri NCIMB 702656 lebih tinggi dari L.
plantarum ATCC 14917 sedangkan pada jumlah kolesterol terasimilasi dalam
1010 sel L. plantarum ATCC 14917 lebih tinggi dari L. reuteri NCIMB 702656.
Tabel 2 Jumlah kolesterol dan persentase kolesterol yang diasimilasi oleh isolat
BAL serta jumlah kolesterol terasimilasi dalam 1010 sel bakteri pada
MRS yang mengandung kolesterol PEG 600 (100 µg/mL) selama 24
jam
Jumlah Kolesterol Persentase
Kolesterol
No.
Isolat BAL
Terasimilasi
Kolesterol
terasimilasi
(µg/mL)
terasimilasi (%) (mg/1010 cfu)
1 L. fermentum A323L
a
a
2 L. fermentum B111K
33.14+3.86
4.10+0.36
0.13+0.03a
3 L. fermentum B323K
4 L. fermentum C113L
5 L. fermentum C222L
b
b
6 L. plantarum IIA-1A5
17.18+2.58
8.10+0.65
0.06+0.01b
7 L. acidophillus IIA-2B4
8 L. plantarum IIA-2C12
Keterangan: Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata
(P