The Use of MHC I Molecular Marker in The Selection of Catfish Resistance to Aeromonas hydrophila Infection
PENGGUNAAN MARKA MOLEKULER MHC I DALAM
SELEKSI IKAN LELE (Clarias sp.) TAHAN
Aeromonas hydrophila
AZIS
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul “Penggunaan Marka
Molekuler MHC I Dalam Seleksi Ikan Lele (Clarias sp.) Tahan Aeromonas
hydrophila” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2016
Azis
NIM C151110041
RINGKASAN
AZIS. Penggunaan Marka Molekuler MHC I Dalam Seleksi Ikan Lele (Clarias
sp.) Tahan INFEKSI Aeromonas hydrophila. Dibimbing oleh ALIMUDDIN,
SUKENDA dan MUHAMMAD ZAIRIN JUNIOR
Permintaan ikan lele (Clarias sp.) tinggi sehingga mendorong berbagai
kalangan untuk terus meningkatkan produksi budidaya ikan lele. Salah satu
ancaman kegagalan budidaya ikan lele adalah serangan motile aeromonad
septicemia (MAS) yang disebabkan oleh bakteri Aeromonas hydrophila. Penyakit
MAS dapat menyebabkan kematian tinggi pada ikan lele. Berbagai pendekatan
dapat dilakukan untuk menanggulangi penyakit MAS, salah satunya adalah
budidaya ikan lele secara genetik tahan infeksi A. hydrophila. Aplikasi metode
seleksi dengan bantuan marka molekuler (marker assisted selection) diduga dapat
mempercepat produksi ikan lele tahan penyakit MAS. Tujuan penelitian ini
adalah: 1) Menemukan kandidat marka molekuler pembeda ikan yang hidup dan
mati pascainfeksi dengan A. hydrophila; 2) Memproduksi keturunan F1 ikan lele
dan menganalisis pewarisan marka DNA ikan tahan infeksi A. hydrophila, dan 3)
Mengevaluasi performa ikan lele pembawa gen MHC I yang diinfeksi bakteri A.
hydrophila.
Pada penelitian pertama, sebanyak 200 ekor ikan lele sangkuriang dengan
bobot 60±5 g diuji tantang dengan menyuntikkan bakteri A. hydrophila dengan
konsentrasi 105 cfu/ekor. Hasil uji tantang menunjukkan kelangsungan hidup ikan
lele sebesar 54% (14 ekor ikan tanpa luka, dan 94 ekor ikan luka dan kemudian
sembuh). Analisis PCR dengan primer spesifik MHC I digunakan untuk
membedakan ikan yang hidup dan mati pascatantang. Tujuh pasang primer
didesain berdasarkan sekuen gen MHC I ikan Clarias gariepinus yang terdapat di
Bank Gen. DNA diekstraksi dari jaringan sirip ekor ikan hidup dan yang mati,
kemudian dijadikan cetakan dalam amplifikasi PCR. Hasil PCR menggunakan
salah satu set primer (ClMHAh-01) menunjukkan adanya pita DNA spesifik
berukuran sekitar 300, 500 dan 930 bp pada ikan yang hidup pascatantang.
Produk PCR disekuensing untuk konfirmasi dan menguji tingkat homologi sekuen
MHC I ikan lele sangkuriang dengan database. Hasil analisis sekuen
menggunakan basic local alignment search tools menunjukkan bahwa produk
PCR tersebut memiliki kesamaan 69-88% dengan MHC I ikan C. gariepinus.
Dengan demikian, fragmen MHC I tersebut dapat menjadi marka molekuler ikan
lele tahan infeksi A. hydrophila.
Pada penelitian kedua, pemijahan dilakukan sebanyak 8 pasang induk yang
membawa marka MHC I dan satu pasang induk kontrol tidak membawa marka.
Persilangan tersebut adalah betina Resisten x jantan Resisten (RR) ; betina Luka
sembuh x jantan Luka sembuh (LL) ; betina Resisten x jantan Luka sembuh (RL) ;
betina Luka sembuh x jantan Resisten (LR), dan betina Kontrol x jantan Kontrol
(KK). Ikan R adalah ikan yang tidak luka dan hidup, sedangkan Luka-sembuh
adalah ikan yang luka kemudian sembuh pascatantang dengan A. hydrophila.
Hasil analisis DNA dengan metode PCR menggunakan primer ClMHAh-01
menunjukkan bahwa keturunan F1 yang membawa marka MHC I hasil
perkawinan ikan lele RR sebesar 83.4%, sementara ikan hasil perkawinan KK
menghasilkan 25% F1 membawa marka MHC I. Hal ini mengindikasikan bahwa
marka MHC I dan daya tahan terhadap infeksi bakteri patogen A. hidrophyla
dapat diwariskan ke keturunan F1.
Selanjutnya, hasil uji tantang dengan A. hydrophila 105 cfu/ekor,
memperlihatkan bahwa kelangsungan hidup ikan F1 dari induk ikan R dan L
(76.8-87.0%) adalah sekitar 2.21 kali lebih tinggi daripada ikan kontrol.
Persentase keturunan dari induk ikan R dan L dengan kategori “resisten” berkisar
64.0-77.2%, dan kategori “luka-sembuh” berkisar λ.2-18.8%, sedangkan pada
ikan kontrol adalah 4.0% “resisten” dan 33.2% “luka-sembuh”. Gambaran darah
dan titer antibodi sejalan dengan daya tahan ikan F1 dari induk R dan L yang
tinggi terhadap infeksi A. hydrophila. Dengan demikian daya tahan terhadap
infeksi A. hydrophila dapat diwariskan ke F1. Pemeliharaan ikan selama 95 hari
di akuarium menunjukkan bahwa pertumbuhan bobot tidak berbeda nyata pada
semua persilangan. Dengan kelangsungan hidup yang lebih tinggi, maka ikan lele
yang mempunyai marka MHC I berpotensi memiliki produktivitas budidaya yang
lebih tinggi.
Sebagai kesimpulan, hasil penelitian menunjukkan bahwa ikan lele tahan
infeksi bakteri A. hydrophila dapat dihasilkan melalui seleksi berbasis marka
MHC I. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menguji performa budidaya ikan
lele di lapangan/kolam, dan stabilitas pewarisan sifat pada keturunan selanjutnya.
Kata kunci: Ikan lele, marka molekuler, MHC I, A. hydrophila, primer MHClAh-01
SUMMARY
AZIS. The Use of MHC I Molecular Marker in The Selection of Catfish (Clarias
sp.) Resistance to Aeromonas hydrophila Infection. Supervised by ALIMUDDIN,
SUKENDA and MUHAMMAD ZAIRIN JUNIOR
High demand of catfish (Clarias sp.) in the market encourages the people to
continuously increase the production. One of the threats to fail the harvest is
motile aeromonad septicemia (MAS) disease caused by Aeromonas hydrophila
infection. MAS could cause high mortality in catfish. Several approaches can be
applied to overcome MAS disease ; one is farming of catfish that genetically
resists to A. hydrophila infection. Application of molecular marker assisted
selection could accelerate the process to obtain disease-resistant fish broodstock.
The aims of this study were to: 1) obtain a major histocompatibility complex
(MHC) I marker in the marker based selection to generate A. hydrophila-resistant
sangkuriang catfish; 2) evaluate the inheritance of MHC I marker in F1 generation,
and 3) Determine the growth and resistance of the F1 against A. hydrophila
infection.
In the first experiment, a total of 200 sangkuriang catfish (average body
weight: 60±5 g) were challenged by intramuscular injecting 0.1 mL/fish with A.
hydrophila at a dose of 105 cfu/fish. The results showed the viability of fish was
54% (14 fish survived without injure, and 94 fish recovered from injured). PCR
analysis with specific primers for MHC I was used to distinguish the survived and
dead fish after challenge test. Seven set primers were designed based on database
gene sequences of MHC I of Clarias gariepinus. Genomic DNA was extracted
from caudal fin tissue of living and the dead fish, and then used as template in
PCR amplification. The PCR results using a set of primer (ClMHAh-01) showed
specific DNA bands of approximately 300, 500 and 930 bp in the survived fish.
PCR product was then sequenced to confirm and analyze homology of MHC I
sequence of sangkuriang catfish and the database. The results of sequence analysis
using the basic local alignment search tools showed that the nucleotide sequence
of those PCR products had similarity of 69-88% with MHC I of C. gariepinus.
As conclusion, MHC I could be used as a molecular marker of A. hydrophila
resistance catfish.
In the second experiment, a total of 8 pairs of parent those carries the MHC
I and one pair of control without MHC I were mated to produce F1 generation.
Those crosses were female R and male R (abbreviated: RxR), LxL, RxL, and LxR,
and each was replicated twice (two brood pairs per crossing). R fishes are the fish
that survived without injury, while L fishes are the fish that injured and survived
when they are challenged with A. hydrophila. Female and male fish without MHC
I marker were mated to produce control fish (C). Results of PCR analysis showed
that the percentage of F1 progenies from R x R broods carrying MHC I marker
was 83.4%, while C fish was only 25%. This indicated that MHC I marker was
inherited to F1 offsprings. Furthermore, results from the challenge test by
intramuscular injection of 0.1 mL A. hydrophila (105 cfu/fish) showed that the
survival of F1 fish from R and L broods (76.8-87.0%) was 2.21 times higher than
that of C fish. Percentage of R category offspring from R and L broods was 64.0-
77.2%, and the L category was 9.2-18.8%, while R and L categories offspring
from control were 4.0% and 33.2%, respectively. Blood profiles and antibody titer
were in line with high resistance of F1 offspring from R and L broods against A.
hydrophila infection. Thus, the resistance to A. hydrophila infection can be
passed on to F1. Furthermore, rearing of fish for 95 days in aquarium showed that
body weight growth was not different in all crosses. With high survival rate,
catfish having MHC I marker is potentially to posses high farming productivity.
As conclusion, the results of study indicated that A. hydrophila-resistance
catfish can be produced by MHC I marker based selection. Further research is
needed to evaluate the performance of F1 catfish farming, and the stability of
marker inheritance to next generations.
Key Words: Catfish, molecular markers, MHClAh-01 primer, MHC I, A. hydrophila.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
1
PENGGUNAAN MARKA MOLEKULER MHC I DALAM
SELEKSI IKAN LELE (Clarias sp.) TAHAN
Aeromonas hydrophila
AZIS
Disertasi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
Pada
Program Studi Ilmu Akuakultur
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
Penguji pada Ujian Tertutup : Dr. Sri Nuryati SPi MSi
Prof. Dr. Ketut Sugama MSc
Penguji pada Ujian Terbuka : Dr. Sri Nuryati SPi MSi
Prof. Dr. Ketut Sugama MSc
Judul Disertasi :
Nama
NIM
:
:
Penggunaan Marka Molekuler MHC I Dalam Seleksi Ikan
Lele (Clarias sp.) Tahan Aeromonas hydrophila
Azis
C161110041
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Alimuddin, S.Pi, M.Sc
Ketua
Dr. Ir. Sukenda, M.Sc
Anggota
Prof. Dr. Ir. Muhammad Zairin Junior, M.Sc
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi
Ilmu Akuakultur
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Widanarni, M.Si
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr
Tanggal Ujian Tertutup : 5 Januari 2016
Tanggal Sidang Promosi : 27 Januari 2016
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Penulis memanjatkan puji dan syukur ke hadirat Allah SWT atas segala
karunia dan rahmat-Nya sehingga penulisan disertasi dengan judul μ “Penggunaan
Marka Molekuler MHC I Dalam Seleksi Ikan Lele (Clarias Sp.) Tahan
Aeromonas hydrophila” dapat diselesaikan. Disertasi ini disusun sebagai salah
satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor di Program Studi Ilmu Akuakultur,
Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyadari bahwa proses penyelesaian penelitian dan penulisan
disertasi ini tidak akan dapat berjalan lancar tanpa dukungan banyak pihak,
sehingga pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada komisi
pembimbing dan Prof. Komar Sumantadinata (Alm), atas waktu dan
bimbingannya mulai dari persiapan penelitian, penelitian hingga penulisan
disertasi.
Terima kasih disampaikan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi,
Kementrian Pendidikan Nasional Indonesia atas penyediaan beasiswa BPPS
Doktoral sehingga penulis dapat memperdalam ilmu di Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih juga kepada Rektor Universitas Borneo Tarakan dan Dekan
Universitas Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Borneo Tarakan
atas izin studi Doktoral di IPB. Terima kasih kepada Dekan Pascasarjana IPB dan
Ketua Program Studi Akuakultur beserta stafnya atas pelayanan administrasi
maupun teknis selama penulis menempuh pendidikan Doktoral di PS Ilmu
Akuakultur Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB.
Ucapan yang sama kepada Ir. H. Sarifin MSi selaku Kepala Balai Besar
Perikanan Budidaya Air Tawar Sukabumi dan segenap penanggung jawab
Laboratorium dan stafnya atas bantuan fasilitas laboratorium dan bantuan teknis
pada saat penelitian berlangsung.
Terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada Ayahanda
Abd. Razak Hamzah (Alm), Ibunda Hasna, Mertua H. Ma’ing (Alm) dan Hj.
Rosmiati serta saudara-saudaraku dan adik ipar. Terima kasih banyak buat Istri
tersayang Nur Ayu yang telah setia mendampingi dan memberi dorongan
semangat pada penulis selama studi di IPB, juga terima kasih kepada anak-anakku
tersayang Nurul Ghina Zahra Azis, Alya salsabilah Azis dan Muhammad Zafran
Al-Ghazali Azis yang menjadi sumber semangat bagi penulis. Saudaraku
sekaligus teman diskusi yang menyenangkan Adi Sucipto dan keluarga. Terima
kasih kepada sahabat-sahabatku Ade Sunarma, Ayi Santika, Dian Hardiantho,
Arief Eko Prasetiyo, Dwi Hany Yanti, Nur Lathifa, Dedy Heriwibowo dan Angga
serta rekan-rekan S3 Prodi Akuakultur angkatan 2011.
Sebagian dari isi disertasi ini telah di publikasikan pada Jurnal Riset
Akuakultur volume 10 (2) tahun 2015 dengan judul “Identifikasi kandidat marka
MHC I pada ikan lele (Clarias sp.) tahan infeksi Aeromonas hydrophila” dan
Pakistan Journal of Biotechnology Volume 12 (2) 2015 dengan judul “MHC I
molecular marker inheritance and first generation catfish (Clarias sp.) resistance
against Aeromonas hydrophila infection”. Semoga hasil penelitian ini dapat
memberi kontribusi bagi pengembangan akuakultur dan dimanfaatkan oleh
praktisi di bidang budidaya perikanan khususnya budidaya ikan lele, serta dapat
menjadi sumber rujukan bagi kalangan peneliti dan akademisi untuk
pengembangan dan perbaikan riset ini.
Bogor, Februari 2016
Azis
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
ix
DAFTAR GAMBAR
x
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan dan Manfaat Penelitian
Kerangka Penelitian
Hipotesis Penelitian
Kebaharuan Penelitian
1
1
2
3
4
4
TINJAUAN PUSTAKA
Ikan Lele Sangkuriang (Clarias sp)
Bakteri Aeromonas hydrophila
Mekanisme Respons Imun
Major Histocompatibility Complex (MHC)
Seleksi Berbasis Marka Molekuler (SBMM)
5
5
5
6
8
9
IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKA MHC I PADA IKAN
LELE (Clarias sp.) TAHAN INFEKSI Aeromonas hydrophila
Abstrak
Abstract
Pendahuluan
Metodologi Penelitian
Hasil
Pembahasan
Simpulan
PEWARISAN MARKA MOLEKULER MHC I DAN PERFORMA
IKAN LELE (Clarias sp.) KETURUNAN PERTAMA TAHAN INFEKSI
BAKTERI Aeromonas hydrophila
Abstrak
Abstract
Pendahuluan
Metodologi Penelitian
Hasil
Pembahasan
Simpulan
11
12
13
14
19
24
26
27
28
29
30
32
33
34
PERFORMA IKAN LELE (Clarias sp.) KETURUNAN
PERTAMA PEMBAWA GEN MHC I YANG DIUJI
TANTANG BAKTERI Aeromonas hydrophila
Abstrak
Abstract
Pendahuluan
Metodologi Penelitian
Hasil
Pembahasan
Simpulan
35
36
37
39
42
47
48
PEMBAHASAN UMUM
SIMPULAN UMUM
SARAN
DAFTAR PUSTAKA
49
51
51
52
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
59
62
DAFTAR TABEL
1
2
Pengujian Gram dan uji biokimia bakteri Aeromonas
hydrophila pascatantang sesuai prosedur standar SNI (2009)
No. 7303:2009
Rataan bobot, panjang, laju pertumbuhan spesifik (SGR), laju
pertumbuhan harian (GR) dan standar deviasi bobot ikan lele
15
46
DAFTAR GAMBAR
Bagan alir produksi ikan lele tahan infeksi Aeromonas hydrophila.
R=sangat tahan (sehat dan tidak terluka) ; LS=tahan (luka dan
sembuh) ; F0=tetua ; F1=turunan pertama
3
2
Mekanisme respons imun MHC I dan MHC II terhadap antigen
9
3
Bagan alir penentuan LD50 dan uji tantang dengan bakteri
Aeromonas hydrophila
16
Mortalitas (%) ikan lele setelah diinfeksi bakteri Aeromonas
hydrophila menggunakan dosis berbeda
19
Produk amplifikasi PCR dalam deteksi marka molekuler dengan
target gen major histocompatibility complex (MHC I) pada ikan
lele (Clarias sp.) strain sangkuriang. β-aktin digunakan untuk
kontrol loading DNA. M= Marka ukuran fragmen DNA (KAPA
Biosystem) ; LS1-5 = ikan luka dan sembuh; M1-5= ikan yang
mati; R1-5= ikan resisten, dan N= produk PCR tanpa cetakan DNA
(kontrol negatif). Angka di sebelah kiri adalah ukuran fragmen
marka DNA
20
Penyejajaran nukleotida produk PCR pada pita DNA berukuran
sekitar 500 bp dengan 930 bp yang spesifik terdapat pada
ikan lele sangkuriang (Clarias sp.) bertahan hidup dalam
uji tantang dengan bakteri Aeromonas hydrophila
20
Penyejajaran nukleotida produk PCR pada pita DNA berukuran
sekitar 300 bp dengan 500 bp yang spesifik terdapat pada
ikan lele sangkuriang (Clarias sp.) bertahan hidup dalam
uji tantang dengan bakteri Aeromonas hydrophila
21
Analisis BLAST sekuen nukleotida produk PCR pita DNA
berukuran sekitar 300 bp (A), 500 bp (B) dan 930 bp (C) dari
ikan lele sangkuriang (Clarias sp.) bertahan hidup dalam uji
tantang bakteri Aeromonas hydrophila. Description adalah
deskripsi alel MHC I C. Gariepinus; Max. score adalah nilai
maksimum; total score adalah nilai total ; identity
adalah nilai kemiripan
22
1
4
5
6
7
8
9
10
Kadar eritrosit dan leukosit ikan lele sangkuriang sebelum (0)
hingga hari keenam uji tantang dengan bakteri A. hydrophila.
Kadar hemoglobin dan hematokrit ikan lele sangkuriang sebelum
23
11
12
13
14
15
16
17
18
19
(0) hingga hari keenam uji tantang dengan bakteri A. hydrophila
23
Elektroforegram produk PCR ikan lele F1 menggunakan primer
ClMHAh-01 terkait marka MHC I (MHC I), dan β-aktin sebagai
kontrol internal loading DNA (β-aktin). M= marka ukuran fragmen
DNA, RR= perkawinan antara ikan betina resistan (R) dan jantan
resistan (R), LL= perkawinan antara ikan betina luka-sembuh (L)
dan jantan luka-sembuh (L), N= kontrol negatif dengan templat
SDW. RR1= pasangan induk RR nomor 1
32
Elektroforegram produk PCR ikan lele F1 menggunakan primer
ClMHAh-01 terkait marka MHC I (MHC I), dan β-aktin sebagai
kontrol internal loading DNA (β-aktin). M= marka ukuran fragmen
DNA, RL= perkawinan antara ikan betina resistan (R) dan jantan
resistan (R), LR= perkawinan antara ikan betina luka-sembuh (L)
dan jantan resistan (R), N= kontrol negatif dengan templat SDW.
RL1= pasangan induk RL nomor 1.
33
Elektroforegram produk PCR ikan lele kontrol menggunakan
primer ClMHAh-01 terkait marka MHC I (MHC I), dan β-aktin
sebagai kontrol internal loading DNA (β-aktin). M= marka ukuran
fragmen DNA, N= kontrol negatif dengan templat SDW. KK1-12=
pasangan induk kontrol nomor 1 sampai nomor 12
33
Persentase ikan lele keturunan pertama kategori resisten, lukasembuh, dan mati pascatantang dengan bakteri Aeromonas
hydrophila 105 cfu/ekor ikan
42
Jumlah leukosit ikan lele Clarias sp. pascatantang Aeromonas
hydrophila. Huruf berbeda di atas bar pada hari yang sama
menunjukkan nilai berbeda nyata berdasarkan uji Anova (p
SELEKSI IKAN LELE (Clarias sp.) TAHAN
Aeromonas hydrophila
AZIS
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul “Penggunaan Marka
Molekuler MHC I Dalam Seleksi Ikan Lele (Clarias sp.) Tahan Aeromonas
hydrophila” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2016
Azis
NIM C151110041
RINGKASAN
AZIS. Penggunaan Marka Molekuler MHC I Dalam Seleksi Ikan Lele (Clarias
sp.) Tahan INFEKSI Aeromonas hydrophila. Dibimbing oleh ALIMUDDIN,
SUKENDA dan MUHAMMAD ZAIRIN JUNIOR
Permintaan ikan lele (Clarias sp.) tinggi sehingga mendorong berbagai
kalangan untuk terus meningkatkan produksi budidaya ikan lele. Salah satu
ancaman kegagalan budidaya ikan lele adalah serangan motile aeromonad
septicemia (MAS) yang disebabkan oleh bakteri Aeromonas hydrophila. Penyakit
MAS dapat menyebabkan kematian tinggi pada ikan lele. Berbagai pendekatan
dapat dilakukan untuk menanggulangi penyakit MAS, salah satunya adalah
budidaya ikan lele secara genetik tahan infeksi A. hydrophila. Aplikasi metode
seleksi dengan bantuan marka molekuler (marker assisted selection) diduga dapat
mempercepat produksi ikan lele tahan penyakit MAS. Tujuan penelitian ini
adalah: 1) Menemukan kandidat marka molekuler pembeda ikan yang hidup dan
mati pascainfeksi dengan A. hydrophila; 2) Memproduksi keturunan F1 ikan lele
dan menganalisis pewarisan marka DNA ikan tahan infeksi A. hydrophila, dan 3)
Mengevaluasi performa ikan lele pembawa gen MHC I yang diinfeksi bakteri A.
hydrophila.
Pada penelitian pertama, sebanyak 200 ekor ikan lele sangkuriang dengan
bobot 60±5 g diuji tantang dengan menyuntikkan bakteri A. hydrophila dengan
konsentrasi 105 cfu/ekor. Hasil uji tantang menunjukkan kelangsungan hidup ikan
lele sebesar 54% (14 ekor ikan tanpa luka, dan 94 ekor ikan luka dan kemudian
sembuh). Analisis PCR dengan primer spesifik MHC I digunakan untuk
membedakan ikan yang hidup dan mati pascatantang. Tujuh pasang primer
didesain berdasarkan sekuen gen MHC I ikan Clarias gariepinus yang terdapat di
Bank Gen. DNA diekstraksi dari jaringan sirip ekor ikan hidup dan yang mati,
kemudian dijadikan cetakan dalam amplifikasi PCR. Hasil PCR menggunakan
salah satu set primer (ClMHAh-01) menunjukkan adanya pita DNA spesifik
berukuran sekitar 300, 500 dan 930 bp pada ikan yang hidup pascatantang.
Produk PCR disekuensing untuk konfirmasi dan menguji tingkat homologi sekuen
MHC I ikan lele sangkuriang dengan database. Hasil analisis sekuen
menggunakan basic local alignment search tools menunjukkan bahwa produk
PCR tersebut memiliki kesamaan 69-88% dengan MHC I ikan C. gariepinus.
Dengan demikian, fragmen MHC I tersebut dapat menjadi marka molekuler ikan
lele tahan infeksi A. hydrophila.
Pada penelitian kedua, pemijahan dilakukan sebanyak 8 pasang induk yang
membawa marka MHC I dan satu pasang induk kontrol tidak membawa marka.
Persilangan tersebut adalah betina Resisten x jantan Resisten (RR) ; betina Luka
sembuh x jantan Luka sembuh (LL) ; betina Resisten x jantan Luka sembuh (RL) ;
betina Luka sembuh x jantan Resisten (LR), dan betina Kontrol x jantan Kontrol
(KK). Ikan R adalah ikan yang tidak luka dan hidup, sedangkan Luka-sembuh
adalah ikan yang luka kemudian sembuh pascatantang dengan A. hydrophila.
Hasil analisis DNA dengan metode PCR menggunakan primer ClMHAh-01
menunjukkan bahwa keturunan F1 yang membawa marka MHC I hasil
perkawinan ikan lele RR sebesar 83.4%, sementara ikan hasil perkawinan KK
menghasilkan 25% F1 membawa marka MHC I. Hal ini mengindikasikan bahwa
marka MHC I dan daya tahan terhadap infeksi bakteri patogen A. hidrophyla
dapat diwariskan ke keturunan F1.
Selanjutnya, hasil uji tantang dengan A. hydrophila 105 cfu/ekor,
memperlihatkan bahwa kelangsungan hidup ikan F1 dari induk ikan R dan L
(76.8-87.0%) adalah sekitar 2.21 kali lebih tinggi daripada ikan kontrol.
Persentase keturunan dari induk ikan R dan L dengan kategori “resisten” berkisar
64.0-77.2%, dan kategori “luka-sembuh” berkisar λ.2-18.8%, sedangkan pada
ikan kontrol adalah 4.0% “resisten” dan 33.2% “luka-sembuh”. Gambaran darah
dan titer antibodi sejalan dengan daya tahan ikan F1 dari induk R dan L yang
tinggi terhadap infeksi A. hydrophila. Dengan demikian daya tahan terhadap
infeksi A. hydrophila dapat diwariskan ke F1. Pemeliharaan ikan selama 95 hari
di akuarium menunjukkan bahwa pertumbuhan bobot tidak berbeda nyata pada
semua persilangan. Dengan kelangsungan hidup yang lebih tinggi, maka ikan lele
yang mempunyai marka MHC I berpotensi memiliki produktivitas budidaya yang
lebih tinggi.
Sebagai kesimpulan, hasil penelitian menunjukkan bahwa ikan lele tahan
infeksi bakteri A. hydrophila dapat dihasilkan melalui seleksi berbasis marka
MHC I. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menguji performa budidaya ikan
lele di lapangan/kolam, dan stabilitas pewarisan sifat pada keturunan selanjutnya.
Kata kunci: Ikan lele, marka molekuler, MHC I, A. hydrophila, primer MHClAh-01
SUMMARY
AZIS. The Use of MHC I Molecular Marker in The Selection of Catfish (Clarias
sp.) Resistance to Aeromonas hydrophila Infection. Supervised by ALIMUDDIN,
SUKENDA and MUHAMMAD ZAIRIN JUNIOR
High demand of catfish (Clarias sp.) in the market encourages the people to
continuously increase the production. One of the threats to fail the harvest is
motile aeromonad septicemia (MAS) disease caused by Aeromonas hydrophila
infection. MAS could cause high mortality in catfish. Several approaches can be
applied to overcome MAS disease ; one is farming of catfish that genetically
resists to A. hydrophila infection. Application of molecular marker assisted
selection could accelerate the process to obtain disease-resistant fish broodstock.
The aims of this study were to: 1) obtain a major histocompatibility complex
(MHC) I marker in the marker based selection to generate A. hydrophila-resistant
sangkuriang catfish; 2) evaluate the inheritance of MHC I marker in F1 generation,
and 3) Determine the growth and resistance of the F1 against A. hydrophila
infection.
In the first experiment, a total of 200 sangkuriang catfish (average body
weight: 60±5 g) were challenged by intramuscular injecting 0.1 mL/fish with A.
hydrophila at a dose of 105 cfu/fish. The results showed the viability of fish was
54% (14 fish survived without injure, and 94 fish recovered from injured). PCR
analysis with specific primers for MHC I was used to distinguish the survived and
dead fish after challenge test. Seven set primers were designed based on database
gene sequences of MHC I of Clarias gariepinus. Genomic DNA was extracted
from caudal fin tissue of living and the dead fish, and then used as template in
PCR amplification. The PCR results using a set of primer (ClMHAh-01) showed
specific DNA bands of approximately 300, 500 and 930 bp in the survived fish.
PCR product was then sequenced to confirm and analyze homology of MHC I
sequence of sangkuriang catfish and the database. The results of sequence analysis
using the basic local alignment search tools showed that the nucleotide sequence
of those PCR products had similarity of 69-88% with MHC I of C. gariepinus.
As conclusion, MHC I could be used as a molecular marker of A. hydrophila
resistance catfish.
In the second experiment, a total of 8 pairs of parent those carries the MHC
I and one pair of control without MHC I were mated to produce F1 generation.
Those crosses were female R and male R (abbreviated: RxR), LxL, RxL, and LxR,
and each was replicated twice (two brood pairs per crossing). R fishes are the fish
that survived without injury, while L fishes are the fish that injured and survived
when they are challenged with A. hydrophila. Female and male fish without MHC
I marker were mated to produce control fish (C). Results of PCR analysis showed
that the percentage of F1 progenies from R x R broods carrying MHC I marker
was 83.4%, while C fish was only 25%. This indicated that MHC I marker was
inherited to F1 offsprings. Furthermore, results from the challenge test by
intramuscular injection of 0.1 mL A. hydrophila (105 cfu/fish) showed that the
survival of F1 fish from R and L broods (76.8-87.0%) was 2.21 times higher than
that of C fish. Percentage of R category offspring from R and L broods was 64.0-
77.2%, and the L category was 9.2-18.8%, while R and L categories offspring
from control were 4.0% and 33.2%, respectively. Blood profiles and antibody titer
were in line with high resistance of F1 offspring from R and L broods against A.
hydrophila infection. Thus, the resistance to A. hydrophila infection can be
passed on to F1. Furthermore, rearing of fish for 95 days in aquarium showed that
body weight growth was not different in all crosses. With high survival rate,
catfish having MHC I marker is potentially to posses high farming productivity.
As conclusion, the results of study indicated that A. hydrophila-resistance
catfish can be produced by MHC I marker based selection. Further research is
needed to evaluate the performance of F1 catfish farming, and the stability of
marker inheritance to next generations.
Key Words: Catfish, molecular markers, MHClAh-01 primer, MHC I, A. hydrophila.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
1
PENGGUNAAN MARKA MOLEKULER MHC I DALAM
SELEKSI IKAN LELE (Clarias sp.) TAHAN
Aeromonas hydrophila
AZIS
Disertasi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
Pada
Program Studi Ilmu Akuakultur
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
Penguji pada Ujian Tertutup : Dr. Sri Nuryati SPi MSi
Prof. Dr. Ketut Sugama MSc
Penguji pada Ujian Terbuka : Dr. Sri Nuryati SPi MSi
Prof. Dr. Ketut Sugama MSc
Judul Disertasi :
Nama
NIM
:
:
Penggunaan Marka Molekuler MHC I Dalam Seleksi Ikan
Lele (Clarias sp.) Tahan Aeromonas hydrophila
Azis
C161110041
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Alimuddin, S.Pi, M.Sc
Ketua
Dr. Ir. Sukenda, M.Sc
Anggota
Prof. Dr. Ir. Muhammad Zairin Junior, M.Sc
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi
Ilmu Akuakultur
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Widanarni, M.Si
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr
Tanggal Ujian Tertutup : 5 Januari 2016
Tanggal Sidang Promosi : 27 Januari 2016
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Penulis memanjatkan puji dan syukur ke hadirat Allah SWT atas segala
karunia dan rahmat-Nya sehingga penulisan disertasi dengan judul μ “Penggunaan
Marka Molekuler MHC I Dalam Seleksi Ikan Lele (Clarias Sp.) Tahan
Aeromonas hydrophila” dapat diselesaikan. Disertasi ini disusun sebagai salah
satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor di Program Studi Ilmu Akuakultur,
Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyadari bahwa proses penyelesaian penelitian dan penulisan
disertasi ini tidak akan dapat berjalan lancar tanpa dukungan banyak pihak,
sehingga pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada komisi
pembimbing dan Prof. Komar Sumantadinata (Alm), atas waktu dan
bimbingannya mulai dari persiapan penelitian, penelitian hingga penulisan
disertasi.
Terima kasih disampaikan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi,
Kementrian Pendidikan Nasional Indonesia atas penyediaan beasiswa BPPS
Doktoral sehingga penulis dapat memperdalam ilmu di Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih juga kepada Rektor Universitas Borneo Tarakan dan Dekan
Universitas Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Borneo Tarakan
atas izin studi Doktoral di IPB. Terima kasih kepada Dekan Pascasarjana IPB dan
Ketua Program Studi Akuakultur beserta stafnya atas pelayanan administrasi
maupun teknis selama penulis menempuh pendidikan Doktoral di PS Ilmu
Akuakultur Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB.
Ucapan yang sama kepada Ir. H. Sarifin MSi selaku Kepala Balai Besar
Perikanan Budidaya Air Tawar Sukabumi dan segenap penanggung jawab
Laboratorium dan stafnya atas bantuan fasilitas laboratorium dan bantuan teknis
pada saat penelitian berlangsung.
Terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada Ayahanda
Abd. Razak Hamzah (Alm), Ibunda Hasna, Mertua H. Ma’ing (Alm) dan Hj.
Rosmiati serta saudara-saudaraku dan adik ipar. Terima kasih banyak buat Istri
tersayang Nur Ayu yang telah setia mendampingi dan memberi dorongan
semangat pada penulis selama studi di IPB, juga terima kasih kepada anak-anakku
tersayang Nurul Ghina Zahra Azis, Alya salsabilah Azis dan Muhammad Zafran
Al-Ghazali Azis yang menjadi sumber semangat bagi penulis. Saudaraku
sekaligus teman diskusi yang menyenangkan Adi Sucipto dan keluarga. Terima
kasih kepada sahabat-sahabatku Ade Sunarma, Ayi Santika, Dian Hardiantho,
Arief Eko Prasetiyo, Dwi Hany Yanti, Nur Lathifa, Dedy Heriwibowo dan Angga
serta rekan-rekan S3 Prodi Akuakultur angkatan 2011.
Sebagian dari isi disertasi ini telah di publikasikan pada Jurnal Riset
Akuakultur volume 10 (2) tahun 2015 dengan judul “Identifikasi kandidat marka
MHC I pada ikan lele (Clarias sp.) tahan infeksi Aeromonas hydrophila” dan
Pakistan Journal of Biotechnology Volume 12 (2) 2015 dengan judul “MHC I
molecular marker inheritance and first generation catfish (Clarias sp.) resistance
against Aeromonas hydrophila infection”. Semoga hasil penelitian ini dapat
memberi kontribusi bagi pengembangan akuakultur dan dimanfaatkan oleh
praktisi di bidang budidaya perikanan khususnya budidaya ikan lele, serta dapat
menjadi sumber rujukan bagi kalangan peneliti dan akademisi untuk
pengembangan dan perbaikan riset ini.
Bogor, Februari 2016
Azis
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
ix
DAFTAR GAMBAR
x
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan dan Manfaat Penelitian
Kerangka Penelitian
Hipotesis Penelitian
Kebaharuan Penelitian
1
1
2
3
4
4
TINJAUAN PUSTAKA
Ikan Lele Sangkuriang (Clarias sp)
Bakteri Aeromonas hydrophila
Mekanisme Respons Imun
Major Histocompatibility Complex (MHC)
Seleksi Berbasis Marka Molekuler (SBMM)
5
5
5
6
8
9
IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKA MHC I PADA IKAN
LELE (Clarias sp.) TAHAN INFEKSI Aeromonas hydrophila
Abstrak
Abstract
Pendahuluan
Metodologi Penelitian
Hasil
Pembahasan
Simpulan
PEWARISAN MARKA MOLEKULER MHC I DAN PERFORMA
IKAN LELE (Clarias sp.) KETURUNAN PERTAMA TAHAN INFEKSI
BAKTERI Aeromonas hydrophila
Abstrak
Abstract
Pendahuluan
Metodologi Penelitian
Hasil
Pembahasan
Simpulan
11
12
13
14
19
24
26
27
28
29
30
32
33
34
PERFORMA IKAN LELE (Clarias sp.) KETURUNAN
PERTAMA PEMBAWA GEN MHC I YANG DIUJI
TANTANG BAKTERI Aeromonas hydrophila
Abstrak
Abstract
Pendahuluan
Metodologi Penelitian
Hasil
Pembahasan
Simpulan
35
36
37
39
42
47
48
PEMBAHASAN UMUM
SIMPULAN UMUM
SARAN
DAFTAR PUSTAKA
49
51
51
52
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
59
62
DAFTAR TABEL
1
2
Pengujian Gram dan uji biokimia bakteri Aeromonas
hydrophila pascatantang sesuai prosedur standar SNI (2009)
No. 7303:2009
Rataan bobot, panjang, laju pertumbuhan spesifik (SGR), laju
pertumbuhan harian (GR) dan standar deviasi bobot ikan lele
15
46
DAFTAR GAMBAR
Bagan alir produksi ikan lele tahan infeksi Aeromonas hydrophila.
R=sangat tahan (sehat dan tidak terluka) ; LS=tahan (luka dan
sembuh) ; F0=tetua ; F1=turunan pertama
3
2
Mekanisme respons imun MHC I dan MHC II terhadap antigen
9
3
Bagan alir penentuan LD50 dan uji tantang dengan bakteri
Aeromonas hydrophila
16
Mortalitas (%) ikan lele setelah diinfeksi bakteri Aeromonas
hydrophila menggunakan dosis berbeda
19
Produk amplifikasi PCR dalam deteksi marka molekuler dengan
target gen major histocompatibility complex (MHC I) pada ikan
lele (Clarias sp.) strain sangkuriang. β-aktin digunakan untuk
kontrol loading DNA. M= Marka ukuran fragmen DNA (KAPA
Biosystem) ; LS1-5 = ikan luka dan sembuh; M1-5= ikan yang
mati; R1-5= ikan resisten, dan N= produk PCR tanpa cetakan DNA
(kontrol negatif). Angka di sebelah kiri adalah ukuran fragmen
marka DNA
20
Penyejajaran nukleotida produk PCR pada pita DNA berukuran
sekitar 500 bp dengan 930 bp yang spesifik terdapat pada
ikan lele sangkuriang (Clarias sp.) bertahan hidup dalam
uji tantang dengan bakteri Aeromonas hydrophila
20
Penyejajaran nukleotida produk PCR pada pita DNA berukuran
sekitar 300 bp dengan 500 bp yang spesifik terdapat pada
ikan lele sangkuriang (Clarias sp.) bertahan hidup dalam
uji tantang dengan bakteri Aeromonas hydrophila
21
Analisis BLAST sekuen nukleotida produk PCR pita DNA
berukuran sekitar 300 bp (A), 500 bp (B) dan 930 bp (C) dari
ikan lele sangkuriang (Clarias sp.) bertahan hidup dalam uji
tantang bakteri Aeromonas hydrophila. Description adalah
deskripsi alel MHC I C. Gariepinus; Max. score adalah nilai
maksimum; total score adalah nilai total ; identity
adalah nilai kemiripan
22
1
4
5
6
7
8
9
10
Kadar eritrosit dan leukosit ikan lele sangkuriang sebelum (0)
hingga hari keenam uji tantang dengan bakteri A. hydrophila.
Kadar hemoglobin dan hematokrit ikan lele sangkuriang sebelum
23
11
12
13
14
15
16
17
18
19
(0) hingga hari keenam uji tantang dengan bakteri A. hydrophila
23
Elektroforegram produk PCR ikan lele F1 menggunakan primer
ClMHAh-01 terkait marka MHC I (MHC I), dan β-aktin sebagai
kontrol internal loading DNA (β-aktin). M= marka ukuran fragmen
DNA, RR= perkawinan antara ikan betina resistan (R) dan jantan
resistan (R), LL= perkawinan antara ikan betina luka-sembuh (L)
dan jantan luka-sembuh (L), N= kontrol negatif dengan templat
SDW. RR1= pasangan induk RR nomor 1
32
Elektroforegram produk PCR ikan lele F1 menggunakan primer
ClMHAh-01 terkait marka MHC I (MHC I), dan β-aktin sebagai
kontrol internal loading DNA (β-aktin). M= marka ukuran fragmen
DNA, RL= perkawinan antara ikan betina resistan (R) dan jantan
resistan (R), LR= perkawinan antara ikan betina luka-sembuh (L)
dan jantan resistan (R), N= kontrol negatif dengan templat SDW.
RL1= pasangan induk RL nomor 1.
33
Elektroforegram produk PCR ikan lele kontrol menggunakan
primer ClMHAh-01 terkait marka MHC I (MHC I), dan β-aktin
sebagai kontrol internal loading DNA (β-aktin). M= marka ukuran
fragmen DNA, N= kontrol negatif dengan templat SDW. KK1-12=
pasangan induk kontrol nomor 1 sampai nomor 12
33
Persentase ikan lele keturunan pertama kategori resisten, lukasembuh, dan mati pascatantang dengan bakteri Aeromonas
hydrophila 105 cfu/ekor ikan
42
Jumlah leukosit ikan lele Clarias sp. pascatantang Aeromonas
hydrophila. Huruf berbeda di atas bar pada hari yang sama
menunjukkan nilai berbeda nyata berdasarkan uji Anova (p