I . AN ALI SI S D N A

1 didasarkan pada polim orfism e gen secara langsung sepert i Random Am plified Polym or phic DNA RAPD , Rest rict ed Fragm ent Lengt h Polym orphism RFLP , Degradat iv e Gradien Gel Elect rophoresis DGGE , analisis sekuen dan Macro- rest rict ed Fragm ent Lengt h Polym orphism MFLP .

BAB I I . AN ALI SI S D N A

Beberapa t ek nik analisis k eanekaragam an genet ik sepert i RAPD, RFLP, dan DGGE m em but uhk an am plifikasi daerah genom t ert ent u dari suat u organism e. Am plifikasi ini m em but uhkan prim er spesifik sekuen oligonukelot ida khusus unt uk daerah t ersebut . Prim er biasany a t erdiri dari 10- 20 nuk leot ida dan dirancang berdasark an daerah k onserv at if dalam genom t ersebut . Mak in panj ang prim er, m akin harus spesifik daerah yang diam plifikasi. Jika suat u kelom pok organism e m em ang berkerabat dek at , m ak a prim er dapat digunak an unt uk m engam plifikasi daerah t ert ent u y ang sam a dalam genom k elom pok t ersebut . Beberapa fak t or sepert i k onsent rasi DNA cont oh, uk uran panj ang prim er, k om posisi basa prim er, konsent rasi ion Mg, dan suhu hibridisasi prim er harus dikont rol dengan hat i- hat i agar dapat diperoleh pit a- pit a DNA y ang ut uh dan baik. Keberhasilan t ek nik ini lebih didasarkan k epada k esesuaian prim er dan efisiensi dan opt im asi proses PCR. Prim er y ang t idak spesifik dapat m eny ebabk an t eram plifikasiny a daerah lain dalam genom y ang t idak dij adik an sasaran at au sebalikny a t idak ada daerah genom y ang t eram plifikasi. Opt im asi PCR j uga diperlukan unt uk m enghasilkan karakt er yang diinginkan. Opt im asi ini m enyangkut suhu denat urasi dan annealing DNA dalam m esin PCR. Suhu denat urasi yang rendah dapat m eny ebabk an belum t erbuk any a DNA ut as ganda sehingga t idak dim ungk ink an t erj adiny a polim erisasi DNA baru. Proses penem pelan prim er pada ut as DNA yang sudah t erbuka m em erlukan suhu opt im um , sebab suhu yang t erlalu t inggi dapat m enyebabkan am plifikasi t idak t erj adi at au sebaliknya suhu yang t erlalu rendah m enyebabkan prim er m enem pel pada sisi lain genom yang bukan sisi hom ologny a; ak ibat ny a dapat t eram plifikasi bany ak daerah t idak spesifik dalam genom t ersebut . Suhu penem pelan annealing ini dit ent uk an berdasark an prim er yang digunakan yang dipengaruhi oleh panj ang dan kom posisi prim er. Suhu penem elan ini sebaiknya sekit ar 5 ° C di baw ah suhu leleh. Secara um um suhu leleh Tm dihit ung dengan rum us Tm = 4 G+ C + 2 A+ T ° C Ry bick y , 1996 . Berikut ini disaj ikan cont oh hasil am plifikasi gen 16S- rRNA pada gel elekt roforesis dari bak t eri dengan prim er dom ain Bact eria 63f 5’- CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC dan 1387r 5’- GGG CGG WGT GTA CAA GGC Mar chesi et al., 1998 . 2 Gam bar 1. Hasil elekt roforesis gel m ini hasil am plifikasi gen 16S rRNA. PCR- RAPD PCR- RAPD m erupak an salah sat u t ek nik m olek uler berupa penggunaan penanda t ert ent u unt uk m em pelaj ari k eanekaragam an genet ik a. Dasar analisis RAPD adalah m enggunakan m esin PCR yang m am pu m engam plifikasi sekuen DNA secara in v it ro. Tek nik ini m elibat k an penem pelan prim er t ert ent u y ang dirancang sesuai dengan k ebut uhan. Tiap prim er boleh j adi berbeda unt uk m enelaah k eanekaragam an genet ik kelom pok yang berbeda. Penggunaan t eknik RAPD m em ang m em ungkinkan unt uk m endet eksi polim orfism e fragm en DNA yang diseleksi dengan m enggunakan sat u prim er arbit rasi, t erut am a k arena am plifikasi DNA secara in v it ro dapat dilak uk an dengan baik dan cepat dengan adany a PCR. Penggunaan penanda RAPD relat if sederhana dan m udah dalam hal preparasi. Tek nik RAPD m em berikan hasil y ang lebih cepat dibandingk an dengan t ek nik m olekuler lainnya. Teknik ini j uga m am pu m enghasilkan j um lah karakt er yang relat if t idak t erbat as, sehingga sangat m em bant u unt uk keperluan analisis k eanekaragam an organism e y ang t idak dik et ahui lat ar belak ang genom ny a. Pada t anam an t ahunan RAPD dapat digunakan unt uk m eningkat kan efisiensi seleksi aw al. Teknik RAPD sering digunakan unt uk m em bedakan organism e t ingkat t inggi eucaryot e . Nam un dem ikian beberapa penelit i m enggunakan t eknik ini unt uk m em bedak an organism e t ingk at rendah procary ot e at au m elihat perbedaan organism e t ingkat rendah m elalui pirant i organel sel sepert i m it okondria. 3 Gam bar 2. Hasil am plifikasi DNA kelapa Genj ah Jom bang m enggunakan prim er OPA- 18. M = 1kb LADDER dar i Hayat i et al., 2000 PCR- RFLP Tek nik ini m irip dengan RAPD pada prinsip penggunaan prim er. Unt uk m elihat polim orfism e dalam genom organism e digunak an j uga suat u enzim pem ot ong t ert ent u rest rict ion enzym es . Karena sifat nya yang spesifik, m aka enzim ini akan m em ot ong sit us t ert ent u y ang dik enali oleh enzim ini. Sit us enzim pem ot ong dari genom suat u kelom pok organism e yang kem udian berubah karena m ut asi at au berpindah k arena genet ic rearrangem ent dapat m eny ebabk an sit us t ersebut t idak lagi dikenali oleh enzim , at au enzim rest riksi akan m em ot ong daerah lain yang berbeda. Proses ini m enyebabkan t erbent uknya fragm en- fragm en DNA yang berbeda ukurannya dari sat u organism e ke organism e lainnya. Polim orfism e ini selanj ut nya digunakan unt uk m em buat pohon filogeni dendogram kekerabat an kelom pok. Teknik RFLP sering digunakan unt uk m enget ahui perbedaan j enis bakt eri m isalnya berdasarkan gen ribosom al DNA cont oh 16S- rRNA . Oleh karenanya t eknik ini seringkali pula disebut ARDRA am plified ribosom al DNA rest rict ion analy sis . Penggunaan t eknik PCR- RFLP t elah pula m am pu secara m engesankan m engungkap k eanekaragam an genet ik m ik roba y ang t idak dapat dik ult urk an di laborat orium . Dengan m enggunakan t eknik isolasi DNA dari lingkungan yang kem udian dilanj ut kan dengan am plifikasi dengan m enggunakan prim er spesifik unt uk 16S- rRNA t elah dapat diungk ap adany a j enis- j enis m ik roba baru. Dengan m enggunak an prim er t ert ent u, t ek nik ini j uga dapat digunak an unt uk gen- gen lain y ang ada dalam cont oh lingkungan. Pem ilihan DNA ribosom unt uk t uj uan ident ifikasi suat u organism e didasarkan pada: • Secara fungsional dan evolusioner m em iliki sifat hom olog dari berbagai orgenism e yang berbeda • Molekul purba dengan st rukt ur dan sekuen nukelot ida sangat konservat if • Sangat bany ak di dalam sel • Cukup besar unt uk m em ungkinkan uj i st at ist ik perbedaan- perbedaannya sat u sam a lain • Kelihat anny a t idak ada art ifak perpindahan lat eral ant ar organism e 4 Gam bar 3. Pem ot ongan plasm id rek om binan gen 16S rRNA dengan RsaI dari Desiliyarni, 1999 . PCR- AN ALI SI S SEKUEN Analisis sek uen m erupak an suat u t ek nik y ang dianggap paling baik unt uk m elihat k eanekaragam an hay at i suat u k elom pok organism e. Tek nik ini berkem bang set elah orang m encipt akan m esin DNA sequencer. Pada prinsipny a polim orfism e dilihat dari urut an at au sekuen DNA dari fragm en t ert ent u dari suat u genom organism e. Unt uk m elihat keanekaragam an j enis dapat dilakukan m elalui analisis sek uen gen 16S- rRNA bagi organism e prokary ot a at au 18S- rRNA bagi organism e eukaryot a. Perbandingan sekuen rRNA m erupakan alat yang baik unt uk m endeduksi hubungan filogeni dan evolusi di ant ara organism e bact eria, archaebact eria, dan eukaryot Weisburg et al., 1991 . Gen- gen penghasil enzim t ert ent u m isalny a dapat j uga dibandingk an berdasark an sek uen m erek a. Saat ini basis dat a dat a- base unt uk banyak gen 16S- rRNA dan 18S- rRNA t ersedia dan disim pan m isalny a dalam Gene- Bank , dan dapat diakses m isalnya m elalui ht t p: w w w .ebi.ac.uk . Dem ikian j uga unt uk banyak gen penghasil enzim pent ing dan beberapa sek uen lainny a. Tabel 1. Cont oh beberapa sek uen 16S rRNA hasil sek uensing. • Sek uen gen 16S rRNA bak t eri fot osint et ik anoksigenik DS- 1 GAGGGCGt t C ATACGTCAGT GGCAGACGGG TGAGTAACGC GTGGGAACGT ACCTTTTGGT TCGGAACAAC ACAGGGAAAC TTGTGCTAAT ACCGGATAAG CCCTTACGGG GAAAGATTTA TCGCCGAAAG ATCGGCCCGC GTCTGATTAG CTAGTTGGTG AGGTAATGGC TCACCAAGGC GACGATCAGT AGCTGGTCTG AGAGGATGAT CAGCCACATT GGGACTGAGA CACGGCCCAA ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TGGGGAATAT TGGACAATGG GCGAAAGCCT GATCCAGCCA TGCCGCGTGA GTGATGAAGG CCCTAGGGTT GTAAAGCTCT TTTGTGCGGG 5 AAGATAATGA CGGTACCGCA AGAATAAGCC CCGGCTAACT TCGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGAAGGG GGCTAGCGTT GCTCGGAATC ACTGGGCGTA AAGGGTGCGT AGGCGGGTTT CTAAGTCAGA GGTGAAAGCC TGGAGCTCAA CTCCAGAACT GCCTTTGATA CTGGAAGTCT TGAGTATGGC AGAAGTGAGT GGAACTGCGA GTGTAGAGGT GAAATTCGTA GATATTCGCA AGAACACCAG TGGCG • Sek uen gen 16S rRNA bak t eri fot osint et ik anoksigenik DS- 4 AGGCTTATAC TCACAGGCAG ACGGGTGAGT AACGCGTGGG AACGTACCTT TTGGTTCGGA GCAACACAAG GAAACTTGTG CTAATACCGG ATTAGCCCTT ACGGGGAAAG ATGTATGGCG GAAGACTCGG CCCGCGTGAG ATTAGCTATT TGGCGAGGTA ACTGGCCTAC CAAGGCGACG ATCATTAGCT GGTCTGAGAG GATGATCACA CACTTGTGAC TGAACCACGG TCCAAACTCN TACGGGAGCA GTTGTGGGGA GTATTTGCCA ATGGGCGAAA GCCTCTTCCA CACATGCCGT ATCAATGATG AAGGCCATAC GGTTGTCAAG GTCTTTTGGG CTAAAAGTTA ATCACTGCGC ATTAAGAATA ATGCCGGGAC AACTTCATGC CATACTTCTT GGGTATACCA AGGGGGATAG CGCTGGTCTT AACCACTGAC CGTTAATGCT GACTGAGAGG GCTTTAAAAC CCGAGGGGCA TGCCTGGACC CCCACCACGG ATCTGTCTTT • Sek uen gen 16S rRNA bak t eri fot osint et ik anoksigenik Cas- 13 GAAGGGCCTT CATACGTCAG TGGCAGACGG GTGAGTAACG CGTGGGAACG TACCTTTTGG TTCGGAACAA CACAGGGAAA CTTGTGCTAA TACCGGATAA GCCCTTACGG GGAAAGATTT ATCGCCGAAA GATCGGCCCG CGTCTGATTA GCTAGTTGGT GAGGTAATGG CTCACCAAGG CGACGATCAG TAGCTGGTCT GAGAGGATGA TCAGCCACAT TGGGACTGAG ACACGGCCCA AACTCCTACG GGAGGCAGCA GTGGGGAATA TTGGACAATG GGCGAAAGCC TGATCCAGCC ATGCCGCGTG AGTGATGAAG GCCCTAGGGT TGTAAAGCTC TTTTGTGCGG GAAGATAATG ACGGTACCGC AAGAATAAGC CCCGGCTAAC TTCGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGAAGG GGGCTAGCGT TGCTCGGAAT CACTGGGCGT AAAGGGTGCG TAGGCGGGTT TCTAAGTCAG AGGTGAAAGC CTGGAGCTCA ACTCCAGAAC TGCCTTTGAT ACTGGAAAGT CTTGAGTATG GCAGAAGTGA GTGGAACTGC CaAGTGTAGA GGTGAAATTC GTAGATATTC GCAAGAACAC CAGTGGCGAA GGCGGCTCAC TGGCCATTAC TGACGCTGAG GCCGAAAGCG TGGGGAT dari Suryant o, 2001 . PCR- D GGE Teknik analisis ini sebenarnya m irip dengan RAPD at aupun RFLP, hanya saj a prim er yang digunakan m isalnya prim er GC clam p. Elekt roforesis yang dilakukan m enggunak an gel poliak rilam ida dengan gradien urea y ang dit am bah dengan form am ida. Pem isahan dilakukan t anpa enzim rest riksi dan sekuen bukan berdasarkan berat m olekul. Teknik ini m enggunakan dasar perbedaan st abilit as produk PCR. Dengan dem ik ian sangat t ergant ung dari j um lah ikat an hidrogen y ang ada dalam DNA t ersebut . 6 Gam bar 4. Denat uring Gradient Gel Elect rophoresis DGGE M FLP Pada prinsipny a sem ua t ek nik pem isahan DNA, m isalny a pada RFLP dan RAPD, m enggunak an suat u t ek nik elekt roforesis m edan list rik t et ap dan sat u arah konfigurasi horizont al dengan m edia agarose at au akrilam id. Gel agarose m em iliki k apasit as pem isahan y ang lebih rendah dibandingk an dengan gel ak rilam id, t et api m em ilik spekt rum pem isahan yang lebih besar. Teknik elekt roforesis gel agarose konvensional ini biasanya digunakan unt uk m em isahkan fragm en DNA dengan uk uran relat if k ecil dengan uk uran sek it ar 200 bp sam pai k ira- k ira 50 k b. Fragm en dengan uk uran di at as 50 k b t idak lagi dapat dipisahk an dengan baik dengan m enggunakan t eknik ini. Fragm en- fragm en ini akan bergerak dalam kecepat an yang sam a dalam gel agarosa. Bat as kem am puan linier t ersebut m elam paui ukuran pori- pori gel. Agar dapat t erpisah fragm en harus bergerak dari uj ung k e uj ung end- on . Masalah ini ak hirny a dapat diat asi oleh Schw art z dan Cant or 1984 y ang m em perk enalkan t ek nik pulsed field gel elect rophoresis PFGE . Dengan t eknik ini m olekul DNA secara periodik m erubah arah m igrasi selam a elekt roforesis. Beberapa t ek nik PFGE t elah diperkenalk an, y ait u field inv ersion gel elect rophoresis FI GE , cont our clam ped hom ogenous elect ric field CHEF , dan program m able, aut onom ously cont rolled elect rode gel elect rophoresis PAGE . Berbeda dengan t eknik elekt roforesis lainnya, yang sering m engisolasi DNA dalam cairan, t eknik PFGE ini m em but uhkan DNA yang kurang lebih ut uh. I solasi DNA dalam cairan seringkali m enyebabkan DNA t erpot ong- pot ong dengan ukuran rat a- rat a k urang dari 1000 k b. Unt uk k eperluan PFGE genom suat u organism e biasanya diisolasi ut uh dengan cara m em erangkap sel dalam agarose. Pem ecahan dan pem urnian DNA selanj ut nya dilakukan secara in sit u. Tek nik ident ifik asi dengan PFGE at au MFLP ini sangat diskrim inat if dalam m em bedakan st rain suat u kelom pok bakt eri dengan st rain bakt eri lainnya. Oleh karenanya t eknik ini sering digunakan unt uk m elihat perbedaan st rain- st rain bakt eri spesies yang sam a. 7 Gam bar 5. Profil MFLP genom t ot al bak t eri fot osint et ik anoksigenik DS- 1, DS- 4, dan Cas- 13 yang dipot ong dengan AseI . M = genom t ot al Rhodobact er sphaeroiides 2.4.1.

BAB I I I . AN ALI SI S KEAN EKARAGAM AN