Penapisan isolat pendegradasi xilan bagas serta pencirian xilanase
PENAPISAN ISOLAT PENDEGRADASI XILAN BAGAS
SERTA PENCIRIAN XILANASE
GADING WILDA ANIRIANI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Penapisan Isolat Pendegradasi
Xilan Bagas serta Pencirian Xilanase adalah karya saya dengan komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi
manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam daftar pustaka dibagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
Gading Wilda Aniriani
NRP P051110121
RINGKASAN
GADING WILDA ANIRIANI. Penapisan isolat pendegradasi xilan bagas serta
pencirian xilanase. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan YOPI.
Xilanase merupakan enzim ekstraseluler yang dapat dihasilkan oleh
mikroba. Enzim ini digunakan secara luas dalam aplikasi bioteknologi. Xilanase
diproduksi menggunakan substrat xilan bagas. Penggunaan bagas sebagai
biomassa tidak akan bersaing dengan ketahanan pangan. Hidrolisis xilan bagas
tebu dapat menghasilkan produk xilooligosakarida. Xilan merupakan komponen
hemiselulosa pada bagas. Xilanase dapat menjangkau xilan dan secara mudah
mengkonversinya menjadi gula sederhana, oleh karena itu perlu dilakukan
pretreatment dan ekstraksi.
Selulosa secara alami diikat oleh hemiselulosa dan dilindungi oleh lignin,
oleh karena itu disebut dengan lignoselulosa. Adanya senyawa pengikat lignin
inilah yang menyebabkan bahan-bahan lignoselulosa sulit untuk dihidrolisa.
Pretreatment akan merusak dinding sel tanaman dan akan mempermudah akses
enzim pada polisakarida bagas. Pretreatment meliputi delignifikasi dan ekstraksi
xilan. Ekstraksi xilan bertujuan untuk memisahkan komponen xilan dengan
selulosa.
Proses pretreatment bagas meliputi delignifikasi menggunakan sodium
hipoklorit (NaOCl) 1% dan ekstraksi xilan menggunakan metode alkalin (NaOH
15%) sebagai pelarut. Terdapat tiga isolat bakteri xilanolitik yang berasal dari
Taman Nasional Bukit Duabelas (TNBD) Jambi yaitu isolat XJ (Xilanolitik
Jambi) no 17, 28 dan 30. Isolat tersebut kemudian diuji secara kualitatif dan
kuantitatif pada substrat xilan bagas. Uji kualitatif menggunakan metode
pewarnaan merah-kongo, sedangakan uji kuantitatif menggunakan metode DNS.
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan penapisan xilanase dari 3 bakteri
xilanolitik, mengkarakterisai xilanase isolat potensial dan menghidrolisis xilan
bagas. Isolat potensial pendegradasi xilan bagas diidentifikasi dengan 16S rRNA.
Produk hidrolisis dianalisis menggunakan KLT (Kromatografi Lapis Tipis).
Hasil ekstraksi xilan dari bagas diperoleh 9,9% xilan dari bagas dan setelah
pemurnian diperoleh 3,4 % xilan larut. Isolat yang dapat menggunakan substrat
xilan bagas dalam uji kualitatif yaitu no XJ28 dan XJ30. Aktivitas xilanase
tertinggi adalah isolat XJ28 pada xilan bagas diperoleh pada jam ke-96 masa
inkubasi dengan aktivitas 11,3 ± 0,6 U/mL, sedangkan pada isolat XJ30 sebesar
0,3 ± 0,005 U/mL pada jam ke-3 masa inkubasi. Produk ekstraksi xilan bagas
kemudian dibandingkan dengan produk komersial, xilanase XJ28 diproduksi dari
substrat xilan beechwood komersial (Sigma) dan mendapatkan aktivitas enzim
sebesar 11,5 ± 0,2 U/mL pada jam ke-48 masa inkubasi. Isolat XJ28 memiliki
karakter xilanase optimum pada pH 7 dengan suhu 50 °C, stabil sampai inkubasi
jam ke-72 pada suhu ruang maupun pada suhu 4 °C, dan bebas selulase.
Berdasarkan hasil tersebut, hidrolisis xilan bagas 0,5 % oleh xilanase ekstrak
kasar menghasilkan gula reduksi dengan BM yang sama dengan sukrosa.
Berdasarkan identifikasi 16S rRNA, isolat potensial XJ28 memiliki tingkat
kemiripan 99 % dengan Bacillus subtilis.
Kata kunci: xilanase, xilan bagas, hidrolisis, KLT, 16S rRNA.
SUMMARY
GADING WILDA ANIRIANI. Screening isolates degrading the xylan bagasse
and xylanases characteristic. Supervised by ANJA MERYANDINI and YOPI.
Xylanase extracellular enzyme is produced by various microbes. The
enzymes are widely used in biotechnology applications. Xylanase can produce
used the bagasse xylan substrate. The use of bagasse as biomass will not compete
with the food stability. Hydrolysis of bagasse xylan can produced
xylooligosaccaride. The main components of hemicellulose was xylan at bagasse.
Xylanase can reach xylan it easily convert into simple sugars, therefore it is
necessary for pretreatment and extraction.
Cellulosa was naturally bound by hemicellulose and was protected by
lignin, therefore called lignosellulose. The presence of lignin-binding compound
that causes lignocellulosic materials difficult to hydrolized. Pretreatment will
damage the cell walls of plants and will facilitate access to the enzyme of bagasse
polysaccharides. Pretreatment includes delignification and xylan estraction.
Xylan estraction aims to separate the compounents of xylan free cellulosa.
Pretreatment process included delignification using sodium hypochlorite
1% and xylans extraction using alkaline (NaOH 15%) as the solvent. There are
three isolate xylanolytic bacteria from Taman Nasional Bukit Duabelas (TNBD)
Jambi that is 17, 28 and 30 number isolate Xylanolytic Jambi (XJ). The isolate
were then tested qualitative and quantitative of the bagasse xylan substrate. The
qualitative test used Congo-Red stainning, whereas quantitative test used DNS
methode. This research aims was to the screening xylanases from three
xylanolytic bacteria, characterized the potential isolate xylanase and hidrolyzed
the xylan bagasse. The potential isolate degrading of xylan bagasse identified with
16S rRNA. The hydrolysis product was analysis used TLC (Thin Layer
Chromatography).
The result of the xylans extracted from bagasse was 9,9% xylan and after
purification was obtained 3,4% soluble xylan. Isolate was used the xylan bagasse
in qualitative test that is number XJ28 and XJ30. Xylanase activity isolate XJ28
has the highest activity at was 96 h of incubation time with activity at 11,3 U/mL,
whereas of isolat XJ30 that is 0,3 U/mL at was 3 h of incubation time. The
product of xylan bagasse extraction and than comparison with commercial
product, xylanase XJ28 produced from xylan beechwood commercial (Sigma) and
obtained enzyme activity that is 11,5 ± 0,2 U/mL at was 48 hour of incubation
time. Xylanase is isolate 28 has the optimum condition at pH 7 and 50 ºC, stable
up to 72 hr of incubation at room temperature and 4 ºC and free-cellulose. The
hydrolysis product using xylanase isolate XJ28 was reducing sugar with the
similiar molecular weight with sucrose. According identified 16S rRNA, isolate
XJ28 has a degree of similarity with the Bacillus subtilis.
Keywords : xylanase , bagasse xylan, hydrolysis , TLC, 16S rRNA.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PENAPISAN ISOLAT PENDEGRADASI XILAN BAGAS
SERTA PENCIRIAN XILANASE
GADING WILDA ANIRIANI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji Sidang Tesis: Dr Nisa Rachmania Mubarik MSi
Judul Tesis : Penapisan isolat pendegradasi xilan bagas serta pencirian xilanase
Nama
: Gading Wilda Aniriani
NIM
: P051110121
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Prof Dr Anja Meryandini MS
Ketua
Dr Yopi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Bioteknologi
Dekan Program Pascasarjana IPB
Prof Dr Ir Suharsono DEA
Dr Ir Dahrul Syah MSc Agr
Tanggal Ujian:
( 22 Agustus 2014)
Tanggal Lulus:
(
)
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2013 ini ialah
enzim, dengan judul Penapisan Isolat Pendegradasi Xilan Bagas serta Pencirian
Xilanase.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Prof Dr Anja Meryandini MS dan
Bapak Dr Yopi selaku pembimbing yang telah banyak memberi saran,
meluangkan waktu dan pikiran. Penulis juga tidak lupa berterima kasih kepada
Ibu Dr. Nisa Rachmania Mubarik Msi selaku penguji pada sidang tesis yang telah
memberikan kritik dan saran dalam penulisan. Di samping itu, penghargaan
penulis sampaikan kepada Kepala Laboratorium Bioenergi dan Fermentasi Pusat
Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Bapak Dr
Yopi beserta staf yang telah memberikan fasilitas penelitian. Penulis juga
menyampaikan terima kasih kepada Kepala Laboratorium Ilmu dan Teknologi
Pakan dalam analisis komponen serat bagas dan Kepala Pusat Penelitian
Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) yang telah membantu dalam
analisis proksimat sampel limbah tebu (bagas). Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada ayah, ibu, empat adik perempuan penulis (Kasyafia, Mega,
Su’aisyah, Aliyah), calon pendamping hidup penulis (Andaru) serta seluruh
keluarga besar, sahabat, teman-teman Bioteknologi IPB 2011 atas segala doa,
dukungan dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2014
Gading Wilda Aniriani
DAFTAR ISI
LEMBAR PENGESAHAN
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
1 PENDAHULUAN
Tujuan Penelitian
Hipotesis Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
2 METODE
Waktu dan Tempat
Bahan dan Alat
Tahapan Penelitian
Pretreatment Substrat Bagas
Penentuan kemampuan delignifikasi substrat
Bakteri Penghasil Xilanase
Produksi Xilanase
Karakteristik Xilanase
Hidrolisis Xilan Bagas dengan Xilanase
Identifikasi Bakteri dengan Analisis Gen 16S rRNA
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Pretreatment Bagas
Bakteri Penghasil Xilanase
Produksi Xilanase menggunakan Xilan Bagas
Perbandingan Aktivitas Xilanase dari xilan bagas dan xilan beechwood
(Sigma)
Karakteristik Enzim
Hidrolisis Xilan Bagas dengan Xilanase
Identifikasi Bakteri Potensial dengan Molekuler
4 KESIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
1
2
2
2
3
3
3
3
4
5
6
6
6
7
8
9
11
11
17
18
10
22
25
27
29
29
34
46
DAFTAR TABEL
1 Kelarutan xilan dalam beberapa pelarut
2 Hasil dari neraca massa tahapan pretreatment substrat
3 Komposisi kimia hasil analisis komponen proksimat sebelum dan
setelah delignifikasi
4 Komposisi kimia hasil analisis komponen serat sebelum dan
setelah delignifikasi
5 Data hasil Indeks Xilanolitik (IX) dari uji kualitaif pewarnaan merahkongo pada masing-masing isolat
6 Aktivitas xilanase sebelum dan sesudah proses dialisis
7 Perbedaan hasil nilai Rf pada sampel hasil hidrolisis dan stdanar gula
hasil KLT
8 Persentase kemiripan sekuen gen 16S rRNA isolat XJ28
5
12
13
14
18
25
27
28
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Diagram alir tahapan penelitian
Preparasi bagas secara fisik
Hasil pretreatment bagas tebu
Peremajaan tiga bakteri xilanolitik pada media xilan beechwood
(Sigma) selama 24 jam
Hasil analisis kualitatif bakteri xilanolitik pada substrat xilan bagas 0,5
% dengan metode pewarnaan merah-kongo 0,2 %
Grafik hubungan antara jumlah 10log TPC dengan aktivitas xilanase
selama inkubasi jam ke-0 sampai jam ke-168 dalam medium xilan
bagas 0,5 %.(pH 7) inkubasi pada suhu 28 °C dengan agitasi 150 g
Grafik perbedaan antara aktivitas xilanase isolat XJ28 yang diproduksi
dari xilan bagas dengan xilan beechwood (Sigma). Substrat uji xilan
beechwood (Sigma) 0,5 % pH 7 selama 30 menit.
Grafik pengaruh berbagai pH bufer terhadap aktivitas xilanase. Kondisi
uji pada bufer sitrat (3-5,5), bufer fosfat (6-7,5) dan bufer glisin NaOH
(8-10) masing-masing dengan konsentrasi 0,02 M, reaksi selama 30
menit
Grafik pengaruh berbagai suhu terhadap aktivitas xilanase
Grafik hubungan perbandingan lama waktu penyimpanan terhadap
aktivitas xilanase XJ28 pada kisaran suhu
Visualisasi KLT hasil hidrolisis xilanase XJ28 pada xilan bagas
Amplifikasi PCR terhadap gen 16S rRNA dengan primer 63 f dan
1387r
4
11
16
17
18
19
20
22
23
24
26
28
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
Prosedur analisis proksimat dan komponen serat
Nerasa massa ekstraksi xilan bagas tebu
Contoh penghitungan penurunan bobot komponen serat bagas
Analisis dan penghitungan aktivitas enzim
Hasil pensejajaran DNA isolat XJ 28 pada program MEGA
Hasil penghitungan TPC pada prekultur (pada OD620 = 0,7)
Surat Penerimaan artikel pada Jurnal Biologi Indonesia (JBI)
terakreditasi LIPI (Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia)
34
37
40
41
44
45
46
1
1 PENDAHULUAN
Enzim merupakan senyawa biokatalis berupa molekul polimer yang
tersusun atas asam amino. Enzim merupakan protein yang diproduksi dan
digunakan oleh sel hidup salah satunya untuk mengkonversi substrat menjadi
molekul yang bermanfaat. Enzim yang memiliki kemampuan dalam mendegradasi
hemiselulosa ialah xilanase, dalam hal ini xilan atau polimer dari xilosa dan xilooligosakarida. Xilanase merupakan jenis enzim yang digunakan secara luas dalam
bidang aplikasi bioteknologi, misalnya pada peternakan sebagai campuran pakan
ternak (Richana 2002), dikombinasikan dengan selulase dan pektinase dapat
digunakan untuk menjernihkan juice dan likuifikasi buah dan sayur (Beg et al.
2001), pada proses pemutihan kertas (Wang et al. 2010), untuk peningkatkan
kualitas roti (Zheng et al. 2011), dan produksi bioenergi seperti etanol (Samsuri et
al. 2009). Sebagian besar xilanase mampu mendegradasi jenis xilan, dan hanya
dibedakan dari produk akhir yang dihasilkan (Himmel 2008). Produk akhir yang
diharapkan pada masing-masing aplikasi dibutuhkan jenis xilanase spesifik.
Xilanase dapat diklasifikasikan berdasarkan spesifikasi pemecahan substrat pada
proses degradasi yaitu -xilosidase, endoxilanase, dan eksoxilanase (Richana
2002), dan arabinofuranosidase, glukuronidase, dan asetilxilan esterase (Prakash
et al. 2012). Endo-1,4- -xilanases (EC 3.2.1.8) menghidrolisis rantai utama xilan,
sedangkan -xilosidase (EC 3.2.1.37) memecah hasil oligomer menjadi monomer
xilosa (Saleem et al. 2012). Jenis mikroorganisme yang sudah umum
menghasilkan xilanase ialah bakteri. Sebagai sumber enzim, kelebihan bakteri
memiliki laju pertumbuhan yang cepat, dapat tumbuh pada substrat yang murah.
Berikut beberapa contoh bakteri yang telah diisolasi dan dapat menghasilkan
xilanase yaitu, Clostridium absonum CFR-702 (Rani dan Nand 2000), Bacillus sp
(Heck et al. 2006), Bacillus pumilus RXAIII-5 (Richana et al. 2007), dan
Alternaria sp. ND-16 (Li et al. 2009).
Xilosa atau xilo-oligisakarida merupakan produk komersial yang tidak
murah. Salah satu cara untuk menekan biaya produksi xilanase ialah dengan
memanfaatkan bahan dasar limbah sebagai medium tumbuh bakteri dan proses
hidrolisis. Beberapa contoh lignoselulosa yang dapat digunakan antara lain limbah
pertanian (rumput, alang-alang, sekam padi, jerami, batang gandum, tongkol, dan
jagung) dan limbah hasil samping industri fermentasi (molase,bagas)
(Iranmahboob et al. 2002; Campo et al. 2006). Salah satu bahan baku yang dapat
digunakan ialah limbah ampas tebu (bagasse atau bagas). Selain ketersediannya
yang melimpah juga tidak bersaing dengan bahan dasar pangan. Menurut
Lavarack et al. (2002) bagas merupakan hasil samping proses pembuatan gula
tebu (sugarcane) yang mengandung residu berupa serat. Minimal 50% serat bagas
diperlukan sebagai bahan bakar (ketel) sedangkan 50% sisanya hanya ditimbun
sebagai buangan yang memiliki nilai ekonomi rendah. Serat bagas umumnya
mengandung polisakarida yang tersusun atas 50%-55% selulosa, 15%-20%
hemiselulosa dan lignin sekitar 20-30%, selain itu sisanya disebut senyawa abu
(Pandey et al. 2000; Samsuri et al. 2009). Komponen kimia dari bagas secara rinci
meliputi 37,35 % glukan (selulosa), 23,66 % xilan (hemiselulosa), 2,1 % lignin,
3,25 % senyawa ekstraktif lain, dan 1,79 % senyawa abu (Sandra et al. 2007).
Bakteri dapat menghasilkan xilanase apabila diinduksi oleh substrat yang
mudah dipecah. Xilanase dapat menjangkau xilan dan secara mudah
2
mengkonversinya menjadi gula sederhana, oleh karena itu perlu dilakukan
pretreatment dan ekstraksi. Pretreatment bertujuan untuk memecah lignin
(delignifikasi) dan merusak struktur kristal yang mengikat selulosa (Sudiyani et
al. 2010), selain itu juga bertujuan untuk memecah bahan-bahan lignoselulosa
baik dari segi struktur dan ukuran. Himmel (2008) biomassa yang tidak
dipretreatment akan bersifat recalcitrant bagi mikrob. Menurut Iranmahboob et
al. (2002) adanya senyawa pengikat lignin itulah yang menyebabkan bahan-bahan
lignoselulosa sulit untuk dihidrolisis. Taherzadeh dan Karimi (2007) menjelaskan
bahwa hidrolisis enzimatis memiliki beberapa keuntungan dibandingkan hidrolisis
asam, antara lain: kondisi proses yang lebih lunak (suhu rendah, pH netral) dan
biaya pemeliharaan peralatan relatif rendah karena tidak ada bahan yang korosif.
Xilan merupakan komponen utama hemiselulosa pada tanaman. Struktur
xilan yang beragam memberikan pengaruh pada aktivitas xilanase yang berbeda
(Li et al. 2010). Keragaman xilanase disebabkan struktur yang beragam dari xilan,
oleh karena itu dilakukan karakterisasi xilanase untuk mengetahui kondisi
optimum dalam menghidrolisis xilan. Tseng et al. (2002) setiap aplikasi
memerlukan jenis xilanase dengan sifat tertentu. Dalam penelitian ini akan
diseleksi tiga isolat bakteri xilanolitik dari Taman Nasional Bukit Duabelas
(TNBD) Jambi dalam mendegradasi xilan bagas. Penelitian sebelumnya
(Kurrataa’yun β01γ), telah berhasil mengisolasi bakteri xilanolitik dari TNBD.
Bakteri yang telah diisolasi merupakan mikrob indigenos yang belum diteliti dan
belum diidentifikasi galurnya, terutama kemampuannya dalam menghasilkan
xilanase pada substrat xilan bagas. Bakteri xilanolitik potensial dalam substrat
xilan bagas akan dikarakterisasi xilanasenya untuk mendegradasi xilan bagas.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan xilan hasil ekstraksi dari limbah
ampas tebu (bagas) dan melakukan penapisan xilanase dari tiga isolat xilanolitik
pada substrat xilan bagas untuk degradasi xilan bagas serta mengkarakteristik
enzimnya, yang meliputi suhu, pH optimum, stabilitas dan produk hidrolisisnya.
Hipotesis Penelitian
Pretreatment bagas tebu mendapatkan ekstrak xilan dan bakteri xilanolitik
hasil isolasi dari Taman Nasional Bukit Duabelas (TNBD) Jambi dapat
menghasilkan enzim xilanase yang dihasilkan dari xilan bagas untuk proses
hidrolisis substrat xilan bagas.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan enzim xilanase potensial dari
tiga bakteri xilanolitik hasil isolasi dari Taman Nasional Bukit Duabelas TNBD
Jambi menggunakan substrat xilan bagas dalam menghasilkan produk gula dari
proses hidrolisis.
3
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini memiliki tema tentang enzim xilanase, selama ini xilanase
banyak digunakan dalam aplikasi bioteknologi. Penggunan xilanase dalam
beberapa proses industri dinilai sangat mahal sehingga diperlukan substrat untuk
produksi enzim berasal dari limbah bagas tebu. Ruang lingkup penelitian ini
mencakup bagaimana cara memperlakukan dan mengekstraksi limbah bagas agar
mudah digunakan oleh bakteri xilanolitik, mengkarakteristik xilanase agar
mendapatkan spesifikasi jenis xilanase dan mendapatkan produk hidrolisis berupa
gula sederhana (misalnya xilopentosa atau xilo-oligosakarida) dari hasil ekstraksi
bagas oleh enzim xilanase yang dihasilkan sendiri dari substrat tersebut. Xilanase
maupun produk gula sederhana yang dihasilkan merupakan penemuan baru dalam
menentukan aplikasi bioteknologi, mengingat bakteri xilanolitik merupakan isolat
indigenous baru yang belum diteliti sebelumnya.
2 METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan pada bulan Maret 2013 sampai dengan Maret 2014 di
Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi (LBF) bidang bioproses pada Pusat
Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong
Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan yaitu isolat bakteri xilanolitik hasil isolasi dari
Taman Nasional Bukit Duabelas, Jambi (kode isolat XJ no.17, 28 dan 30), limbah
ampas tebu (bagas), xilan beechwood (Sigma), media pertumbuhan dan produksi
meliputi 0,5% xilan bagas; 0,5% ekstrak khamir; 0,02% MgSO4; 0,1% K2HPO4;
0,5% bakto pepton. Bahan untuk pretreatment dan ekstraksi xilan terdiri atas
NaOCl, NaOH, HCl 37%, Carboxymethyl Cellulose (CMC) 0,5 % dan etanol
95%. Bahan-bahan lain berupa akuades, agar-agar, NaCl, larutan asam sulfat
pekat (H2SO4 pekat), pewarna merah kongo 0,2 %, membran dialisis, bufer (sitrat,
fosfat danglisin NaOH). Untuk proses analisis enzim secara kuantitatif ialah
reagen berupa larutan Dinitrosalicyclic Acid (DNS) yang terdiri atas DNS, NaOH
padat, dan Kalium Natrium Tartrat (KNa-tartrat). Untuk analisis Kromatografi
Lapis Tipis (KLT) ialah n-butanol, asam asetat, difenilamin, anilin, aseton, asam
fosfat, kertas KLT. Untuk identifikasi gen 16S rRNA ialah galur bakteri potensial
penghasil xilanase, bufer TAE (Tris Asetat EDTA), Etidium bromide, primer 63
F, 1387R, dan Genomic DNA mini kit (Geneid). Untuk elektroforesis, yaitu gel
agarose, Loading dye Fermentas, milli-Q. Alat yang digunakan yaitu, peralatan
analisis proksimat, shaker (Hithachi, Tokyo Japan), spektrofotometer UV-VIS
(Hitachi, U-3900H, Tokyo Japan), dan mesin Polymerase Chain Reaction (PCR).
4
Tahapan Penelitian
Bagas tebu
Pretreatment (delignifikasi
ekstraksi dan purifikasi xilan)
Tiga isolat
xilanolitik Jambi
Xilan bagas
Dialisis
s
Produksi xilanase
Karakteristik xilanase
(pengaruh pH, suhu, dan
stabilitas)
Uji kualitatif
(pewarnaan merah
kongo)
Uji kuantitatif
(metode DNS),
kurva tumbuh (TPC)
Isolat potensial
Identifikasi 16S rRNA
Hidrolisis xilan
secara enzimatik
Produk gula
Kromatografi Lapis Tipis
(KLT)
Gambar 1 Diagram alir tahapan penelitian
5
Pretreatment Substrat Bagas
Preparasi Bagas
Limbah tebu yang berupa ampas tebu di keringkan dengan oven pada suhu
80 ºC sampai kering dan dihancurkan dengan mesing giling. Setelah menjadi
serbuk bagas kemudian dilakukan pembubukan lolos saringan 40 mesh, hasil
modifikasi dari Lee (2003). Kandungan total selulosa, hemiselulosa, lignin dan
lain-lain pada bagas didapatkan dari analisis proksimat dan komponen serat.
Tahapan proses analisis dapat dilihat pada Lampiran 1.
Delignifikasi
Delignifikasi serbuk bagas dilakukan berdasarkan penelitian Richana et al.
(2007) (yang telah dimodifikasi) dengan menggunakan pelarut natrium hipoklorit
(NaOCl) 1%, proses delignifikasi dilakukan selama 5 jam pada suhu ruang.
Hasilnya kemudian dicuci sampai bau NaOCl nya hilang, lalu dilakukan proses
penyaringan untuk membuang air yang mengandung lignin. Bubuk bagas
kemudian dikeringkan pada suhu 50 ºC selama 48 jam. Hasil delignifikasi
dianalisis proksimat dan komponen serat kembali untuk mendapatkan kandungan
selulosa, hemiselulosa dan lignin setelah delignifikasi. Tahapan neraca massa
proses pretreatment dapat dilihat pada Lampiran 2.
Ekstraksi Xilan dari Bagas
Metode ekstraksi xilan menggunakan metode dari Richana et al. (2007).
Ekstraksi xilan menggunakan NaOH sebagai larutan pengekstrak xilan dari bagas,
karena sifat kelarutannya pada xilan (Tabel 1). Padatan hasil delignifikasi
direndam dalam larutan natrium hidroksida (NaOH) 15% pada suhu 28ºC selama
24 jam untuk mendapatkan ekstrak xilan. Setelah 24 jam dilakukan penyaringan
dengan menggunakan kain saring, filtrat (suspensi) yang dihasilkan dari proses
ekstraksi diukur pH nya kemudian dinetralkan dengan menggunakan HCl 37%
sampai netral (pH 7). Suspensi kemudian di sentrifuge pada 6000 g selama 15
menit. Supernatan mengandung ekstrak xilan, sedangkan endapan dibuang. Xilan
yang larut dalam supernatan dibersihkan dengan menambahkan etanol 95%.
Etanol ditambahkan pada supernatan dengan perbandingan supernatan-etanol
ialah 1:3 kemudian dilakukan sentrifuge kembali dengan kecepatan 6000 g selama
15 menit. Hasil dari sentrifugasi tersebut ialah endapan yang mengandung xilan.
Tabel 1 Kelarutan xilan dalam beberapa pelaruta
Pelarut
Kelarutan
NaOH 1%
+++ (sangat larut)
Air Panas (90 ºC)
++ (larut)
Air Dingin (27 ºC)
+ (sedikit larut)
HCl 1N
- (tidak larut)
a
Sumber: Richana et al. (2007).
6
Penentuan Kemampuan Delignifikasi Substrat
Substrat hasil delignifikasi dengan NaOCl 1 % yang telah dikeringkan
dalam oven 5 ºC selama 48 jam. Substrat ini selanjutnya digunakan untuk analisis
kandungan selulosa, hemiselulosa dan lignin menggunakan metode Van Soest et
al. (1991). Persentase kehilangan bobot substrat dihitung dengan persamaan
berikut:
Susut bobot (%) =
Keterangan :
BKO = Bobot Kering Oven (g)
Penurunan kadar komponen serat (sebagai lignin, selulosa, hemiselulosa) dihitung
berdasarkan rumus:
Persentase penurunan komponen serat (%) =
Keterangan :
x = kadar komponen serat sebelum delignifikasi (%)
y = kadar kompnen serat setelah delignifikasi (%)
z = susut bobot (%)
Bakteri Penghasil Xilanase
Peremajaan Isolat
Isolat XJ (no. 17, 28 dan 30) masing-masing diremajakan dengan cara
menumbuhkannya pada media padat xilan (beechwood, Sigma) 0,5%, kemudian
cawan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang.
Uji Kualitatif (Pewarnaan Merah-Kongo)
Uji kualitatif pertumbuhan masing-masing bakteri XJ (isolat 17, 28 dan 30)
dilakukan dengan mengambil sebanyak 2 µL suspensi bakteri kemudian
diinokulasikan pada media padat xilan bagas 0,5% dan diinkubasi selama 24-48
jam pada suhu ruang. Uji dilakukan dengan pewarna merah kongo 0,2% dalam
media kultur bakteri sampai semua lapisan tergenang selama 15 menit. Kemudian
dicuci (destainning) dengan NaCl 2%. Pengamatan zona bening dilakukan sebagai
indikator aktivitas enzim.
Produksi Xilanase
Kurva pertumbuhan bakteri dan kurva aktivitas xilanase
Prekultur dibuat dengan cara menginokulasikan masing-masing isolat
bakteri yang telah diinkubasi selama 24 jam, sebanyak 1 ose biakan dari media
padat xilan bagas 0,5% ke dalam 20 mL media cair xilan bagas 0,5% (v/v) pH 7
dalam erlenmeyer 250 mL. Prekultur kemudian diinkubasi selama 8-24 jam pada
7
suhu ruangdi 150 g (OD 620 nm antara 0,5-0,8). Pencawanan prekultur dilakukan
pada pengenceran 10-6-10-8.
Sebanyak 15 mL (10%v/v) biakan hasil prekultur dimasukkan ke dalam
135 mL media cair xilan bagas 0,5% pH 7 dan suhu ruang.Inkubasi dilakukan
selama 7 hari dalam suhu ruang pada 150 g. Sampling dilakukan setiap 3, 6, 9, 12,
18, 24, 30, 36,48, 60, 72, 96, 120, 144, dan 168 jam. Setiap sampling diambil
sebanyak 3 mL ke dalam tabung eppendorf steril secara aseptik, sebanyak 1 mL
diencerkan untuk dihitung koloni bakterinya dengan metode Total Plate Count
(TPC). Sebanyak 2 mL disentrifugasi suhu 4ºC pada 15.000 g selama 10 menit.
Supernatan sebagai enzim ekstrak kasar diuji aktivitasnya.
Uji aktivitas enzim xilanase dilakukan berdasarkan metode DNS (Miller
1959) pada masing-masing bakteri. Nilai absorban yang diperoleh dikonversi
menjadi konsentrasi gula pereduksi menggunakan persamaan yang didapat dari
kurva standar xilosa. Pembuatan kurva standar xilosa dapat dilihat pada lampiran
1. Satu unit aktivitas enzim xilanase (U) didefinisikan sebagai sejumlah enzim
yang dapat mengkatalisis konversi dari 1 µmol xilan menjadi xilosa dalam 1 menit
(Prakash et al. 2012). Aktivitas xilanase dihitung menggunakan rumus sebagai
berikut:
Aktivitas enzim = Gula reduksi (mg/mL) x FP x 1000
Waktu reaksi x BM xilosa
PerbandinganAktivitas Xilanase yang Diproduksi dari Xilan Bagas
dengan Xilan Beechwood Komersial (Sigma)
Isolat potensial hasil penapisan kualitatif dan kuantitatif kemudian
diproduksi xilanasenya dari medium produksi xilan komersial. Enzim ekstrak
kasar yang dihasilkan, kemudian diuji aktivitas xilanase nya menggunakan
metode DNS. Substrat uji aktivitas xilanase menggunakan xilan beechwood
(Sigma) 0,5 % dengan kondisi uji dalam bufer fosfat 0,02 M (pH 7) pada suhu
ruang. Waktu produksi xilanase terbaik didapatkan dari aktivitas enzim tertinggi.
Karakteristik Xilanase
Pengaruh pH terhadap Aktivitas Xilanase
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim xilanase dilakukan dengan
mereaksikan enzim ekstrak kasar dengan substrat xilan bagas 0,5% yang
dilarutkan dalam bufer dengan kisaran pH 4,0 sampai 11,0 pada suhu ruang.
Untuk pH 4,0-5,0 digunakanbufer sitrat 0,02 M, untuk pH 6,0-7 digunakan bufer
fosfat 0,02 M dan untuk pH 8-10 digunakan bufer glisin NaOH. Sampel enzim
yang dianalisa saat produksi tertinggi yang diperoleh dari kurva aktivitas enzim.
Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk
menggunakan metode DNS.
8
Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Xilanase
Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim xilanase dilakukan dengan
mereaksikan enzim dengan substrat xilan bagas 0,5 % yang dilarutkan dalam
bufer 0,02 M pada pH optimum di suhu γ0, 40, 50, 60, 70, 80, dan 90 ◦C. Sampel
enzim yang dianalisa saat produksi tertinggi yang diperoleh dari kurva aktivitas
enzim. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk
menggunakan metode DNS.
Stabilitas Enzim
Stabilitas enzim didapatkan pada dua kondisi yaitu pada suhu optimum
dan suhu ruang. Masing-masing crude enzymes hasil sentrifuge dipisahkan
sebanyak 100 mL dan didiamkan pada suhu ruang dan pada suhu optimum.
Pengamatan dilakukan per jam sampai 5 jam dan jika selama 5 jam aktivitas
enzim masih tinggi maka diamati per 24 jam. Aktivitas xilanase dihitung
berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode DNS. Uji
aktivitas dilakukan pada kondisi optimum enzim.
Menentukan Xilanase Bebas-Selulase
Menentukan xilanase yang bebas-selulase, enzim ekstrak kasar isolat
potensial diuji aktivitas selulase menggunakan metode DNS. Substrat uji aktivitas
selulase menggunakan Carboxymethyl Cellulose (CMC) 0,5 % dengan kondisi uji
dalam bufer fosfat 0,02 M (pH 7) pada suhu ruang. Waktu produksi xilanase
terbaik didapatkan dari aktivitas enzim tertinggi.
Hidrolisis Xilan Bagas dengan Xilanase
Preparasi Enzim dengan Dialisis
Enzim ekstrak kasar sebanyak ± 60 mL dimasukkan ke dalam membran
dialisis. Proses dialisis dilakukan dengan merendam membran dalam 1 L bufer
fosfat 0,02 M pH 7 selama 5-6 jam pada suhu 4 °C. Perlakuan dikondisikan dalam
keadaan teraduk dengan magnetik stirer. Penggantian bufer dilakukan satu kali.
Aktivitas enzim diuji sebelum dan sesudah dialisis menggunakan metode DNS.
Proses Hidrolisis
Hidrolisis dilakukan dengan mereaksikan substrat xilan bagas 0,5 % dalam
enzim ekstrak kasar xilanase. Sampel dianalisis pada jam ke-0, 2.5, 5, dan 24 jam.
Reaksi hidrolisis dihentikan dengan dipanaskan pada suhu 100 °C selama 15
menit, kemudian disentrifuge pada 12.000 g 15 menit. Supernatan sebagai sampel
yang dianalisis.
Analisis Gula Pereduksi
Jumlah gula pereduksi yang terbentuk dari hasil sakarifikasi ditentukan
dengan metode DNS (Miller 1959). Larutan standar dibuat dari berbagai macam
9
konsentrasi xilosa yang telah diencerkan dari 1000 ppm, pembuatan standar gula
pereduksi dapat dilihat pada lampiran 4.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Sampel hasil dari proses sakarifikasi diambil sebanyak 1 µL ditotolkan di
kertas kromatografi. Larutan standart xilosa 1000 ppm dibuat sebagai kontrol
pencapaian gula reduksi yang dihasilkan. Larutan eluen dibuat dengan komposisi
12 mL n- butanol: 6 mL asam asetat: 6 mL akuades, kemudian dijenuhkan selama
30 menit. Sampel dan standar ditotolkan padakertas kromatografi, kemudian
kertas kromatografi direndam ke dalam eluen dan ditutup rapat sampai 1 jam.
Pengeringan dengan hair dryer di dalam ruangan asam, kemudian disemprotkan
larutan DAP yang terdiri dari 0,2 g difenilamin, 0,2 mL aniline, 10 mL aseton,
dan 1,5 mL asam fosfat, keringkan kembali setelah itu panaskan pada suhu 100 ◦C
selama 15 menit. Nilai Rf (Retention factor) dapat dihitung dengan rumus berikut.
Rf = Jarak yang ditempuh substansi
Jarak yang ditempuh pelarut
Identifikasi Bakteri dengan Analisis Gen 16S rRNA
Ekstraksi DNA Genom Menggunakan Kit
Ekstraksi DNA genom menggunakan GenomicDNA mini Kit (Blood/
cultured cell). Tahap pertama (pre-lisis) yaitu dengan menumbuhkan isolat bakteri
dalam media padat xilan. Koloni sel yang tumbuh kemudian disuspensikan ke
dalam akuades steril. Suspensi disentrifugasi 14.000-16.000 g selama 1 menit.
Endapan di suspensikan ke dalam 200 µL bufer GT, lalu diresuspensi dan
divortex. Suspensi kemudian diinkubasi pada suhu 60 ºC selama 10 menit
(swirling setiap 3 menit). Tahap kedua (pengikatan DNA), ditambahkan sebanyak
200 µL etanol absolut, kemudian divortex selama 10 menit. Apabila masih ada
endapan, dihancurkan dengan pipeting. Semua campuran dituang ke kolom (filter)
GD, kemudian disentrifugasi 14.000-16.000 g selama 2 menit (tabung koleksi
dibuang/ tabung tampungan filtrat, menyisakan kolom). Tahap ketiga (pencucian),
ditambahkan sebanyak 400 µL bufer W1 pada kolom GD kemudian sentrifugasi
kembali 14.000-16.000 g selama 30-60 menit. Cairan yang ada ditabung koleksi
dibuang dan diletakkan kembali kolom pada tabung reaksi. Sebanyak 600 µL
wash buffer (yang telah ditambah etanol) ditambahkan, kemudian sentrifugasi
14.000-16.000 g selama 30-60 menit. Cairan yang ada dalam tabung koleksi
dibuang. Kolom diletakkan pada tabung koleksi kemudian disentrifugasi 14.00016.000 g selama 3 menit. Tahap ke-empat (elusi DNA), memindahkan kolom
pada tabung mikro baru. Sebanyak 100 µL preheated bufer elusi atau TE
ditambahkan pada tengah-tengah kolom (jika sampel sedikit, hanya 30-50 µL
bufer elusi). Suspensi diinkubasi pada 37 ºC selama 3-10 menit. Kemudian
sentrifugasi 14.000-16.000 g selama 30-60 menit, pelet sebagai DNA. Sebelum
digunakan di cuci terlebih dahulu dengan wash bufer + 100 µL etanol absolut.
Komposisi reaksi PCR terdiri atas enzim La Taq DNA polimerase 0.5 µL, 2x
bufer GC 25 µL, dNTP mixture 8 µL, masing-masing primer (10 pmol) 1.5 µl,
10
ddH2O 9.5 µL, dan DNA template 4 µL. Primer forward6γF (5′-CAG GCC TAA
CAC ATG CAA GTC-γ′) danprimerreverse 1γ87R (5′-GGG CGG WGT GTA
CAA GGC-γ′). Kondisi PCR yang digunakan yaitu pre-denaturasi (94ºC, 4 menit),
denaturasi (94ºC, 45 detik), annealing (55ºC, 1 menit), elongation (72ºC, 1 menit
10 detik), dan post PCR (72ºC, 7 menit) dengan jumlah siklus sebanyak 30 siklus.
Elektroforesis Hasil PCR
Setelah proses amplifikasi dengan PCR selesai maka dilakukan analisis
elektroforesis untuk mendeteksi DNA ke dalam sumur gel agarose, sedangkan
untuk marker sebanyak 0,5 µL ditambahkan 0,5 µL Loading dye Fermentas dan 2
µL milli-Q dan dicampur kemudian dimasukkan dalam sumur yang berbeda.
Proses elektroforesis dilakukan selama 60 menit dengan voltase 50 V dalam
larutan buffer TAE 0,5 %. DNA hasil amplifikasi yang telah dielektroforesis
divisualisasikan dengan perendaman agarose yang mengandung DNA target ke
dalam larutan etidium bromide selama 15 menit, kemudian setelah dibilas dengan
akuades selama 10 menit. Dengan menggunakan UV transluminator, pita DNA
akan terlihat dan dapat diketahui ukurannya berdasarkan pendana ukuran molekul
yang dinyatakan dengan base pair (bp).
Identifikasi Bakteri Potensial
Sekuensing dilakukan di Laboratorium 1st BASE Singapure dan data
sekuen parsial yang diperoleh akan melalui proses pengeditan dengan
menggunakan program Bioedit. Setelah diperoleh data hasil urutan nukleotida
berdasarkan amplifikasi dengan primer universal, maka homologinya akan
dibandingkan dengan prokariota lain yang terdapat pada situs web
(http://www.ncbi.go.id).
11
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
PretreatmentBagas
Preparasi Bagas
Limbah bagas tebu didapatkan dari beberapa tempat yang berbeda, yakni
berasal dari limbah industri minuman dan limbah restoran. Proses pretreatment
bagas membutuhkan sebanyak 1000 g serbuk bagas kering. Berikut ialah proses
preparasi bagas secara bertahap sebelum dilakukan pretreatment yang disajikan
dalam Gambar 2.
(a)
(b)
(c)
(d)
Gambar 2
Preparasi bagas secara fisik. Limbah ampas tebu (bagas) basah
(a), pengeringan pada suhu 80 ºC selama ±24 jam sampai kering
(b), penggilingan (c), bagas lolos mesh 40 (d)
Gula dari tanaman tebu dihasilkan melalui proses penggilingan atau
ekstraksi dan meninggalkan bagas sebagai limbahnya. Bagas tebu masih
mengandung gula sehingga dapat dimanfaatkan baik sebagai substrat untuk
menghasilkan enzim maupun di degradasi hingga memiliki nilai ekonomi.
Menurut Riyanti (2008), ketersediaan bagas sebagai substrat relatif melimpah,
yaitu sekitar 30-40% dari total proses penggilingan tebu setiap produksi. Proses
tersebut biasanya membutuhkan lima tahap, yaitu penggilingan, pengepresan,
fermentasi, distilasi, dan dehidrasi. Limbah bagas yang digunakan dalam
penelitian ini telah melewati dua proses yakni penggilingan dan pengepresan.
Pretreatment limbah ampas tebu (bagas) meliputi proses preparasi bagas secara
fisik (Gambar5), delignifikasi, ekstraksi xilan, dan purifikasi xilan (pengujian
berikutnya). Pretreatment akan merusak dinding sel tanaman dan akan
mempermudah akses enzim pada polisakarida tanaman (Gray et al. 2006). Proses
pretreatment pada penelitian ini bertujuan untuk mempermudah proses untuk
mencapai tahap hidrolisis menggunakan enzim. Gray et al. (2006) menyatakan
bahwa biomassa yang tidak diperlakukant akan bersifat recalcitrant pada proses
pemecahan oleh enzim. Pengeringan sampel dalam preparasi untuk memudahkan
12
proses penggilingan karena bagas mengandung air 48 – 52%. Penggilingan bagas
menjadi bubuk bagas dilakukan agar proses perendaman oleh larutan NaOCl
(delignifikasi) dan NaOH (ekstraksi xilan) menjadi lebih mudah
homogensehingga penetrasi pereaksi sempurna danreaksi seragam (Fengel dan
Wegener 1995). Hasil dari proses penggilingan biasanya belum homogen dan
masih kasar, maka sampel perlu diayak untuk menghilangkan bahan yang masih
kasar sehingga dapat digiling kembali. Bubuk bagas hasil gilingan kemudian
diayak pada saringan mesh 40. Fengel dan Weneger (1995), menjelaskan bahwa
tidak ada aturan umum perihal ukuran partikel yang paling baik yang digunakan
dalam analisis kayu, tetapi ukuran partikel yang lazim berkisar antara 40-80 mesh
atau antara 0,05 dan 0,4 mm. Hasil dari proses preparasi fisik bagas kemudian
dilakukan anailsis proksimat.
Hasil Neraca Massa Tahapan Pretreatment Bagas
Setiap melalui tahapan pretreatment terjadi pengurangan berat bagas dari
1000 g menjadi 34 g pada akhir pemurnian xilan. Rendemen bagas hasil
delignifikasi sebanyak 704,74 g (29,74 %), dengan rendemen ekstraksi sebanyak
98,80 g xilan (9,9 %) dan setelah purifikasi didapatkan 3,4 % xilan murni (Tabel
2). Hasil serupa juga telah didapatkan dalam penelitian Richana et al. (1994),
bahwa xilan hasil ekstraksi dari bagas tebu mencapai 9,6 %.
Tabel 2 Hasil dari neraca massa tahapan pretreatment bagas tebu
Hasil
Tahap perlakuan
Berat (g)
Penurunan persentase (%)
Bagas
1000
100
Delignifikasi
704,74
29,52
Ekstraksi xilan
98,8
9,9
Pemurnian xilan
34
3,4
Penurunan terjadi karena hilangnya material selama proses penyaringan,
komponen lignin maupun polisakarida yang terlarut di dalam pelarut. Berdasarkan
studi yang sama Fengel dan Wegener (1995) menyimpulkan bahwa ekstraksi pada
jenis kayu lunak menggunakan larutan NaOH menghasilkan xilan antara 5%17,5%. Semakin tinggi konsentrasi yang digunakan maka semakin tinggi pula
tingkat kelarutan xilan. Bagian yang larut dalam media alkali tetapi dapat
mengendap dari larutan yang dinetralkan disebut -selulosa dan untuk selulosa
yang tidak larut dalam larutan NaOH kuat ialah jenis α-selulosa (Fengel dan
Wegener 1995). Selain melakukan pemisahan secara mekanik yakni sentrifugasi,
suspensi hasil ekstraksi masih perlu difraksinasi untuk memisahkan hemiselulosa
xilan dari fraksi pengotor seperti α-selulosa dan -selulosa. Sebanyak 50 g bagas
kombinasi perbandingan NaOCl 0,5 % dan etanol:supernatan (1:3) menghasilkan
rendemen xilan tertinggi sebesar 12,95 % (Richanaet al. 2007). Perbedaan hasil
rendemen xilan dalam penelitian tersebut diduga karena perbedaan biomassa dan
perbedaan jumlah bagas yang digunakan terlalu banyak (1000 g), sehingga proses
pengikatan xilan kurang merata dan dibutuhkan waktu perendaman yang lebih
lama.
13
Pemurnian hasil ekstraksi xilan menjadi penting karena masih terdapatnya
komponen-komponen pengotor lain, seperti selulosa dan lignin. -selulosa ialah
nama untuk bagian yang tetap larut meskipun dalam larutan yang dinetralkan
(Cross dan Bevan 1912; Fengel dan Wegener 1995). Selama ekstraksi dengan
larutan alkali kuat, maka bagian selulosa yang memiliki berat molekul rendah
dapat terlarut bersama-sama dengan hemiselulosa.
Analisis Komponen Kimia Bagas
Analisis komponen kimia menggunakan uji proksimat dan analisis
komponen serat. Tahapan pengujian ditampilkan pada lampiran 1. Hasil analisis
komponen kimia terhadap bagas disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3 Komposisi kimia hasil analisis komponen proksimat bagas sebelum dan
setelah delignifikasi
Hasil analisis (%)
Perlakuan
kadarair
protein
lemak
abu
serat kasar
2,45
1,97
0,39
1,55
30,34
10,66
1,30
2,30
27,38
Bagas raw
Bagas
terdelignifikasi
0,75
Berdasarkan hasil pengujian Tabel 3, analisis proksimat bagas raw
(sebelum di delignifikasi) menghasilkan total persentase bobot basah 36,7 % (total
persentase kadar air, protein, lemak, abu, dan serat kasar) dan menyisakan
komponen karbohidrat (by difference) sebesar 63,3 %. Analisis proksimat untuk
bagas terdelignifikasi menghasilkan persentase bobot basah sebesar 42,39 % dan
menyisakan komponen karbohidrat sebesar 57,61 %. Penghitungan persentase
kadar karbohidrat dapat dilihat pada Lampiran 1. Komponen karbohidrat terdiri
atas komponen serat atau penyusun senyawa makromolekul. Oleh karena itu perlu
diuji analisis kembali kandungan karbohidrat (Tabel 4). Menurut Fengel dan
Wegener (1995), setiap komponen kimia kayu dapat dibedakan menjadi senyawa
berberat molekul kecil yang terdiri atas bahan organik (ekstraktif) dan anorganik
(abu), kemudian senyawa makromolekul yang terdiri atas polisakarida (selulosa,
hemiselulosa) dan lignin.
Tabel 4 Komposisi kimia hasil analisis komponen serat sebelum dan setelah
delignifikasi
Perlakuan
BKa
NDFb
Hasil analisis (%)
Hemi
ADFc
selulosa
Bagas raw
90,23
89,16
77,62
Bagas
terdelignifikasi
88,83
76,3
52,33
a
Selulosa
Lignin
11,54
53,29
24,19
23,97
39,42
12,62
Bobot Kering.; bNeutral Detergent Fiber.; cAcid Detergent Fiber.
14
Berdasarkan rumus penghitungan Van Soest et al. (1991), penurunan
kadar komponen serat terjadi pada lignin sebesar 15,29 % dan selulosa sebesar
25,5 %. Namun, peningkatan persentase terjadi pada hemiselulosa dari 11,54 %
menjadi 23,97 %. Nilai persentase komponen serat setelah degradasi merupakan
selisih antara persentase setelah dan sebelum delignifikasi terhadap nilai mutlak
bobot (dengan perhitungan pada Lampiran 3).
Penelitian serupa dilakukan oleh Lee (2003), delignifikasi bagas dengan 1
% NaOCl mengalami penurunan persentase lignin sebesar 6,9 %. Penurunan
persentase lignin diikuti oleh penurunan selulosa sebesar 25,5 %, namun terjadi
kenaikan persentase pada hemiselulosa. Hal tersebut terjadi karena dalam proses
delignifikasi ada komponen polisakarida yang terlarut di dalam pelarut.
Menjelang akhir delignifikasi dapat terjadi kehilangan polisakarida (Fengel dan
Wegener 1995), sehingga mengurangi rendemen. Beg et al. (2001) menyatakan
bahwa xilan atau hemiselulosa berada diantara lignin dan kumpulan serat selulosa,
lapisan xilan berikatan secara kovalen dengan lignin dan non-kovalen dengan
selulosa melalui ikatan hidrogen. Pelarut sodium hipoklorit dalam penelitian ini
diduga mampu memutus ikatan kovalen dan melarutkan selulosa, sehingga terjadi
penurunan.
Penurunan lignin, selulosa, BK, NDF, ADF, protein, dan serat kasar akibat
perlakuan delignifikasi mampu memutuskan ikatan-ikatan lignoselulosa dan
lignohemiselulosa dengan efektif (Tabel 3,4). Fengel dan Wegener (1995)
pengaruh hidrolitik yang menyebabkan pemecahan rantai polisakarida. Ghunu dan
Tarmidi (2006) menyatakan bahwa akibat pemecahan polisakarida secara
enzimatis maupun proses kimiawi yang semakin lama mengakibatkan degradasi
NDF semakin bertambah banyak. Pada penelitian Ghunu dan Tarmidi (2006)
menyatakan bahwa hasil penurunan kandungan NDF, ADF, dan lignin pada
substrat rumput kering (Kume) terbaik ialah berdasarkan peningkatan kadar air
substrat tertinggi yaitu 77,5%. Penurunan serupa terjadi pada protein sebesar 0,67
% merupakan protein terdegradasi selama proses delignifikasi. Fengel dan
Wegener (1995) sel parenkim dalam bagian batang bukan kayu mengandung
protein sekitar 1%, yaitu pada kambium dan bagian kulit terdalam. Protein
tergolong senyawa ekstraktif pada bagas.
Hasil analisis sampel bebas air sering ditemukan perubahan berat kering
karena melalui proses pengeringan dan karena kesukaran penimbangan sampel
kering tanpa penyerapan uap air. Penurunan tersebut juga bisa disebabkan oleh
konsentrasi pelarut delignifikasi yang digunakan. Hasil penelitian Lee (2003),
pada konsentrasi NaOCl 1% terjadi kehilangan berat lebih sedikit yaitu 6,9 %
dibandingkan konsentrasi NaOCl 5 % yaitu sebesar 51 %. Hubungan antara
penurunan berat kering dengan konsentrasi pelarut dalam delignifikasi dikaitkan
dengan ikatan komplek lignin-polisakarida, jika konsentrasi yang digunakan
tinggi maka dapat terjadi kehilangan banyak polisakarida.
Penurunan persentase yang terjadi dalam protein berbanding terbalik dengan
persentase lemak, terjadi peningkatan sebesar 0,36 %. Lemak dan atau minyak
(gliserol) dalam kayu terdapat dalam bentuk asam asetat yang berikatan dengan
polisakarida sebagai ester, akibat dari proses delignifikasi beberapa ikatan tersebut
putus dan membentuk senyawa lemak tunggal. Komponen abu sebesar 1,55 %
lebih besar dibandingkan jenis kayu daerah beriklim sedang berkisar antara 0,2
dan 0,5 %, nilai tersebut bisa lebih besar jika berasal dari tanaman tebu bukan
15
limbah ampas tebu. Fengel dan Wegener (1995) dijelaskan bahwa kesalahan
menentukan kandungan abu kemungkinan disebabkan hilangnya sejumlah garam
amonia dan logam klorida atau juga disebabkan kurang efisiennya oksidasi
terhadap karbonat-karbonat dari logam-logam alkali. Peningkatan persentase yang
terjadi berarti prosedur tidak mengalami kesalahan analisis, karena tidak terjadi
pengurangan jumlah garam dan logam. Persentase penurunan serat kasar akan
berbdaning lurus dengan NDF dan ADF, jadi serat kasar juga dipengaruhi oleh
kadar air suatu bahan.
Hasil analisis proksimat dan komponen serat bagas sebelum diperlakukan
sdi atas (Tabel 3,4) berbeda dengan hasil analisis proksimat oleh Sandra et al.
(2007) yang menyatakan bahwa bagas (raw) mengandung selulosa 37,35 %,
hemiselulosa 23,66 %, lignin 25,10 %, senyawa ekstraktif lain 3,25 %, dan
senyawa abu 1,79 %, perbedaan tersebut dipengaruhi beberapa faktor seperti
perbedaan varietas tebu dan pengaruh pengambilan sampel acak di berbeda
tempat. Faktor yang mempengaruhi tersebut tidak dapat dikontrol dan
diseragamkan dikarenakan bahan dasar merupakan jenis limbah. Menurut Sun dan
Cheng (2002), bahwa kandungan bagas sebagai bahan lignoselulosa jenis kayu
lunak yang secara umum diketahui sebagai sisa hasil pertanian dan limbah
mengandung selulosa (40-50 %), hemiselulosa (25-35 %), dan lignin (25-35 %).
Delignifikasi Bagas
Lignin yang terdegradasi larut dalam media delignifikasi dalam bentuk
senyawa keton. Penggunaan konsentrasi yang kecil yaitu 1% NaOCl dalam proses
delignifikasi bertujuan untuk tidak banyak melarutkan hemiselulosa (xilan).
Pretreatment pada bahan lignoselulosa dapat menghilangkan lignin dan
hemiselulosa, mengurangi kristal selulosa, dan meningkatkan porositas material
(Sun dan Cheng 2002).
Beberapa oksidator lain, termasuk ozon, hidrogen peroksida, hipoklorit,
klorin, klorin dioksida, dan asam asetat telah dilakukan untuk delignifikasi secara
kimia pada biomassa (Chapman 2003). Berbeda dengan asam hipoklor dan klorin
yang tidak terurai, ion hipoklorit yang digunakaan dalam penelitian ini (NaOCl)
merupakan elektrofil dan bermuatan negatif sebagai nukleofil yang dapat
menyerang tempat-tempat bermuatan positif dalam substrat. Selain itu, ion
hipoklorit merupakan oksidan kuat yang dapat memecah ikatan-ikatan karbon
dengan karbon dalam struktur kayu (Sjötröm 1995). Oksidasi dapat meningkatkan
jumlah molekul positif dengan penghilangan satu atau lebih elektron dari atom
atau ion. Menurut Sjötröm (1995), ion-ion hipoklorit akan mendorong terjadinya
pemecahan ikatan pada gugus eter karena adanya pelepasan gugus-gugus hidroksil
fenol. Pada kompleks lignin-hemiselulosa maupun lignin-selulosa terdapat ikatan
ester atau eter maupun glikosida yang dapat dipecah oleh alkali. Penggunaan
larutan alkali di dalam delignifikasi karena kandungan alkali dapat memecah
ikatan ester dari xilan melalui ikatan asam 4-O-metil glukoronat.
16
Ekstraksi Xilan
Hemiselulosa xilan memiliki kelarutan tinggi dalam alkali (Richana et al.
2007), oleh karena itu NaOH digunakan dalam mengekstraksi xilan dari bagas. Su
et al. (2012) hasil delignifikasi bagas dengan NaOH 10 % menghasilkan
persentase lignin dari 19,32 % menjadi 7,32 %, dengan kehilangan hemiselulosa
dari 23,12 % menjadi 17,12 %. Hasil penelitian Richana et al. (2007), konsentrasi
NaOCl yang tinggi (7,5%) dapat membuat hemiselulosa hilang atau larut dalam
proses delignifikasi dan sebaliknya pada konsentrasi yang rendah hanya sebagian
hemiselulosa yang larut. Demikian pula dengan hasil penelitian Lee (2003),
persentase penurunan lignin dengan konsentrasi NaOCl 1% hanya menghilangkan
sebesar 24,4 % dibandingkan dengan konsentrasi NaOCl 5 % mencapai 63,3 %.
Perbandingan hasil tersebut menyimpulkan bahwa penggunaan NaOCl lebih
efektif dari pada NaOH sebagai pendegradasi lignin. Selain itu penggunaan NaOH
sebagai pendegradasi lignin justru akan melarutkan xilan yang akan diekstraksi
pada tahap selanjutnya.
Komponen-komponen hasil ekstraksi tidak dapat dipisahkan secara
SERTA PENCIRIAN XILANASE
GADING WILDA ANIRIANI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Penapisan Isolat Pendegradasi
Xilan Bagas serta Pencirian Xilanase adalah karya saya dengan komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi
manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam daftar pustaka dibagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
Gading Wilda Aniriani
NRP P051110121
RINGKASAN
GADING WILDA ANIRIANI. Penapisan isolat pendegradasi xilan bagas serta
pencirian xilanase. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan YOPI.
Xilanase merupakan enzim ekstraseluler yang dapat dihasilkan oleh
mikroba. Enzim ini digunakan secara luas dalam aplikasi bioteknologi. Xilanase
diproduksi menggunakan substrat xilan bagas. Penggunaan bagas sebagai
biomassa tidak akan bersaing dengan ketahanan pangan. Hidrolisis xilan bagas
tebu dapat menghasilkan produk xilooligosakarida. Xilan merupakan komponen
hemiselulosa pada bagas. Xilanase dapat menjangkau xilan dan secara mudah
mengkonversinya menjadi gula sederhana, oleh karena itu perlu dilakukan
pretreatment dan ekstraksi.
Selulosa secara alami diikat oleh hemiselulosa dan dilindungi oleh lignin,
oleh karena itu disebut dengan lignoselulosa. Adanya senyawa pengikat lignin
inilah yang menyebabkan bahan-bahan lignoselulosa sulit untuk dihidrolisa.
Pretreatment akan merusak dinding sel tanaman dan akan mempermudah akses
enzim pada polisakarida bagas. Pretreatment meliputi delignifikasi dan ekstraksi
xilan. Ekstraksi xilan bertujuan untuk memisahkan komponen xilan dengan
selulosa.
Proses pretreatment bagas meliputi delignifikasi menggunakan sodium
hipoklorit (NaOCl) 1% dan ekstraksi xilan menggunakan metode alkalin (NaOH
15%) sebagai pelarut. Terdapat tiga isolat bakteri xilanolitik yang berasal dari
Taman Nasional Bukit Duabelas (TNBD) Jambi yaitu isolat XJ (Xilanolitik
Jambi) no 17, 28 dan 30. Isolat tersebut kemudian diuji secara kualitatif dan
kuantitatif pada substrat xilan bagas. Uji kualitatif menggunakan metode
pewarnaan merah-kongo, sedangakan uji kuantitatif menggunakan metode DNS.
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan penapisan xilanase dari 3 bakteri
xilanolitik, mengkarakterisai xilanase isolat potensial dan menghidrolisis xilan
bagas. Isolat potensial pendegradasi xilan bagas diidentifikasi dengan 16S rRNA.
Produk hidrolisis dianalisis menggunakan KLT (Kromatografi Lapis Tipis).
Hasil ekstraksi xilan dari bagas diperoleh 9,9% xilan dari bagas dan setelah
pemurnian diperoleh 3,4 % xilan larut. Isolat yang dapat menggunakan substrat
xilan bagas dalam uji kualitatif yaitu no XJ28 dan XJ30. Aktivitas xilanase
tertinggi adalah isolat XJ28 pada xilan bagas diperoleh pada jam ke-96 masa
inkubasi dengan aktivitas 11,3 ± 0,6 U/mL, sedangkan pada isolat XJ30 sebesar
0,3 ± 0,005 U/mL pada jam ke-3 masa inkubasi. Produk ekstraksi xilan bagas
kemudian dibandingkan dengan produk komersial, xilanase XJ28 diproduksi dari
substrat xilan beechwood komersial (Sigma) dan mendapatkan aktivitas enzim
sebesar 11,5 ± 0,2 U/mL pada jam ke-48 masa inkubasi. Isolat XJ28 memiliki
karakter xilanase optimum pada pH 7 dengan suhu 50 °C, stabil sampai inkubasi
jam ke-72 pada suhu ruang maupun pada suhu 4 °C, dan bebas selulase.
Berdasarkan hasil tersebut, hidrolisis xilan bagas 0,5 % oleh xilanase ekstrak
kasar menghasilkan gula reduksi dengan BM yang sama dengan sukrosa.
Berdasarkan identifikasi 16S rRNA, isolat potensial XJ28 memiliki tingkat
kemiripan 99 % dengan Bacillus subtilis.
Kata kunci: xilanase, xilan bagas, hidrolisis, KLT, 16S rRNA.
SUMMARY
GADING WILDA ANIRIANI. Screening isolates degrading the xylan bagasse
and xylanases characteristic. Supervised by ANJA MERYANDINI and YOPI.
Xylanase extracellular enzyme is produced by various microbes. The
enzymes are widely used in biotechnology applications. Xylanase can produce
used the bagasse xylan substrate. The use of bagasse as biomass will not compete
with the food stability. Hydrolysis of bagasse xylan can produced
xylooligosaccaride. The main components of hemicellulose was xylan at bagasse.
Xylanase can reach xylan it easily convert into simple sugars, therefore it is
necessary for pretreatment and extraction.
Cellulosa was naturally bound by hemicellulose and was protected by
lignin, therefore called lignosellulose. The presence of lignin-binding compound
that causes lignocellulosic materials difficult to hydrolized. Pretreatment will
damage the cell walls of plants and will facilitate access to the enzyme of bagasse
polysaccharides. Pretreatment includes delignification and xylan estraction.
Xylan estraction aims to separate the compounents of xylan free cellulosa.
Pretreatment process included delignification using sodium hypochlorite
1% and xylans extraction using alkaline (NaOH 15%) as the solvent. There are
three isolate xylanolytic bacteria from Taman Nasional Bukit Duabelas (TNBD)
Jambi that is 17, 28 and 30 number isolate Xylanolytic Jambi (XJ). The isolate
were then tested qualitative and quantitative of the bagasse xylan substrate. The
qualitative test used Congo-Red stainning, whereas quantitative test used DNS
methode. This research aims was to the screening xylanases from three
xylanolytic bacteria, characterized the potential isolate xylanase and hidrolyzed
the xylan bagasse. The potential isolate degrading of xylan bagasse identified with
16S rRNA. The hydrolysis product was analysis used TLC (Thin Layer
Chromatography).
The result of the xylans extracted from bagasse was 9,9% xylan and after
purification was obtained 3,4% soluble xylan. Isolate was used the xylan bagasse
in qualitative test that is number XJ28 and XJ30. Xylanase activity isolate XJ28
has the highest activity at was 96 h of incubation time with activity at 11,3 U/mL,
whereas of isolat XJ30 that is 0,3 U/mL at was 3 h of incubation time. The
product of xylan bagasse extraction and than comparison with commercial
product, xylanase XJ28 produced from xylan beechwood commercial (Sigma) and
obtained enzyme activity that is 11,5 ± 0,2 U/mL at was 48 hour of incubation
time. Xylanase is isolate 28 has the optimum condition at pH 7 and 50 ºC, stable
up to 72 hr of incubation at room temperature and 4 ºC and free-cellulose. The
hydrolysis product using xylanase isolate XJ28 was reducing sugar with the
similiar molecular weight with sucrose. According identified 16S rRNA, isolate
XJ28 has a degree of similarity with the Bacillus subtilis.
Keywords : xylanase , bagasse xylan, hydrolysis , TLC, 16S rRNA.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PENAPISAN ISOLAT PENDEGRADASI XILAN BAGAS
SERTA PENCIRIAN XILANASE
GADING WILDA ANIRIANI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji Sidang Tesis: Dr Nisa Rachmania Mubarik MSi
Judul Tesis : Penapisan isolat pendegradasi xilan bagas serta pencirian xilanase
Nama
: Gading Wilda Aniriani
NIM
: P051110121
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Prof Dr Anja Meryandini MS
Ketua
Dr Yopi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Bioteknologi
Dekan Program Pascasarjana IPB
Prof Dr Ir Suharsono DEA
Dr Ir Dahrul Syah MSc Agr
Tanggal Ujian:
( 22 Agustus 2014)
Tanggal Lulus:
(
)
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2013 ini ialah
enzim, dengan judul Penapisan Isolat Pendegradasi Xilan Bagas serta Pencirian
Xilanase.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Prof Dr Anja Meryandini MS dan
Bapak Dr Yopi selaku pembimbing yang telah banyak memberi saran,
meluangkan waktu dan pikiran. Penulis juga tidak lupa berterima kasih kepada
Ibu Dr. Nisa Rachmania Mubarik Msi selaku penguji pada sidang tesis yang telah
memberikan kritik dan saran dalam penulisan. Di samping itu, penghargaan
penulis sampaikan kepada Kepala Laboratorium Bioenergi dan Fermentasi Pusat
Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Bapak Dr
Yopi beserta staf yang telah memberikan fasilitas penelitian. Penulis juga
menyampaikan terima kasih kepada Kepala Laboratorium Ilmu dan Teknologi
Pakan dalam analisis komponen serat bagas dan Kepala Pusat Penelitian
Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) yang telah membantu dalam
analisis proksimat sampel limbah tebu (bagas). Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada ayah, ibu, empat adik perempuan penulis (Kasyafia, Mega,
Su’aisyah, Aliyah), calon pendamping hidup penulis (Andaru) serta seluruh
keluarga besar, sahabat, teman-teman Bioteknologi IPB 2011 atas segala doa,
dukungan dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2014
Gading Wilda Aniriani
DAFTAR ISI
LEMBAR PENGESAHAN
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
1 PENDAHULUAN
Tujuan Penelitian
Hipotesis Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
2 METODE
Waktu dan Tempat
Bahan dan Alat
Tahapan Penelitian
Pretreatment Substrat Bagas
Penentuan kemampuan delignifikasi substrat
Bakteri Penghasil Xilanase
Produksi Xilanase
Karakteristik Xilanase
Hidrolisis Xilan Bagas dengan Xilanase
Identifikasi Bakteri dengan Analisis Gen 16S rRNA
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Pretreatment Bagas
Bakteri Penghasil Xilanase
Produksi Xilanase menggunakan Xilan Bagas
Perbandingan Aktivitas Xilanase dari xilan bagas dan xilan beechwood
(Sigma)
Karakteristik Enzim
Hidrolisis Xilan Bagas dengan Xilanase
Identifikasi Bakteri Potensial dengan Molekuler
4 KESIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
1
2
2
2
3
3
3
3
4
5
6
6
6
7
8
9
11
11
17
18
10
22
25
27
29
29
34
46
DAFTAR TABEL
1 Kelarutan xilan dalam beberapa pelarut
2 Hasil dari neraca massa tahapan pretreatment substrat
3 Komposisi kimia hasil analisis komponen proksimat sebelum dan
setelah delignifikasi
4 Komposisi kimia hasil analisis komponen serat sebelum dan
setelah delignifikasi
5 Data hasil Indeks Xilanolitik (IX) dari uji kualitaif pewarnaan merahkongo pada masing-masing isolat
6 Aktivitas xilanase sebelum dan sesudah proses dialisis
7 Perbedaan hasil nilai Rf pada sampel hasil hidrolisis dan stdanar gula
hasil KLT
8 Persentase kemiripan sekuen gen 16S rRNA isolat XJ28
5
12
13
14
18
25
27
28
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Diagram alir tahapan penelitian
Preparasi bagas secara fisik
Hasil pretreatment bagas tebu
Peremajaan tiga bakteri xilanolitik pada media xilan beechwood
(Sigma) selama 24 jam
Hasil analisis kualitatif bakteri xilanolitik pada substrat xilan bagas 0,5
% dengan metode pewarnaan merah-kongo 0,2 %
Grafik hubungan antara jumlah 10log TPC dengan aktivitas xilanase
selama inkubasi jam ke-0 sampai jam ke-168 dalam medium xilan
bagas 0,5 %.(pH 7) inkubasi pada suhu 28 °C dengan agitasi 150 g
Grafik perbedaan antara aktivitas xilanase isolat XJ28 yang diproduksi
dari xilan bagas dengan xilan beechwood (Sigma). Substrat uji xilan
beechwood (Sigma) 0,5 % pH 7 selama 30 menit.
Grafik pengaruh berbagai pH bufer terhadap aktivitas xilanase. Kondisi
uji pada bufer sitrat (3-5,5), bufer fosfat (6-7,5) dan bufer glisin NaOH
(8-10) masing-masing dengan konsentrasi 0,02 M, reaksi selama 30
menit
Grafik pengaruh berbagai suhu terhadap aktivitas xilanase
Grafik hubungan perbandingan lama waktu penyimpanan terhadap
aktivitas xilanase XJ28 pada kisaran suhu
Visualisasi KLT hasil hidrolisis xilanase XJ28 pada xilan bagas
Amplifikasi PCR terhadap gen 16S rRNA dengan primer 63 f dan
1387r
4
11
16
17
18
19
20
22
23
24
26
28
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
Prosedur analisis proksimat dan komponen serat
Nerasa massa ekstraksi xilan bagas tebu
Contoh penghitungan penurunan bobot komponen serat bagas
Analisis dan penghitungan aktivitas enzim
Hasil pensejajaran DNA isolat XJ 28 pada program MEGA
Hasil penghitungan TPC pada prekultur (pada OD620 = 0,7)
Surat Penerimaan artikel pada Jurnal Biologi Indonesia (JBI)
terakreditasi LIPI (Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia)
34
37
40
41
44
45
46
1
1 PENDAHULUAN
Enzim merupakan senyawa biokatalis berupa molekul polimer yang
tersusun atas asam amino. Enzim merupakan protein yang diproduksi dan
digunakan oleh sel hidup salah satunya untuk mengkonversi substrat menjadi
molekul yang bermanfaat. Enzim yang memiliki kemampuan dalam mendegradasi
hemiselulosa ialah xilanase, dalam hal ini xilan atau polimer dari xilosa dan xilooligosakarida. Xilanase merupakan jenis enzim yang digunakan secara luas dalam
bidang aplikasi bioteknologi, misalnya pada peternakan sebagai campuran pakan
ternak (Richana 2002), dikombinasikan dengan selulase dan pektinase dapat
digunakan untuk menjernihkan juice dan likuifikasi buah dan sayur (Beg et al.
2001), pada proses pemutihan kertas (Wang et al. 2010), untuk peningkatkan
kualitas roti (Zheng et al. 2011), dan produksi bioenergi seperti etanol (Samsuri et
al. 2009). Sebagian besar xilanase mampu mendegradasi jenis xilan, dan hanya
dibedakan dari produk akhir yang dihasilkan (Himmel 2008). Produk akhir yang
diharapkan pada masing-masing aplikasi dibutuhkan jenis xilanase spesifik.
Xilanase dapat diklasifikasikan berdasarkan spesifikasi pemecahan substrat pada
proses degradasi yaitu -xilosidase, endoxilanase, dan eksoxilanase (Richana
2002), dan arabinofuranosidase, glukuronidase, dan asetilxilan esterase (Prakash
et al. 2012). Endo-1,4- -xilanases (EC 3.2.1.8) menghidrolisis rantai utama xilan,
sedangkan -xilosidase (EC 3.2.1.37) memecah hasil oligomer menjadi monomer
xilosa (Saleem et al. 2012). Jenis mikroorganisme yang sudah umum
menghasilkan xilanase ialah bakteri. Sebagai sumber enzim, kelebihan bakteri
memiliki laju pertumbuhan yang cepat, dapat tumbuh pada substrat yang murah.
Berikut beberapa contoh bakteri yang telah diisolasi dan dapat menghasilkan
xilanase yaitu, Clostridium absonum CFR-702 (Rani dan Nand 2000), Bacillus sp
(Heck et al. 2006), Bacillus pumilus RXAIII-5 (Richana et al. 2007), dan
Alternaria sp. ND-16 (Li et al. 2009).
Xilosa atau xilo-oligisakarida merupakan produk komersial yang tidak
murah. Salah satu cara untuk menekan biaya produksi xilanase ialah dengan
memanfaatkan bahan dasar limbah sebagai medium tumbuh bakteri dan proses
hidrolisis. Beberapa contoh lignoselulosa yang dapat digunakan antara lain limbah
pertanian (rumput, alang-alang, sekam padi, jerami, batang gandum, tongkol, dan
jagung) dan limbah hasil samping industri fermentasi (molase,bagas)
(Iranmahboob et al. 2002; Campo et al. 2006). Salah satu bahan baku yang dapat
digunakan ialah limbah ampas tebu (bagasse atau bagas). Selain ketersediannya
yang melimpah juga tidak bersaing dengan bahan dasar pangan. Menurut
Lavarack et al. (2002) bagas merupakan hasil samping proses pembuatan gula
tebu (sugarcane) yang mengandung residu berupa serat. Minimal 50% serat bagas
diperlukan sebagai bahan bakar (ketel) sedangkan 50% sisanya hanya ditimbun
sebagai buangan yang memiliki nilai ekonomi rendah. Serat bagas umumnya
mengandung polisakarida yang tersusun atas 50%-55% selulosa, 15%-20%
hemiselulosa dan lignin sekitar 20-30%, selain itu sisanya disebut senyawa abu
(Pandey et al. 2000; Samsuri et al. 2009). Komponen kimia dari bagas secara rinci
meliputi 37,35 % glukan (selulosa), 23,66 % xilan (hemiselulosa), 2,1 % lignin,
3,25 % senyawa ekstraktif lain, dan 1,79 % senyawa abu (Sandra et al. 2007).
Bakteri dapat menghasilkan xilanase apabila diinduksi oleh substrat yang
mudah dipecah. Xilanase dapat menjangkau xilan dan secara mudah
2
mengkonversinya menjadi gula sederhana, oleh karena itu perlu dilakukan
pretreatment dan ekstraksi. Pretreatment bertujuan untuk memecah lignin
(delignifikasi) dan merusak struktur kristal yang mengikat selulosa (Sudiyani et
al. 2010), selain itu juga bertujuan untuk memecah bahan-bahan lignoselulosa
baik dari segi struktur dan ukuran. Himmel (2008) biomassa yang tidak
dipretreatment akan bersifat recalcitrant bagi mikrob. Menurut Iranmahboob et
al. (2002) adanya senyawa pengikat lignin itulah yang menyebabkan bahan-bahan
lignoselulosa sulit untuk dihidrolisis. Taherzadeh dan Karimi (2007) menjelaskan
bahwa hidrolisis enzimatis memiliki beberapa keuntungan dibandingkan hidrolisis
asam, antara lain: kondisi proses yang lebih lunak (suhu rendah, pH netral) dan
biaya pemeliharaan peralatan relatif rendah karena tidak ada bahan yang korosif.
Xilan merupakan komponen utama hemiselulosa pada tanaman. Struktur
xilan yang beragam memberikan pengaruh pada aktivitas xilanase yang berbeda
(Li et al. 2010). Keragaman xilanase disebabkan struktur yang beragam dari xilan,
oleh karena itu dilakukan karakterisasi xilanase untuk mengetahui kondisi
optimum dalam menghidrolisis xilan. Tseng et al. (2002) setiap aplikasi
memerlukan jenis xilanase dengan sifat tertentu. Dalam penelitian ini akan
diseleksi tiga isolat bakteri xilanolitik dari Taman Nasional Bukit Duabelas
(TNBD) Jambi dalam mendegradasi xilan bagas. Penelitian sebelumnya
(Kurrataa’yun β01γ), telah berhasil mengisolasi bakteri xilanolitik dari TNBD.
Bakteri yang telah diisolasi merupakan mikrob indigenos yang belum diteliti dan
belum diidentifikasi galurnya, terutama kemampuannya dalam menghasilkan
xilanase pada substrat xilan bagas. Bakteri xilanolitik potensial dalam substrat
xilan bagas akan dikarakterisasi xilanasenya untuk mendegradasi xilan bagas.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan xilan hasil ekstraksi dari limbah
ampas tebu (bagas) dan melakukan penapisan xilanase dari tiga isolat xilanolitik
pada substrat xilan bagas untuk degradasi xilan bagas serta mengkarakteristik
enzimnya, yang meliputi suhu, pH optimum, stabilitas dan produk hidrolisisnya.
Hipotesis Penelitian
Pretreatment bagas tebu mendapatkan ekstrak xilan dan bakteri xilanolitik
hasil isolasi dari Taman Nasional Bukit Duabelas (TNBD) Jambi dapat
menghasilkan enzim xilanase yang dihasilkan dari xilan bagas untuk proses
hidrolisis substrat xilan bagas.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan enzim xilanase potensial dari
tiga bakteri xilanolitik hasil isolasi dari Taman Nasional Bukit Duabelas TNBD
Jambi menggunakan substrat xilan bagas dalam menghasilkan produk gula dari
proses hidrolisis.
3
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini memiliki tema tentang enzim xilanase, selama ini xilanase
banyak digunakan dalam aplikasi bioteknologi. Penggunan xilanase dalam
beberapa proses industri dinilai sangat mahal sehingga diperlukan substrat untuk
produksi enzim berasal dari limbah bagas tebu. Ruang lingkup penelitian ini
mencakup bagaimana cara memperlakukan dan mengekstraksi limbah bagas agar
mudah digunakan oleh bakteri xilanolitik, mengkarakteristik xilanase agar
mendapatkan spesifikasi jenis xilanase dan mendapatkan produk hidrolisis berupa
gula sederhana (misalnya xilopentosa atau xilo-oligosakarida) dari hasil ekstraksi
bagas oleh enzim xilanase yang dihasilkan sendiri dari substrat tersebut. Xilanase
maupun produk gula sederhana yang dihasilkan merupakan penemuan baru dalam
menentukan aplikasi bioteknologi, mengingat bakteri xilanolitik merupakan isolat
indigenous baru yang belum diteliti sebelumnya.
2 METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan pada bulan Maret 2013 sampai dengan Maret 2014 di
Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi (LBF) bidang bioproses pada Pusat
Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong
Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan yaitu isolat bakteri xilanolitik hasil isolasi dari
Taman Nasional Bukit Duabelas, Jambi (kode isolat XJ no.17, 28 dan 30), limbah
ampas tebu (bagas), xilan beechwood (Sigma), media pertumbuhan dan produksi
meliputi 0,5% xilan bagas; 0,5% ekstrak khamir; 0,02% MgSO4; 0,1% K2HPO4;
0,5% bakto pepton. Bahan untuk pretreatment dan ekstraksi xilan terdiri atas
NaOCl, NaOH, HCl 37%, Carboxymethyl Cellulose (CMC) 0,5 % dan etanol
95%. Bahan-bahan lain berupa akuades, agar-agar, NaCl, larutan asam sulfat
pekat (H2SO4 pekat), pewarna merah kongo 0,2 %, membran dialisis, bufer (sitrat,
fosfat danglisin NaOH). Untuk proses analisis enzim secara kuantitatif ialah
reagen berupa larutan Dinitrosalicyclic Acid (DNS) yang terdiri atas DNS, NaOH
padat, dan Kalium Natrium Tartrat (KNa-tartrat). Untuk analisis Kromatografi
Lapis Tipis (KLT) ialah n-butanol, asam asetat, difenilamin, anilin, aseton, asam
fosfat, kertas KLT. Untuk identifikasi gen 16S rRNA ialah galur bakteri potensial
penghasil xilanase, bufer TAE (Tris Asetat EDTA), Etidium bromide, primer 63
F, 1387R, dan Genomic DNA mini kit (Geneid). Untuk elektroforesis, yaitu gel
agarose, Loading dye Fermentas, milli-Q. Alat yang digunakan yaitu, peralatan
analisis proksimat, shaker (Hithachi, Tokyo Japan), spektrofotometer UV-VIS
(Hitachi, U-3900H, Tokyo Japan), dan mesin Polymerase Chain Reaction (PCR).
4
Tahapan Penelitian
Bagas tebu
Pretreatment (delignifikasi
ekstraksi dan purifikasi xilan)
Tiga isolat
xilanolitik Jambi
Xilan bagas
Dialisis
s
Produksi xilanase
Karakteristik xilanase
(pengaruh pH, suhu, dan
stabilitas)
Uji kualitatif
(pewarnaan merah
kongo)
Uji kuantitatif
(metode DNS),
kurva tumbuh (TPC)
Isolat potensial
Identifikasi 16S rRNA
Hidrolisis xilan
secara enzimatik
Produk gula
Kromatografi Lapis Tipis
(KLT)
Gambar 1 Diagram alir tahapan penelitian
5
Pretreatment Substrat Bagas
Preparasi Bagas
Limbah tebu yang berupa ampas tebu di keringkan dengan oven pada suhu
80 ºC sampai kering dan dihancurkan dengan mesing giling. Setelah menjadi
serbuk bagas kemudian dilakukan pembubukan lolos saringan 40 mesh, hasil
modifikasi dari Lee (2003). Kandungan total selulosa, hemiselulosa, lignin dan
lain-lain pada bagas didapatkan dari analisis proksimat dan komponen serat.
Tahapan proses analisis dapat dilihat pada Lampiran 1.
Delignifikasi
Delignifikasi serbuk bagas dilakukan berdasarkan penelitian Richana et al.
(2007) (yang telah dimodifikasi) dengan menggunakan pelarut natrium hipoklorit
(NaOCl) 1%, proses delignifikasi dilakukan selama 5 jam pada suhu ruang.
Hasilnya kemudian dicuci sampai bau NaOCl nya hilang, lalu dilakukan proses
penyaringan untuk membuang air yang mengandung lignin. Bubuk bagas
kemudian dikeringkan pada suhu 50 ºC selama 48 jam. Hasil delignifikasi
dianalisis proksimat dan komponen serat kembali untuk mendapatkan kandungan
selulosa, hemiselulosa dan lignin setelah delignifikasi. Tahapan neraca massa
proses pretreatment dapat dilihat pada Lampiran 2.
Ekstraksi Xilan dari Bagas
Metode ekstraksi xilan menggunakan metode dari Richana et al. (2007).
Ekstraksi xilan menggunakan NaOH sebagai larutan pengekstrak xilan dari bagas,
karena sifat kelarutannya pada xilan (Tabel 1). Padatan hasil delignifikasi
direndam dalam larutan natrium hidroksida (NaOH) 15% pada suhu 28ºC selama
24 jam untuk mendapatkan ekstrak xilan. Setelah 24 jam dilakukan penyaringan
dengan menggunakan kain saring, filtrat (suspensi) yang dihasilkan dari proses
ekstraksi diukur pH nya kemudian dinetralkan dengan menggunakan HCl 37%
sampai netral (pH 7). Suspensi kemudian di sentrifuge pada 6000 g selama 15
menit. Supernatan mengandung ekstrak xilan, sedangkan endapan dibuang. Xilan
yang larut dalam supernatan dibersihkan dengan menambahkan etanol 95%.
Etanol ditambahkan pada supernatan dengan perbandingan supernatan-etanol
ialah 1:3 kemudian dilakukan sentrifuge kembali dengan kecepatan 6000 g selama
15 menit. Hasil dari sentrifugasi tersebut ialah endapan yang mengandung xilan.
Tabel 1 Kelarutan xilan dalam beberapa pelaruta
Pelarut
Kelarutan
NaOH 1%
+++ (sangat larut)
Air Panas (90 ºC)
++ (larut)
Air Dingin (27 ºC)
+ (sedikit larut)
HCl 1N
- (tidak larut)
a
Sumber: Richana et al. (2007).
6
Penentuan Kemampuan Delignifikasi Substrat
Substrat hasil delignifikasi dengan NaOCl 1 % yang telah dikeringkan
dalam oven 5 ºC selama 48 jam. Substrat ini selanjutnya digunakan untuk analisis
kandungan selulosa, hemiselulosa dan lignin menggunakan metode Van Soest et
al. (1991). Persentase kehilangan bobot substrat dihitung dengan persamaan
berikut:
Susut bobot (%) =
Keterangan :
BKO = Bobot Kering Oven (g)
Penurunan kadar komponen serat (sebagai lignin, selulosa, hemiselulosa) dihitung
berdasarkan rumus:
Persentase penurunan komponen serat (%) =
Keterangan :
x = kadar komponen serat sebelum delignifikasi (%)
y = kadar kompnen serat setelah delignifikasi (%)
z = susut bobot (%)
Bakteri Penghasil Xilanase
Peremajaan Isolat
Isolat XJ (no. 17, 28 dan 30) masing-masing diremajakan dengan cara
menumbuhkannya pada media padat xilan (beechwood, Sigma) 0,5%, kemudian
cawan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang.
Uji Kualitatif (Pewarnaan Merah-Kongo)
Uji kualitatif pertumbuhan masing-masing bakteri XJ (isolat 17, 28 dan 30)
dilakukan dengan mengambil sebanyak 2 µL suspensi bakteri kemudian
diinokulasikan pada media padat xilan bagas 0,5% dan diinkubasi selama 24-48
jam pada suhu ruang. Uji dilakukan dengan pewarna merah kongo 0,2% dalam
media kultur bakteri sampai semua lapisan tergenang selama 15 menit. Kemudian
dicuci (destainning) dengan NaCl 2%. Pengamatan zona bening dilakukan sebagai
indikator aktivitas enzim.
Produksi Xilanase
Kurva pertumbuhan bakteri dan kurva aktivitas xilanase
Prekultur dibuat dengan cara menginokulasikan masing-masing isolat
bakteri yang telah diinkubasi selama 24 jam, sebanyak 1 ose biakan dari media
padat xilan bagas 0,5% ke dalam 20 mL media cair xilan bagas 0,5% (v/v) pH 7
dalam erlenmeyer 250 mL. Prekultur kemudian diinkubasi selama 8-24 jam pada
7
suhu ruangdi 150 g (OD 620 nm antara 0,5-0,8). Pencawanan prekultur dilakukan
pada pengenceran 10-6-10-8.
Sebanyak 15 mL (10%v/v) biakan hasil prekultur dimasukkan ke dalam
135 mL media cair xilan bagas 0,5% pH 7 dan suhu ruang.Inkubasi dilakukan
selama 7 hari dalam suhu ruang pada 150 g. Sampling dilakukan setiap 3, 6, 9, 12,
18, 24, 30, 36,48, 60, 72, 96, 120, 144, dan 168 jam. Setiap sampling diambil
sebanyak 3 mL ke dalam tabung eppendorf steril secara aseptik, sebanyak 1 mL
diencerkan untuk dihitung koloni bakterinya dengan metode Total Plate Count
(TPC). Sebanyak 2 mL disentrifugasi suhu 4ºC pada 15.000 g selama 10 menit.
Supernatan sebagai enzim ekstrak kasar diuji aktivitasnya.
Uji aktivitas enzim xilanase dilakukan berdasarkan metode DNS (Miller
1959) pada masing-masing bakteri. Nilai absorban yang diperoleh dikonversi
menjadi konsentrasi gula pereduksi menggunakan persamaan yang didapat dari
kurva standar xilosa. Pembuatan kurva standar xilosa dapat dilihat pada lampiran
1. Satu unit aktivitas enzim xilanase (U) didefinisikan sebagai sejumlah enzim
yang dapat mengkatalisis konversi dari 1 µmol xilan menjadi xilosa dalam 1 menit
(Prakash et al. 2012). Aktivitas xilanase dihitung menggunakan rumus sebagai
berikut:
Aktivitas enzim = Gula reduksi (mg/mL) x FP x 1000
Waktu reaksi x BM xilosa
PerbandinganAktivitas Xilanase yang Diproduksi dari Xilan Bagas
dengan Xilan Beechwood Komersial (Sigma)
Isolat potensial hasil penapisan kualitatif dan kuantitatif kemudian
diproduksi xilanasenya dari medium produksi xilan komersial. Enzim ekstrak
kasar yang dihasilkan, kemudian diuji aktivitas xilanase nya menggunakan
metode DNS. Substrat uji aktivitas xilanase menggunakan xilan beechwood
(Sigma) 0,5 % dengan kondisi uji dalam bufer fosfat 0,02 M (pH 7) pada suhu
ruang. Waktu produksi xilanase terbaik didapatkan dari aktivitas enzim tertinggi.
Karakteristik Xilanase
Pengaruh pH terhadap Aktivitas Xilanase
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim xilanase dilakukan dengan
mereaksikan enzim ekstrak kasar dengan substrat xilan bagas 0,5% yang
dilarutkan dalam bufer dengan kisaran pH 4,0 sampai 11,0 pada suhu ruang.
Untuk pH 4,0-5,0 digunakanbufer sitrat 0,02 M, untuk pH 6,0-7 digunakan bufer
fosfat 0,02 M dan untuk pH 8-10 digunakan bufer glisin NaOH. Sampel enzim
yang dianalisa saat produksi tertinggi yang diperoleh dari kurva aktivitas enzim.
Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk
menggunakan metode DNS.
8
Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Xilanase
Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim xilanase dilakukan dengan
mereaksikan enzim dengan substrat xilan bagas 0,5 % yang dilarutkan dalam
bufer 0,02 M pada pH optimum di suhu γ0, 40, 50, 60, 70, 80, dan 90 ◦C. Sampel
enzim yang dianalisa saat produksi tertinggi yang diperoleh dari kurva aktivitas
enzim. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk
menggunakan metode DNS.
Stabilitas Enzim
Stabilitas enzim didapatkan pada dua kondisi yaitu pada suhu optimum
dan suhu ruang. Masing-masing crude enzymes hasil sentrifuge dipisahkan
sebanyak 100 mL dan didiamkan pada suhu ruang dan pada suhu optimum.
Pengamatan dilakukan per jam sampai 5 jam dan jika selama 5 jam aktivitas
enzim masih tinggi maka diamati per 24 jam. Aktivitas xilanase dihitung
berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode DNS. Uji
aktivitas dilakukan pada kondisi optimum enzim.
Menentukan Xilanase Bebas-Selulase
Menentukan xilanase yang bebas-selulase, enzim ekstrak kasar isolat
potensial diuji aktivitas selulase menggunakan metode DNS. Substrat uji aktivitas
selulase menggunakan Carboxymethyl Cellulose (CMC) 0,5 % dengan kondisi uji
dalam bufer fosfat 0,02 M (pH 7) pada suhu ruang. Waktu produksi xilanase
terbaik didapatkan dari aktivitas enzim tertinggi.
Hidrolisis Xilan Bagas dengan Xilanase
Preparasi Enzim dengan Dialisis
Enzim ekstrak kasar sebanyak ± 60 mL dimasukkan ke dalam membran
dialisis. Proses dialisis dilakukan dengan merendam membran dalam 1 L bufer
fosfat 0,02 M pH 7 selama 5-6 jam pada suhu 4 °C. Perlakuan dikondisikan dalam
keadaan teraduk dengan magnetik stirer. Penggantian bufer dilakukan satu kali.
Aktivitas enzim diuji sebelum dan sesudah dialisis menggunakan metode DNS.
Proses Hidrolisis
Hidrolisis dilakukan dengan mereaksikan substrat xilan bagas 0,5 % dalam
enzim ekstrak kasar xilanase. Sampel dianalisis pada jam ke-0, 2.5, 5, dan 24 jam.
Reaksi hidrolisis dihentikan dengan dipanaskan pada suhu 100 °C selama 15
menit, kemudian disentrifuge pada 12.000 g 15 menit. Supernatan sebagai sampel
yang dianalisis.
Analisis Gula Pereduksi
Jumlah gula pereduksi yang terbentuk dari hasil sakarifikasi ditentukan
dengan metode DNS (Miller 1959). Larutan standar dibuat dari berbagai macam
9
konsentrasi xilosa yang telah diencerkan dari 1000 ppm, pembuatan standar gula
pereduksi dapat dilihat pada lampiran 4.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Sampel hasil dari proses sakarifikasi diambil sebanyak 1 µL ditotolkan di
kertas kromatografi. Larutan standart xilosa 1000 ppm dibuat sebagai kontrol
pencapaian gula reduksi yang dihasilkan. Larutan eluen dibuat dengan komposisi
12 mL n- butanol: 6 mL asam asetat: 6 mL akuades, kemudian dijenuhkan selama
30 menit. Sampel dan standar ditotolkan padakertas kromatografi, kemudian
kertas kromatografi direndam ke dalam eluen dan ditutup rapat sampai 1 jam.
Pengeringan dengan hair dryer di dalam ruangan asam, kemudian disemprotkan
larutan DAP yang terdiri dari 0,2 g difenilamin, 0,2 mL aniline, 10 mL aseton,
dan 1,5 mL asam fosfat, keringkan kembali setelah itu panaskan pada suhu 100 ◦C
selama 15 menit. Nilai Rf (Retention factor) dapat dihitung dengan rumus berikut.
Rf = Jarak yang ditempuh substansi
Jarak yang ditempuh pelarut
Identifikasi Bakteri dengan Analisis Gen 16S rRNA
Ekstraksi DNA Genom Menggunakan Kit
Ekstraksi DNA genom menggunakan GenomicDNA mini Kit (Blood/
cultured cell). Tahap pertama (pre-lisis) yaitu dengan menumbuhkan isolat bakteri
dalam media padat xilan. Koloni sel yang tumbuh kemudian disuspensikan ke
dalam akuades steril. Suspensi disentrifugasi 14.000-16.000 g selama 1 menit.
Endapan di suspensikan ke dalam 200 µL bufer GT, lalu diresuspensi dan
divortex. Suspensi kemudian diinkubasi pada suhu 60 ºC selama 10 menit
(swirling setiap 3 menit). Tahap kedua (pengikatan DNA), ditambahkan sebanyak
200 µL etanol absolut, kemudian divortex selama 10 menit. Apabila masih ada
endapan, dihancurkan dengan pipeting. Semua campuran dituang ke kolom (filter)
GD, kemudian disentrifugasi 14.000-16.000 g selama 2 menit (tabung koleksi
dibuang/ tabung tampungan filtrat, menyisakan kolom). Tahap ketiga (pencucian),
ditambahkan sebanyak 400 µL bufer W1 pada kolom GD kemudian sentrifugasi
kembali 14.000-16.000 g selama 30-60 menit. Cairan yang ada ditabung koleksi
dibuang dan diletakkan kembali kolom pada tabung reaksi. Sebanyak 600 µL
wash buffer (yang telah ditambah etanol) ditambahkan, kemudian sentrifugasi
14.000-16.000 g selama 30-60 menit. Cairan yang ada dalam tabung koleksi
dibuang. Kolom diletakkan pada tabung koleksi kemudian disentrifugasi 14.00016.000 g selama 3 menit. Tahap ke-empat (elusi DNA), memindahkan kolom
pada tabung mikro baru. Sebanyak 100 µL preheated bufer elusi atau TE
ditambahkan pada tengah-tengah kolom (jika sampel sedikit, hanya 30-50 µL
bufer elusi). Suspensi diinkubasi pada 37 ºC selama 3-10 menit. Kemudian
sentrifugasi 14.000-16.000 g selama 30-60 menit, pelet sebagai DNA. Sebelum
digunakan di cuci terlebih dahulu dengan wash bufer + 100 µL etanol absolut.
Komposisi reaksi PCR terdiri atas enzim La Taq DNA polimerase 0.5 µL, 2x
bufer GC 25 µL, dNTP mixture 8 µL, masing-masing primer (10 pmol) 1.5 µl,
10
ddH2O 9.5 µL, dan DNA template 4 µL. Primer forward6γF (5′-CAG GCC TAA
CAC ATG CAA GTC-γ′) danprimerreverse 1γ87R (5′-GGG CGG WGT GTA
CAA GGC-γ′). Kondisi PCR yang digunakan yaitu pre-denaturasi (94ºC, 4 menit),
denaturasi (94ºC, 45 detik), annealing (55ºC, 1 menit), elongation (72ºC, 1 menit
10 detik), dan post PCR (72ºC, 7 menit) dengan jumlah siklus sebanyak 30 siklus.
Elektroforesis Hasil PCR
Setelah proses amplifikasi dengan PCR selesai maka dilakukan analisis
elektroforesis untuk mendeteksi DNA ke dalam sumur gel agarose, sedangkan
untuk marker sebanyak 0,5 µL ditambahkan 0,5 µL Loading dye Fermentas dan 2
µL milli-Q dan dicampur kemudian dimasukkan dalam sumur yang berbeda.
Proses elektroforesis dilakukan selama 60 menit dengan voltase 50 V dalam
larutan buffer TAE 0,5 %. DNA hasil amplifikasi yang telah dielektroforesis
divisualisasikan dengan perendaman agarose yang mengandung DNA target ke
dalam larutan etidium bromide selama 15 menit, kemudian setelah dibilas dengan
akuades selama 10 menit. Dengan menggunakan UV transluminator, pita DNA
akan terlihat dan dapat diketahui ukurannya berdasarkan pendana ukuran molekul
yang dinyatakan dengan base pair (bp).
Identifikasi Bakteri Potensial
Sekuensing dilakukan di Laboratorium 1st BASE Singapure dan data
sekuen parsial yang diperoleh akan melalui proses pengeditan dengan
menggunakan program Bioedit. Setelah diperoleh data hasil urutan nukleotida
berdasarkan amplifikasi dengan primer universal, maka homologinya akan
dibandingkan dengan prokariota lain yang terdapat pada situs web
(http://www.ncbi.go.id).
11
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
PretreatmentBagas
Preparasi Bagas
Limbah bagas tebu didapatkan dari beberapa tempat yang berbeda, yakni
berasal dari limbah industri minuman dan limbah restoran. Proses pretreatment
bagas membutuhkan sebanyak 1000 g serbuk bagas kering. Berikut ialah proses
preparasi bagas secara bertahap sebelum dilakukan pretreatment yang disajikan
dalam Gambar 2.
(a)
(b)
(c)
(d)
Gambar 2
Preparasi bagas secara fisik. Limbah ampas tebu (bagas) basah
(a), pengeringan pada suhu 80 ºC selama ±24 jam sampai kering
(b), penggilingan (c), bagas lolos mesh 40 (d)
Gula dari tanaman tebu dihasilkan melalui proses penggilingan atau
ekstraksi dan meninggalkan bagas sebagai limbahnya. Bagas tebu masih
mengandung gula sehingga dapat dimanfaatkan baik sebagai substrat untuk
menghasilkan enzim maupun di degradasi hingga memiliki nilai ekonomi.
Menurut Riyanti (2008), ketersediaan bagas sebagai substrat relatif melimpah,
yaitu sekitar 30-40% dari total proses penggilingan tebu setiap produksi. Proses
tersebut biasanya membutuhkan lima tahap, yaitu penggilingan, pengepresan,
fermentasi, distilasi, dan dehidrasi. Limbah bagas yang digunakan dalam
penelitian ini telah melewati dua proses yakni penggilingan dan pengepresan.
Pretreatment limbah ampas tebu (bagas) meliputi proses preparasi bagas secara
fisik (Gambar5), delignifikasi, ekstraksi xilan, dan purifikasi xilan (pengujian
berikutnya). Pretreatment akan merusak dinding sel tanaman dan akan
mempermudah akses enzim pada polisakarida tanaman (Gray et al. 2006). Proses
pretreatment pada penelitian ini bertujuan untuk mempermudah proses untuk
mencapai tahap hidrolisis menggunakan enzim. Gray et al. (2006) menyatakan
bahwa biomassa yang tidak diperlakukant akan bersifat recalcitrant pada proses
pemecahan oleh enzim. Pengeringan sampel dalam preparasi untuk memudahkan
12
proses penggilingan karena bagas mengandung air 48 – 52%. Penggilingan bagas
menjadi bubuk bagas dilakukan agar proses perendaman oleh larutan NaOCl
(delignifikasi) dan NaOH (ekstraksi xilan) menjadi lebih mudah
homogensehingga penetrasi pereaksi sempurna danreaksi seragam (Fengel dan
Wegener 1995). Hasil dari proses penggilingan biasanya belum homogen dan
masih kasar, maka sampel perlu diayak untuk menghilangkan bahan yang masih
kasar sehingga dapat digiling kembali. Bubuk bagas hasil gilingan kemudian
diayak pada saringan mesh 40. Fengel dan Weneger (1995), menjelaskan bahwa
tidak ada aturan umum perihal ukuran partikel yang paling baik yang digunakan
dalam analisis kayu, tetapi ukuran partikel yang lazim berkisar antara 40-80 mesh
atau antara 0,05 dan 0,4 mm. Hasil dari proses preparasi fisik bagas kemudian
dilakukan anailsis proksimat.
Hasil Neraca Massa Tahapan Pretreatment Bagas
Setiap melalui tahapan pretreatment terjadi pengurangan berat bagas dari
1000 g menjadi 34 g pada akhir pemurnian xilan. Rendemen bagas hasil
delignifikasi sebanyak 704,74 g (29,74 %), dengan rendemen ekstraksi sebanyak
98,80 g xilan (9,9 %) dan setelah purifikasi didapatkan 3,4 % xilan murni (Tabel
2). Hasil serupa juga telah didapatkan dalam penelitian Richana et al. (1994),
bahwa xilan hasil ekstraksi dari bagas tebu mencapai 9,6 %.
Tabel 2 Hasil dari neraca massa tahapan pretreatment bagas tebu
Hasil
Tahap perlakuan
Berat (g)
Penurunan persentase (%)
Bagas
1000
100
Delignifikasi
704,74
29,52
Ekstraksi xilan
98,8
9,9
Pemurnian xilan
34
3,4
Penurunan terjadi karena hilangnya material selama proses penyaringan,
komponen lignin maupun polisakarida yang terlarut di dalam pelarut. Berdasarkan
studi yang sama Fengel dan Wegener (1995) menyimpulkan bahwa ekstraksi pada
jenis kayu lunak menggunakan larutan NaOH menghasilkan xilan antara 5%17,5%. Semakin tinggi konsentrasi yang digunakan maka semakin tinggi pula
tingkat kelarutan xilan. Bagian yang larut dalam media alkali tetapi dapat
mengendap dari larutan yang dinetralkan disebut -selulosa dan untuk selulosa
yang tidak larut dalam larutan NaOH kuat ialah jenis α-selulosa (Fengel dan
Wegener 1995). Selain melakukan pemisahan secara mekanik yakni sentrifugasi,
suspensi hasil ekstraksi masih perlu difraksinasi untuk memisahkan hemiselulosa
xilan dari fraksi pengotor seperti α-selulosa dan -selulosa. Sebanyak 50 g bagas
kombinasi perbandingan NaOCl 0,5 % dan etanol:supernatan (1:3) menghasilkan
rendemen xilan tertinggi sebesar 12,95 % (Richanaet al. 2007). Perbedaan hasil
rendemen xilan dalam penelitian tersebut diduga karena perbedaan biomassa dan
perbedaan jumlah bagas yang digunakan terlalu banyak (1000 g), sehingga proses
pengikatan xilan kurang merata dan dibutuhkan waktu perendaman yang lebih
lama.
13
Pemurnian hasil ekstraksi xilan menjadi penting karena masih terdapatnya
komponen-komponen pengotor lain, seperti selulosa dan lignin. -selulosa ialah
nama untuk bagian yang tetap larut meskipun dalam larutan yang dinetralkan
(Cross dan Bevan 1912; Fengel dan Wegener 1995). Selama ekstraksi dengan
larutan alkali kuat, maka bagian selulosa yang memiliki berat molekul rendah
dapat terlarut bersama-sama dengan hemiselulosa.
Analisis Komponen Kimia Bagas
Analisis komponen kimia menggunakan uji proksimat dan analisis
komponen serat. Tahapan pengujian ditampilkan pada lampiran 1. Hasil analisis
komponen kimia terhadap bagas disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3 Komposisi kimia hasil analisis komponen proksimat bagas sebelum dan
setelah delignifikasi
Hasil analisis (%)
Perlakuan
kadarair
protein
lemak
abu
serat kasar
2,45
1,97
0,39
1,55
30,34
10,66
1,30
2,30
27,38
Bagas raw
Bagas
terdelignifikasi
0,75
Berdasarkan hasil pengujian Tabel 3, analisis proksimat bagas raw
(sebelum di delignifikasi) menghasilkan total persentase bobot basah 36,7 % (total
persentase kadar air, protein, lemak, abu, dan serat kasar) dan menyisakan
komponen karbohidrat (by difference) sebesar 63,3 %. Analisis proksimat untuk
bagas terdelignifikasi menghasilkan persentase bobot basah sebesar 42,39 % dan
menyisakan komponen karbohidrat sebesar 57,61 %. Penghitungan persentase
kadar karbohidrat dapat dilihat pada Lampiran 1. Komponen karbohidrat terdiri
atas komponen serat atau penyusun senyawa makromolekul. Oleh karena itu perlu
diuji analisis kembali kandungan karbohidrat (Tabel 4). Menurut Fengel dan
Wegener (1995), setiap komponen kimia kayu dapat dibedakan menjadi senyawa
berberat molekul kecil yang terdiri atas bahan organik (ekstraktif) dan anorganik
(abu), kemudian senyawa makromolekul yang terdiri atas polisakarida (selulosa,
hemiselulosa) dan lignin.
Tabel 4 Komposisi kimia hasil analisis komponen serat sebelum dan setelah
delignifikasi
Perlakuan
BKa
NDFb
Hasil analisis (%)
Hemi
ADFc
selulosa
Bagas raw
90,23
89,16
77,62
Bagas
terdelignifikasi
88,83
76,3
52,33
a
Selulosa
Lignin
11,54
53,29
24,19
23,97
39,42
12,62
Bobot Kering.; bNeutral Detergent Fiber.; cAcid Detergent Fiber.
14
Berdasarkan rumus penghitungan Van Soest et al. (1991), penurunan
kadar komponen serat terjadi pada lignin sebesar 15,29 % dan selulosa sebesar
25,5 %. Namun, peningkatan persentase terjadi pada hemiselulosa dari 11,54 %
menjadi 23,97 %. Nilai persentase komponen serat setelah degradasi merupakan
selisih antara persentase setelah dan sebelum delignifikasi terhadap nilai mutlak
bobot (dengan perhitungan pada Lampiran 3).
Penelitian serupa dilakukan oleh Lee (2003), delignifikasi bagas dengan 1
% NaOCl mengalami penurunan persentase lignin sebesar 6,9 %. Penurunan
persentase lignin diikuti oleh penurunan selulosa sebesar 25,5 %, namun terjadi
kenaikan persentase pada hemiselulosa. Hal tersebut terjadi karena dalam proses
delignifikasi ada komponen polisakarida yang terlarut di dalam pelarut.
Menjelang akhir delignifikasi dapat terjadi kehilangan polisakarida (Fengel dan
Wegener 1995), sehingga mengurangi rendemen. Beg et al. (2001) menyatakan
bahwa xilan atau hemiselulosa berada diantara lignin dan kumpulan serat selulosa,
lapisan xilan berikatan secara kovalen dengan lignin dan non-kovalen dengan
selulosa melalui ikatan hidrogen. Pelarut sodium hipoklorit dalam penelitian ini
diduga mampu memutus ikatan kovalen dan melarutkan selulosa, sehingga terjadi
penurunan.
Penurunan lignin, selulosa, BK, NDF, ADF, protein, dan serat kasar akibat
perlakuan delignifikasi mampu memutuskan ikatan-ikatan lignoselulosa dan
lignohemiselulosa dengan efektif (Tabel 3,4). Fengel dan Wegener (1995)
pengaruh hidrolitik yang menyebabkan pemecahan rantai polisakarida. Ghunu dan
Tarmidi (2006) menyatakan bahwa akibat pemecahan polisakarida secara
enzimatis maupun proses kimiawi yang semakin lama mengakibatkan degradasi
NDF semakin bertambah banyak. Pada penelitian Ghunu dan Tarmidi (2006)
menyatakan bahwa hasil penurunan kandungan NDF, ADF, dan lignin pada
substrat rumput kering (Kume) terbaik ialah berdasarkan peningkatan kadar air
substrat tertinggi yaitu 77,5%. Penurunan serupa terjadi pada protein sebesar 0,67
% merupakan protein terdegradasi selama proses delignifikasi. Fengel dan
Wegener (1995) sel parenkim dalam bagian batang bukan kayu mengandung
protein sekitar 1%, yaitu pada kambium dan bagian kulit terdalam. Protein
tergolong senyawa ekstraktif pada bagas.
Hasil analisis sampel bebas air sering ditemukan perubahan berat kering
karena melalui proses pengeringan dan karena kesukaran penimbangan sampel
kering tanpa penyerapan uap air. Penurunan tersebut juga bisa disebabkan oleh
konsentrasi pelarut delignifikasi yang digunakan. Hasil penelitian Lee (2003),
pada konsentrasi NaOCl 1% terjadi kehilangan berat lebih sedikit yaitu 6,9 %
dibandingkan konsentrasi NaOCl 5 % yaitu sebesar 51 %. Hubungan antara
penurunan berat kering dengan konsentrasi pelarut dalam delignifikasi dikaitkan
dengan ikatan komplek lignin-polisakarida, jika konsentrasi yang digunakan
tinggi maka dapat terjadi kehilangan banyak polisakarida.
Penurunan persentase yang terjadi dalam protein berbanding terbalik dengan
persentase lemak, terjadi peningkatan sebesar 0,36 %. Lemak dan atau minyak
(gliserol) dalam kayu terdapat dalam bentuk asam asetat yang berikatan dengan
polisakarida sebagai ester, akibat dari proses delignifikasi beberapa ikatan tersebut
putus dan membentuk senyawa lemak tunggal. Komponen abu sebesar 1,55 %
lebih besar dibandingkan jenis kayu daerah beriklim sedang berkisar antara 0,2
dan 0,5 %, nilai tersebut bisa lebih besar jika berasal dari tanaman tebu bukan
15
limbah ampas tebu. Fengel dan Wegener (1995) dijelaskan bahwa kesalahan
menentukan kandungan abu kemungkinan disebabkan hilangnya sejumlah garam
amonia dan logam klorida atau juga disebabkan kurang efisiennya oksidasi
terhadap karbonat-karbonat dari logam-logam alkali. Peningkatan persentase yang
terjadi berarti prosedur tidak mengalami kesalahan analisis, karena tidak terjadi
pengurangan jumlah garam dan logam. Persentase penurunan serat kasar akan
berbdaning lurus dengan NDF dan ADF, jadi serat kasar juga dipengaruhi oleh
kadar air suatu bahan.
Hasil analisis proksimat dan komponen serat bagas sebelum diperlakukan
sdi atas (Tabel 3,4) berbeda dengan hasil analisis proksimat oleh Sandra et al.
(2007) yang menyatakan bahwa bagas (raw) mengandung selulosa 37,35 %,
hemiselulosa 23,66 %, lignin 25,10 %, senyawa ekstraktif lain 3,25 %, dan
senyawa abu 1,79 %, perbedaan tersebut dipengaruhi beberapa faktor seperti
perbedaan varietas tebu dan pengaruh pengambilan sampel acak di berbeda
tempat. Faktor yang mempengaruhi tersebut tidak dapat dikontrol dan
diseragamkan dikarenakan bahan dasar merupakan jenis limbah. Menurut Sun dan
Cheng (2002), bahwa kandungan bagas sebagai bahan lignoselulosa jenis kayu
lunak yang secara umum diketahui sebagai sisa hasil pertanian dan limbah
mengandung selulosa (40-50 %), hemiselulosa (25-35 %), dan lignin (25-35 %).
Delignifikasi Bagas
Lignin yang terdegradasi larut dalam media delignifikasi dalam bentuk
senyawa keton. Penggunaan konsentrasi yang kecil yaitu 1% NaOCl dalam proses
delignifikasi bertujuan untuk tidak banyak melarutkan hemiselulosa (xilan).
Pretreatment pada bahan lignoselulosa dapat menghilangkan lignin dan
hemiselulosa, mengurangi kristal selulosa, dan meningkatkan porositas material
(Sun dan Cheng 2002).
Beberapa oksidator lain, termasuk ozon, hidrogen peroksida, hipoklorit,
klorin, klorin dioksida, dan asam asetat telah dilakukan untuk delignifikasi secara
kimia pada biomassa (Chapman 2003). Berbeda dengan asam hipoklor dan klorin
yang tidak terurai, ion hipoklorit yang digunakaan dalam penelitian ini (NaOCl)
merupakan elektrofil dan bermuatan negatif sebagai nukleofil yang dapat
menyerang tempat-tempat bermuatan positif dalam substrat. Selain itu, ion
hipoklorit merupakan oksidan kuat yang dapat memecah ikatan-ikatan karbon
dengan karbon dalam struktur kayu (Sjötröm 1995). Oksidasi dapat meningkatkan
jumlah molekul positif dengan penghilangan satu atau lebih elektron dari atom
atau ion. Menurut Sjötröm (1995), ion-ion hipoklorit akan mendorong terjadinya
pemecahan ikatan pada gugus eter karena adanya pelepasan gugus-gugus hidroksil
fenol. Pada kompleks lignin-hemiselulosa maupun lignin-selulosa terdapat ikatan
ester atau eter maupun glikosida yang dapat dipecah oleh alkali. Penggunaan
larutan alkali di dalam delignifikasi karena kandungan alkali dapat memecah
ikatan ester dari xilan melalui ikatan asam 4-O-metil glukoronat.
16
Ekstraksi Xilan
Hemiselulosa xilan memiliki kelarutan tinggi dalam alkali (Richana et al.
2007), oleh karena itu NaOH digunakan dalam mengekstraksi xilan dari bagas. Su
et al. (2012) hasil delignifikasi bagas dengan NaOH 10 % menghasilkan
persentase lignin dari 19,32 % menjadi 7,32 %, dengan kehilangan hemiselulosa
dari 23,12 % menjadi 17,12 %. Hasil penelitian Richana et al. (2007), konsentrasi
NaOCl yang tinggi (7,5%) dapat membuat hemiselulosa hilang atau larut dalam
proses delignifikasi dan sebaliknya pada konsentrasi yang rendah hanya sebagian
hemiselulosa yang larut. Demikian pula dengan hasil penelitian Lee (2003),
persentase penurunan lignin dengan konsentrasi NaOCl 1% hanya menghilangkan
sebesar 24,4 % dibandingkan dengan konsentrasi NaOCl 5 % mencapai 63,3 %.
Perbandingan hasil tersebut menyimpulkan bahwa penggunaan NaOCl lebih
efektif dari pada NaOH sebagai pendegradasi lignin. Selain itu penggunaan NaOH
sebagai pendegradasi lignin justru akan melarutkan xilan yang akan diekstraksi
pada tahap selanjutnya.
Komponen-komponen hasil ekstraksi tidak dapat dipisahkan secara