Penapisan dan Identifikasi Bakteri Rhizosfer Padi Penghasil Asam Indol Asetat pada Kondisi Salin

PENAPISAN DAN IDENTIFIKASI BAKTERI RHIZOSFER
PADI PENGHASIL ASAM INDOL ASETAT
PADA KONDISI SALIN

KHARISMA PANJI RAMADHAN

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Penapisan dan
Identifikasi Bakteri Rhizosfer Padi Penghasil Asam Indol Asetat pada Kondisi
Salin adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
daftar pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2015
Kharisma Panji Ramadhan
NIM G84100031

ABSTRAK
KHARISMA PANJI RAMADHAN. Penapisan dan Identifikasi Bakteria
Rhizosfer Padi Penghasil Asam Indol Asetat pada Kondisi Salin. Dibimbing oleh
I MADE ARTIKA dan DWI NINGSIH SUSILOWATI.
Kenaikan muka air laut pada lahan pertanian pesisir berdampak pada
gangguan keseimbangan ion, peningkatan konsentrasi etilen akar, menimbulkan
kondisi hipo osmotik pada akar tanaman dan pada akhirnya menghambat
pertumbuhan akar. Aplikasi rhizobakteria indigen dengan kemampuan produksi
fitohormon pertumbuhan asam indol asetat (AIA) dapat menjadi salah satu solusi
dari permasalahan tersebut. Penelitian ini bertujuan menyeleksi dan
mengidentifikasi sejumlah rhizobakteria yang mampu memproduksi fitohormon
AIA dan memiliki sifat toleran terhadap cekaman salinitas. Sebanyak 48 isolat
rhizobakteria asal sawah pesisir wilayah Eretan dan Patimban, Jawa Barat telah
dianalisis. Isolat dengan kode Er B1.3 dan Er B1.7a mampu tumbuh pada media

minimal salt dengan kandungan NaCl 15 %. Kedua isolat tersebut masih mampu
menghasilkan AIA dengan konsentrasi berturut-turut 11.55 ppm dan 3.1 ppm pada
media minimal salt dengan kandungan NaCl 10 %. Hasil identifikasi gen IaaM
membuktikan bahwa isolat Er B1.3 dan Er B1.7a terindikasi memproduksi AIA
melalui jalur IAM. Berdasarkan hasil sekuensing gen 16S rRNA diketahui isolat
Er B1.3 dan Er B1.7a masing-masing termasuk dalam genus Brevibacterium dan
Aeromonas.
Kata kunci: rhizobakteria, produksi AIA, toleran salinitas

ABSTRACT
KHARISMA PANJI RAMADHAN. Screening and Identification of Indole Acetic
Acid-Producing Rice Rhizobacteria in Saline Condition. Supervised by I MADE
ARTIKA and DWI NINGSIH SUSILOWATI.
Increased salinity in farmland due to the rising sea level have an impact on
ion balance, an increased of ethylene in roots, caused of hypo-osmotic condition
in roots, and finally hinder the growth of root. Utilization of indigen rhizobacteria
with ability to produce growth phytohormone indole-3-acetic acid (IAA) could
become one of solution of this problem. This research aims to screening a number
of rhizobacteria which have ability of producig phytohormone IAA and tolerant of
salinity stress. A total of 48 rhizobacteria isolates from coastal rice field of

Patimban and Eretan, west Java have been analyzed. Isolates Er B1.3 and Er
B1.7a have ability to grow on minimal salt medium content with 15 % NaCl. Both
isolates are still capable of producing IAA with consecutive concentrations at 11
ppm and 3.1 ppm on minimal medium salt content with 10 % NaCl. IaaM gene
identification results prove that isolates Er B1.3 and Er B1.7a producing IAA
through the IAM pathway. Based on the result of sequencing 16S Rrna gene
known that isolate Er B1.3 and Er B1.7a belong to genus Brevibacterium and
Aeromonas, respectively.
Keyword: rhizobacteria, IAA production, salinity stress tolerance

PENAPISAN DAN IDENTIFIKASI BAKTERI RHIZOSFER
PADI PENGHASIL ASAM INDOL ASETAT
PADA KONDISI SALIN

KHARISMA PANJI RAMADHAN

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada

Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Judul Skripsi : Penapisan dan Identifikasi Bakteri Rhizosfer Padi Penghasil Asam
Indol Asetat pada Kondisi Salin
Nama
: Kharisma Panji Ramadhan
NIM
: G84100031

Disetujui oleh

Dr Ir I Made Artika, MappSc
Pembimbing I

Dwi Ningsih Susilowati, STP MSi
Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan November 2013 ini adalah Penapisan
dan Identifikasi Bakteri Rhizosfer Padi Penghasil Asam Indol Asetat pada Kondisi
Salin.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Ir I Made Artika, MappSc
dan Ibu Dwi Ningsih Susilowati, STP MSi selaku pembimbing yang telah banyak
memberikan pengarahan dan saran. Di samping itu, penghargaan penulis

sampaikan kepada Bapak Jajang, Bapak Ughi dan Ibu Aminah beserta seluruh staf
Laboratorium Mikrobiologi Konservasi Mikroorganisme BB-Biogen yang telah
membantu selama pengumpulan data penelitian. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada Ayah, Ibu, Adik, sahabat dekat, serta teman-teman Biokimia
angkatan 47 untuk segala doa, kasih sayang dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2015

Kharisma Panji Ramadhan

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

viii

DAFTAR LAMPIRAN

viii

PENDAHULUAN

1

METODE

2

Bahan dan alat

2

Metode Penelitian

2

HASIL

6

Kemampuan Isolat Bakteri Rhizosfer dalam Produksi AIA

6

Toleransi Isolat Bakteri Rhizosfer terhadap Salinitas

7

Produksi AIA dalam Media Salin

9

Amplikon Gen IaaM

9

Isolat Bakteri Rhizosfer Hasil identifikasi
PEMBAHASAN

10

10

Kemampuan Isolat Bakteri Rhizosfer dalam Produksi AIA

10

Toleransi Salinitas dan Analisis Produksi AIA dalam Media Salin

11

Amplikon Gen IaaM

12

Isolat Bakteri Rhizosfer Hasil Identifikasi

13

SIMPULAN DAN SARAN

13

Simpulan

13

Saran

14

DAFTAR PUSTAKA

14

LAMPIRAN

16

RIWAYAT HIDUP

28

DAFTAR GAMBAR
1 Isolat bakteri rhizosfer padi yang mampu tumbuh pada konsentrasi
NaCl 10 %
2 Isolat bakteri rhizosfer padi yang mampu tumbuh pada konsentrasi
NaCl 15 %
3 Produksi AIA isolat Er B1.7a dan Er B1.3 pada media salin dengan
kandungan NaCl dibandingkan dengan kontrol tanpa NaCl
4 Amplikon hasil PCR gen IaaM
5 Lintasan sintesis AIA pada sel bakteri

8
8
9
10
12

DAFTAR TABEL
1 Konsentrasi AIA yang diproduksi oleh isolat bakteri sampel
2 Daya tumbuh isolat bakteri sampel pada media salin
3 Hasil analisis sekuens 16S rRNA sampel unggul dengan
menggunakan program blast n

6
7
10

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5

Isolat bakteri rhizosfer yang digunakan dalam penelitian
Diagram alir penelitian
Perhitungan konsentrasi AIA pada analisis kuantitatif produksi AIA
Uji toleransi salinitas
Perhitungan konsentrasi AIA pada analisis kuantitatif produksi AIA
pada media salin
6 Konsentrasi dan kemurnian DNA isolat Er B1.7a dan isolat Er B1.3
7 Sekuens gen 16S rRNA isolat Er B1.3 dan isolat Er B1.7a

16
17
18
23
25
26
27

PENDAHULUAN
Perubahan iklim akibat pemanasan global (global warming) menjadi salah
satu tantangan besar yang harus dihadapi warga bumi pada milenium ketiga ini.
Berdasarkan hasil kajian The Intergovernmental Panel on Climate Change
(IPCC 2013) menunjukkan bahwa lapisan es abadi di benua antartika terpantau
menurun selama periode 1979 sampai 2012 dengan laju penurunan 0.73 - 1.07
km2/dekade. Penurunan lapisan es ini berdampak pada kenaikan permukaan air
laut global yang meningkat dengan laju rata-rata 2.0 mm/tahun dalam kurun
waktu tahun 1971 - 2010. Kenaikan total permukaan air laut yang berhasil dicatat
pada abad ke-20 diperkirakan mencapai 0.17 m. Kenaikan permukaan air laut ini
berdampak serius pada sektor pertanian, khususnya subsektor tanaman pangan
yang ditanam di wilayah pesisir.
Pesisir pantai utara Pulau Jawa berperan sebagai salah satu lumbung padi
nasional. Padi yang diproduksi di Pulau Jawa tercatat mencapai 37 juta ton dari
total produksi padi nasional sebesar 71 juta ton atau berkontribusi sekitar 52.6 %
terhadap produksi padi nasional (BPS 2013). Tingginya produktivitas padi di
Pulau Jawa tidak lepas dari peranan kabupaten serta kota di wilayah pesisir yang
bertindak sebagai sentra produksi beras seperti Indramayu, Subang, Cirebon, serta
beberapa kabupaten lain di wilayah pantai utara Pulau Jawa. Peningkatan salinitas
lahan pertanian pesisir tentunya akan berdampak serius pada produktivitas
kabupaten serta kota yang bertindak sebagai sentra produksi beras tersebut.
Peningkatan kandungan NaCl dalam tanah mengakibatkan peningkatan
konsentrasi etilen pada akar, gangguan keseimbangan ion, serta menimbulkan
kondisi hipo osmotik pada akar tanaman. Dampak yang timbul pada akhirnya
adalah terhambatnya pertumbuhan akar tanaman (Ahmad et al. 2013). Kandungan
garam dalam tanah pertanian dapat dihilangkan dengan rehabilitasi lahan secara
kimiawi, namun hal ini tidak efisien dan tidak ekonomis bila diterapkan pada
lahan salin yang luas (Rajput et al. 2013). Strategi lain yang mungkin dilakukan
untuk mengatasi gangguan pertumbuhan tanaman akibat cekaman lingkungan
salin adalah perakitan secara genetik serta penanaman varieatas padi dengan
kemampuan toleran salin, namun tentunya upaya perakitan tanaman ini
membutuhkan penelitian yang lama. Solusi lain yang dapat dilakukan untuk
mengatasi masalah ini salah satunya dengan pengaplikasian rhizobakteria pemacu
tumbuh tanaman (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) dengan kemampuan
produksi hormon pertumbuhan asam indol asetat (AIA) serta toleran salin dari
wilayah setempat (mikrob indigen) (Jha et al. 2012). Upaya pengaplikasian
rhizobakteria dengan kemampuan tersebut diharapkan mampu mengurangi
dampak cekaman salinitas pada tanaman dengan menstimulasi pembelahan,
pembesaran, serta diferensiasi sel sehingga dapat meningkatan pertumbuhan area
perakaran tanaman yang terhambat akibat cekaman kandungan NaCl yang tinggi
pada tanah.
Penelitian ini bertujuan melakukan seleksi serta identifikasi sejumlah isolat
rhizobakteria tanaman padi asal tanah pesisir pantai utara Pulau Jawa yang
toleran kondisi salin (halotoleran) dan mampu menghasilkan fitohormon auksin
(AIA). Penggalian potensi isolat rhizobakteria ini diharapkan mampu memberikan

2
kontribusi bagi pertanian di lahan pesisir guna mengantisipasi dampak
peningkatan muka air laut akibat perubahan iklim.

METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu isolat bakteri
rhizosfer koleksi Biogen Culture Collection (Biogen CC) Balai Besar Penelitian
dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB
Biogen) dan InaCC (Indonesian Culture Collection) Lembaga Ilmu Pengetahuan
Indonesia (lampiran 1), FeCl3, air deionisasi, HClO4 35 %, larutan stok asam
indol asetat (AIA), NaCl, pepton, beef extract, KH2PO4, Na2HPO4, MgSO4·7H2O,
CaCl2·2H2O, FeSO4·7H2O, MnSO4·H2O, CuSO4·5H2O, ZnSO4·7H2O, H3BO3,
CoCl2·6H2O, Na2MoO4·H2O, H2SO4, akuades, glukosa, L-triptofan, ekstrak
khamir, kit lisis sel, primer spesifik gen IaaM (primer TMOr dan primer TMOf),
DNA polymerase (Go Taq Green Master Mix-Promega), loading dye 6x, dan
marker ladder 100 bp. Adapun alat-alat yang digunakan antara lain
spektrofotometer, alat-alat gelas, neraca analitik, sentrifus, pipet mikro, mesin
PCR, freezer, microwave, laminar air flow, pengaduk magnetik, vortex, autoklaf,
waterbath, orbital shaker, sentrifus, elektroforesis gel agarosa, dan UVTransiluminator.
Metode Penelitian
Secara garis besar penelitian ini terbagi menjadi beberapa tahap, yaitu
analisis kuantitatif produksi AIA, uji salinitas, analisis kuantitatif produksi AIA
pada media salin, isolasi DNA, identifikasi gen IaaM, amplifikasi gen 16S rRNA
dan identifikasi isolat.
Analisis Kuantitatif Produksi AIA (Gupta et al. 2012)
Analisis kuantitatif produksi AIA diawali dengan tahap persiapan dengan
pembuatan media dan larutan yaitu media Soil Extract Agar (SEA), media
Nutrient Broth M-26, larutan L-triptofan, dan media minimal salt. Setelah tahap
persiapan selanjutnya dilakukan tahap analisis yang diawali dengan peremajaan
isolat bakteri, pembuatan kurva standar, kemudian dilanjutkan tahap analisis
kuantitatif. Prinsip analisis kuantitatif produksi AIA adalah reaksi yang terjadi
antara pereaksi Salper yang mengandung FeCl3 dan HClO4 dengan asam indol
asetat sehingga terjadi perubahan warna asam indol asetat yang tidak berwarna
menjadi produk reaksi yang berwarna merah muda. Nilai absorbansi pada panjang
gelombang 530 nm dari produk reaksi akan berbanding lurus dengan konsentrasi
asam indol asetat sehingga dapat ditentukan konsentrasi asam indol asetat dalam
sampel.
Tahap Persiapan
Pembuatan Media Soil Extract Agar (SEA). Sebanyak 17 gram soil
extract agar dilarutkan dengan 500 ml akuades kemudian dituangkan ke dalam
tabung reaksi dengan volume masing-masing 5 ml dan disterilisasi pada suhu
121 oC dan tekanan 1 Atm selama 15 menit dengan piranti autoklaf.

3
Pembuatan Media Nutrient Broth M-26 (NB-M26) (Miliute dan Buzaite
2011). Sebanyak 5 g NaCl, 10 g pepton, 10 g beef extract dilarutkan dengan
akuades hingga volume satu liter kemudian diaduk dengan pengaduk magnetik.
Media tersebut lalu dimasukkan ke dalam botol kaca kecil dengan volume
masing-masing botol kaca sebanyak 10 ml dan disterilisasi pada suhu 121 oC dan
tekanan 1 Atm selama 15 menit dengan autoklaf.
Pembuatan Larutan L-Triptofan (Gupta et al. 2012). Sebanyak 10 g
glukosa, satu gram L-triptofan dan 0.1 g ekstrak khamir dilarutkan dengan
akuades steril hingga mencapai volume akhir 100 mL kemudian disterilkan
dengan milipore 0.2 m.
Pembuatan Media Minimal Salt (Gupta et al. 2012). Seberat 1.36 g
KH2PO4, 2.13 g Na2HPO4, 0.2 g MgSO4·7H2O, dan 10 ml larutan trace element
dilarutkan dengan satu liter akuades kemudian dimasukkan dalam botol kaca kecil
dengan volume masing-masing 9 ml. Larutan trace element terbuat dari 700 mg
CaCl2·2H2O, 300 mg FeSO4·7H20, 20 mg MnSO4·H20, 40 mg CuSO4·5H2O, 20
mg ZnSO4·7H2O, 3 mg H3BO3, 7 mg CoCl2·6H2O, 4 mg Na2MoO4·H2O, dan 1
ml H2SO4 yang dilarutkan dalam akuades hingga volume akhir tepat satu liter.
Media minimal salt yang telah dimasukkan dalam botol kaca kecil lalu disterilkan
dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit. Setelah dingin, media
minimal salt tersebut ditambahkan 1 ml larutan L-triptofan pada tiap botol kaca.
Tahap Analisis
Peremajaan Isolat Bakteri. Sebanyak satu ose isolat bakteri diambil
kemudian digoreskan di atas media SEA. Kultur bakteri dalam media SEA
tersebut diinkubasi pada suhu 27 oC selama 3 hari.
Pembuatan Kurva Standar. Kurva standar dibuat dengan cara melarutkan
larutan stok AIA dengan akuades sehingga konsentrasi larutan stok AIA menjadi
0.2, 1, 5, 15, 25, 35, dan 45 ppm dengan volume masing-masing 2 mL. Larutan
stok AIA tersebut ditambahkan 4 mL pereaksi Salper dan dikocok dengan vortex
lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 25 menit. Larutan tersebut lalu dibaca
nilai absorbansinya pada panjang gelombang 530 nm kemudian dibuat persamaan
hubungan antara konsentrasi AIA dengan nilai absorbansi larutan pada panjang
gelombang 530 nm.
Analisis Kuantitatif. Analisis kuantitatif dilakukan dengan metode
Gupta et al. (2012). Sebanyak satu ose koloni bakteri yang telah diremajakan
dimasukkan dalam media NB M-26, kemudian diinkubasi di atas orbital shaker
dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang selama 24 jam. Sebanyak 100 L
kultur bakteri tersebut selanjutnya dipipet dan dipindahkan ke media minimal salt
kemudian diinkubasi di atas orbital shaker dengan kecepatan 120 rpm selama 48
jam.
Setelah melalui proses inkubasi 48 jam, kultur bakteri dalam media minimal
salt tersebut diambil sebanyak 3 mL untuk dimasukkan dalam tabung Eppendorf
steril dan disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm dengan suhu 4 oC selama 10
menit. Supernatan dari hasil sentrifugasi dipisahkan dari peletnya. Sebanyak 2 mL
supernatan tersebut dipipet ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 4 mL
pereaksi Salper dan dikocok dengan vortex lalu diinkubasi pada suhu ruang
selama 25 menit. Pereaksi Salper dibuat dengan melarutkan 0.5 M FeCl3 dengan
50 mL HClO4 35 %. Setelah proses inkubasi selesai, campuran tersebut dibaca
nilai absorbansinya pada panjang gelombang 530 nm. Nilai absorbansi yang

4
terbaca kemudian disubstitusikan ke dalam kurva standar sehingga konsentrasi
AIA dalam sampel dapat diketahui.
Uji Toleransi Salinitas (modifikasi Gupta et al. 2012)
Uji toleransi salinitas diawali dengan pembuatan media minimal salt padat
dengan kandungan NaCl bervariasi, kemudian dilakukan analisis toleran salinitas
dengan menumbuhkan isolat bakteri sampel pada media minimal salt tersebut.
Pembuatan Media Minimal Salt Padat (modifikasi Gupta et al. 2012).
Seberat 1.36 g KH2PO4, 2.13 g Na2HPO4, 0.2 g MgSO4·7H2O, 10 ml larutan trace
element, dan 10 g Bacto agar dilarutkan dengan akuades hingga volume akhir 1
liter kemudian dimasukkan dalam botol kaca kecil dengan volume masing-masing
9 ml. Media minimal salt ini ditambahkan NaCl dengan variasi konsentrasi 0, 10,
dan 15 %. Media minimal salt tersebut kemudian disterilkan dengan autoklaf
pada suhu 121 oC selama 15 menit. Sebanyak 100 mL larutan L-triptofan
ditambahkan pada media minimal salt steril kemudian dikocok perlahan dan
dituangkan dalam cawan Petri steril.
Analisis Toleransi Salinitas. Sebanyak satu ose koloni bakteri yang telah
diremajakan pada media SEA dimasukkan dalam media NB M-26, kemudian
diinkubasi di atas orbital shaker dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang
selama 24 jam. Sebanyak 5 L kultur bakteri tersebut selanjutnya diambil dan
diteteskan ke atas media minimal salt padat berkonsentrasi 0, 10, dan 15 %
kemudian diinkubasi di atas orbital shaker dengan kecepatan 120 rpm selama 48
jam. Setelah melalui proses inkubasi, dilakukan pengamatan terhadap koloni
bakteri yang tumbuh di atas media minimal salt tersebut.
Analisis Produksi AIA dalam Media Salin (Modifikasi Frankenberg dan
Poth 1988 dalam Gupta et al. 2012).
Pembuatan Media Minimal Salt Salin (Gupta et al. 2012). Seberat 1.36 g
KH2PO4, 2.13 g Na2HPO4, 0.2 g MgSO4·7H2O, dan 10 ml larutan trace element
dilarutkan dengan akuades hingga volume akhir 1 liter. Media minimal salt ini
ditambahkan NaCl dengan variasi konsentrasi 0, 10, dan 15 %. Media minimal
salt tersebut kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15
menit. Setelah dingin, media minimal salt tersebut ditambahkan 1 mL larutan
L-triptofan pada tiap botol kaca.
Analisis Kuantitatif AIA. Analisis kuantitatif AIA dilakukan dengan
metode modifikasi Gupta et al. (2012) sesuai dengan prosedur yang telah
diuraikan di atas namun media minimal salt digunakan disubstitusi dengan media
minimal salt salin.
Identifikasi Gen IaaM (Kochar et al. 2009)
Isolasi DNA. Isolasi DNA dilakukan dengan kit (Wizard DNA Genome
Purification Kit-Promega). Satu lup isolat bakteri diambil dan dimasukkan ke
dalam media NB kemudian diinkubasi di atas orbital shaker pada suhu ruang
selama 24 jam dengan kecepatan 120 rpm. Sebanyak 1.5 mL kultur bakteri yang
telah diinkubasi dituangkan ke dalam tabung Eppendorf untuk disentrifugasi
dengan kecepatan 8000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oC. Supernatan yang
terbentuk dibuang dan peletnya disimpan untuk proses berikutnya. Pelet yang
merupakan bakteri Gram positif ditambahkan EDTA 50 mM sebanyak 480 L

5
dan lisozim 10 mg/mL sebanyak 100 L kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC
selama 60 menit. Setelah diinkubasi, campuran tersebut disentrifugasi dengan
kecepatan 14.000 g kemudian dibuang supernatannya. Pelet dari hasil sentrifugasi
disimpan untuk tahap lisis sel.
Bakteri dengan Gram negatif langsung masuk ke tahap lisis sel. Pada tahap
lisis sel baik bakteri Gram positif maupun bakteri Gram negatif diberi nuclei lysis
solution sebanyak 600 L kemudian dikocok perlahan menggunakan pipet mikro.
Campuran tersebut lalu diinkubasi di atas waterbath selama 5 menit pada suhu
80 oC dan didiamkan pada suhu kamar hingga suhunya mendingin. Setelah cukup
dingin ditambahkan RNAse solution mix sebanyak 2 L kemudian diinkubasi
kembali pada suhu 37 oC selama 30 menit untuk masuk ke tahap presipitasi
protein.
Setelah diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit, campuran tersebut
diberi protein precipitation solution sebanyak 200 L lalu diinkubasi di penangas
es selama 5 menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14000 g selama 3
menit. Supernatan yang terbentuk pasca sentrifugasi dimasukkan ke isopropanol
absolut 600 L lalu disentrifugasi kembali dengan kecepatan 14000 g selama 2
menit dan diambil supernatannya. Supernatan tersebut ditambahkan etanol 70 %
sebanyak 600 L dan disentrifugasi pada kecepatan 14000 g selama 2 menit.
Setelah disentrifugasi, supernatan dibuang dan peletnya dikeringkan di udara
selama 15 menit kemudian disuspensi kembali dengan 20 L rehydration solution
dan disimpan dalam freezer (Kochar et al. 2009).
Analisis Kuantitatif DNA dengan Nanodrop. Sebanyak 2 L larutan TE
dipipet ke dalam lubang ukur kemudian nanodrop ditutup dan tombol read blank
pada komputer ditekan. Buffer TE yang tersisa dibersihkan dengan kertas tissue.
Sampel DNA dipipet sebanyak 2 L ke dalam lubang ukur, kemudian menu read
sample diklik. Hasil pengukuran berupa nilai konsentrasi DNA akan muncul
dalam satuan ng/ L. Kemurnian DNA dapat dilihat berdasarkan nilai nisbah nilai
absorbansi DNA pada 260 nm dengan nilai absorbansi DNA pada 280 nm
(Thermo Fisher Scientific 2009).
Identifikasi Gen IaaM dengan PCR (Kochar et al. 2011). Gen IaaM
diamplifikasi
menggunakan
primer
spesifik
untuk
yaitu
TMOf
(5’TATCTCGAGCCGTTAAAAGGTGCTGTTTCA’3)
dan
TMOr
(5’ATATCTAGATAGCGATAGGAGGCGTTGAT’3). Volume akhir yang
digunakan untuk PCR yaitu 25 µL. Komposisi reaksi PCR yang digunakan antara
lain Go Taq DNA polimerase 12.5 µL, primer reverse 1 µL, primer forward 1µL,
ddH2O 8.5 µL dan DNA hasil isolasi 2 µL.
Proses amplifikasi dilakukan dengan suhu denaturasi 94 oC selama 5 menit;
suhu annealing 94 oC selama 30 detik, 50 oC selama 30 detik, 72 oC selama
1 menit; tahap annealing dilakukan sebanyak 10 siklus. Tahap ekstensi dilakukan
pada suhu 94 oC selama 30 detik, 55 oC selama 30 detik, 72 oC selama 1 menit;
tahap ekstensi ini dikerjakan sebanyak 30 siklus. Tahap ekstensi diakhiri pada
suhu 72 oC selama 7 menit, 40 oC selama 5 menit, dan 16 oC selama 10 menit.
DNA hasil amplifikasi divisualisasi menggunakan elektroforesis gel agarosa 1 %.
Terlihatnya pita DNA yang berukuran ±148 pb (Sutini 2008) menandakan
indikasi adanya gen IaaM pada isolat bakteri tersebut.

6
Identifikasi Isolat (Jha et al. 2012)
Amplifikasi gen 16S rRNA. Gen penyandi 16S rRNA diamplifikasi dengan
metode PCR menggunakan primer 63F (5’CAGGCCTAACACATGCAAGTC’3)
dan 1387R (5’GGGCGGWGTGTACAAGGC’3). Komposisi reaksi PCR yang
digunakan antara lain Go Taq DNA polimerase 12.5 µL, primer reverse 1 µL,
primer forward 1µL, ddH2O 8.5 µL dan DNA hasil isolasi 2 µL.
Proses amplifikasi dilakukan dengan suhu denaturasi 94 oC selama 5 menit;
suhu annealing 94 oC selama 30 detik, 50 oC selama 30 detik, 72 oC selama
1 menit. Tahap annealing dilakukan sebanyak 10 siklus. Tahap ekstensi dilakukan
pada suhu 94 oC selama 30 detik, 55 oC selama 30 detik, 72 oC selama 1 menit;
tahap ekstensi ini dikerjakan sebanyak 30 siklus. Tahap ekstensi diakhiri pada
suhu 72 oC selama 7 menit, dan 15 oC selama 5 menit. DNA hasil amplifikasi
divisualisasi menggunakan elektroforesis gel agarosa 1 %. Terlihatnya pita DNA
yang berukuran ±1500 pb menandakan gen 16S rRNA telah teramplifikasi
(modifikasi Jha et al. 2012).
Sekuensing gen 16S rRNA. Sekuensing dilakukan melalui jasa perusahaan
sekuensing 1st Base Malaysia. Sekuens DNA selanjutnya disejajarkan dengan data
base dari GeneBank menggunakan blast n dari situs NCBI (National Center for
Biotechnology Information) melalui http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (modifikasi Jha
et al. 2012).

HASIL
Kemampuan Isolat Bakteri Rhizosfer dalam Produksi AIA
Hasil dari analisis kuantitatif produksi AIA dari empat puluh delapan
isolat bakteri rhizosfer seperti ditunjukkan pada Tabel 1. Seluruh isolat yang
dianalisis mampu menghasilkan AIA dengan konsentrasi yang beragam antara
2.32 ± 0.14 ppm hingga 109 ± 0.99 ppm. Isolat dengan produksi AIA terendah
yaitu isolat dengan kode Er B2.4, sedangkan isolat dengan produksi AIA tertinggi
yaitu isolat dengan kode Er B2.8. Berdasarkan hasil analisis produksi AIA ini
dipilih 12 isolat dengan produksi AIA tinggi untuk diuji daya tumbuhnya pada
media dengan kadar garam tinggi melalui uji toleransi salinitas.
Tabel 1 Konsentrasi AIA yang diproduksi oleh isolat bakteri sampel
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Kode
Sampel
Er B1.1
Er B1.2
Er B1.3*
Er B1.4
Er B1.5
Er B1.6
Er B1.7a*
Er B1.9*
Er B2.1

Konsentrasi
AIA (ppm)
6.95 ± 0.91
13.95 ± 0.15
49.64 ± 0.07
23.72 ± 0.78
7.14 ± 0.48
14.99 ± 0.45
85.40 ± 0.23
79.85 ± 0.82
25.19 ± 0.79

No.

10
11
12
13
14
15
16

17
18

Kode
Sampel
Er B2.2
Er B2.3
Er B2.4
Er B2.5
Er B2.8*
Er B2.9
Er B2.10*
Er B2.11
Er B2.12*

Konsentrasi
AIA (ppm)
28.35 ± 0.56
13.03 ± 0.04
2.32 ± 0.14
10.39 ± 0.16
109.34 ± 0.99
8.99 ± 0.08
41.34 ± 0.10
3.10 ± 0.04
36.06 ± 0.20

7

Tabel 1 Konsentrasi AIA yang diproduksi oleh isolat bakteri sampel (lanjutan)
Konsentrasi
No.
AIA (ppm)
38.04 ± 0.79
34
19
12.82 ± 0.23
35
20
12.59 ± 0.17
36
21
7.24 ± 0.22
37
22
38
26.95 ± 0.45
23 Er B3.4
39
27.29 ± 0.19
24 Er B3.5
40
7.24 ± 0.00
25 Er B3.6
41
11.39 ± 0.00
26 Er B3.7
42
23.79 ± 0.40
27 Er B3.8
43
40.69 ± 1.62
28 Er B3.10*
44
46.09 ± 0.90
29 Er B3.12*
45
8.99 ± 0.47
30 Er B3.14
31 Er B3.15
28.07 ± 0.83
46
32 Ptb B1.3*
85.40 ± 0.17
47
33 Ptb B1.4
8.22 ± 0.40
48
*
Dua belas isolat dengan produksi AIA tinggi
No.

Kode
Sampel
Er B2.13*
Er B2.14
Er B3.1
Er B3.3

Kode
Sampel
Ptb B2.3*
Ptb B2.4
Ptb B2.8
Ptb B2.9
Ptb B2.10
Ptb B2.11
Ptb B2.12
Ptb B3.1
Ptb B3.2
Ptb B3.3
Ptb B3.5*
Ptb B3.6
Ptb B3.8
Ptb B3.9
Ptb B3.10

Konsentrasi
AIA (ppm)
40.72 ± 0.47
3.14 ± 0.05
12.78 ± 0.10
4.00 ± 0.18
8.95 ± 0.40
16.17 ± 0.08
11.24 ± 0.13
8.42 ± 0.35
11.49 ± 2.03
3.31 ± 0 .05
38.04 ± 0.10
12.82 ± 0.25
12.59 ± 0.65
7.24 ± 0.18
26.95 ± 1.96

Toleransi Isolat Bakteri Rhizosfer terhadap Salinitas
Uji toleransi salinitas dilakukan dengan menginokulasikan dua belas isolat
bakteri rhizosfer di atas media padat dengan kandungan NaCl 0, 10, dan 15 %.
Daya tumbuh dari isolat-isolat bakteri tersebut ditandai dengan terbentuknya
koloni bakteri berwarna putih seperti yang terlihat pada Gambar 1 dan Gambar 2.
Hasil uji toleransi salinitas ini disajikan pada Tabel 2. Seluruh isolat dapat tumbuh
dengan subur pada media dengan konsentrasi NaCl 0 %. Media dengan
konsentrasi NaCl 10 % terlihat 4 isolat bakteri yang masih mampu tumbuh dengan
komposisi 2 isolat bakteri tumbuh dengan subur dan 2 isolat bakteri lain tumbuh
dengan daya tumbuh sedang. Namun media dengan konsentrasi NaCl 15 % hanya
2 isolat bakteri yang tumbuh, masing-masing dengan daya tumbuh sedang dan
daya tumbuh subur. Dua isolat yang masih mampu tumbuh pada media dengan
kandungan NaCl 15 % inilah yang terpilih untuk dianalisis pada tahap-tahap
selanjutnya.
Tabel 2 Daya tumbuh isolat bakteri sampel pada media salin
No.
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Kode Isolat
Er B2.8
Er B1.7a
Er B1.9
Er B1.3
Ptb B3.8
Er B3.12

Daya Tumbuh Pada Media Salin*
0 %NaCl
10 %NaCl
15 %NaCl
+++++
+++++
++++
++++
+++++
+++++
++++
+++
+++++
+++++
-

8
Tabel 2 Daya tumbuh isolat bakteri sampel pada media salin (lanjutan)
Daya Tumbuh Pada Media Salin*
0 %NaCl
10 %NaCl
15 %NaCl
7.
Er B2.10
+++++
+++
8.
Ptb B2.3
+++++
9.
Er B3.10
+++++
10.
Er B2.13
+++++
11.
Er B2.12
+++++
+++
12.
Ptb B3.10
+++++
Keterangan= (+++++): tumbuh sangat subur, (++++): tumbuh subur,
(+++): tumbuh sedang (++): tumbuh sedikit, (+): tumbuh sangat sedikit
(-): tidak mampu tumbuh
No.

*

Kode Isolat

Koloni bakteri

Gambar 1 Isolat bakteri rhizosfer padi yang mampu tumbuh pada media dengan
konsentrasi NaCl 10 % (keterangan: 2= Er B1.7a, 4= Er B1.3, 7= Er
B2.10 11= Er B2.12)

Gambar 2 Isolat bakteri rhizosfer padi yang mampu tumbuh pada media dengan
konsentrasi NaCl 15 % (keterangan: 2= Er B1.7a, 4= Er B1.3)

9
Produksi AIA dalam Media Salin
Tahap analisis produksi AIA dalam media salin dilakukan untuk mengetahui
konsistensi isolat dalam memproduksi AIA saat tumbuh pada media salin.
Berdasarkan hasil analisis pada Gambar 3, isolat Er B1.7a dan isolat Er B1.3
menghasilkan AIA dengan konsentrasi masing-masing 85.55 ppm dan 49.45 ppm.
Penurunan produksi AIA secara drastis terjadi pada kedua isolat pada konsentrasi
NaCl 10 % menjadi 11.55 ppm untuk isolat Er B1.7a dan 3.1 ppm untuk isolat
Er B1.3. Baik isolat Er B1.7a maupun isolat Er B1.3 tidak mampu lagi
menghasilkan AIA pada media dengan kadar garam 15 %.
85.55

49.45

11.55

3.1

0

0

Gambar 3 Produksi AIA isolat Er B1.7a dan Er B1.3 pada media salin
Amplikon Gen IaaM
Identifikasi gen IaaM dilakukan dengan metode PCR menggunakan
primer spesifik TMOf dan TMOr. Hasil positif ditandai dengan munculnya pita
tunggal DNA dengan ukuran ~148 bp. Berdasarkan elektroforegram hasil PCR
pada Gambar 4, terlihat bahwa baik isolat Er B1.7a maupun isolat Er B1.3
keduanya menghasilkan pita tunggal DNA yang berukuran ~148 bp. Oleh karena
itu, kedua isolat tersebut terindikasi memiliki gen IaaM.
M

1

2

3000 bp

1000 bp
500 bp
200 bp

~148 bp

Gambar 4 Amplikon hasil PCR gen IaaM (M= Marker ladder 100 bp , 1= Er 1.7a,
2= Er B1.3)

10
Isolat Bakteri Rhizosfer Hasil Identifikasi
Hasil identifikasi pada Tabel 3, terlihat bahwa isolat Er B1.3 memiliki
persentase keidentikan hampir 100 % dengan lima bakteri genus Brevibacterium,
sedangkan isolat Er B1.7a juga memiliki persentase keidentikan hampir 100 %
pula dengan lima bakteri genus Aeromonas. Berdasarkan nilai presentase
keidentikan ini, maka diketahui bahwa isolat dengan kode Er B1.3 dan Er B1.7a
masing-masing termasuk dalam bakteri genus Brevibacterium dan Aeromonas.
Tabel 3 Hasil identifikasi isolat Er B1.3 dan isolat Er B1.7a
Isolat
Er B1.3

Er B1.7a

Sekuens bakteri homolog (NCBI)
Brevibacterium epidermidis strain
XJNKY-12-YXX2
Brevibacterium linens strain 15D
Brevibacterium iodinum strain
WHYN13
Brevibacterium aureum strain ZT1
Brevibacterium permense strain
VKM Ac-2280
Aeromonas dhakensis strain MSSRF
P104
Aeromonas jandaei strain MSSRF
P44
Aeromonas hydrophila strain N27
Aeromonas caviae strain MSSRF P12
Aeromonas veronii strain MSSRF P4

Persentase
Keidentikan
98 %

JQ975950.1

98 %
98 %

JF792081.1
KF444388.1

98 %

KF002251.1

97 %

NR025732.1

99 %

KJ877660.1

99 %

KJ877657.1

99 %
99 %
99 %

KJ650078.1
KJ877655.1
KJ877653.1

No. Aksesi

PEMBAHASAN
Kemampuan Isolat Bakteri Rhizosfer dalam Produksi AIA
Analisis AIA dilakukan dengan metode kolorimetri, berdasarkan
perubahan warna AIA ketika ditambahkan dengan pereaksi Salper dari tidak
berwarna menjadi berwarna merah muda setelah diinkubasi selama 25 menit.
Analisis AIA dengan metode ini mempunyai beberapa keunggulan, yaitu mudah,
cepat, dan dapat dikerjakan untuk menganalisis sampel dalam jumlah banyak.
Konsentrasi AIA yang diproduksi oleh isolat bakteri sampel masih tergolong
rendah bila dibandingkan dengan AIA yang dihasilkan dari Azospirillum sp. yang
mencapai 160 ppm. Azospirillum sp. merupakan salah satu bakteri pemacu
tumbuh tanaman yang telah dikenal dapat meningkatkan pertumbuhan serta
produktivitas berbagai tanaman pertanian (Bashan 2008).
Asam indol asetat (AIA) merupakan auksin utama pada tanaman dan
terdapat pada hampir semua jenis tanaman. Auksin memiliki peranan penting
sebagai hormon tanaman yang mengatur beragam proses fisiologis, proliferasi
akar, diferensiasi sel serta pertumbuhan tunas (Nimnoi dan Pongsilp 2009). Selain

11
tanaman, lebih dari 80 % bakteri rhizosfer juga dilaporkan dapat memproduksi
auksin (Khalid et al. 2004).
Bakteri rhizosfer dengan kemampuan produksi fitohormon auksin telah
dilaporkan mampu meningkatkan toleransi tanaman terhadap cekaman salinitas.
Lingkungan dengan salinitas tinggi akan merangsang tanaman untuk
memproduksi hormon etilen (hormon pemacu stres pada tanaman) yang salah satu
dampaknya akan menghambat perkembangan akar tanaman (Siddikee et al. 2010).
AIA yang dihasilkan oleh bakteri rhizosfer akan meningkatkan panjang dan
permukaan akar tanaman sehingga tanaman tersebut akan mendapatkan akses
yang lebih baik terhadap nutrisi-nutrisi yang tersedia di tanah. Selain itu AIA
tersebut juga akan melonggarkan sel-sel pada dinding akar tenaman sehingga
eksudat-eksudat yang berperan sebagai nutrisi bagi bakteri rhizosfer akan lebih
mudah diserap oleh bakteri rhizosfer yang berada di sekitar tanaman (Glick 2012).
Toleransi Salinitas dan Analisis Produksi AIA pada Media Salin
Uji toleransi salinitas yang dilakukan terhadap kedua belas isolat bakteri
penghasil AIA dengan konsentrasi tinggi perlu dilakukan untuk mengetahui
sejauh mana isolat-isolat bakteri tersebut mampu hidup pada lingkungan dengan
cekaman salinitas. Berdasarkan uji toleransi salinitas yang dilakukan pada kedua
belas isolat bakteri, hanya isolat bakteri dengan kode Er B1.7a dan Er B1.3 yang
masih mampu hidup bahkan pada media dengan tingkat salinitas 15 % (b/v).
Kemampuan tumbuh isolat bakteri tersebut ditandai dengan terbentuknya koloni
berwarna putih pada permukaan media.
Isolat bakteri dengan kode Er B1.7a dan Er B1.3 yang mampu tumbuh
pada media dengan salinitas 15 % tersebut dapat digolongkan menjadi bakteri
halotoleran. Bakteri halotoleran adalah kelompok bakteri yang mampu tumbuh
dalam media dengan cakupan konsentrasi NaCl yang luas (1 - 33 %), maupun
dalam media tanpa kandungan NaCl (Siddikee et al. 2010). Bakteri dengan
kemampuan tumbuh pada media dengan kandungan garam lebih dari 15 % (b/v),
atau sekitar 2.5 M, termasuk bakteri halotoleran ekstrim (Shivanand dan
Mugeraya 2011).
Bakteri halotoleran memiliki strategi unik untuk menjaga stabilitas
tekanan osmosis di dalam sel agar tidak terjadi plasmolisis saat berada pada
lingkungan salin. Bakteri halotoleran akan menstabilkan tekanan osmosis di
dalam sel dengan cara mensintesis atau mengambil molekul organik compatible
solute dari lingkungan. Molekul compatible solute ini antara lain poliol (gliserol,
gula, dan turunannya), asam amino dan turunannya, serta quarternary amine
seperti glisin betain dan ektoin (Shivanand dan Mugeraya 2011)
Hasil analisis produksi AIA yang dilakukan pada isolat Er B1.7a dan
isolat Er B1.3 menunjukkan penurunan produksi AIA seiring dengan peningkatan
konsentrasi NaCl pada media tumbuh. Penurunan produksi AIA ini juga terjadi
pada penelitian yang dilakukan oleh Dehwal dan Kumar (2013). Rhizobakteria
pemacu tumbuh tanaman Pseudomonads aeruginosa, P. putida, P. ceacia, dan P.
fluorescens mengalami penurunan produksi AIA ketika berada pada media salin
1.5 % dan terus turun hingga tidak mampu memproduksi AIA pada kondisi
salinitas 3 % (Deshwal dan Kumar 2013). Hal ini mungkin terjadi karena nutrisi
yang diserap dari media dimanfaatkan oleh sel bakteri dengan prioritas untuk

12
mensintesis molekul organik compatible solute demi mempertahankan tekanan
osmosis di dalam sel sehingga tidak terjadi plasmolisis. Enzim-enzim yang
berperan dalam produksi AIA juga tentunya akan berkurang bahkan mungkin
tidak dihasilkan oleh bakteri tersebut.
Amplikon Gen IaaM
Identifikasi gen IaaM pada isolat Er B1.7a dan Er B1.3 dilakukan dengan
metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Amplifikasi gen IaaM dilakukan
menggunakan primer spesifik TMOf dan TMOr dengan panjang masing-masing
29 nukleotida dan 30 nukleotida. Berdasarkan visualisasi amplikon pasca PCR,
terlihat pita amplikon yang berukuran ~148 bp pada kedua isolat yang
menunjukkan bahwa isolat Er B 1.7a dan isolat Er B1.3 terindikasi memiliki gen
fungsional IaaM dan mensintesis AIA melalui jalur indole-3-acetamide (IAM).
Biosintesis AIA melalui jalur IAM melibatkan 2 tahap. Tahap pertama adalah
perubahan senyawa perkursor (triptofan) menjadi indole-3-acetamide oleh TMO
(tryptophan monooxygenase) yang disandikan oleh gen IaaM dan tahap
selanjutnya yaitu perubahan indole-3-acetamide menjadi asam indol-3-asetat
(AIA) oleh indole-3-acetamide hydrolase yang disandikan oleh gen IaaH. Adapun
enzim kunci pada biosintesis AIA melalui jalur IAM adalah enzim TMO (Spaepen
et al. 2007). Gen IaaM maupun IaaH telah banyak dikarakterisasi dari bakteri
yang simbion pengikat nitrogen seperti spesies Rhizobium dan Brandyrhizobium
maupun bakteri patogen tanaman seperti Agrobacterium tumefaciens, P.
savastanoi, dan P. agglomerans (Spaepen dan Vanderleyden 2011). Berdasarkan
laporan dari Spaepan dan Vanderleyden (2013), biosintesis AIA melalui jalur
IAM banyak terjadi pada bakteri patogen tanaman seperti Agrobacteria
tumefaciens, Psudomonas syringae, dan E. herbicola. Rhizobakteria yang
bersimbiosis dengan tanaman seperti Rhizobium fredii dan Brandyrhizobium
japonicum juga dilaporkan mensintesis AIA melalui jalur IAM.
Selain melalui jalur IAM, bakteri dapat mensintesis AIA melalui beberapa
jalur (Gambar 5) yaitu jalur indole-3-piruvate (IpyA), jalur tryptamine (TAM),
jalur indole-3-acetonitrile (IAN), dan jalur oksidasi rantai samping triptofan
(TSO) (Spaepen et al. 2007). Yang et al. (2007) melaporkan bahwa pada banyak
kasus, bakteri dengan galur tertentu dapat mensintesis AIA melalui lebih dari satu
jenis jalur.

Gambar 5 Lintasan sintesis AIA pada sel bakteri (Spaepen et al. 2007)

13
Isolat Bakteri Rhizosfer Hasil Identifikasi
Sekuensing gen 16S rRNA isolat bakteri dilakukan untuk mengetahui
informasi taksonomis isolat bakteri sampel berdasarkan basis data National
Center of Biotechnology Information (NCBI). Sekuens isolat bakteri rhizosfer
unggul yang diperoleh dibandingkan dengan sekuen DNA yang tersedia pada
basis data NCBI melalui proses penyejajaran (alignment). Berdasarkan hasil
penyejajaran menunjukkan bahwa isolat dengan kode Er B1.3 termasuk dalam
genus Brevibacterium. Bakteri genus Brevibacterium hidup di berbagai habitat,
khususnya habitat dengan tingkat konsentrasi garam yang tinggi. Sebagian besar
bakteri genus ini tumbuh dengan baik di lingkungan dengan kadar NaCl 8 %, dan
banyak pula yang dapat tumbuh di lingkungan dengan konsentrasi NaCl 15 %
(Sgroy et al. 2009). Siddikee et al. (2010) melaporkan bahwa beberapa bakteri
genus Brevibacterium seperti bakteri Brevibacterium iodinum dan Brevibacterium
epidermidis termasuk bakteri yang memiliki sifat halotoleran. Inokulasi bakteri
Brevibacterium epidermidis strain RS15 dapat meningkatkan berat kering serta
perpanjangan akar tanaman canola hingga 40 % dibandingkan dengan tanaman
canola tanpa inokulasi bakteri tersebut. Brevibacterium iodinum juga dilaporkan
memiliki kemampuan menghasilkan AIA, memfiksasi nitrogen, mengoksidasi
tiosulfat, serta memproduksi amonia.
Hasil analisis sekuens 16S rRNA isolat Er B1.7a menunjukkan bahwa isolat
tersebut termasuk dalam genus Aeromonas. Bakteri dari genus Aeromonas banyak
dilaporkan bertindak sebagai agen biokontrol bagi beberapa mikroorganisme
patogen pada tanaman. Salah satu contohnya adalah Aeromonas caviae dengan
kemampuan menghasilkan kitinase yang merupakan enzim lisis sel bagi patogen
target Rhizoctonia solani yang menyerang tanaman kapas dan Sclerotium rolfsii
yang menyerang tanaman buncis (Bouizgarne 2012). Berdasarkan beberapa
penelitian terkini, beberapa bakteri dari genus ini juga dapat dimanfaatkan dalam
bioremediasi lahan pertanian dari polutan ion-ion besi (Fe). Kemampuan
bioremediasi ini terjadi karena beberapa bakteri dari genus Aeromonas dapat
menghasilkan molekul siderophore yang merupakan protein yang dapat
mengkelat polutan ion-ion besi yang berada di lingkungan
(Khan et al.
2014). Selain kemampuan biokontrol dan bioremediasi tersebut beberapa bakteri
dari genus Aeromonas, juga dilaporkan termasuk PGPR (Plant Growth Promoting
Rhizobacteria) dengan kemampuan produksi beragam fitohormon seperti asam
indol asetat, asam giberelin, dan sitokinin. Salah satu contohnya adalah
Aeromonas veroni yang mampu menghasilkan fitohormon asam indol asetat serta
sering ditemukan hidup di wilayah rhizosfer tanaman padi (Bhattacharyya dan Jha
2012).

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Berdasarkan hasil penelitian, isolat bakteri rhizosfer dengan kode Er B1.7a
dan kode Er B1.3 mampu hidup pada media salin dengan konsentrasi NaCl 15 %.
Kedua isolat tersebut dapat memproduksi hormon auksin (AIA) dengan

14
konsentrasi masing-masing 11.55 ppm dan 3.1 ppm pada media salin dengan
konsentrasi NaCl 10 %. Isolat dengan kode Er B1.7a dan kode Er B1.3 tersebut
terindikasi memproduksi AIA melalui jalur IAM. Hasil identifikasi gen 16S
rRNA menunjukkan bahwa isolat bakteri Er B1.7a termasuk dalam genus
Aeromonas sedangkan isolat bakteri Er B1.3 termasuk dalam genus
Brevibacterium.
Saran
Penelitian lebih lanjut dengan menginokulasi isolat bakteri pada tanaman
perlu dilakukan agar terlihat pengaruh AIA yang dihasilkan oleh isolat bakteri
unggul terhadap pertumbuhan tanaman. Selain itu perlu dilakukan uji
patogenisitas bakteri unggul tersebut.

DAFTAR PUSTAKA
Ahmad M, Zahir AZ, Fahreen N, Fahreeha A, M Arshad, M Khalid. 2013.
Effectiveness of halo-tolerant, auxin producing Psudomonas and Rhizobium
strains to improve osmotic stress tolerance in mung bean (Vigna radiata L.).
Brazilian Journal of Microbiology 44: 1341-1348.
[BPS] Badan Pusat Statustik. 2013. Tabel Luas Panen, Produktifitas, Produksi
Tanaman Padi Seluruh Provinsi [internet]. [diacu 2014 Agustus 20]. Tersedia
dari: http://www.bps.go.id/tnmn_pgn.php?kat=3.
Bashan LE. 2008. Involvement of indole-3-acetic acid produced by the growthpromoting bacterium Azospirillum spp. in promoting growth of Chlorella
vulgaris. J. Phycol 44:938-947.
Bhattacharyya PN, Jha DK. 2012. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR):
emergence in agriculture. World J Microbiol Biotechnol. 28:1327-1350.
Bouizgarne B. 2012. Bacteria in agrobiology: Disease management. New York:
Springer Publishing.
Deshwal VK, P Kumar. 2013. Effect of salinity on growth and PGPR activity of
Psudomonads. Journal of Academia and Industrial Research (JAIR) 2: 22785213.
Frankenberger Jr WT, Poth M. 1988. L-tryptophan transaminase of bacterium
isolated from the rhizosphere of Festuca octoflora (Gramineae). Soil Biol
Biochem 20: 299-304.
Glick BR. 2012. Plant Growth-Promoting Bacteria: Mechanisms and
Applications. Kairo: Hindawi Publishing Corporation.
Gupta M, Shashi K, Arvind G, Bikram S, Rupinder T. 2012. Isolation and
identification of phosphate solubilizing bacteria eble to enhance the growth and
aloin-A biosynthesis of Aloe barbadensis Miller. Microbiological Research
167: 358-363.
[IPCC] Intergovermental Panel on Climate Change. Climate Change 1013: The
Physical Science Basis [internet]. [diacu 20 Agustus 2014]. Tersedia dari:
http://www.ipcc.ch/report/ar5/wg1/.

15
Jha B, Gontia I, Anton H. 2012. The roots of halophyte Salicornia branchiata are
a source of new halotolerant diazotropic bacteria with plant growth-promoting
potential. Plant Soil 326: 265-277.
Khalid A, Arshad M, Zahir ZA. 2004. Screening plant growth promoting
rhizobacteria for improving growth and yield of wheat. J. Appl. Microbiol. 96:
473–480.
Khan AAH, Sadguna A, Divya V, Begum S, Naseem, Siddiqui AG. 2014.
Potential of microorganism in Clean-ip the environment. Int. J. of
Multidiclipinary and Current research 2: 2321-3124.
Kochar M, Ashutosh U, Sheela S. 2011. Indole-3-acetic acid biosynthesis in the
biocontrol strain Pseudomonas flourescens Psd and plant growth regulation by
hormone overexpression. Research in Microbiology 162: 426-435.
Miliute I, O Buzaite. 2011. IAA production and other plant growth promoting
traits of endophytic bacteria from apple tree. Biologija 57: P. 98-102.
Nimnoi P & Pongsilp N. 2009. Genetic diversity and plant-growth promoting
ability of the indole-3-acetic Acid (IAA) synthetic bacteria isolated from
agricultural soil as well as rhizospher, rhizoplane and root tissue of Ficus
Religiosa L., Leucena Leucocephala and Piper Sarmentosum Roxb. Research
Journal of Agriculture and Biological Science 5(1): 29-41.
Rajput L, Asma I, Fathia M, Fauzia YH. 2013. Salt-tolerant PGPR strain
Planococcus rifietoensis promotes the growth and yield of wheat (Triticum
aestivum L.) cultivated in saline soil. Pak. J. Bot 45(6): 1955-1962.
Sgroy V, F Cassan, O Masciarelli, MF Del Papa, A Lagares, V Luna. 2009.
Isolation and characterization of endophytic plant growth-promoting (PGPB)
or stress homeostasis-regulating (PSHB) bacteria associated to the halophyte
Propis strombulifera. Applied Microbial Biotechnol 85:371-381.
Shiddikee MA, PS Chauhan, R Anandham, Gwang-Hyun Han, Tonfmin S.
Isolation, characterization, and use for plant growth promoting under salt
stress, of ACC Deaminase-producing halotolerant bacteria derived from coastal
soil. J Miicrobiol Biotechnol 11:1577-1584.
Shivanand P, G Mugeraya. 2011. Halophilic bacteria and their compatible solutes,osmoregulation and potential application. Current Science 100:10.
Spaepan S, Vanderleyden J, Roseline R. 2007. Indole-3-acetic acid in microbial
and microorganism-plant signaling. FEMS Microbiol Rev 1-24.
Spaepan S, Vanderleyden J. 2013. Auxin and plant-microbe intractions. Cold
Spring Harb Perspect Biol 10:1101.
Sutini. 2008. Analisis stabilitas insersi dan ekspresi fenotipik gen partenokarpi
DefH9-IaaM pada T3 tanaman tomat (Lycopersicon esculentum Mill.)
transgenik asal varietas opal. Skripsi. FMIPA UI.
Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop 2000/200c Spectrpphotometer V1.0
User Manual. Wilmington: Thermo Fischer Scientific.
Yang S, Zhang Q, Guo J, Charkowski AO, Glick BR, Ibekwe AM, Cooksey DA,
Yang CH. 2007. Global effect of indole-3-acetic acid biosynthesis on multiple
virulence factors of Erwinia chrysanthemi 3937. Appl Environ Microbiol 73:
1079–1088.

16
Lampiran 1 Daftar isolat bakteri rhizosfer yang digunakan dalam penelitian
No.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20
21.
22,
23.
24.

Kode Isolat
Er B1.1
Er B1.2
Er B1.3
Er B1.4
Er B1.5
Er B1.6
Er B1.7a
Er B1.9
Er B2. 1
Er B2.2
Er B2.3
Er B2.4
Er B2.5
Er B2.8
Er B2.9
Er B2.10
Er B2.11
Er B2.12
Er B2.13
Er B3.14
Er B3.1
Er B3.3
Er B3.4
Er B3.5

Jenis Gram
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-

No.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.

Kode Isolat
Er B3.6
Er B3.7
Er B3.8
Er B3.10
Er B3.12
Er B3.14
Er B3.15
Ptb B1.3
Ptb B1.4
Ptb. B2.3
Ptb. B2.4
Ptb. B2.8
Ptb. B2.9
Ptb. B2.10
Ptb. B2.11
Ptb. B2.12
Ptb.B3.1
Ptb.B3.2
Ptb.B3.3
Ptb.B3.5
Ptb.B3.6
Ptb.B3.8
Ptb.B3.9
Ptb.B3.10

Jenis Gram
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

17
Lampiran 2 Diagram alir penelitian
Sebanyak 48 isolat
bakteri rhizosfer

Peremajaan isolat

Analisis Kuantitatif Produksi AIA

12 Isolat dengan produksi
AIA tertinggi

Isolat lain dengan
produksi AIA lebih rendah

Uji Toleransi Salinitas

Isolat yang mampu
hidup di media
dengan tingkat
salinitas tinggi

Isolat yang tidak mampu
hidup di media dengan
tingkat salinitas tinggi

Analisis kuantitatif
produksi AIA pada
media salin

Isolasi DNA bakteri

Identifikasi Gen IaaM

Amplifikasi gen 16S
rRNA

Sekuensing gen 16S
rRNA

Identifikasi isolat

18
Lampiran 3 Perhitungan konsentrasi AIA pada analisis kuantitatif produksi AIA
Analisis kuantitatif produksi AIA gelombang I
Kode
Isolat
Er B1.6
Er B1.7
Er B2.1
Er B2.11
Er B3.12
Ptb B3.10

Absorbansi
Sampel
FP
S1
S2
0.361 0.373 1
0.822 0.819 2
0.532 0.533 2
0.163 0.162 1
0.457 0.445 2
0.378 0.404 2

Konsentrasi (ppm)
A 530 nm

0.2
0.002

Sampel-Blanko
S1
0.274
0.813
0.523
0.154
0.448
0.369
1
0.017

S2
0.286
0.810
0.544
0.153
0.436
0.395
5
0.098

Konsentrasi
Rataan
AIA (ppm)
Deviasi
(S)
S1
S2
14.069 14.707 14.388 0.451
85.559 85.239 85.399 0.226
27.354 28.471 27.912 0.790
7.726
7.673
7.699
0.038
46.729 45.452 46.090 0.903
38.324 41.090 39.707 1.956
15
0.334

25
0.488

35
0.644

Blanko
0.088

Analisis kuantitatif produksi AIA gelombang II
Kode
Isolat
Er B1.1
Er B2.5
Er B2.9
Er B2.12
Er B2.13
Er B2.14
Er B3.4
Er B3.7
Er B3.8
Er B3.10
Er B3.14
Er B3.15
Ptb B2.3

Absorbansi
Sampel
S1
S2
0.213 0.234
0.284 0.288
0.260 0.262
0.743 0.748
0.771 0.791
0.333 0.326
0.588 0.577
0.304 0.304
0.531 0.521
0.808 0.849
0.255 0.267
0.592 0.613
0.823 0.835

FP
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

Sampel-Blanko
S1
-0.670
0.004
-0.020
0.463
0.491
0.053
0.308
0.024
0.251
0.528
-0.025
0.312
0.543

S2
-0.044
0.008
-0.018
0.468
0.511
0.046
0.297
0.024
0.241
0.569
-0.013
0.333
0.555

Konsentrasi
AIA (ppm)
S1
S2
6.307
7.592
10.274 10.497
8.933
9.045
35.916 36.196
37.480 38.598
13.011 12.650
27.257 26.262
11.391 11.391
24.073 23.514
39.547 41.838
8.654
9.324
27.480 28.654
40.385 41.056

Rataan
(S)

Deviasi

6.950
10.385
8.989
3.6056
38.039
12.816
26.950
11.391
23.793
40.693
8.989
28.067
40.721

0.909
0.158
0.079
0.198
0.790
0.277
0.435
0.000
0.395
1.620
0.474
0.830
0.474

19
Lampiran 3 Perhitungan konsentrasi AIA pada analisis kuantitatif produksi AIA
(Lanjutan)
Konsentrasi (ppm)
A 530 nm

0.2
0

1
0

5
0

15
0.108

25
0.305

35
0.463

45
0.588

Blanko
0.28

Rataan
(S)

Deviasi

12.780
4.004
8.950
16.167
11.238
8.418
11.486
3.312
5.369
9.411
46.305
4.074

0.100
0.176
0.401
0.075
0.125
0.351
2.031
0.050
0.100
0.251
0.652
0.176

Analisis kuantitatif produksi AIA gelombang III
Kode
Isolat
Ptb B2.8
Ptb B2.9
Ptb B2.10
Ptb B2.11
Ptb B2.12
Ptb B3.1
Ptb B3.2
Ptb B3.3
Ptb B3.5
Ptb B3.6
Ptb B3.8
Ptb B3.9

Absorbansi
Sampel
S1
S2
0.414 0.410
0.168 0.161
0.312 0.296
0.506 0.509
0.371 0.366
0.296 0.282
0.416 0.335
0.144 0.146
0.205 0.201
0.312 0.322
0.711 0.698
0.163 0.170

Konsentrasi (ppm)
A 530 nm

0.2
0

FP
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1

Sampel-Blanko
S1
0.262
0.016
0.160
0.354
0.219
0.144
0.264
-0.008
0.053
0.160
0.559
0.011
1
0

S2
0.258
0.009
0.144
0.357
0.214
0.130
0.183
-0.006
0.049
0.170
0.546
0.018
5
0.039

Konsentrasi
AIA (ppm)
S1
S2
12.851 12.709
4.128
3.879
9.234
8.667
16.113 16.220
11.326 11.149
8.667
8.170
12.992 10.050
3.277
3.348
5.440
5.298
9.234
9.589
46.766 45.844
39.50
4.199

15
0.353

25
0.630

35
45
Blanko
0.892 1.143 0.152

20
Lampiran 3 Perhit