The use of probiotic on aquaculture media as water additive to control the infection of aeromonas hydrophila in cyprinid (Cyprinus carpio)

PEMBERIAN PROBIOTIK PADA MEDIA BUDIDAYA

UNTUK PENGENDALIAN Aeromonas hydrophila

PADA IKAN MAS (Cyprinus carpio)

ALFABETIAN HARJUNO CONDRO HADITOMO

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis dengan judul Pemberian Probiotik pada Media Budidaya untuk Pengendalian Aeromonas hydrophila pada Ikan Mas (Cyprinus carpio) adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Oktober 2011

Alfabetian Harjuno Condro Haditomo NIM C151090051

ABSTRACT

ALFABETIAN HARJUNO CONDRO HADITOMO. The Use of Probiotic on Aquaculture Media as Water Additive to control the Infection of Aeromonas hydrophila in Cyprinid (Cyprinus carpio). Under direction of WIDANARNI and ANGELA MARIANA LUSIASTUTI.

The use of probiotic on aquaculture media as water additive becomes one of the alternatives solution for fish farmers to control the infection of A. hydrophila in cyprinid culture. It was easier and more possible to implement for fish culture. The aimed of this research was to know the concentration of A. hydrophila in media aquaculture that can cause Motile Aeromonad Septicemia (MAS) of the cyprinids and to know the effect of probiotic B. firmus in controlling growth of A. hydrophila. This research comprised 4 treatments with 3 replications, namely: PAP treatment (A. hydrophila 102_{cfu/ml + B. firmus} 106_{cfu/ml every 2 days for 2 week), PAS (A. hydrophila10}2_{cfu/ml + B. firmus10}6 cfu/ml and siphon every 2 days for 2 week), PC (A. hydrophila 102cfu/ml + B. firmus 108_{cfu/ml every 2 days for 2 week), and PK (no addition). Data were} analyzed descriptively, using tables, graphs and figures. The results showed that the concentration of A. hydrophila on media aquaculture that can cause Motile Aeromonad Septicemia (MAS) of the cyprinids were around 107-108 cfu/ml, and might be worst when the cyprinids were stressfull. The best results of this research was PAP treatment (A. hydrophila102_{cfu/ml +B. firmus10}6_{cfu/ml every} 2 days for 2 week) with survival rate 100%.

Keywords: probiotic on aquaculture media, Aeromonas hydrophila, Bacillus firmus, Cyprinus carpio

ALFABETIAN HARJUNO CONDRO HADITOMO. Pemberian Probiotik pada Media Budidaya untuk Pengendalian Aeromonas hydrophila pada Ikan Mas (Cyprinus carpio). Dibimbing oleh WIDANARNI dan ANGELA MARIANA LUSIASTUTI.

Pemberian probiotik pada media budidaya menjadi salah satu solusi alternatif bagi pembudidaya ikan dalam mengendalikan serangan A. hydrophila pada budidaya ikan mas (Cyprinus carpio). Dengan cara ini maka probiotik lebih mudah dan memungkinkan untuk diterapkan dalam budidaya perikanan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui konsentrasi dari A. hydrophila di media budidaya yang dapat menyebabkan Motile Aeromonad Septicemia (MAS) pada ikan mas (Cyprinus carpio) serta pengaruh penambahan probiotik yang dapat menekan pertumbuhan A. hydrophiladi media budidaya.

Penelitian ini dilaksanakan di Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Bogor. Penelitian ini dilaksanakan dalam empat tahapan dengan berbagai perlakuan di setiap tahapannya. Hasil dari setiap tahapan menjadi dasar penentu keputusan pada penelitian tahap selanjutnya. Data utama penelitian ini berupa tingkat kelangsungan hidup, fase pertumbuhan bakteri, kepadatan bakteri pada media budidaya beserta data pendukung berupa kualitas air, gejala klinis, dan perubahan gambaran darah, akan dianalisa secara deskriptif dengan menggunakan tabel, grafik dan gambar.

Penelitian tahap pertama mengenai pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya. Hasil pertumbuhan tertinggi A. hydrophila pada media budidaya adalah dengan kondisi tanpa aerasi dan penambahan bahan organik yang berasal dari pakan. Penelitian tahap kedua berkaitan dengan pertumbuhan probiotik Bacillus firmus pada media budidaya. Hasil pertumbuhan tertinggi probiotik B. firmus pada media budidaya adalah dengan kondisi beraerasi dan penambahan bahan organik yang berasal dari pakan. Konsentrasi terbaik probiotik B. firmus yang di uji tantang A. hydrophila 102cfu/mL pada kondisi in vitro adalah 106cfu/mL dan 108cfu/mL. Penelitian tahap tiga mengenai infeksi A. hydrophila pada ikan uji melalui media budidaya. Hasil yang diperoleh pada penelitian tahap ketiga ini adalah data kelangsungan hidup ikan uji selama penelitian yang didukung data pemanfaatan pakan, gambaran darah, dan gejala klinis. Penelitian tahap keempat adalah aplikasi probiotik B. firmus pada media budidaya. Dari penelitian ini diperoleh hasil terbaik berturut-turut adalah pada perlakuan PAP yaitu dengan penambahan probiotik B. firmus 106 cfu/mL setiap dua hari dengan tingkat kelangsungan hidup mencapai 100%. Selanjutnya perlakuan PAS dengan penambahan probiotik B. firmus106 _{cfu/mL dan penyiponan setiap 2 hari sekali.} Lalu perlakuan PC dengan penambahan probiotik B. firmus 108 cfu/mL dengan SR 75%. Terakhir adalah perlakuan PK yaitu perlakuan tanpa penambahan probiotik B. firmusdengan SR 50%.

© Hak Cipta milik IPB, Tahun 2011 Hak Cipta dilindungi Undang-undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ALFABETIAN HARJUNO CONDRO HADITOMO

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Program Studi Ilmu Akuakultur

MAYOR ILMU AKUAKULTUR

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Nama : Alfabetian Harjuno Condro Haditomo

NIM : C151090051

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Widanarni, M.Si

Ketua AnggotaDr. drh. Angela Mariana L, M.Si

Diketahui

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana

Ilmu Akuakultur

PRAKATA

Puji syukur atas segala rahmat, hidayah serta karunia Allah SWT, sehingga karya ilmiah dengan judul “Pemberian Probiotik pada Media Budidaya untuk Pengendalian Aeromonas hydrophila pada Ikan Mas (Cyprinus carpio)” dapat diselesaikan dengan baik. Penulis mengucapkan terimakasih kepada:

1. Dr.Ir.Widanarni, M.Si dan Dr. drh. Angela Mariana Lusiastuti, M.Si atas waktu, tuntunan, kesabaran, kebijaksanaan, serta bimbingan dan arahan yang selalu diberikan hingga tesis ini dapat diselesaikan.

2. Dr.Ir. Sukenda, M.Sc selaku penguji luar komisi yang telah memberikan saran dan masukan untuk kesempurnaan tesis ini.

3. Prof.Dr.Ir. Enang Harris, MS sebagai Ketua Program Studi Ilmu Akuakultur yang telah banyak memberikan bantuan selama menempuh pendidikan di Institut Pertanian Bogor.

4. Seluruh jajaran pimpinan, peneliti, teknisi, administrasi dan rekan-rekan di Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Bogor atas segala bantuan dan fasilitas yang diberikan.

5. Kementrian Pendidikan Nasional yang telah memberikan Beasiswa selama mengikuti pendidikan S2.

6. Ayahanda Hari Supranoto dan Ibunda Sri Supiana, Bapak Mertua Dedy Tinardi (Alm) dan Ibu Mertua Hj. Dewi Puspahati yang telah memberikan cinta dan kasih sayang, doa serta semangat yang tak pernah henti kepada penulis. Adik-adik dan kakak-kakakku Destian Bimantoro, Krestian Tripratomo, Retno Palupi, Reny Purwandari serta seluruh keluarga besar yang selalu memberikan do`a, dukungan dan semangat.

7. Istri tercinta Rina Puspitasari, sumber inspirasi dan semangatku Diandra Azzahra Sari Haditomo atas kasih sayang, pengertian, dukungan, kesabaran, pengorbanan, dan doa yang diberikan

8. Teman-teman Akuakultur 2009 (Reza Samsudin, Rahman, Tanbiyaskur, Hary Krettiawan, Aras Syazili, Syafrizal Putra, Anwar Hasan, Eulis Marlina, Dian Febriani, Sefti Heza, Jenny Abidin, Iko Imelda Arisa, Muznah Toatubun, Dewi Puspaningsih, Riri Ezraneti, Mulyani, Novi Mayasari, Zuraida, Erna Thalib, Wahyuni Fanggitasik, Jacqueline Sahetapy, Jakomina Metungun, Mariana Beruatjaan, Ary Agus Twilasto, Romeos Kalvari).

9. Semua pihak yang tidak dapat disebut satu persatu yang telah memberikan segala doa dan bantuan baik moril maupun materil.

Bogor, Oktober 2011 Alfabetian Harjuno Condro Haditomo

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 08 September 1983, putra pertama dari tiga bersaudara pasangan Bapak Hari Supranoto dan Ibu Sri Supiana.

Tahun 2000 Penulis lulus dari SMU Negeri 2 Tegal. Pada tahun yang sama penulis melanjutkan pendidikan Strata Satu (S1) pada Program Studi Budidaya Perairan, Jurusan Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Diponegoro, Semarang dan berhasil lulus pada Tahun 2005.

Tahun 2006 penulis bekerja sebagai staf pengajar di Program Studi Budidaya Perairan, Jurusan Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Diponegoro Semarang hingga saat ini. Tahun 2009, Penulis melanjutkan studi pada Program Master (S2) di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Mayor Ilmu Akuakultur.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL... iv

DAFTAR GAMBAR ... vii

DAFTAR LAMPIRAN... viii

PENDAHULUAN ... 1

Latar Belakang ... 1

Rumusan Masalah... 2

Tujuan dan Manfaat Penelitian... 3

Hipotesis ... 3

TINJAUAN PUSTAKA ... 5

Probiotik Akuakultur ... 5

Bacillus firmus ... 7

Aeromonas hydrophila... 8

Gambaran Darah ... 10

Hematokrit ... 10

Hemoglobin ... 11

Eritrosit ... 11

Leukosit ... 12

METODE PENELITIAN... 13

Waktu dan Tempat Penelitian... 13

Pemilihan Ikan Uji dan Bakteri (Patogen dan Probiotik) ... 13

Bahan dan Media ... 13

Prosedur Penelitian ... 13

Penelitian Tahap I ... 14

Penelitian Tahap II ... 15

Penelitian Tahap III... 16

Penelitian Tahap IV... 17

Pengukuran Parameter ... 17

Fase pertumbuhan bakteri ... 17

Kelangsungan hidup... 18

Gejala klinis ... 18

Gambaran darah ... 18

Kadar hematokrit... 18

Analisa Data... 20

HASIL DAN PEMBAHASAN... 21

Penelitian Tahap I ... 21

Identifikasi bakteri patogen uji ... 21

Pertumbuhan A. hydrophila pada media broth... 22

Pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya ... 24

Penelitian Tahap II ... 25

Identifikasi probiotik uji ... 26

Pertumbuhan B. firmus pada media broth... 26

Pertumbuhan B. firmus pada media budidaya ... 27

Penelitian Tahap III... 30

Kelangsungan hidup... 30

Tingkat pertumbuhan A. hydrophilapada media budidaya ... 32

Pemanfaatan pakan... 33

Kadar hemoglobin... 35

Kadar hematokrit... 36

Total eritrosit... 36

Total leukosit... 38

Infeksi A. hydrophila terhadap histopatologi ginjal dan hati ikan ... 38

Penelitian Tahap IV... 40

Kualitas Media Budidaya... 43

SIMPULAN DAN SARAN ... 45

Simpulan ... 45

Saran... 45

DAFTAR PUSTAKA ... 46

DAFTAR TABEL

Halaman 1 Identifikasi A. hydrophilahasil reisolasi dari ikan uji……….. ₂₂ 2 Kepadatan A. hydrophila setelah 24 jam pada media broth

(TSB)………. 23

3 Identifikasi probiotik B. firmus……….... ₂₆ 4 Kepadatan probiotik B. firmus setelah 24 jam pada media broth

(TSB) ... 26 5 Perbandingan kultur bersama probiotik B. firmus dengan A.

hydrophila……… 29

6 Waktu kematian ikan uji pada infeksi A. hydrophila melalui

media budidaya ……… 31

Halaman 1 Landasan penelitian dan pengembangan probiotik sebagai agen

biokontrol dalam akuakultur……… 5

2 A. hydrophilapada media agar ………. 21

3 Ikan sakit pada uji Postulat Koch………... 22

4 Kurva pertumbuhan A. hydrophila pada media broth pengamatan setiap 2 jam selama 24 jam ………. 23

5 Pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya ……….. 24

6 Kondisi DO media budidaya yang didalamnya ditambahkan A. hydrophila102cfu/ml di awal penelitian ……… 25

7 Kurva pertumbuhan B. firmus pada media broth setiap 2 jam selama 24 jam ……….. 27

8 Pertumbuhan probiotik B. firmuspada media budidaya ………... 28

9 Koloni A. hydrophila pada media budidaya probiotik B. firmus.. 28

10 Tingkat kelangsungan hidup ikan uji... 30

11 Kepadatan A. hydrophiladi media budidaya (Log 10cfu/ml)…….. 32

12 Kurva pemanfaatan pakan ikan uji ……….. 34

13 Kadar hemoglobin ikan uji selama penelitian………... 35

14 Kadar hematokrit ikan uji selama penelitian ………... 36

15 Total eritrosit ikan uji ……….. 37

16 Total Leukosit ikan uji ……… 38

17 Kondisi ginjal dan hati ikan uji ……….. 39

18 Tingkat kelangsungan hidup ikan uji setelah pemberian probiotik.. 41 19 a) Koloni A. hydrophila dan probiotik B. firmus yang tumbuh

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1 Perubahan pola renang ikan mas penelitian tahap 3………...… ₅₇ 2 Perubahan aktivitas makan ikan mas penelitian tahap 3………. 58 3 Kepadatan A. hydrophila selama penelitian ……….... 59 4 Kepadatan bakteri probiotik B. firmus selama penelitian…………. 60

Latar Belakang

Salah satu kendala yang umum dihadapi dalam budidaya ikan adalah adanya serangan penyakit yang disebabkan oleh bakteri. Permasalahan ini meningkat seiring dengan semakin intensifnya suatu usaha budidaya perikanan. Intensifikasi suatu usaha budidaya ditandai dengan meningkatnya padat tebar dan pemberian pakan pada suatu usaha budidaya.

Hatmanti et al. (2009) menyatakan bahwa beberapa bakteri patogen yang sering menimbulkan permasalahan bagi pembudidaya ikan adalah Vibrio sp., Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Streptococcus sp., Pasteurella sp., dan Mycobacterium sp. Penyakit bakterial yang sering menyerang berbagai jenis ikan pada berbagai tingkatan umur adalah Aeromonas hydrophila. Pada tahun 1980 pernah terjadi wabah yang disebabkan oleh A. hydrophila di daerah Jawa Barat dan sekitarnya, menimbulkan kerugian yang sangat besar bagi para pembudidaya berbagai spesies ikan air tawar.

Motile Aeromonad Septicemia (MAS) yang disebabkan oleh A. hydrophila merupakan permasalahan yang dihadapi oleh pembudidaya di seluruh dunia. A. hydrophila ini tidak hanya menyerang ikan mas saja, namun juga menyerang berbagai ikan air tawar lain. Tahun 2002, Dinas Peternakan dan Perikanan Kabupaten Bogor melaporkan jumlah total ikan mas yang mati akibat serangan bakteri yang diduga kuat A. hydrophila hingga mencapai 200 ton, di lain daerah yakni Pemerintah Daerah Kuningan menyebutkan adanya kematian 800 ton ikan mas siap jual. Kejadian tahun 2006, di Provinsi Sumatra Barat terjadi kematian hampir mencapai 47 ton ikan gurame karena serangan A. hydrophila, sedangkan di Kabupaten Bogor para petani sering mengeluhkan kematian ikan mas, lele, dan patin akibat serangan bakteri ini walau dalam jumlah sedikit (Hidayat 2006).

Mikroflora yang berada di lingkungan perairan dan saluran pencernaan organisme akuatik menunjukkan peran yang menguntungkan dalam menghadapi serangan penyakit (Gomez-Gil et al. 2000). Menurut Gatesoupe (1999);

2

sebagai probiotik. Probiotik seringkali digunakan sebagai upaya pencegahan serangan bakteri patogen yang lebih aman dibandingkan dengan penggunaan antibiotik yang menimbulkan resistensi bakteri terhadap antibiotik tersebut. Aplikasi penggunaan probiotik dapat dilakukan dengan beberapa metode yaitu melalui pencampuran pakan dan perendaman atau pemberian probiotik pada media budidaya.

Rumusan Masalah

A. hydrophila merupakan bakteri patogen oportunistik yang bersifat fakultatif anaerob dan umum ada di setiap perairan (Burton & Lanza 1986; Palumbo et al. 1992; Inglis et al. 1993; Harikrishnan et al. 2005), oportunistik atau tidak menjadi berbahaya jika dalam kondisi budidaya yang baik, akan tetapi bila kondisi budidaya buruk, seperti adanya perubahan lingkungan yang menyebabkan tingkat stres ikan meningkat, akan dapat menyebabkan kematian masal (Harikrishnan et al. 2005), baik pada ukuran benih maupun induk dalam waktu yang relatif singkat sehingga mengakibatkan kerugian yang cukup besar. Namun demikian hingga saat ini belum diketahui secara pasti tingkat kepadatan A. hydrophila yang dapat memicu timbulnya serangan penyakit pada ikan mas pada media budidaya.

Manipulasi terhadap populasi mikroba yang berada di perairan guna pencegahan sebelum terjadinya serangan bakteri yang bersifat mematikan perlu dilakukan sebagaimana konsep probiotik sebagai biokontrol. Namun demikian penggunaan probiotik di dunia perikanan saat ini memakan biaya yang cukup tinggi karena harus digunakan secara rutin setiap hari atau beberapa hari sekali hingga waktu panen tiba. Sehingga diperlukan solusi yang lebih baik dan tepat di dalam pemakaian probiotik untuk dapat menekan biaya produksi dan meningkatkan keuntungan usaha budidaya perikanan.

Dengan optimalisasi pemberian probiotik pada saat yang tepat sebelum terjadi peningkatan kepadatan A. hydrophila yang dapat memicu timbulnya serangan penyakit pada ikan di media budidaya, maka besar kemungkinan biaya produksi dari penggunaan probiotik dapat ditekan dan budidaya mendapatkan hasil yang optimal.

Tujuan dan Manfaat Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui konsentrasi A. hydrophila di media budidaya yang dapat menyebabkan MAS pada ikan mas, serta pengaruh penambahan probiotik yang dapat menekan pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya.

Manfaat dari penelitian ini adalah dengan mengetahui tingkat konsentrasi A. hydrophila yang dapat menyebabkan MAS pada ikan mas, maka dapat dilakukan pencegahan terhadap kemungkinan terjadinya serangan yang mematikan dengan cara memberikan probiotik yang dapat menekan pertumbuhan A. hydrophiladi media lingkungan budidaya. Diharapkan hasil dari penelitian ini dapat mengatasi permasalahan yang ada pada budidaya ikan mas dengan lebih efektif dan efisien.

Hipotesis

Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah pemberian probiotik pada media budidaya dapat menekan dan mengendalikan infeksi A. hydrophila.

TINJAUAN PUSTAKA

Probiotik Akuakultur

Probiotik adalah bakteri hidup yang ditambahkan ke dalam pakan yang dapat memberikan keuntungan bagi inang dengan memperbaiki keseimbangan bakteri di dalam ususnya (Fuller 1992). Namun demikian, pengertian ini menjadi berkembang bagi hewan akuatik yang berarti sebagai bakteri hidup yang memberikan pengaruh menguntungkan bagi inang dengan memodifikasi komunitas bakteri atau berasosiasi dengan inang, menjamin perbaikan dalam penggunaan pakan atau memperbaiki nutrisinya, memperbaiki respon inang terhadap penyakit atau memperbaiki kualitas lingkungannya (Verschuere et al. 2000).

Gambar 1 Landasan penelitian dan pengembangan probiotik sebagai agen biokontrol dalam akuakultur (Verschuere et al.2000).

Bakteri probiotik memiliki mekanisme kerja yang dapat dibagi menjadi beberapa cara, yakni: produksi senyawa inhibitor; kompetisi terhadap senyawa kimia (Fe) atau sumber energi (nutrisi); kompetisi terhadap tempat pelekatan; peningkatan respon imun (kekebalan); perbaikan kualitas air; dan interaksi dengan fitoplankton.

Dalam proses seleksi probiotik, Farzanfar (2006) menyebutkan bahwa bakteri probiotik setidaknya harus memiliki kriteria sebagai berikut: (1) bersifat antagonis terhadap patogen (Fuller 1992; Austin et al. 1995; Moriarty 1999; Ali 2000; Verschuere et al. 2000; Irianto dan Austin 2002). Probiotik seharusnya mampu menstimulasi sistem imunitas dari inang dengan meningkatkan jumlah eritrosit, makrofaga dan limfosit (Irianto dan Austin 2002). Ciri utama bakteri yang bersifat antagonistik terhadap patogen adalah menghasilkan bahan antimikrobial seperti asam organik, hidrogen peroksida, sideropheros dan juga lisosim (Verschuere et al. 2000; Irianto dan Austin 2002). (2) Berguna atau bermanfaat bagi inang dengan berbagai cara, diantaranya promoter pertumbuhan atau melindungi ikan dari bakteri patogen, menghasilkan berbagai bahan-bahan penting seperti biotin dan vitamin B12 (Fuller 1992; Irianto dan Austin 2002). (3) Memiliki kemampuan bertahan hidup pada organisme akuatik (Fuller 1992; Ali 2000; Verschuere et al. 2000). Sama halnya dengan keberadaan dari suatu jenis bakteri dominan dengan kepadatan tinggi pada media budidaya yang mengindikasikan kemampuan pertumbuhan bakteri yang sangat baik pada kondisi lingkungan yang umum. Diduga juga bahwa jenis bakteri tersebut mampu berkompetisi dengan sangat efisien dengan bakteri merugikan lainnya (Verschuere et al. 2000). (4) Pelekatan atau lokasi hidup dari bakteri merupakan salah satu yang terpenting dalam kriteria seleksi bakteri probiotik karena hal ini termasuk dalam prasyarat pembentukan suatu koloni (Fuller 1992; Verschuere et al. 2000). (5) Pengaplikasian bakteri probiotik harus stabil dalam jangka waktu yang cukup lama dalam proses penyimpanannya sebaik di kondisi alam (Fuller 1992). (6) Sesuai dengan sifat bakteri probiotik itu sendiri, maka bakteri ini harus bersifat nonpatogen, nontoksik, dalam kaitannya menghindari berbagai efek yang tidak diinginkan terhadap inang/ikan (Fuller 1992). (7) Bakteri probiotik seharusnya berasal atau ditemukan dari organ target ikan yang diinginkan. Hal ini

7

didasarkan pada alasan ekologis yang berkaitan dengan habitat asli dari kandidat bakteri probiotik (misal: mikroorganisme flora yang terdapat di saluran pencernaan). Probiotik dari habitat aslinya memiliki peluang hidup dan tumbuh yang lebih besar dibandingkan kompetitor asing dari luar sistem, dan mereka menunjukkan pertumbuhan dalam jumlah sebagai buktinya (Riquelme et al. 1997; Jo¨born et al. 1997; Rengpipat et al. 2003).

Saat ini probiotik sudah menjadi bagian tak terpisahkan dalam budidaya perikanan untuk mendapatkan produksi yang tingi. Probiotik yang umum digunakan termasuk spesies dari Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Carnobacterium, Shewanella, Bacillus, Aeromonas, Vibrio, Enterobacter, Pseudomonas, Clostridium, dan Saccharomyces. Keterkaitan probiotik dalam nutrisi, ketahanan terhadap penyakit, dan berbagai keuntungan lainnya pada ikan sudah diyakini dan tidak diragukan lagi. Salah satu keuntungan yang paling umum diakibatkan oleh adanya probiotik adalah memodulasi sistem imun dengan menstimulasi imun non spesifik secara sistemik baik dalam kondisi in vitro maupun in vivo. Pemberian probiotik baik satu spesies ataupun multispesies mampu meningkatkan aktivitas pagositas, lisosim, komplemen, respiratory burst dengan baik pada ikan. Sama halnya dengan probiotik dapat meningkatkan sistem imun yang ditandai dengan meningkatnya jumlah sel-sel Igp dan acidophilic granulocytes. Berbagai faktor seperti sumber probiotik, dosis, lama pemberian akan memberikan efek yang sangat penting dalam aktivitas immunomodulatory dari probiotik (Nayak 2010).

Bacillus firmus

Bakteri ini merupakan bakteri nontoksik, tidak patogen, berperan sebagai anti infeksius, dan mengaktifasi makrofaga serta dapat merangsang limfosit B (Lomakova 2005). Secara taksonomi B. firmus dapat diklasifikasikan kedalam Filum Firmicutes, Kelas Bacilli, Ordo Bacillales, Famili Bacillaceae, Genus Bacillus, Spesies Bacillus firmus.

Secara morfologi B. firmus memiliki ciri diantaranya adalah termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif, motil oleh flagel peritrichous, memiliki endospora berbentuk oval, bundar atau silinder. Bakteri ini bersifat fakultatif aerob. Secara fisiologi sangat tahan terhadap fluktuasi suhu, pH dan salinitas serta

tumbuh pada suhu 30o_{C. Bakteri ini juga tersebar luas pada bermacam-macam} habitat, tidak bersifat patogen terhadap vertebrata ataupun invertebrata (Feliatra et al. 2004) oleh karenanya dapat digunakan sebagai probiotik.

Probiotik B. firmus mampu menghasilkan fitohormon dan termasuk dalam bakteri pelarut fosfat. Pelarutan fosfat secara biologis terjadi karena bakteri ini menghasilkan beberapa enzim seperti enzim fosfatase (Lynch 1983), dan enzim fitase (Alexander 1977). Sebagai probiotik, B. firmus juga mampu berfungsi sebagai immunostimulator yang dapat meningkatkan aktifitas fagosit dengan merangsang makrofaga (Prokesova et al. 1998).

Aeromonas hydrophila

Bakteri A. hydrophila umum ditemukan di perairan, seringkali berperan dalam infeksi sekunder pada jaringan luka (Angka 2001), bakteri ini secara normal terdapat di lingkungan perairan (Harikrishnan et al. 2005). Bakteri Aeromonas tersebar luas di lingkungan akuatik (Palumbo et al. 1992) dan menyebabkan hemoragi septikemia serta menimbulkan sindrom luka borok yang bersifat epizootik di banyak spesies perairan air tawar (Shao et al. 2004) dan spesies air laut (Lilley et al. 1997). Infeksi A. hydrophila memiliki rentang yang luas pada hewan akuatik maupun teresterial termasuk mamalia, dan menjadi agen penyebab penyakit yang umum menyerang ikan budidaya perairan hangat di seluruh dunia (Austin and Adams 1996; Thune et al. 1993; Yu et al. 2004). Di Asia Tenggara, A. hydrophila menyumbang kontribusi kerugian ekonomi yang sangat besar bagi industri perikanan (Llobrera and Gacutan, 1987; Thampuran et al. 1995). Di sisi lain, A. hydrophila ternyata tidak hanya menjadi agen penyebab penyakit ikan-ikan perairan hangat seperti Channel catfish, Ictalurus punctatus, Tilapia (Amin et al. 1985), Plecoglossus altivelis (Miyazaki and Jo 1985), tetapi juga pada ikan-ikan di perairan dingin dan juga hewan vertebrata tingkat tinggi lainnya (Janda and Abbott 1998). Jadi, sebagai patogen oportunistik A. hydrophila berasosiasi dengan berbagai kondisi klinis dengan rentang yang sangat luas, meliputi kondisi inang homeotermik dan poikilotermik.

Serangan A. hydrophilayang merupakan bakteri oportunistik (Grizzle and Kirya 1993) lebih cenderung pada ikan-ikan yang berada dalam tingkat stres yang

9

buruk, penanganan yang kurang baik ataupun karena adanya patogen berbahaya lain yang terdapat di lingkungan tersebut (Leung et al. 1991). Sindermann (1988) diacu dalam Harikrishnan et al. (2005), menyatakan luka borok di permukaan kulit ikan yang disebabkan oleh A. hydrophilaadalah salah satu penanda biologis utama yang digunakan sebagai acuan dalam menentukan pencemaran pada lingkungan akuatik yang dapat menyebabkan tingkat stres yang tinggi bagi ikan yang hidup di dalamnya.

A. hydrophila yang masuk dalam family Vibrionaceae ini terdiri dari dua genera yang umum disebut sebagai Vibrio dan Aeromonas. Bakteri ini mampu bergerak motil dengan bantuan alat gerak berupa flagella (Botterelli and Ossiprandi 1999), dengan bentuknya batang halus pendek, berukuran 0.7-0.8 µm x 1.0-1.5µm (Kabata 1985) atau diameter 0.3-1.0µm dan panjang 1.0-3.5µm (Hayes 2000; Botterelli and Ossiprandi 1999), tidak berspora, biasanya tidak berkapsul, menyukai lingkungan yang bersuhu 15-30oC dan tumbuh dengan baik pada suhu optimum 28oC (Hayes 2000). Perairan umum A. hydrophila masih ditemukan pada suhu 4oC-32oC dan pertumbuhan mencapai tingkat tertinggi pada suhu 28o_{C (Burton and Lanza 1986).}

Faktor virulensi bakteri ini adalah enterotoksin, sitotoksin dan hemolisin, diperkuat dengan penelitian Hayes (2000) yang menemukan bahwa A. hydrophila dan A. sobria memproduksi enterotoksin, dermonecrotic factors, hemolisin dan protease serta aerolisin. Secara struktural A. hydrophila memiliki fili, flagella, S-layer, lipopolisakarida, dan protein membran luar yang berperan sebagai faktor virulensi. Sedangkan S-layer adalah protein yang memiliki berat molekul 52.000 dan resisten terhadap zat bakterisidal (Murray et al. 1988 diacu dalam Hidayat 2006), juga terdapat dinding luar sel dan dapat mengurangi tingkat virulensi hingga 10.000 kali lipat jika struktur ini hilang (Janda 1991). Aeromonas sp. memproduksi berbagai produk yang salah satunya toksin. Toksin dikeluarkan dalam bentuk terlarut sehingga dapat langsung menginfeksi sel, selain itu toksin ini dapat bertahan di permukaan sel dan akan masuk ketika sel sudah mati. Tiga protein ekstraseluler yang dimiliki dalam kaitannya dengan patogenitas A. hydrophila adalah aerolisin, GCAT (glycerophospolipid cholesterol

acyltransferase), dan serin protease (Hayes 2000). Infeksi bakteri lain dapat menginduksi patogenitas bakteri A. hydrophila.

Menurut Hidayat (2006), terdapat dua mekanisme patogenisitas pada Aeromonas sp. yaitu: (1) Tissue adherence yang diperantarai oleh S-layers. S-layersmembantu adherence dan kolonisasi bakteri pada mukosa usus. Proses ini juga dibantu oleh struktur filamentous (fimbriae) atau membranous (adhesin) yang memiliki aktivitas hemaglutinasi, terutama ditemukan pada strain mesofilik (Botterelli and Ossiprandi 1999). (2) Toxic production; toksin Aeromonas dapat diklasifikasikan sebagai ekso dan endotoksin. Cytotoxins dan enterotoxins (termasuk dengan aktivitas haemolytic) merupakan yang paling penting dalam patogenisitas. Aeromonas sp. dapat juga menghasilkan substansi ekstraseluler lainnya, dengan faktor-faktor difusi yang penting, yaitu: protease, amylase, chitinase, lipase, nuclease (Botterelli and Ossiprandi 1999).

Gambaran Darah

Darah pada ikan berfungsi membawa ion-ion anorganik dan senyawa organik seperti hormon, vitamin, serta beberapa protein plasma. Protein plasma itu sendiri berperan dalam respon tubuh terhadap kekebalan suatu penyakit, penyangga dari perubahan pH darah dan pengatur tekanan osmotik (Bond 1979). Selain itu darah juga berfungsi dalam peredaran zat makanan hasil pencernaan dan oksigen ke sel-sel tubuh serta membawa hormon dan enzim menuju organ-organ yang membutuhkannya. Perubahan gambaran darah baik secara kualitatif maupun kuantitatif dapat menentukan kondisi ikan atau status kesehatannya (Wedemeyer et al. 1990). Beberapa parameter yang dapat memperlihatkan perubahan kondisi tubuh pada darah yaitu kadar hematokrit (Ht), hemoglobin (Hb), jumlah sel darah merah (eritrosit) dan jumlah sel darah putih (leukosit). Hematokrit

Parameter yang digunakan dalam pengukuran volume sel darah merah adalah hematokrit, yakni presentase volume sel darah merah di dalam darah atau merupakan perbandingan antara volume sel darah merah dengan plasma darah (Bond 1979). Kadar hematokrit dalam darah ikan dapat digunakan untuk mendeteksi terjadinya anemia pada ikan. Apabila ikan terserang penyakit atau

11

kehilangan nafsu makan karena sebab tertentu, maka kadar hematokrit akan menurun (Snieszko et al. 1974). Nilai kadar hematokrit tidak selalu tetap (Randall 1970), ikan memiliki kadar hematokrit berkisar antara 5-60% (Snieszko et al. 1960). Apabila berada di bawah 30% menunjukkan defisiensi eritrosit (Bond 1979), namun demikian kadar hematokrit normal dalam darah ikan mas adalah 27,1%.

Kadar hematokrit berguna untuk menentukan apakah ikan dalam kondisi normal atau anemia, karena nilainya berbeda-beda pada setiap status kesehatan ikan. Menurunnya kadar hematokrit dapat dijadikan petunjuk mengenai rendahnya kandungan protein pakan, defisiensi vitamin atau ikan mendapat infeksi, sedangkan meningkatnya kadar hematokrit menunjukkan ikan ada dalam keadaan stres (Wedemeyer & Yasutake 1977; Anderson & Siwicki 1993).

Hemoglobin

Lagler et al. (1977), hemoglobin berperan dalam proses pengangkutan oksigen dalam darah dan kadar hemoglobin dalam darah berkaitan erat dengan jumlah eritrosit. Kadar hemoglobin dalam darah ikan teleostei berkisar antara 37-70% dan 100% Hb setara dengan 14 gram dalam 100 ml darah, dalam keadaan sakit akut kadar Hb pada ikan akan turun hingga 27%. Kadar hemoglobin pada ikan mas dewasa adalah 8,61-10,86 (gram per 100 cc volume darah) (Angka 1990).

Kadar hemoglobin merupakan indikator anemia yang berkaitan dengan eritrosit yaitu kadar atau kandungan eritrosit matang atau dewasa dalam aliran darah. Rendahnya Hb menunjukkan ikan menderita anemia, namun tingginya kadar Hb berkaitan dengan kondisi ikan yang stres (Blaxhall 1972).

Eritrosit

Eritrosit merupakan unsur seluler utama dari darah, bentuk selnya tipis dan ovoid serta mempengaruhi nukleus dalam penempatannya di tengah atau pusat dari sel. Populasi eritrosit dalam darah peripheral dari ikan kebanyakan terdiri dari eritrosit dewasa, tetapi sel yang belum dewasa atau belum matang juga dapat teramati. Jumlah sel yang belum dewasa bervariasi menurut spesies, umur, musim dan kondisi lingkungan (Takashima & Hibiya 1995). Ukuran dan jumlah dari

eritrosit menunjukkan variasi yang dipertimbangkan berdasarkan spesies: umumnya ukuran sel memiliki sumbu yang lebih panjang yaitu 10-15 µm dan yang lebih pendek 8-12 µm dengan jumlah 1-3E+06 sel/mm3 _{(Takashima &} Hibiya 1995; Alifuddin 1996; Dana 1996).

Rendahnya jumlah eritrosit menunjukkan ikan mengalami anemia, kerusakan ginjal, sedangkan tingginya jumlah eritrosit menandakan ikan berada dalam kondisi stres (Wedemeyer & Yasutake 1977). Ellsaesser (1985), menyatakan bahwa pemeriksaan darah penting artinya untuk memastikan diagnosis suatu penyakit.

Leukosit

Leukosit pada ikan dihasilkan di organ limpa yaitu bagian pulpa putih (Angka 2005), merupakan salah satu sistem pertahanan tubuh yang bersifat non spesifik (Alifuddin 1996; Dana 1996). Tripathi et al. (2004) menyatakan bahwa jumlah leukosit ikan normal mencapai 2.4E+04 sel/mm3. Namun jumlah total leukosit tergantung pada jenis ikannya, ikan lele (Clarias batrachus) 64.75E+03 sel/mm3 (Chinabut et al. 1991) sedangkan pada ikan rainbow trout sebesar 7.8-20.9E+03 (Alifuddin 1996; Dana 1996). Perubahan nilai total leukosit dapat dijadikan indikator adanya infeksi penyakit tertentu yang terjadi pada ikan (Blaxhall 1972).

METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan selama 5 bulan, mulai Januari–Juni 2011 di Laboratorium Patologi Ikan, Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar, Bogor, Jawa Barat.

Pemilihan Ikan Uji dan Bakteri (Patogen dan Probiotik)

Ikan uji yang digunakan adalah ikan mas (Cyprinus carpio) dengan bobot 15 – 30 gram. Dalam penelitian ini padat tebar ikan uji pada setiap akuarium sebanyak 10 ekor/20 liter. Bakteri probiotik yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri probiotik P23 yaitu Bacillus firmus yang telah diteliti oleh Balai Riset Perikanan Air Tawar, Bogor (Lusiastuti 2010) dan bakteri patogen A. hydrophila (Balai Riset Perikanan Air Tawar, Bogor). Sebelum digunakan ikan uji diaklimatisasi selama 1 minggu.

Bahan dan Media

Bahan yang digunakan terdiri atas media kultur bakteri yaitu: Trypticase Soy Agar (TSA), Trypticase Soy Broth (TSB), media selektif untuk Aeromonas

sp. dan Pseudomonas sp. yaitu media agar GSP, serta media selektif untuk A. hydrophila yaitu media Rhimler Shotts (R-S medium). Selain itu digunakan pula aquades, salin (larutan fisiologi), alkohol 96%, dan 70%, korek api, tisu, kapas tutup tabung reaksi, minyak imersi, garam ikan, PK (kalium permanganat) dan bahan-bahan lain untuk karakterisasi bakteri baik patogen maupun probiotik, bahan untuk histopatologi dan lain-lain.

Prosedur Penelitian

Penelitian terdiri atas persiapan dan pelaksanaan penelitian. Penelitian dilakukan dalam 4 tahapan yang masing-masing dijabarkan dalam suatu rangkaian penelitian. Sebelum rangkaian penelitian ini dijalankan maka A. hydrophila yang digunakan dalam penelitian ini terlebih dahulu dilaksanakan pasase.

Pasase dilakukan dengan penyiapan A. hydrophila yang dikultur pada media agar TSA dan kemudian diinkubasi selama 24 jam untuk kemudian dipindahkan ke media broth TSB. Selanjutnya suspensi sel tersebut siap untuk diinjeksikan ke ikan. Pada pasase ini 15 ekor ikan uji dimasukkan ke dalam dua akuarium untuk spesies bakteri patogen dan satu akuarium untuk kontrol (diinjeksi dengan larutan fisiologis). Selanjutnya ikan uji diamati sampai ikan tersebut menunjukkan gejala klinis atau sakit. Ikan yang sakit diambil untuk diisolasi bakterinya dengan cara digoreskan pada media GSP, RS, dan TSA. Goresan berasal dari luka, rongga perut dan organ ginjal. Koloni bakteri yang tumbuh diamati morfologi koloni, karakteristik biokimia (oksidase dan katalase) serta sifat Gram, untuk memastikan bakteri tersebut adalah spesies bakteri patogen yang diinfeksikan pada ikan. Proses pasase dilakukan dua kali untuk meningkatkan keganasan dari bakteri, selanjutnya bakteri dikultur pada media agar miring TSA untuk sediaan penelitian selanjutnya.

Penelitian Tahap I: Pertumbuhan A. hydrophila pada Media Budidaya

Penelitian ini diawali dengan melihat kurva tumbuh A. hydrophila pada media broth (TSB) selama 24 jam. Pengamatan dan penghitungan jumlah bakteri dilakukan setiap 2 jam dengan metode TPC (Total Plate Count) pada media agar TSA. Hal ini dilakukan untuk mengetahui tingkat pertumbuhan A. hydrophila

pada media broth.

Untuk dapat mengetahui pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya maka dilakukan serangkaian perlakuan terhadap bakteri tersebut berikut ini: (KA) Kontrol – tanpa penambahan A. hydrophila; (PA1) Media diberi A. hydrophila dengan kepadatan 102cfu/ml tanpa aerasi dan tanpa penambahan pakan; (PA2) Media diberi A. hydrophila dengan kepadatan 102cfu/ml dengan aerasi dan tanpa penambahan pakan; (PA3) Media diberi A. hydrophila dengan kepadatan 102_{cfu/ml dengan aerasi dan penambahan pakan setiap harinya; (PA4)} Media diberi A. hydrophila dengan kepadatan 102_{cfu/ml tanpa aerasi dan} dilakukan penambahan pakan setiap harinya, perlakuan ini ditempatkan pada ruangan biasa; (PA5) Media diberi A. hydrophila dengan kepadatan 102_cfu/ml

15

tanpa aerasi dan juga dilakukan penambahan pakan setiap harinya, perlakuan ini ditempatkan pada ruangan yang dingin dengan suhu air 24-25o_C.

Wadah yang digunakan pada penelitian ini adalah bejana air dari kaca yang diisi dengan air media budidaya sebanyak 2 liter per wadah. Media budidaya yang digunakan berasal dari sumur artetis. Pada setiap perlakuan diasumsikan berisi 10 ekor ikan dengan bobot rata-rata 18 gram dengan volume air 20 liter/akuarium, dengan pemberian pakan 5% dari bobot total ikan yaitu 9 gram/hari. Berdasarkan asumsi tersebut maka pemberian pakan pada penelitian tahap ini adalah 0.18 gram/hari/wadah.

Penelitian dilaksanakan selama 14 hari, dengan pemeriksaan pertumbuhan bakteri dilakukan setiap hari menggunakan metode TPC. Setiap perlakuan dilakukan pengulangan 2 kali. Hasil dari penelitian tahap ini menjadi dasar pertimbangan pada penelitian tahap selanjutnya.

Penelitian Tahap II: Pertumbuhan B. firmus pada Media Budidaya

Penelitian ini diawali dengan melihat kurva tumbuh probiotik B. firmus

pada media broth (TSB) selama 24 jam. Pengamatan dan penghitungan jumlah bakteri dilakukan setiap 2 jam dengan metode TPC pada media agar TSA. Hal ini dilakukan untuk mengetahui tingkat pertumbuhan probiotik B. firmus pada media

broth.

Untuk mengetahui pertumbuhan probiotik B. firmus pada media budidaya maka dilakukan serangkaian perlakuan terhadap bakteri tersebut. Rancangan penelitian terhadap probiotik B. firmus adalah sebagai berikut: (KP) Kontrol – tanpa penambahan bakteri; (PP1) Media diberi probiotik B. firmus dengan kepadatan 102cfu/ml tanpa aerasi dan tanpa penambahan pakan; (PP2) Media diberi probiotik B. firmus dengan kepadatan 102cfu/ml dengan aerasi dan tanpa penambahan pakan; (PP3) Media diberi probiotikB. firmusdengan kepadatan 102 cfu/ml dengan aerasi dan diberikan penambahan pakan setiap harinya; (PP4) Media diberi probiotik B. firmusdengan kepadatan 102_{cfu/ml tanpa aerasi namun} dengan penambahan pakan setiap harinya.

Wadah yang digunakan pada penelitian ini adalah bejana air dari kaca yang diisi dengan air media budidaya sebanyak 2 liter per wadah. Media

budidaya yang digunakan berasal dari sumur artetis. Pada setiap perlakuan diasumsikan berisi 10 ekor ikan dengan bobot rata-rata 18 gram dengan volume air 20 liter/akuarium, dengan pemberian pakan 5% dari bobot total ikan yaitu 9 gram/hari. Berdasarkan asumsi tersebut maka pemberian pakan pada penelitian tahap ini adalah 0.18 gram/hari/wadah dan dilakukan selama 4 hari.

Setelah diketahui hasil dari penelitian tahap ini, selanjutnya dilakukan pencarian konsentrasi terbaik dari probiotik B. firmus dengan A. hydrophilasecara

in vitro dengan uji kultur bersama. Pada uji kultur bersama antara probiotik B. firmus dengan A. hydrophila ini dibandingkan hasil setiap ujinya dengan kontrol. Uji kultur bersama dilakukan pada perbandingan probiotik B. firmus : A. hydrophila =102 : 102cfu/ml hingga probiotik B. firmus : A. hydrophila =1012 : 102cfu/ml; dan kontrol hanya A. hydrophila102cfu/ml saja.

Setiap perlakuan dikultur pada media broth TSB selama 24 jam untuk selanjutnya diencerkan hingga kepadatan yang diinginkan lalu di kultur bersama pada media broth TSB kembali dan diinkubasi selama 24 jam. Selanjutnya seluruh perlakuan ditanam kedalam media agar RS dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah diinkubasi selama 24 jam maka A. hydrophila yang tumbuh pada media RS dilihat dan dibandingkan dengan kontrol. Konsentrasi probiotik yang digunakan pada penelitian tahap IV adalah hasil terbaik dari uji kultur bersama yang telah dilakukan secara in vitro, hasil terbaik ditunjukkan dengan semakin sedikitnya A. hydrophila yang tumbuh pada media RS.

Penelitian Tahap III: Infeksi A. hydrophila pada Ikan Mas (Cyprinus carpio) melalui Media Budidaya

Penelitian tahap ketiga ini dilakukan sesuai dengan hasil dari penelitian tahap pertama yang berkaitan dengan pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya.

Pada tahap ini dilakukan tiga perlakuan selama 14 hari yaitu: (PA) Perlakuan pemberian A. hydrophila102 cfu/ml pada media budidaya tanpa adanya penyiponan. (PK) Perlakuan tanpa pemberian A. hydrophila pada media budidaya tanpa adanya penyiponan. (KS) Perlakuan tanpa pemberian A. hydrophila pada media budidaya namun dilakukan penyiponan setiap 3 hari.

17

Perlakuan ini juga dianggap sebagai perlakuan kontrol. Setiap perlakuan dilakukan 3 kali pengulangan.

Setiap akuarium dimasukan ikan uji 10 ekor/ 20 liter air media budidaya dengan pemberian pakan sebanyak 5 % dari bobot total ikan uji per akuarium. Pemberian pakan dilakukan sedikit demi sedikit hingga ikan uji kenyang dan tidak merespon setiap pakan yang diberikan.

Hasil penelitian tahap ini akan dijadikan sebagai dasar tingkat patogenitas

A. hydrophila.

Penelitian Tahap IV: Pemberian Probiotik B. firmus melalui Media Budidaya terhadap Infeksi A. hydrophila

Tahap keempat penelitian ini merupakan suatu penerapan dan aplikasi usaha pemecahan permasalahan yang terjadi dengan serangkaian penelitian yang telah dilakukan. Setelah mendapatkan dua hasil konsentrasi terbaik probiotik B. firmus dengan A. hydrophila secara in vitro pada penelitian kedua, selanjutnya diimplementasikan secara in vivo pada penelitian tahap IV yaitu pemberian probiotik B. firmuspada media budidaya terhadap infeksi A. hydrophila.

Pada tahap ini dilakukan perlakuan selama 14 hari yaitu: (PAP) Perlakuan penambahan A. hydrophila 102_{cfu/ml dan pemberian probiotik B. firmus 10}6 cfu/ml yang diberikan setiap 2 hari; (PC) Perlakuan penambahan A. hydrophila

102 _{cfu/ml dan pemberian probiotik B. firmus 10}8 _{cfu/ml yang diberikan setiap 2} hari; (PK) Perlakuan tanpa penambahan A. hydrophila dan tanpa penambahan probiotik B. firmus serta tanpa penyiponan; (PAS) Perlakuan penambahan A. hydrophila 102 _{cfu/ml dan pemberian probiotik B. firmus 10}6 _{cfu/ml namun} dengan penyiponan setiap 2 hari sekali.

Pengukuran Parameter

Pengukuran parameter dalam penelitian ini meliputi fase pertumbuhan bakteri, tingkat kelangsungan hidup, gejala klinis, gambaran darah, histopatologi, dan pengukuran kualitas air.

Fase pertumbuhan bakteri

Pengukuran kinetik pertumbuhan, untuk mengetahui pertumbuhan A. hydrophila dan probiotik B. firmus yang ditumbuhkan pada media broth (TSB), dilakukan pengenceran seri dengan selang pengukuran 2 jam sampai bakteri

masuk fase penurunan. Hasil pengenceran dikultur pada media agar (TSA), diinkubasi selama 24 jam dan dihitung kepadatannya.

Kelangsungan hidup

Kelangsungan hidup/survival rate (SR), dihitung dengan metode menurut Effendi (1979).

Keterangan :

SR = Kelangsungan hidup (%)

Nt = Jumlah ikan yang hidup pada akhir pemeliharaan (ekor) No = Jumlah ikan pada awal pemeliharaan (ekor)

Gejala klinis

Parameter gejala klinis yang diamati meliputi perubahan tingkah laku ikan yang dapat dijadikan indikator kesehatan ikan, berupa respon reflek (renang, gerak renang ikan pada kolom air dan pernafasan ikan), patologi anatomi tubuh eksternal berupa kecerahan warna tubuh dan mata, kondisi kulit, geripis atau rusaknya sirip atau kelainan lainnya. Selain itu diamati respon makan ikan terhadap pakan yang diberikan selama penelitian dilaksanakan.

Gambaran darah Kadar hematokrit

Kadar Hematokrit (He) diukur menurut Anderson dan Siwicki (1993). Kadar He ditentukan dengan cara: sampel darah dimasukkan dalam tabung mikrohematokrit sampai kira-kira 3/4 bagian tabung, ujungnya disumbat dengan

crytoseal sedalam 1 mm. Setelah itu disentrifus dengan sentrifus hematokrit selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit dan dilakukan pengukuran panjang darah yang mengendap (a) serta panjang total volume darah yang terdapat didalam tabung (b). Kadar He dinyatakan sebagai % volume padatan sel darah yang dihitung dengan cara; He = (a/b) x 100%.

Kadar hemoglobin

Pengukuran kadar hemoglobin (Hb) dilakukan dengan metode Sahli dengan sahlinometer (Wedemeyer dan Yasutake 1977). Kadar Hb diukur dengan cara mengkonversikan darah ke dalam bentuk asam hematin setelah darah ditambah dengan asam klorida. Prosedur perhitungan dilakukan dengan cara :

SR = x _100% No

19

darah dihisap dengan pipet sahli sampai skala 20 mm3 _{atau skala 0,2 ml, lalu} ujung pipet dibersihkan dengan kertas tisu. Setelah itu darah dalam pipet dipindahkan dalam tabung Hb-meter yang telah diisi HCl 0,1 N sampai skala 10 (merah), diaduk dan dibiarkan selama 3 sampai 5 menit. Akuades ditambahkan sampai warna darah dan HCl tersebut seperti warna larutan standar yang ada dalam Hb meter tersebut. Kemudian skala dibaca dengan melihat permukaan cairan dan dicocokkan dengan skala tabung sahli yang dilihat pada skala berwarna kuning (gr %) yang berarti banyaknya hemoglobin dalam gram per 100 ml darah.

Total eritrosit

Jumlah eritrosit dihitung dengan metode Blaxhall dan Daisley (1973). Perhitungan eritrosit dilakukan dengan cara: sampel darah dihisap dengan pipet sampai skala 0.5, kemudian ditambahkan larutan Hayem’s sampai skala 101, digoyang atau diayunkan membentuk angka delapan selama 3 – 5 menit agar bercampur homogen. Tetesan pertama dibuang, tetesan berikutnya diteteskan ke dalam hemasitometer dan ditutup dengan kaca penutup, diamati di bawah mikroskop. Perhitungan dilakukan pada kotak kecil hemasitometer, Σ eritrosit = Σ sel eritrosit terhitung x 104_sel/mm3_.

Total leukosit

Jumlah leukosit dihitung dengan metode Blaxhall dan Daisley (1973) yaitu : sampel darah dihisap dengan pipet berskala sampai 0,5. Lalu ditambahkan larutan turk’s dihisap sampai skala 11 selanjutnya pipet digoyang membentuk angka delapan selama 5 menit agar bercampur homogen. Tetesan pertama dibuang, tetesan berikutnya dimasukkan ke dalam hemasitometer ditutup dengan kaca penutup, diamati dibawah mikroskop. Perhitungan dilakukan pada kotak kecil hemasitometer, Σ leukosit = Σ sel leukosit terhitung x 50 sel/mm3_.

Histopatologi

Pengukuran parameter histopatologi dilakukan pada organ hati dan ginjal ikan mas. Sampel organ yang diambil, difiksasi dengan menggunakan larutan fiksatif Neutral Buffer Formalin (NBF) 10%. Organ yang telah difiksasi sekurang-kurangnya 24 jam dipotong sebesar 3-5 mm dan 1 x 1 cm, selanjutnya jaringan tersebut dimasukkan dalam etanol bertingkat. Kemudian jaringan dimasukkan dalam xylene lalu paraffin untuk dilakukan proses blocking. Jaringan

dipotong dengan mikrotom rotary dengan ketebalan 3-5 µm dan diletakkan pada gelas objek. Setelah proses tersebut diatas tahap selanjutnya dilakukan proses pewarnaan dengan menggunakan hematoksilin–eosin. Selanjutnya preparat diamati di bawah mikroskop untuk mengamati perubahan jaringan yang mungkin terjadi. Histopatologi dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui tingkat kerusakan organ akibat serangan bakteri patogen. Masing-masing perlakuan diambil satu ekor ikan uji sebagai sampel.

Analisa Data

Data utama penelitian ini berupa tingkat kelangsungan hidup, fase pertumbuhan bakteri, kepadatan bakteri pada media budidaya beserta data pendukung berupa kualitas air, gejala klinis, dan perubahan gambaran darah, akan dianalisa secara deskriptif dengan menggunakan tabel, grafik dan gambar.

20

HASIL DAN PEMBAHASAN

Data yang diperoleh selama penelitian adalah data utama dan data penunjang. Data utama meliputi tingkat kelangsungan hidup ikan uji, kurva pertumbuhan bakteri, kepadatan bakteri pada media budidaya beserta data pendukung berupa perubahan gambaran darah, gejala klinis, dan kualitas air. Penelitian Tahap I : Pertumbuhan A. hydrophilapada Media Budidaya Identifikasi bakteri patogen uji

Pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya menjadi hal yang sangat penting untuk diketahui dan dikaji lebih mendalam mengingat masih minimnya pengetahuan mendasar mengenai hal ini. Untuk mengetahui hal ini maka dilakukan beberapa kegiatan diantaranya identifikasi bakteri patogen uji, pasase, dan kemudian diujikan pada rancangan penelitian yang telah disiapkan.

Pada media agar GSP, bakteri positif Aeromonas sp. jika bakteri yang tumbuh berwarna krem dan media agar berubah menjadi berwarna oranye, sedangkan pada media selektif RS bakteri positif jika tumbuh koloni berwarna kuning (Gambar 2).

Gambar 2 A. hydrophila pada media agar; a) media selektif GSP; b) media selektif RS

Hasil pengamatan morfologi koloni, karakteristik biokimia dan sifat Gram bakteri hasil reisolasi dari ikan uji yang diinfeksi dengan A. hydrophila disajikan pada Tabel 1.

Tabel 1 Identifikasi A. hydrophila hasil reisolasi dari ikan uji

Media _Warna Morfologi Koloni_{Elevasi Tepian} Karakteristik Biokimia_{Mot Kat Oks} Sifat Gram

TSA Krem Cembung Halus + + +

-GSP Krem Cembung Halus + + +

-RS Kuning Cembung Halus + + +

-Berdasarkan hasil tersebut maka proses pasase berhasil karena bakteri yang diinjeksikan pada ikan memberikan gejala klinis dan efek kerusakan fisiologis pada tubuh sebagaimana ciri infeksi A. hydrophila. Selain itu saat bagian luka tersebut dilakukan reisolasi maka diperoleh kembali karakteristik yang sama dengan A. hydrophilayang diinjeksikan.

Hasil dari pasase ini juga memperlihatkan keganasan dari bakteri ini, 100% ikan mati dalam kurun waktu kurang dari 24 jam terutama pada jam ke 4 hingga 12 (Gambar 3).

Gambar 3 Ikan sakit pada uji pasase; a) tampak eksternal, b) organ dalam yang mengalami dropsi

Pada Gambar 3 terlihat pada bekas injeksi terdapat suatu luka infeksi dan ruam pada tubuh bagian luar. Kondisi rongga tubuh penuh berisi cairan, otot yang terinfeksi hancur disebabkan infeksi A. hydrophila.

Pasase diulang sebanyak dua kali, dan bakteri tersebut digunakan dalam penelitian selanjutnya yaitu untuk mengetahui pertumbuhan bakteri A. hydrophila pada media budidaya dengan berbagai kondisi, yakni dengan ada tidaknya aerasi, pakan, dan suhu. Hasil penelitian ini dijadikan acuan dalam penelitian tahap berikutnya.

Pertumbuhan A. hydrophilapada media broth

Pada tahap ini pertumbuhan A. hydrophila dilihat setelah 24 jam pada media brothTSB dengan hasil disajikan pada Tabel 2.

b a

22

Tabel 2 KepadatanA. hydrophila setelah 24 jam pada media broth(TSB) Pengenceran Jumlah Koloni Kepadatan Rerata (cfu/mL)

10-10 TBUD

-1.77E+17

10-10 _TBUD

-10-14 _{171 1.71E+17}

10-14 183 1.83E+17

Gambaran pertumbuhan A. hydrophila pada media broth (TSB) dengan pengamatan setiap 2 jam selama 24 jam disajikan pada Gambar 4.

Gambar 4 Kurva pertumbuhan A. hydrophilapada media brothhasil pengamatan setiap 2 jam selama 24 jam; I = fase lamban, II = fase mulai, III = fase eksponensial, IV = fase statis dan kematian.

Berdasarkan kurva di atas memperlihatkan bahwa fase eksponensial A. hydrophila terjadi pada jam ke-16 hingga jam ke-22 dengan peningkatan jumlah mencapai puncaknya pada jam ke-22 dengan kepadatan bakteri mencapai 1.66E+19 cfu/mL. Widdel (2007) diacu dalam Winarti (2010) menyebutkan bahwa fase pertumbuhan bakteri dimulai dengan fase lamban (lag phase) yaitu suatu periode awal yang tampaknya tanpa pertumbuhan, diikuti dengan fase mulai (starting phase), kemudian pertumbuhan cepat yaitu fase eksponensial atau logaritma (exponential phase), selanjutnya mendatar yang disebut disebut fase statis (stationer phase) dan akhirnya diikuti oleh fase penurunan atau kematian (die-off phase).

Dengan diketahuinya kurva pertumbuhan dari A. hydrophila pada media brothTSB maka dapat dijadikan dasar pengetahuan terhadap tingkat pertumbuhan bakteri ini dan menjadi acuan pada penelitian tahap selanjutnya.

I

Pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya

Hasil penelitian tahap ini memperlihatkan kemampuan A. hydrophila untuk hidup, tumbuh dan bertahan pada rentang DO yang luas (0.13–7.82mg/L) sebagaimana disajikan pada Gambar 5.

Gambar 5 Pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya; (PA1) Perlakuan tanpa aerasi dan tanpa pakan; (PA2) Perlakuan dengan aerasi dan tanpa pakan; (PA3) Perlakuan dengan aerasi dan penambahan pakan; (PA4) Perlakuan tanpa aerasi dan penambahan pakan; (PA5) Perlakuan tanpa aerasi dan penambahan pakan (suhu air 24-25o_C)

Pada kondisi DO terendah yaitu 0.13mg/L (Gambar 6) terlihat pada perlakuan PA5 (perlakuan tanpa aerasi dan penambahan pakan) terjadi pada hari kelima setelah pemberian A. hydrophila 102_{cfu/mL dengan kepadatan bakteri}

meningkat menjadi 2.3E+10 cfu/mL. Sedangkan DO tertinggi terlihat pada perlakuan PA2 (perlakuan dengan aerasi dan tanpa penambahan pakan) yaitu 7.82mg/L pada hari pertama setelah pemberian A. hydrophila 102_{cfu/mL yaitu}

dengan kepadatan bakteri 9.5E+01 cfu/mL.

Berbagai perlakuan yang digunakan pada penelitian ini ditujukan untuk mengetahui gambaran pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya di berbagai kondisi lingkungan. Pada Gambar 6 dapat disimpulkan bahwa untuk A. hydrophila ada atau tidaknya oksigen dalam kurun waktu tertentu bukan menjadi faktor pembatas dalam kehidupan bakteri sesuai dengan karakteristiknya yang bersifat fakultatif anaerob. Namun dengan adanya penambahan pakan menyebabkan peningkatan pertumbuhan bakteri. Hal ini disebabkan A. hydropila merupakan bakteri heterotrof yang memiliki kemampuan memanfaatkan

24

Sebagaimana Burton and Lanza (1986), A. hydrophila merupakan bakteri yang umum ditemukan di perairan, dengan tingkat kepadatan yang berkorelasi dengan kandungan nutrien di suatu perairan tersebut. Bahan organik yang berasal dari sisa pakan ikan, dapat memicu peningkatan pertumbuhan A. hydrophila sehingga berpotensi menyebabkan penyakit pada ikan, terutama ikan yang dalam kondisi stres.

Gambar 6 Kondisi DO media budidaya yang ditambahkan A. hydrophila102_{cfu/mL di}

awal penelitian; (PA1) Perlakuan tanpa aerasi dan tanpa pakan; (PA2) Perlakuan dengan aerasi dan tanpa pakan; (PA3) Perlakuan dengan aerasi dan penambahan pakan; (PA4) Perlakuan tanpa aerasi dan penambahan pakan; (PA5) Perlakuan tanpa aerasi dan penambahan pakan (suhu air 24-25o_{C); (KA) Perlakuan kontrol tanpa penambahan bakteri, tanpa aerasi dan}

tanpa pakan

Kemampuan A. hydrophila untuk tumbuh pada rentang suhu dan kadar oksigen yang luas menyebabkan A. hydrophilaini menjadi salah satu bakteri yang paling sering ditemukan pada perairan dan menyebabkan sakit pada berbagai jenis ikan budidaya. Burton and Lanza (1986) dan Austin and Austin (2007) menyatakan bahwa A. hydrophilamampu hidup pada lingkungan bersuhu 4-37o_C

dan pertumbuhan mencapai tingkat tertinggi pada suhu 28o_C.

Berdasarkan hasil penelitian ini maka pada penelitian aplikasi dengan pemeliharaan ikan di tahap ketiga, digunakan perlakuan ketiga yaitu ikan dipelihara dengan pemberian pakan dan aerasi.

Penelitian Tahap II: Pertumbuhan B. firmus pada Media Budidaya

Probiotik B. firmus yang digunakan dalam penelitian ini merupakan hasil penelitian Lusiastuti (2010), bakteri ini telah diuji mampu menghambat

pertumbuhan A. hydrophilasecara in vitro. Selanjutnya dilakukan penelitian lebih mendalam untuk memanfaatkan probiotik B. firmus sehingga mendapatkan hasil optimal.

Identifikasi probiotik uji

Probiotik B. firmus yang digunakan dalam penelitian ini mampu membentuk zona hambat terhadap A. hydrophila dengan jarak 3 mm (Lusiastuti 2010). Hasil pengamatan terhadap bentuk, karakteristik biokimia dan sifat gram probiotik B. firmusdisajikan pada Tabel 3.

Tabel 3 Identifikasi probiotik B. firmus

Warna _Bentuk Morfologi Koloni_{Elevasi Tepian Motil}Karakteristik Biokimia_{Kat Oks Gram}Sifat

Putih Batang Cembung Halus + + - Biru (+)

Probiotik B. firmus memiliki ciri morfologi diantaranya adalah memiliki sifat Gram positif, motil oleh flagel peritrichous, memiliki endospora berbentuk oval, bundar atau silinder. Bakteri ini bersifat fakultatif aerob, tersebar luas pada bermacam-macam habitat tawar maupun laut (Feliatra et al. 2004), serta tidak bersifat patogen terhadap vertebrata ataupun invertebrata.

Pertumbuhan B. firmus pada media broth(TSB)

Prosedur yang dilakukan pada penanaman bakteri ini sama dengan penanaman A. hydrophila maupun bakteri lainnya. Kepadatan probiotik B. firmus setelah 24 jam pada media broth(TSB) disajikan pada Tabel 4.

Tabel 4 Kepadatan probiotik B. firmus setelah 24 jam pada media broth(TSB) Pengenceran Jumlah Koloni Kepadatan Rerata (cfu/mL)

10-8 _TBUD

-5.53E+15

10-8 TBUD

-10-12 _{405 4.05E+15}

10-12 _{700 7.00E+15}

Gambaran pertumbuhan B. firmus pada media broth (TSB) dengan pengamatan setiap 2 jam selama 24 jam disajikan pada Gambar 7.

26

Gambar 7 Kurva pertumbuhan B. firmus pada media brothsetiap 2 jam selama 24 jam; I = fase lamban, II = fase mulai, III = fase eksponensial, IV = fase statis dan kematian.

Berdasarkan kurva di atas memperlihatkan bahwa fase eksponensial probiotik B. firmus terjadi pada jam ke-14 hingga jam ke-22 dengan peningkatan jumlah mencapai puncaknya pada jam ke-22 dengan kepadatan bakteri mencapai 1.20E+17 cfu/mL dan mulai menurun setelahnya. Pelczar & Chan (2005) menyatakan bahwa terjadi penambahan populasi yang teratur pada interval waktu tertentu selama masa inkubasi di mana semua bahan dan sel berada dalam keadaan seimbang sehingga menjadikannya fase pertumbuhan ideal bakteri. Pada fase kematian terjadi timbunan produk metabolisme yang beracun, kepadatan bakteri tinggi namun sumber nutrien dan substrat terbatas sehingga jumlah sel yang mati lebih cepat daripada terbentuknya sel-sel baru.

Pertumbuhan B. firmus pada media budidaya

Pertumbuhan probiotik B. firmus pada media budidaya yang diamati selama penelitian disajikan pada Gambar 8. Berbagai perlakuan yang dilakukan pada penelitian ini ditujukan untuk mengetahui gambaran pertumbuhan B. firmus pada media budidaya di berbagai kondisi lingkungan. Dari hasil penelitian ini maka dapat diketahui bahwa adanya oksigen dan penambahan pakan menyebabkan peningkatan pertumbuhan probiotik B. firmus. Probiotik B. firmus merupakan bakteri fakultatif aerob lebih menyukai kondisi lingkungan yang cukup oksigen sehingga pertumbuhannya menjadi lebih baik.

II

Gambar 8 Pertumbuhan probiotik B. firmus pada media budidaya; (PP1) Perlakuan tanpa aerasi dan tanpa pakan; (PP2) Perlakuan dengan aerasi dan tanpa pakan; (PP3) Perlakuan tanpa aerasi dan penambahan pakan; (PP4) Perlakuan dengan aerasi dan penambahan pakan.

Pada tahap ini terjadi penyesuaian rencana waktu pelaksanaan penelitian. Pada tahap ini rencananya dilaksanakan selama 14 hari seperti tahap pertama, namun dalam pelaksanaannya hal itu tidak memungkinkan untuk dilakukan. Penelitian ini dilaksanakan dalam empat hari karena ini adalah hari terakhir probiotik B. firmus dapat terbaca dalam penghitungan TPC. Hal ini disebabkan pertumbuhan probiotik B. firmus kalah cepat dengan pertumbuhan A. hydrophila yang secara alami ada pada media budidaya sehingga pada saat penghitungan bakteri dengan pengenceran tertinggi pada media agar TSA hanya terdapat koloni A. hydrophila dan tidak ada koloni probiotik B. firmus, sebagaimana disajikan pada Gambar 9.

Gambar 9 Koloni A. hydrophila pada media budidaya probiotik B. firmus. a) beberapa koloni probiotik B. firmus(pengenceran 10-12_{); b) tidak ada koloni probiotik B.} firmussama sekali (pengenceran 10-14_).

b a

28

Pada tahap ini dilakukan uji kultur bersama (efikasi konsentrasi probiotik B. firmus terhadap A. hydrophila secara in vitro) pada media TSB dan ditanam pada media TSA dan RS agar. Uji kultur bersama dilakukan dengan membandingkan hasil kultur bersama dengan kontrol yaitu media yang hanya ditanam A. hydrophila 102_{cfu/mL saja (Tabel 5).}

Tabel 5 Perbandingan kultur bersama probiotik B. firmusdengan A. hydrophila B. firmus (cfu/mL) A. hydrophila(cfu/mL) Hasil

102 ₁₀2 ₊₊₊₊₊

103 ₁₀2 ₊₊₊₊

104 102 ++++

105 ₁₀2 ₊₊₊

106 ₁₀2 ₊

107 102 +++

108 102 ++

109 ₁₀2 ₊₊₊

1010 ₁₀2 ₊₊₊

1011 102 +++

1012 ₁₀2 ₊₊

- 102 ₊₊₊₊₊

Keterangan: +++++ = A. hydrophila tumbuh memenuhi seluruh cawan ++++ = A. hydrophila tumbuh sebagian besar cawan +++ = A. hydrophila tumbuh setengah bagian cawan ++ = A. hydrophila tumbuh seperempat bagian cawan + = A. hydrophila tumbuh sedikit pada cawan

Dari Tabel 5 dapat disimpulkan bahwa hasil terbaik dari probiotik B. firmus yang diuji tantang dengan A. hydrophila102 _{cfu/mL secara in vitro adalah}

pada konsentrasi probiotik B. firmus 106 _{cfu/mL. Pada konsentrasi probiotik B.}

firmus yang lebih tinggi, namun hasilnya kurang optimal diduga karena adanya persaingan nutrisi dan oksigen yang tinggi diantara sesama probiotik B. firmus sehingga menyebabkan keseimbangan bakteri pada media terganggu. Dugaan ini didasarkan pada pernyataan Fuller (1992) bahwa efektivitas probiotik diantaranya dipengaruhi oleh komposisi bakteri, dosis/konsentrasi yang digunakan, umur dan kualitas probiotik. Nikoskelainen et al. (2001) juga menyatakan bahwa penggunaan probiotik dalam konsentrasi tinggi ternyata tidak menjamin perlindungan yang lebih baik terhadap inang.

Dari hasil uji kultur bersama secara in vitro diperoleh dua konsentrasi/kepadatan probiotik B. firmus yang terbaik yaitu 106 dan 108cfu/mL

untuk selanjutnya ditambahkan pada media budidaya (in vivo) pada penelitian tahap IV.

Penelitian Tahap III: Infeksi A. hydrophila pada Ikan Uji Melalui Media Budidaya

Pada penelitian tahap ini mulai digunakan ikan dan diuji tantang dengan pemberian A. hydrophilapada masa pemeliharaannya.

Kelangsungan hidup

Tingkat kelangsungan hidup ikan setelah diuji tantang dengan A. hydrophila didapatkan bahwa kelangsungan hidup ikan uji tertinggi diperoleh pada perlakuan KS dengan rata-rata 80% sebagaimana tersaji pada Gambar 10.

Gambar 10 Tingkat kelangsungan hidup ikan uji. Kondisi ikan uji sebelum pemberian probiotik; (PA) Perlakuan penambahan A. hydrophila 102 _{cfu/mL; (PK)}

Perlakuan tanpa penambahan A. hydrophila dan tanpa sipon; (KS) Perlakuan tanpa penambahan A. hydrophila namun dengan penyiponan setiap 3 hari sekali.

Berdasarkan Gambar 10 diketahui bahwa pada media budidaya yang tidak diberikan bakteri patogen sekalipun (perlakuan PK), kelangsungan hidupnya rendah yaitu rata-rata 33.33%. Pada perlakuan PK kematian ikan disebabkan oleh A. hydrophila, hal ini dipastikan setelah bakteri diisolasi dari organ ginjal dan hati ikan yang sakit lalu ditanam pada media RS menunjukkan bahwa bakteri yang tumbuh adalah A. hydrophila. Hal ini menunjukkan bahwa A. hydrophila selalu ada di perairan dan akan berkembang dengan cepat akibat adanya bahan organic yang berasal dari penambahan pakan dan dapat menyebabkan penyakit pada kondisi yang memungkinkan. A. hydrophila merupakan bakteri patogen

30

oportunistik dan dapat menyebabkan kematian tinggi pada ikan budidaya (Aoki 1999; Ghufran & Kordi 2004; Irianto 2005; Austin & Austin 2007). Kematian ikan disebabkan oleh sifat virulen bakteri yang disebabkan oleh endotoksin dan produk ekstraseluler atau eksotoksin (Angka 2005).

Metode perlakuan ini merupakan adaptasi dari kondisi alamiah di media budidaya, di mana bakteri masuk kedalam tubuh ikan dengan berbagai macam cara. Secara umum bakteri masuk dan menyebar kedalam tubuh ikan dapat melalui kulit, insang, dan saluran pencernaan (Alifuddin 1996). Waktu awal kematian ikan yang rata-rata terjadi pada hari ke tujuh cenderung lebih lambat dibandingkan dengan penelitian sejenis mengenai kerentanan ikan jelawat Leptobarbus hoevenii Blkr oleh Winarti (2010) yang melakukan beberapa pola infeksi A. hydrophila yaitu melalui perendaman, intra peritoneal (IP) dan intra muscular (IM) yang waktu awal kematiannya kurang dari satu hari. Hal ini dikarenakan pada penelitian Winarti (2010) konsentrasi perendaman (kepadatan bakteri) didasarkan pada dosis letal 50. Waktu kematian ikan uji pada tahap ini dapat dilihat pada Tabel 6.

Tabel 6. Waktu kematian ikan uji pada infeksi A. hydrophila melalui media budidaya

Akua Rium

Kematian Ikan _SR

(%) D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 TOT

PA1 - - - 2 1 - 2 - - - 1 6 40

PA2 - - - 1 2 3 - 1 - 1 8 20

PA3 - - - 1 - 1 1 - 1 1 - 5 50

PK1 - - - 3 1 1 - 2 - - 7 30

PK2 - - - 1 1 - - 1 2 - 5 50

PK3 - - - 3 1 1 1 1 - 1 8 20

KS1 - - - - 1 - - - 1 90

KS2 - - - 1 1 90

KS3 - - - - 3 - - - 1 4 60

Keterangan: (PA) Perlakuan penambahan A. hydrophila 102 _{cfu/mL; (PK) Perlakuan}

tanpa penambahan A. hydrophila dan tanpa sipon; (KS) Perlakuan tanpa penambahan A. hydrophilanamun dengan penyiponan setiap 3 hari sekali D0…12 = Hari ke-0…ke-12; 1,2,3 = ulangan ke-1,2,3

Berdasarkan Tabel 6 dapat dilihat bahwa kematian ikan uji pada perlakuan PA mulai terjadi pada hari ke tujuh sebanyak tiga ekor. Selanjutnya pada hari ke delapan terjadi kematian dua ekor pada perlakuan PA dan tujuh ekor pada

perlakuan PK. Pada hari berikutnya ikan mengalami kematian dengan jumlah yang berbeda pada setiap perlakuan hingga akhir pengamatan. Kondisi jumlah bakteri yang semakin meningkat, tingkat kepadatan ikan yang tinggi, dan kondisi lingkungan yang memburuk semakin menambah tingkat stres pada ikan. Nafsu makan ikan semakin menurun memudahkan A. hydrophila menginfeksi ikan hingga akhirnya mengalami kematian.

Pada penelitian ini A. hydrophilatumbuh secara alami berdasarkan kondisi lingkungan sehingga dibutuhkan waktu bakteri untuk tumbuh di media budidaya dan masuk kedalam tubuh untuk kemudian juga tumbuh dan menginfeksi ke dalam tubuh secara alamiah. Selain itu, ikan memiliki pertahanan non spesifik yang ada tanpa perlu dirangsang terlebih dahulu yang siap menghadapi patogen yang akan masuk kedalam tubuh. Pertahanan tersebut meliputi pertahanan mekanik atau fisik seperti mukus, sisik dan kulit, lisosim, enzim bakteriolitik lain, serta mukopolisakarida yang menghalangi pergerakan bakteri kedalam tubuh (Anderson 1990).

Tingkat pertumbuhan A. hydrophilapada media budidaya

Tingkat pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya, disajikan Gambar 11.

Gambar 11 Kepadatan A. hydrophilapada media budidaya. (PA) Perlakuan penambahan

A. hydrophila 102 _{cfu/mL dan tanpa sipon; (PK) Perlakuan tanpa}

penambahan A. hydrophila dan tanpa sipon; (KS) Perlakuan tanpa penambahan A. hydrophiladan penyiponan setiap 3 hari sekali.

32

Dari Gambar 11 terlihat pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya mencapai puncaknya pada hari ke-8 dengan kepadatan bakteri mencapai 5.00E+08 cfu/mL pada perlakuan PA dan mengakibatkan kematian ikan 4 ekor (Tabel 6). Pada perlakuan PK pertumbuhan A. hydrophila tertinggi juga terjadi pada hari ke-8 yaitu 1.65E+09 cfu/mL dan mengakibatkan 10 ekor ikan uji mati. Tingkat pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya (Lampiran 3) sejalan dengan terjadinya kematian ikan uji pada waktu tersebut. Dari hasil ini maka dapat diketahui bahwa konsentrasi A. hydrophila pada media budidaya yang dapat menyebabkan Motile Aeromonad Septicemia(MAS) pada ikan mas berkisar antara 107_–108 _cfu/mL.

Pada perlakuan KS terlihat bahwa pertumbuhan A. hydrophila bertahan pada kisaran kepadatan 105cfu/mL. Hal ini disebabkan adanya proses penyiponan media budidaya yang dilakukan setiap tiga hari. Cara ini juga dapat digunakan sebagai pencegahan terhadap serangan A. hydrophila. Penyiponan berfungsi sebagai cara untuk mencegah A. hydrophila mencapai jumlah populasi tertentu yang dapat menyebabkan sakit pada ikan (quorum). Quorum sensing ini merupakan suatu bahasa yang digunakan untuk berkomunikasi antara sesama bakteri dalam bentuk sinyal molekul yang digunakan untuk mengkoordinasikan aktivitas yang bersifat terbatas pada golongan bakteri tertentu untuk mengekspresikan protein, selain itu untuk bermigrasi ke lingkungan yang lebih baik. Bakteri A. hydrophila dapat mengekspresikan secara bersamaan sinyal molekul bernama C4HSL untuk memproduksi protein AhyI/AhyR (Teresa et al.

2000).

Pemanfaatan pakan

Berdasarkan data pemberian pakan selama penelitian memperlihatkan kondisi ikan uji pada tahap ini. Pemanfaatan pakan oleh ikan uji selama penelitian disajikan pada Gambar 12.

Gambar 12 Kurva pemanfaatan pakan ikan uji; a) tren pemanfaatan pakan ikan uji pada perlakuan (PA); b) tren pemanfaatan pakan ikan uji pada perlakuan (PK); c) tren pemanfaatan pakan ikan uji pada perlakuan (KS). (PA) Perlakuan penambahan A. hydrophila 102 _{cfu/mL dan tanpa sipon; (PK) Perlakuan}

tanpa penambahan A. hydrophila dan tanpa sipon; (KS) Perlakuan tanpa penambahan A. hydrophiladan penyiponan setiap 3 hari sekali.

Dari Gambar 12 dapat dilihat gejala klinis dari ikan yang mengalami infeksi A. hydrophila ditandai dengan menurunnya nafsu makan ikan yang rata-rata dimulai pada hari ke empat, yang menandakan bahwa infeksi A. hydrophila mulai terjadi. Penurunan nafsu makan ini dapat juga disebabkan karena menurunnya kadar Hb akibat infeksi A. hydrophila (Gambar 13). Menurut Hardi (2011) rendahnya kadar Hb menyebabkan laju metabolisme menurun dan energi yang dihasilkan menjadi rendah, hal ini membuat ikan menjadi lemah dan tidak memiliki nafsu makan serta terlihat berdiam diri di dasar atau berenang lemah. Lebih lanjut Kabata (1985) menyatakan bahwa nafsu makan berkurang dan tingkah laku abnormal merupakan salah satu tanda ikan terinfeksi A. hydrophila.

Hasil analisa dari tingkat pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya, kelangsungan hidup ikan uji, dan waktu kematian ikan uji serta didukung oleh data pemberian pakan dan gambaran darah diperoleh bahwa kondisi kritis ikan uji akibat pertumbuhan A. hydrophila terjadi mulai hari ke-4 hingga ke-7 dengan kepadatan bakteri berkisar antara 105_-108_{cfu/mL. Jika dilihat}

dari gejala klinis tingkah laku, pola renang dan respon terhadap pakan dari ikan uji terlihat terjadi perubahan pola renang seperti berenang di permukaan, berkumpul di sudut akuarium, berenang lemah, menyendiri, dengan respon terhadap pemberian pakan yang mulai menurun. Pada pemeriksaan darah, hati dan ginjal ikan yang sakit menunjukkan positif terinfeksi A. hydrophila, dan hasil TPC pada darah diperoleh koloni bakteri dengan kepadatan yang bervariasi antara

b

34

102_-106 _{cfu/mL. Pemeriksaan pada ikan yang terlihat sehat tidak ditemukan}

adanya A. hydrophila. Kadar hemoglobin

Hemoglobin berfungsi dalam transportasi oksigen dan karbondioksida serta mencegah keasaman darah yang terlalu tinggi (Angka 2005), juga berperan penting dalam osmolaritas eritrosit (Dellman and Brown 1989). Hemoglobin ikan mas normal adalah 7.77 ± 1.58 (5.8-9.8 g%) (Mones 2008) dan 8,3+1,78 (6,4-10,8 g%)(Vonti 2008). Pada penelitian ini didapatkan ikan uji sebelum diberikan perlakuan infeksi A. hydrophila adalah 6.5-7%. Kondisi hemoglobin ikan uji selama pengamatan disajikan pada Gambar 13. Ketidakstabilan kadar Hb sebagaimana terlihat dari Gambar 13 disebabkan toksik hemolisin yang dihasilkan oleh A. hydrophila. Toksin ini yang menyebabkan osmolaritas plasma darah lebih rendah sehingga menyebabkan lisis, hal inilah yang diduga menjadi salah satu faktor virulensi pada A. hydrophila.

Gambar 13 Kadar hemoglobin ikan uji selama penelitian; (PA) Perlakuan penambahan

A. hydrophila 102 _{cfu/mL; (PK) Perlakuan tanpa penambahan A.} hydrophila dan tanpa sipon; (KS) Perlakuan tanpa penambahan A. hydrophilanamun dengan penyiponan setiap 3 hari sekali.

Secara umum setelah perlakuan diberikan, hemoglobin mengalami fluktuasi. Titik terendah yaitu 4.4% terjadi pada perlakuan PA saat hari ke tiga pasca perlakuan infeksi A. hydrophilamelalui media budidaya. Kadar hemoglobin yang menurun berkaitan dengan gejala anemia dan jumlah sel darah pada ikan. Sedangkan peningkatan hemoglobin kemudian diikuti adanya penurunan yang sangat cepat diduga terjadi karena adanya infeksi (Gambar 13).

54

Snieszko SF. 1974. The effect of environmental stress on outbreaks of infectious disease of fishes. J Fish Biol 6:197-208.

Sucipto A. 2005. Broodstock manajemen ikan mas dan nila. Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya. Sukabumi. Pp 1-13

Sucitra Z. 2011. Pengaruh penambahan bakteri probiotik (Bacillus firmus) pada media pemeliharaan terhadap ketahanan benih lele dumbo (Clarias gariepinus) yang diinfeksi bakteri A. hydrophila. [Skripsi]. Jatinangor; Program Sarjana, Univeristas Padjajaran.

Sugita H, Shibuya K, Shimooka H, Deguchi Y. 1996. Antibacterial abilities of intestinal bacteria in freshwater fishes. Biosciences, Biotecnology and Biochemistry56 : 1678-1679.

Takashima F, Hibiya T. 1995. An atlas of fish histology: normal and pathological features. Tokyo: Kodansa LTD.

Tannock G W. 1999. Probiotics a critical review. University of Otago. Horizon Scientific Press. New Zealand.

Taufik P. 1984. Faktor kualitas air dapat mempengaruhi timbulnya suatu penyakit pada ikan. Majalah pertanian no 3, tahun ke-31. Departemen Pertanian. Jakarta. Hlm 21.

Teresa R. de Kievit and Iglewski BH. 2000. Minireview. Bacterial quorum sensing in pathogenic relationships. infection and immunity. University of Rochester School of Medicine and Dentistry, Rochester, New York. p. 4839–4849

Thampuran N and Surendran PK. 1995. Incidence of motile aeromonads in marine environment, fishes and processed fishery products. pp. 352-358. Thune RL, Stanley LA, Cooper RK. 1993. Pathogenesis of gram negative

bacterial infections in warmwater fish. Di dalam: Faisal M, Hetrich FM, editor Annual review of fish disease. Pergamon Press. New York. p 37-68. Tripathi NK, Latimer KS, Burnley VV. 2004. Haematologic reference interval for

koi (Cyprinus carpio), including blood cell morphology, cytochemistry and ultrastructure. J Veterinary Clinical Pathology33:74-83.

Verschuere L, Rombaut G, Sorgeloos P, Verstraete W. 2000. Probiotics bacteria as biological control agents in aquaculture. J Microbiology and Molecular Biology Review. Dec. 64:655-671.

Vonti O. 2008. Gambaran darah ikan mas (Cyprinus carpio Linn) strain Sinyonya yang berasal dari daerah Ciampea-Bogor. [Skripsi]. Fakultas Kedokteran Hewan. Institut Pertanian Bogor.

55

Wedemeyer GA and Yasutake WT.1977. Clinical methods for the assessement of the effect environmental stress on fish health. Technical Papaers Of The U.S. Fish and Wildfield Service. US.Depart. Of the Interior Fish and Wildlife Service.89:1-17.

Wedemeyer GA, Barton BA, Mc Leay DJ.1990. Stress and acclimation. Di dalam: Schreck CB, Moyle PB, editor.Methods for fish biology. Bethesda, USA: American Fisheries Society hlm:45-477.

Widanarni, Elly DT, Soelityowati dan Suwanto A. 2008. Pemberian bakteri probiotik skt-b pada larva udang windu (Penaeus monodon) melalui pengkayaan artemia. Jurnal Akukultur Indonesia 7:129-137.

Widanarni, Suwanto A, Sukenda, dan Lay BW. 2003. Potency of vibrio isolates for biocontrol of vibriosis in tiger shrimp (Penaeus monodon) Larvae. Biotropia20:11-23

Widdel F. 2007. Theory and measurement of bacterial growth. Grundpraktikum Mikrobiologie, 4. Sem. (B.Sc). Germany: Universitat Bremen.

Winarti. 2010. Kerentanan ikan jelawat Leptobarbus hoevenii Blkr terhadap infeksi bakteri patogen [Tesis]. Bogor; Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Lampiran 1. Perubahan pola renang ikan mas penelitian tahap 3 Hari

ke- Pemberian tanpa penyiponan (PA) A .hydrophila dengan penyiponan (KS)Pemberian A. hydrophila Tanpa Pemberian A. hydrophila (PK)

Perlakuan PA Perlakuan KS Perlakuan PK

0 Norm, Rspc Norm, Rspc Norm, Rspc

1 Norm, Rspc Norm, Rspc Norm, Rspc

2 Norm, Bdp, Bds, Sol Norm, Rspc Norm, Bdp, Bds, Sol

3 Bdp, Bds, Lmh, Sol Norm, Rspc Bdp, Bds, Lmh, Sol

4 Bdp, Bds, Lmh, Sol Norm, Rspc Bdp, Bds, Lmh, Sol

5 Bdp, Bds, Lmh, Sol Norm, Rspc Bdp, Bds, Lmh, Sol

6 Bdp, Tb, Lmh, Gasp, Sol Norm, Rspc Bdp, Tb, Lmh, Gasp, Sol 7 Bdp, Tb, Lmh, Gasp, Sol Norm, Rspc Bdp, Tb, Lmh, Gasp, Sol 8 Bdp, Tb, Lmh, Gasp, Sol Norm, Rspc Bdp, Tb, Lmh, Gasp, Sol 9 Bdp, Tb, Lmh, Gasp, Sol Norm, Rspc Bdp, Tb, Lmh, Gasp, Sol 10 Bdp, Tb, Lmh, Gasp, Sol Norm, Rspc Bdp, Tb, Lmh, Gasp, Sol

11 Norm, Lmh, Sol, Norm, Rspc Norm, Lmh, Sol

12 Norm Norm, Rspc Norm

13 Norm Norm, Rspc Norm

14 Norm Norm, Rspc Norm

Keterangan:

Norm : Berenang teratur di dasar dan kolom air Lmh : Berenang lemah

Bdp : Berenang di permukaan air Bds : Berkumpul disudut akuarium

Agr : Agresif Gasp : Megap – megap

Sol : Soliter Rspc : Respon cepat

Tb : Berenang tidak beraturan, diberbagai arah

Lampiran 2. Perubahan aktivitas makan ikan mas penelitian tahap 3 Hari

ke- Pemberian A. hydrophila tanpa penyiponan (PA) dengan penyiponan (KS)Pemberian A. hydrophila Tanpa Pemberian A. hydrophila (PK)

Perlakuan A Perlakuan KS Perlakuan K

0 Pakan normal, Cepat Pakan normal, Cepat Pakan normal, Cepat 1 Pakan normal, Cepat Pakan normal, Cepat Pakan normal, Cepat 2 Pakan normal, Normal Pakan normal, Cepat Pakan normal, Normal 3 Pakan normal, Normal Pakan normal, Cepat Pakan normal, Normal 4 Pakan normal, Normal Pakan normal, Cepat Pakan normal, Normal 5 Pakan normal, Lambat Pakan normal, Cepat Pakan normal, Lambat 6 Pakan sedikit, Lambat Pakan normal, Cepat Pakan sedikit, Lambat 7 Pakan sedikit, Lambat Pakan normal, Cepat Pakan sedikit, Lambat 8 Pakan sedikit, Lambat Pakan normal, Cepat Pakan sedikit, Lambat 9 Pakan sedikit, Lambat Pakan normal, Cepat Pakan sedikit, Lambat 10 Pakan sedikit, Lambat Pakan normal, Cepat Pakan sedikit, Lambat 11 Pakan sedikit, Lambat Pakan normal, Cepat Pakan sedikit, Lambat 12 Pakan normal, Cepat Pakan normal, Cepat Pakan normal, Cepat 13 Pakan normal, Cepat Pakan normal, Cepat Pakan normal, Cepat 14 Pakan normal, Cepat Pakan normal, Cepat Pakan normal, Cepat Keterangan:

Normal : 3-4 detik waktu yang dibutuhkan untuk mengambil pakan berikutnya. Cepat : < 3 detik waktu yang dibutuhkan untuk mengambil pakan berikutnya.

Lambat : 5 detik atau lebih waktu yang dibutuhkan untuk mengambil pakan berikutnya. Jumlah pakan normal : 4-7 g /akuarium

Lampiran 3. Kepadatan A. hydrophila selama penelitian

A. Kepadatan A. hydrophila pada media broth TSB selama 24 jam dengan pengamatan setiap 2jam(Log 10 cfu/ml)

jam ke- 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

A.hydrophila 0.01 5.15 6.15 7.15 8.15 9.15 9.59 10.69 10.89 14.38 16.23 19.17 18.15 B. Kepadatan A. hydrophila pada media budidaya penelitian tahap 1

PERLAKUAN

BAKTERI 0 1 2 3 4 KEPADATAN 5 6 A.hydrophila7 8(Log 10 cfu/ml)9 10 11 12 13 14

PA1 (TA, TP) 2.00 1.95 1.40 1.45 1.30 1.10 1.10 1.10 1.10 1.20 1.10 1.30 1.30 1.10 0.00

PA2 (A,TP) 2.00 2.18 2.18 1.80 2.14 1.10 1.10 1.80 1.50 1.30 1.30 1.20 1.10 0.00 0.00

PA3 (A, P) 2.00 2.12 3.50 5.40 9.10 7.30 7.10 6.30 8.11 7.40 7.30 7.20 7.10 6.09 6.12 PA4 (TA,P) 2.00 3.21 5.36 7.13 8.84 10.23 12.24 12.81 13.40 16.28 14.15 13.40 11.34 10.30 10.16 PA5 (TA,P) 2.00 2.56 5.43 6.75 8.21 10.66 12.42 11.10 11.40 14.43 14.05 14.03 14.02 12.09 12.08

C. Kepadatan A. hydrophila pada media budidaya penelitian tahap 3 PERLAKUAN

BAKTERI 0 2 KEPADATAN 4 6A.hydrophila 8 (Log 10 cfu/ml)10 12 14

PA 2.00 6.75 8.12 7.91 8.50 5.21 5.97 7.17

PK 2.00 5.48 7.20 6.82 9.17 5.48 6.20 7.30

KS 2.48 5.00 5.40 5.00 5.00 5.00 5.77 5.29

D. Kepadatan A. hydrophila pada media budidaya penelitian tahap 4 hari ke 7 PERLAKUAN

BAKTERI (Log 10 cfu/ml)A. hyrophila

PAP 7.45

PC 6.31

PK 7.25

PAS 5.80

Lampiran 4. Kepadatan bakteri probiotik B. firmus selama penelitian

A. Kepadatan B. firmus pada media broth TSB selama 24 jam dengan pengamatan setiap 2jam (Log 10 cfu/ml)

jam ke- 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

B.firmus 0.01 4.93 5.20 6.15 7.15 8.15 9.05 9.10 11.61 13.40 15.30 17.12 17.10

B. Kepadatan bakteri probiotik B. firmus pada media budidaya penelitian tahap 2 PERLAKUAN

BAKTERI KEPADATAN BAKTERI (Log 10 cfu/ml)0 1 2 3 4

PP1 (TA, TP) 2 2.48 2.32 1.10 2.16

PP2 (A,TP) 2 4.41 6.18 6.14 4.11

PP3 (TA, P) 2 5.24 10.12 11.10 12.31