Pemilihan dan karakterisasi bakteri penghasil enzim proteolik dari terasi medan
PEMILAHAN DAN PENCIRIAN BAKTERI PENGHASIL
ENZIM PROTEOLITIK DARI TERASI MEDAN
DIAN KRISTIANA
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
PEMILAHAN DAN KARAKTERISASI BAKTERI PENGHASIL
ENZIM PROTEOLITIK DARI TERASI MEDAN
DIAN KRISTIANA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
ABSTRAK
DIAN KRISTIANA. Pemilahan dan Pencirian Bakteri Penghasil Enzim
Proteolitik dari Terasi Medan. Dibimbing oleh DONDIN SAJUTHI danYANTI.
Enzim protease yang diproduksi oleh isolat bakteri D1T2 diisolasi dari
Terasi medan makanan fermentasi tradisonal Indonesia, menunjukkan aktivitas
fibrinolitik. Penelitian bertujuan memperoleh isolat yang berpotensi memproduksi
enzim protease dari isolat Terasi Medan dan mengkaji karakterisasi enzim
tersebut.
Ekstrak enzim protease dilakukan beberapa tahapan pemurnian dengan
presipitasi ammonium sulfat 55%, dialisis menggunakan kantung dialisis (cut off
10 kD) dan pemekatan dengan polietilenglikol (PEG). Hasil penelitian
menunjukkan bahwa aktivitas spesifik dialisat adalah 4.6461 U/mg dengan tingkat
kemurnian 3.01 kali dibandingkan dengan ekstrak enzim kasar (1.5434 U/mg).
Analisis SDS-PAGE 10% menunjukkan bahwa ekstrak kasar protease mempunyai
2 buah pita protein (34.70 kD dan 9.62 kD) dan dialisat dengan 1 buah pita (23.86
kD). Uji zimografi 10 % menunjukkan bahwa enzim protease ini mempunyai
aktivitas kaseinolitik, fibrinolitik, dan gelatinolitik. Aktivitas protease meningkat
dengan penambahan ion Ca2+ 1mM. Protease ini dihambat spesifik oleh TLCK
(N-p-tosil-L-lisinklorometil keton), PMSF (Fenil Metil Sulfonil Fluorida), dan
STI (Soybean Trypsin Inhibitor) sehingga digolongkan kedalam kelompok
protease serin.
ABSTRACT
DIAN KRISTIANA. Selection and Characterization of Bacteria Produced
Proteolytic from Terasi Medan. Under the direction of DONDIN SAJUTHI and
YANTI.
Protease which produced by bacteria D1T2 isolated from Terasi Medan an
Indonesian traditional fermented food, showed fibrinolytic activity. Therefore, the
purpose of the research was to get bacteria which potential of protease produced
from Terasi Medan and explained of Characterization that enzyme.
The extract of protease went through several steps of purification using
ammonium sulfate 55% saturation, dialyzed (cut-off 10 kD), and concentrated
with polyethylene glycol (PEG). The result of the study showed specific activity
of this dialyzed 4.6461 U/mg. Compared to the crude extract it has 3.01 fold
higher purification. Analysis of the SDS-PAGE 10% showed that crude extract
protease have two bands (34.70 kD dan 9.62 kD) and the dialyzed just has one
protein band (23.86 kD). Zimografi test 10% showed that of protease have
fibrinolytic, caseinolytic, and gelatinolytic activity. The protease enzyme activity
increased by the addition of ion Ca 2+ (1mM). This enzyme was inhibited strongly
by N-p-tosil-L-lisin chloromethyl ketone, phenylmethylsulphonylfluoride, and
soybean trypsin inhibitor. Therefore this enzyme that purified from Terasi Medan
can be classified as serin protease.
PRAKATA
Alhamdulillaahirobbilaalamiin, penulis panjatkan kepada Allah SWT,
karena berkat kasih sayang dan cinta-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian
dan karya ilmiah dengan judul Pemilahan dan Pencirian Bakteri Penghasil Enzim
Proteolitik dari Terasi Medan.
Karya ilmiah ini merupakam hasil penelitian yang dilakukan penulis sejak
bulan Juni sampai Desember 2005, di Fakultas Teknobiologi, Universitas Katolik
Atmajaya, Jakarta.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. drh.
Dondin Sajuthi, MST.,PhD. dan Yanti, S.Si., M.Si. selaku pembimbing yang telah
memberikan bimbingan, saran, dan pengarahan kepada penulis dalam
menyelesaikan karya ilmiah ini.
Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan untuk keluarga tercinta,
Ayah, Ibu, Kakak, dan Adik yang telah memberikan dukungan baik moril maupun
materiil, serta doa dan kasih sayangnya. Disamping itu, terima kasih juga kepada
teman seperjuanganku mbak Wiwit, mbak Soli, Santi, Selvi, Peris dan sahabatsahabatku Rokme, Dyah, Ekong, Atik, seluruh dosen dan staf Laboratorium
Biokimia dan Teknologi Enzim, Mas Yudi, dan Mas Bambang yang telah
membantu selama penelitian. Tak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Mas
Heri, teman-teman Kimia 38 dan seluruh penghuni C-8 atas bantuan dan
kebersamaannya. Serta semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu
persatu.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Maret 2006
Dian Kristiana
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pati-Jateng pada tanggal 29 Juni 1983 dari ayah
Waluyo dan ibu Endang Wiryanti. Penulis merupakan putri ketiga dari lima
bersaudara.
Tahun 2001 penulis lulus dari SMU Negeri 2 PATI dan pada tahun yang
sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB.
Penulis diterima di Program Studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melaksanakan praktik
lapangan di Laboratorium Mikrobiologi Lingkungan, Pusat Penelitian Biologi
LIPI, Bogor pada tahun 2004. Penulis menjadi guru privat pada Lembaga
Bimbingan Belajar Nurul Ilmi dan Gema Pelajar Study Center sampai sekarang.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL........................................................................................................ ix
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................... ix
DAFTAR LAMPIRAN................................................................................................. x
PENDAHULUAN
TINJAUAN PUSTAKA
Terasi.................................................................................................................... 1
Protase fibrinolitik................................................................................................ 3
Karakteristik Biokimia Enzim Protease ............................................................... 3
Elektroforesis dan Zimografi ............................................................................... 5
BAHAN DAN METODE
Alat dan bahan ..................................................................................................... 6
Screening.............................................................................................................. 6
Analisis Aktivitas Protease .................................................................................. 7
Analisis Kadar Protein ......................................................................................... 7
Presipitasi ............................................................................................................. 7
Dialisis ................................................................................................................. 7
Karaktersasi Protease Ekstrak Kasar.................................................................... 7
Analisis SDS-PAGE dan zimografi ..................................................................... 8
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Bakteri Terasi ........................................................................................... 9
Produksi Enzim Protease ..................................................................................... 9
Pemurnian Enzim ............................................................................................. 10
Penentuan Suhu Optimum ................................................................................ 11
Penentuan pH Optimum ................................................................................... 12
Pengaruh Waktu Inkubasi ................................................................................. 12
Pengaruh Konsentrasi Substrat .......................................................................... 13
Pengaruh Ion Logam ......................................................................................... 14
Pengaruh Inhibitor.............................................................................................. 15
Penentuan Bobot Molekul ................................................................................. 16
Zimogram .......................................................................................................... 17
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ............................................................................................................ 18
Saran .................................................................................................................. 18
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 18
LAMPIRAN................................................................................................................. 20
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Komposisi kimia terasi.................................................................................... 2
2 Makanan yang difermentasikan oleh bakteri .................................................. 3
3 Sumber-sumber enzim fibrinolitik .................................................................. 3
4 Komposisi gel pemisah dan gel penahan ........................................................ 8
5 Karakterisasi enzim protease isolat................................................................ 18
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Terasi medan ..................................................................................................... 2
2
Isolat D1T2 dari terasi medan ........................................................................... 9
3
Pengaruh konsentrasi ammonium ................................................................... 11
4
Pengaruh suhu terhadap aktivitas.................................................................... 11
5
Pengaruh pH terhadap aktivitas ...................................................................... 12
6 Pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas ................................................... 13
7
Kurva Michaelis-Menten ................................................................................ 14
8 Kurva pengaruh ion logam ekstrak ................................................................. 14
9 Kurva pengaruh ion logam dialisat ................................................................... 15
10 Kurva pengaruh inhibitor ................................................................................ 15
11 Analisis SDS-PAGE ....................................................................................... 16
12 Zimogram fibrin, kasein.................................................................................. 17
13 Zimogram gelatin, albumin............................................................................. 17
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Aktivitas enzim dari seleksi isolat bakteri ......................................................21
2 Data pengaruh suhu, pH ekstrak .....................................................................22
3 Data pengaruh ion logam ekstrak....................................................................23
4 Data pengaruh suhu, pH dialisat .....................................................................24
5 Data pengaruh ion logam dialisat....................................................................25
6
Kurva Lineweaver-Burk .................................................................................26
7
Kurva standart Bradford..................................................................................27
8 Kurva standart SDS-PAGE .............................................................................28
9
Diagram alir penelitian....................................................................................29
10 Komposisi media pertumbuhan dan produksi.................................................30
11 Prosedur pembuatan pereaksi kimia................................................................31
12 Pereaksi untuk analisis SDS-PAGE dan Zimografi........................................ 32
LAMPIRAN
Lampiran 1 Aktivitas enzim dari seleksi isolat bakteri Terasi Medan dan
ringkasan hasil pemurnian protease
Aktivitas enzim isolat bakteri dari Terasi Medan
Isolat
Aktivitas Enzim (U/ml)
D1T1
0.1959
D3T1
0.4581
D6T1
0.2082
D7T1
0.1446
D1T2
0.4621
D3T2
0.2230
D4T2
0.0768
D5T2
0.0789
D7T2
0.1949
Ringkasan tahap pemurnian protease Terasi Medan
Tahap
V (ml)
AE
(U/ml)
Total AE
[protein]
(mg/ml)
Total
protein
AS
(U/mg)
Tingkat
kemurnian
1.5434
Persen
Hasil
(%)
100
Ekstrak
kasar
Presipitat
55%
Dialisat
600
0.4621
277.2600
0.2994
179.6400
20
0.5310
10.6200
0.1646
3.2920
3.2260
3.83
2.09
10
0.6630
6.6300
0.1427
1.4270
4.6461
2.39
3.01
1
Lampiran 2 Data pengaruh suhu, pH dan waktu inkubasi terhadap aktivitas enzim
protease dari ekstrak kasar isolat D1T2
Pengaruh suhu
Suhu
Asampel
o
( C)
Ablanko
Astandart
AE(U/ml)
AS
(U/mg)
0.898
0.995
0.931
1.296
0.843
0.842
0.742
0.873
0.788
0.914
0.728
0.769
1.063
1.286
1.239
1.410
1.292
1.242
0.2916
0.1772
0.1902
0.4621
0.1223
0.0926
0.9739
0.5919
0.6353
1.5434
0.4085
0.3093
Pengaruh pH
pH
Asampel
Ablanko
Astandart
AE(U/ml)
AS
(U/mg)
35
37
40
50
55
60
Aktifitas
Relatif
(%)
63.10
38.35
41.16
100
26.47
20.04
4
0.665
0.741
1.286
0.0000
0.0000
Aktifitas
Relatif
(%)
0.00
6
7
8
10
0.883
1.296
1.143
0.827
0.827
0.914
0.736
0.792
1.841
1.410
1.952
1.265
0.0331
0.4621
0.2068
0.0444
0.1106
1.5434
0.6907
0.1483
7.16
100
44.75
9.61
Pengaruh waktu inkubasi
Waktu
Asampel
Ablanko
Inkubasi
(menit)
5
0.790
0.610
10
1.296
0.914
15
0.901
0.629
20
0.925
0.591
25
0.808
0.750
Astandart
AE(U/ml)
AS
(U/mg)
1.287
1.410
1.413
1.405
1.323
0.3191
0.4621
0.1388
0.0985
0.0304
1.0658
1.5434
0.4636
0.3290
0.1015
Aktivitas
Relatif
(%)
69.05
100
30.04
21.32
6.58
Lampiran 3 Data pengaruh ion logam, inhibitor dan konsentrasi substrat terhadap
aktivitas enzim protease dari ekstrak kasar isolat D1T2
Pengaruh ion logam (5mM)
Logam
Asampel
Ablanko
(5mM)
Astandart
AE (U/ml)
0.170
0.136
0.905
0.591
0.728
0.914
0.456
0.699
1.408
1.405
1.292
1.410
0.1890
0.0278
0.4688
0.2462
0.1223
0.4621
Pengaruh ion logam (1mM)
Logam
Asampel
Ablanko
(1mM)
Astandart
AE (U/ml)
0.107
0.281
0.905
0.742
0.629
0.914
0.597
0.523
1.390
1.063
1.413
1.410
0.2535
0.0595
0.4763
0.2916
0.2082
0.4621
Ablanko
Astandart
AE (U/ml)
0.158
0.164
1.063
0.197
0.914
0.734
0.667
0.742
0.674
1.410
0.0208
0.0298
0.2916
0.0138
0.4621
KCl
NaCl
CaCl2
MgCl2
FeCl3
Kontrol
KCl
NaCl
CaCl2
MgCl2
FeCl3
Kontrol
0.260
0.162
1.298
0.925
0.843
1.296
0.314
0.305
1.290
0.898
0.901
1.296
Pengaruh inhibitor
Inhibitor
Asampel
PMSF
STI
EDTA
TLCK
Kontrol
0.178
0.189
0.898
0.208
1.296
Pengaruh berbagai konsentrasi substrat kasein
Konsentrasi
Sampel
Blanko
kasein (%)
0.1
0.314
0.107
0.5
0.387
0.102
1.0
0.374
0.100
1.5
0.624
0.169
2.0
1.296
0.914
AE
residu
(%)
40.90
6.02
101.45
53.28
26.47
100
AE
residu
(%)
54.86
12.88
103.07
63.10
45.06
100
AE
residu
(%)
4.50
6.45
63.10
2.99
100
Standart
AE (U/ml)
0.597
0.561
0.521
0.827
1.410
0.2535
0.3725
0.3905
0.4149
0.4621
Lampiran 4 Data pengaruh suhu, pH dan waktu inkubasi terhadap aktivitas enzim
protease dari dialisat isolat D1T2
Pengaruh suhu
Suhu
Asampel
o
( C)
35
37
40
50
55
60
0.888
1.100
1.083
1.047
1.080
1.047
Pengaruh pH
PH
Asampel
4
6
7
8
10
0.799
1.043
1.047
1.046
1.105
Ablanko
Astandart
AE(U/ml)
AS(U/mg)
0.559
0.796
0.754
0.605
0.750
0.904
1.066
1.462
1.231
1.005
1.280
1.537
0.3893
0.2739
0.4138
0.6630
0.3736
0.1355
2.7281
1.9194
2.8998
4.6461
2.6181
0.9495
Ablanko
Astandart
AE(U/ml)
AS(U/mg)
0.648
0.801
0.605
0.872
0.912
1.139
1.014
1.005
1.330
1.539
0.1845
0.4050
0.6630
0.2279
0.1847
1.2929
2.8381
4.6461
1.5971
1.2943
Astandart
AE(U/ml)
AS(U/mg)
1.163
1.005
1.068
1.217
1.143
0.4119
0.6630
0.3111
0.1530
0.1226
2.8865
4.6461
2.1801
1.0722
0.8591
Pengaruh waktu inkubasi
Waktu
Asampel Ablanko
Inkubasi
(menit)
5
1.031
0.962
10
1.047
0.605
15
1.042
0.951
20
1.144
1.068
25
1.051
0.955
AE
Relatif
(%)
58.72
41.31
62.41
100
56.35
20.44
AE
Relatif
(%)
27.83
61.09
100
34.37
27.86
AE
Relatif
(%)
62.13
100
46.92
23.08
18.49
Lampiran 5 Data pengaruh ion logam, inhibitor dan konsentrasi substrat terhadap
aktivitas enzim protease dari dialisat isolat D1T2
Pengaruh ion logam (5 mM)
Logam
Asampel
Ablanko
(5mM)
Astandart
AE (U/ml)
0.363
0.371
0.414
0.368
0.310
0.605
0.400
0.641
0.794
0.818
0.860
1.005
0.2270
0.2100
0.6789
0.4547
0.3240
0.6630
Ablanko
Astandart
AE (U/ml)
0.310
0.306
0.322
0.461
0.322
0.605
0.850
1.056
0.500
0.751
0.782
1.005
0.3511
0.2960
0.9607
0.5048
0.4135
0.6630
Pengaruh inhibitor
Inhibitor
Asampel
Ablanko
Astandart
AE (U/ml)
PMSF
STI
EDTA
TLCK
Kontrol
0.335
0.315
0.905
0.409
0.605
0.978
0.700
1.400
1.295
1.005
0.1512
0.2042
0.4764
0.1300
0.6630
KCl
NaCl
CaCl2
MgCl2
FeCl3
Kontrol
0.377
0.441
0.844
0.709
0.607
1.047
Pengaruh ion logam (1mM)
Logam
Asampel
(1mM)
KCl
NaCl
CaCl2
MgCl2
FeCl3
Kontrol
0.626
0.676
0.607
0.705
0.639
1.047
0.497
0.446
1.298
0.601
1.047
Pengaruh berbagai konsentrasi substrat kasein
Konsentrasi
Sampel
Blanko
kasein (%)
0.1
0.210
0.096
0.5
0.988
0.550
1.0
1.280
0.841
1.5
0.624
0.169
2.0
1.047
0.605
AE
residu
(%)
34.24
31.67
102.40
68.58
48.87
100
AE
residu
(%)
52.96
44.65
144.91
76.14
62.37
100
AE
residu
(%)
22.81
30.80
71.85
19.61
100
Standart
AE (U/ml)
0.486
1.338
1.518
0.827
1.005
0.1754
0.3335
0.3891
0.4149
0.6630
Lampiran 6 Kurva Lineweaver-Burk pada protease isolat D1T2
Pengaruh berbagai konsentrasi substrat kasein pada ekstrak kasar (A)
Konsentrasi
AE (U/ml)
1/S
1/V
kasein (%)
0.1
0.1754
10
5.7013
0.5
0.3335
2
2.9985
1.0
0.3891
1
2.5700
1.5
0.4149
0.67
2.4102
2.0
0.4621
0.5
2.1640
Pengaruh berbagai konsentrasi substrat kasein pada dialisat (B)
Konsentrasi
AE (U/ml)
1/S
1/V
kasein (%)
0.1
0.2535
10
3.9448
0.5
0.3725
2
2.6846
1.0
0.3905
1
2.5608
1.5
0.4149
0.67
2.4102
2.0
0.6630
0.5
1.5083
7
6
1/V (U/mL)
1/V (U/mL)
5
4
3
y = 0.3566x + 2.1581
R2 = 0.9941
2
1
0
0
5
10
1/[S] (%b/v)
(A)
15
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
y = 0.1922x + 2.077
R2 = 0.7957
0
5
10
1/[S] (%b/vl)
(B)
15
Lampiran 7 Kurva Standart Bradford
[BSA] μg/ml
Absorbansi
0.025
0.168
0.050
0.237
0.075
0.368
0.100
0.464
0.125
0.561
0.150
0.587
0.175
0.591
0.200
0.627
0.225
0.635
0.250
0.639
0.275
0.648
0.300
0.651
0.7
Absorbansi
0.6
0.5
0.4
0.3
y = 4.3703 + 0.0265
R = 99.49
0.2
0.1
0
0
0.05
0.1
[BSA] mg/ml
0.15
0.2
Log BM
Lampiran 8 Kurva standart SDS-PAGE 10%
Pita
Rf (cm)
BM (kDa)
Log BM
1
0.1731
66
1.8195
2
0.2500
45
1.6533
3
0.3077
36
1.5563
4
0.4231
29
1.4624
5
0.4808
24
1.3802
6
0.6154
20
1.3010
7
0.7885
14.20
1.1523
8
0.8654
6.5
0.8129
2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
y = -1.2073x + 1.9814
R2 = 0.9407
0
0.2
0.4
0.6
Rf (cm)
0.8
1
Lampiran 9 Diagram alir penelitian
Sampling
Screening dan isolasi
dari bakteri penghasil
enzim fibrinolitik
Produksi enzim
kasar
Presipitasi ammonium
sulfat (kejenuhan 30-90%)
Analisa aktivitas protease
dan kadar protein
Karakterisasi
enzim
Dialisis dan pemekatan
dengan kantung dialisis
(cut-of 10kD)
Elektroforesis SDS-PAGE
dan Zimografi
Lampiran 10 komposisi media pertumbuhan dan media produksi
•
Media Luria Bertani Broth (LB 10%), pH 7
Yeast ekstrak 0.05 g
•
Tripton
0.1 g
NaCl
0.05 g
Akuadest
100 ml
Media Skim Milk Agar (SMA), pH 7
Agar
4.5 g
Susu skim milk 100 ml
Akuadest
200 ml
(Dengan perbandingan total (1:2 = susu skim : akuadest)
Lampiran 11 Prosedur pembuatan pereaksi kimia
Pereaksi untuk Analisis Akvitas Enzim dan Kadar Protein
•
Kasein 2% b/v
Sebanyak 2 gram kasein Hammarsten atau kasein taknis dilarutkan dalam
buffer universal (tambahkan sedikit-sedikit) sambil distirer dan dipanaskan
(50-60oC) supaya mudah larut, lalu ditera hingga volume total 100ml.
•
Tirosin 5mM
Sebanyak 0.091 gram tirosin dilarutkan dalam akuadest (tambahkan
sedikit-sedikit) sambil distirer, lalu ditera hingga volume total 100ml.
•
TCA 0.1M
Sebanyak 1.634 gram TCA dilarutkan dalam akuadest (tambahkan sedikitsedikit) sambil distirer, lalu di tera hingga volume total 100ml (gunakan
sarung tangan!)
•
Na2CO3 0.4M
Sebanyak 4.2404 gram Na2CO3 dilarutkan dalam 100ml akuadest, lalu
diaduk dengan pengaduk magnetic hingga larut.
•
Pereaksi Folin-Ciocalteau
Sebanyak 25 ml pereaksi Folin-Ciocalteau diencerkan dengan akuadest
hingga volume 50 ml dan diaduk dengan stirrer hingga homogen.
•
Pereaksi Bradford
Stok larutan Bradford dibuat dengan cara melarutkan 0.1 gram
Coomasssie Brilliant Blue R-250 dalam 50 ml etanol 95% v/v dan 100 ml
asam fosfat 85% v/v, lalu ditera dengan akuadest hingga volume 200 ml.
Larutan kerja Bradford dibuat dengan cara mengencerkan 5 ml larutan
stok Bradford dengan akuadest hingga volume 50 ml.
Lampiran 12 Pereaksi untuk analisis SDS-PAGE dan Zimografi
•
Larutan A ( 30% b/v akrilamida; 0.8% b/v bis-akrilamida)
Sebanyak 14.6 gram akrilamida dan 0.4 gram bis-akrilamida dilarutkan
dalam 50 ml akuadest dan diaduk dengan pengaduk magnetic hingga larut
homogen.
•
Larutan B (buffer gel pemisah, Tris-HCl 2M pH 8.8)
Sebanyak 75 ml larutan Tris-HCl 2M pH 8.8 dan 4 ml larutan SDS 10%
(b/v) ditambahkan dengan akuadest hingga volume total 100ml.
•
Larutan C (buffer gel penahan, Tris-HCl 1M pH 6.8)
Sebanyak 6.8 Tris-HCl 1M pH 6.8 dan 4 ml larutan SDS 10% (b/v)
ditambahkan dengan akuadest hingga volume total100ml.
•
Ammonium persulfat 10% (b/v)
Sebanyak 0.1 gram ammonium persulfat dilarutkan dalam satu ml
akuadest.
•
Buffer Elektroforesis
Sebanyak 1.803 gram Tris, 8.648 gram glisin, dan 0.6 gram SDS
dilarutkan dalam 600 ml akuadest, lalu ditera hingga pH 8.3 dengan HCl
1M.
•
Buffer Sampel
Komposisi buffer sampel untuk SDS-PAGE terdiri dari 0.3 ml Tris-HCl
1M pH 6.8, 2.5 ml gliserol 50% (v/v), 1.0 ml SDS 10% (b/v), 0.25 ml 2merkaptoetanol, 0.5 ml bromfenol blue 1% (b/v), dan 0.45 ml akuadest
dengan volume total 5.0 ml. Sementara komposisi buffer sample untuk
zimografi terdiri dari 0.5 gram SDS, 1ml gliserol 50 % (v/v), 1ml
bromfenol blue, 0.625 ml Tris-HCl 1M pH 6.8, dan 2.375 ml akuadest
dengan volume total 5.0 ml.
•
Larutan Pewarna
Sebanyak 0.5 gram Coomasssie Brilliant Blue R-250 dalrutkan dalam
camopuran 225 ml methanol, 50 ml asam asetat glacial, dan 225 akudest
dengan volume total 500ml.
•
Larutan peluntur
Komposisi larutan terdiri dari 50 ml methanol, 50 ml asam asetat glacial,
dan 400 ml akuadest dengan volume total 500 ml.
•
TritonX-1002.5 % (v/v)
Sebanyak 2.5 ml larutan Triton X-100 dilarutkan dalam akuadest hingga
volume total 500ml.
Larutan berbagai buffer
Larutan kerja buffer dibuat dengan cara mengencerkan 25 ml larutan stok
buffer 0.2M dengan akuadest hingga volume total 100 ml. Buffer yang digunakan
dalam penelitian ini adalah buffer buffer universal (pH 4-10), glisin-HCl (pH 8.3),
dan buffer Tris-HCl pH 6.8 dan 8.8.
ENZIM PROTEOLITIK DARI TERASI MEDAN
DIAN KRISTIANA
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
PEMILAHAN DAN KARAKTERISASI BAKTERI PENGHASIL
ENZIM PROTEOLITIK DARI TERASI MEDAN
DIAN KRISTIANA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
ABSTRAK
DIAN KRISTIANA. Pemilahan dan Pencirian Bakteri Penghasil Enzim
Proteolitik dari Terasi Medan. Dibimbing oleh DONDIN SAJUTHI danYANTI.
Enzim protease yang diproduksi oleh isolat bakteri D1T2 diisolasi dari
Terasi medan makanan fermentasi tradisonal Indonesia, menunjukkan aktivitas
fibrinolitik. Penelitian bertujuan memperoleh isolat yang berpotensi memproduksi
enzim protease dari isolat Terasi Medan dan mengkaji karakterisasi enzim
tersebut.
Ekstrak enzim protease dilakukan beberapa tahapan pemurnian dengan
presipitasi ammonium sulfat 55%, dialisis menggunakan kantung dialisis (cut off
10 kD) dan pemekatan dengan polietilenglikol (PEG). Hasil penelitian
menunjukkan bahwa aktivitas spesifik dialisat adalah 4.6461 U/mg dengan tingkat
kemurnian 3.01 kali dibandingkan dengan ekstrak enzim kasar (1.5434 U/mg).
Analisis SDS-PAGE 10% menunjukkan bahwa ekstrak kasar protease mempunyai
2 buah pita protein (34.70 kD dan 9.62 kD) dan dialisat dengan 1 buah pita (23.86
kD). Uji zimografi 10 % menunjukkan bahwa enzim protease ini mempunyai
aktivitas kaseinolitik, fibrinolitik, dan gelatinolitik. Aktivitas protease meningkat
dengan penambahan ion Ca2+ 1mM. Protease ini dihambat spesifik oleh TLCK
(N-p-tosil-L-lisinklorometil keton), PMSF (Fenil Metil Sulfonil Fluorida), dan
STI (Soybean Trypsin Inhibitor) sehingga digolongkan kedalam kelompok
protease serin.
ABSTRACT
DIAN KRISTIANA. Selection and Characterization of Bacteria Produced
Proteolytic from Terasi Medan. Under the direction of DONDIN SAJUTHI and
YANTI.
Protease which produced by bacteria D1T2 isolated from Terasi Medan an
Indonesian traditional fermented food, showed fibrinolytic activity. Therefore, the
purpose of the research was to get bacteria which potential of protease produced
from Terasi Medan and explained of Characterization that enzyme.
The extract of protease went through several steps of purification using
ammonium sulfate 55% saturation, dialyzed (cut-off 10 kD), and concentrated
with polyethylene glycol (PEG). The result of the study showed specific activity
of this dialyzed 4.6461 U/mg. Compared to the crude extract it has 3.01 fold
higher purification. Analysis of the SDS-PAGE 10% showed that crude extract
protease have two bands (34.70 kD dan 9.62 kD) and the dialyzed just has one
protein band (23.86 kD). Zimografi test 10% showed that of protease have
fibrinolytic, caseinolytic, and gelatinolytic activity. The protease enzyme activity
increased by the addition of ion Ca 2+ (1mM). This enzyme was inhibited strongly
by N-p-tosil-L-lisin chloromethyl ketone, phenylmethylsulphonylfluoride, and
soybean trypsin inhibitor. Therefore this enzyme that purified from Terasi Medan
can be classified as serin protease.
PRAKATA
Alhamdulillaahirobbilaalamiin, penulis panjatkan kepada Allah SWT,
karena berkat kasih sayang dan cinta-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian
dan karya ilmiah dengan judul Pemilahan dan Pencirian Bakteri Penghasil Enzim
Proteolitik dari Terasi Medan.
Karya ilmiah ini merupakam hasil penelitian yang dilakukan penulis sejak
bulan Juni sampai Desember 2005, di Fakultas Teknobiologi, Universitas Katolik
Atmajaya, Jakarta.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. drh.
Dondin Sajuthi, MST.,PhD. dan Yanti, S.Si., M.Si. selaku pembimbing yang telah
memberikan bimbingan, saran, dan pengarahan kepada penulis dalam
menyelesaikan karya ilmiah ini.
Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan untuk keluarga tercinta,
Ayah, Ibu, Kakak, dan Adik yang telah memberikan dukungan baik moril maupun
materiil, serta doa dan kasih sayangnya. Disamping itu, terima kasih juga kepada
teman seperjuanganku mbak Wiwit, mbak Soli, Santi, Selvi, Peris dan sahabatsahabatku Rokme, Dyah, Ekong, Atik, seluruh dosen dan staf Laboratorium
Biokimia dan Teknologi Enzim, Mas Yudi, dan Mas Bambang yang telah
membantu selama penelitian. Tak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Mas
Heri, teman-teman Kimia 38 dan seluruh penghuni C-8 atas bantuan dan
kebersamaannya. Serta semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu
persatu.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Maret 2006
Dian Kristiana
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pati-Jateng pada tanggal 29 Juni 1983 dari ayah
Waluyo dan ibu Endang Wiryanti. Penulis merupakan putri ketiga dari lima
bersaudara.
Tahun 2001 penulis lulus dari SMU Negeri 2 PATI dan pada tahun yang
sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB.
Penulis diterima di Program Studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melaksanakan praktik
lapangan di Laboratorium Mikrobiologi Lingkungan, Pusat Penelitian Biologi
LIPI, Bogor pada tahun 2004. Penulis menjadi guru privat pada Lembaga
Bimbingan Belajar Nurul Ilmi dan Gema Pelajar Study Center sampai sekarang.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL........................................................................................................ ix
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................... ix
DAFTAR LAMPIRAN................................................................................................. x
PENDAHULUAN
TINJAUAN PUSTAKA
Terasi.................................................................................................................... 1
Protase fibrinolitik................................................................................................ 3
Karakteristik Biokimia Enzim Protease ............................................................... 3
Elektroforesis dan Zimografi ............................................................................... 5
BAHAN DAN METODE
Alat dan bahan ..................................................................................................... 6
Screening.............................................................................................................. 6
Analisis Aktivitas Protease .................................................................................. 7
Analisis Kadar Protein ......................................................................................... 7
Presipitasi ............................................................................................................. 7
Dialisis ................................................................................................................. 7
Karaktersasi Protease Ekstrak Kasar.................................................................... 7
Analisis SDS-PAGE dan zimografi ..................................................................... 8
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Bakteri Terasi ........................................................................................... 9
Produksi Enzim Protease ..................................................................................... 9
Pemurnian Enzim ............................................................................................. 10
Penentuan Suhu Optimum ................................................................................ 11
Penentuan pH Optimum ................................................................................... 12
Pengaruh Waktu Inkubasi ................................................................................. 12
Pengaruh Konsentrasi Substrat .......................................................................... 13
Pengaruh Ion Logam ......................................................................................... 14
Pengaruh Inhibitor.............................................................................................. 15
Penentuan Bobot Molekul ................................................................................. 16
Zimogram .......................................................................................................... 17
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ............................................................................................................ 18
Saran .................................................................................................................. 18
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 18
LAMPIRAN................................................................................................................. 20
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Komposisi kimia terasi.................................................................................... 2
2 Makanan yang difermentasikan oleh bakteri .................................................. 3
3 Sumber-sumber enzim fibrinolitik .................................................................. 3
4 Komposisi gel pemisah dan gel penahan ........................................................ 8
5 Karakterisasi enzim protease isolat................................................................ 18
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Terasi medan ..................................................................................................... 2
2
Isolat D1T2 dari terasi medan ........................................................................... 9
3
Pengaruh konsentrasi ammonium ................................................................... 11
4
Pengaruh suhu terhadap aktivitas.................................................................... 11
5
Pengaruh pH terhadap aktivitas ...................................................................... 12
6 Pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas ................................................... 13
7
Kurva Michaelis-Menten ................................................................................ 14
8 Kurva pengaruh ion logam ekstrak ................................................................. 14
9 Kurva pengaruh ion logam dialisat ................................................................... 15
10 Kurva pengaruh inhibitor ................................................................................ 15
11 Analisis SDS-PAGE ....................................................................................... 16
12 Zimogram fibrin, kasein.................................................................................. 17
13 Zimogram gelatin, albumin............................................................................. 17
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Aktivitas enzim dari seleksi isolat bakteri ......................................................21
2 Data pengaruh suhu, pH ekstrak .....................................................................22
3 Data pengaruh ion logam ekstrak....................................................................23
4 Data pengaruh suhu, pH dialisat .....................................................................24
5 Data pengaruh ion logam dialisat....................................................................25
6
Kurva Lineweaver-Burk .................................................................................26
7
Kurva standart Bradford..................................................................................27
8 Kurva standart SDS-PAGE .............................................................................28
9
Diagram alir penelitian....................................................................................29
10 Komposisi media pertumbuhan dan produksi.................................................30
11 Prosedur pembuatan pereaksi kimia................................................................31
12 Pereaksi untuk analisis SDS-PAGE dan Zimografi........................................ 32
LAMPIRAN
Lampiran 1 Aktivitas enzim dari seleksi isolat bakteri Terasi Medan dan
ringkasan hasil pemurnian protease
Aktivitas enzim isolat bakteri dari Terasi Medan
Isolat
Aktivitas Enzim (U/ml)
D1T1
0.1959
D3T1
0.4581
D6T1
0.2082
D7T1
0.1446
D1T2
0.4621
D3T2
0.2230
D4T2
0.0768
D5T2
0.0789
D7T2
0.1949
Ringkasan tahap pemurnian protease Terasi Medan
Tahap
V (ml)
AE
(U/ml)
Total AE
[protein]
(mg/ml)
Total
protein
AS
(U/mg)
Tingkat
kemurnian
1.5434
Persen
Hasil
(%)
100
Ekstrak
kasar
Presipitat
55%
Dialisat
600
0.4621
277.2600
0.2994
179.6400
20
0.5310
10.6200
0.1646
3.2920
3.2260
3.83
2.09
10
0.6630
6.6300
0.1427
1.4270
4.6461
2.39
3.01
1
Lampiran 2 Data pengaruh suhu, pH dan waktu inkubasi terhadap aktivitas enzim
protease dari ekstrak kasar isolat D1T2
Pengaruh suhu
Suhu
Asampel
o
( C)
Ablanko
Astandart
AE(U/ml)
AS
(U/mg)
0.898
0.995
0.931
1.296
0.843
0.842
0.742
0.873
0.788
0.914
0.728
0.769
1.063
1.286
1.239
1.410
1.292
1.242
0.2916
0.1772
0.1902
0.4621
0.1223
0.0926
0.9739
0.5919
0.6353
1.5434
0.4085
0.3093
Pengaruh pH
pH
Asampel
Ablanko
Astandart
AE(U/ml)
AS
(U/mg)
35
37
40
50
55
60
Aktifitas
Relatif
(%)
63.10
38.35
41.16
100
26.47
20.04
4
0.665
0.741
1.286
0.0000
0.0000
Aktifitas
Relatif
(%)
0.00
6
7
8
10
0.883
1.296
1.143
0.827
0.827
0.914
0.736
0.792
1.841
1.410
1.952
1.265
0.0331
0.4621
0.2068
0.0444
0.1106
1.5434
0.6907
0.1483
7.16
100
44.75
9.61
Pengaruh waktu inkubasi
Waktu
Asampel
Ablanko
Inkubasi
(menit)
5
0.790
0.610
10
1.296
0.914
15
0.901
0.629
20
0.925
0.591
25
0.808
0.750
Astandart
AE(U/ml)
AS
(U/mg)
1.287
1.410
1.413
1.405
1.323
0.3191
0.4621
0.1388
0.0985
0.0304
1.0658
1.5434
0.4636
0.3290
0.1015
Aktivitas
Relatif
(%)
69.05
100
30.04
21.32
6.58
Lampiran 3 Data pengaruh ion logam, inhibitor dan konsentrasi substrat terhadap
aktivitas enzim protease dari ekstrak kasar isolat D1T2
Pengaruh ion logam (5mM)
Logam
Asampel
Ablanko
(5mM)
Astandart
AE (U/ml)
0.170
0.136
0.905
0.591
0.728
0.914
0.456
0.699
1.408
1.405
1.292
1.410
0.1890
0.0278
0.4688
0.2462
0.1223
0.4621
Pengaruh ion logam (1mM)
Logam
Asampel
Ablanko
(1mM)
Astandart
AE (U/ml)
0.107
0.281
0.905
0.742
0.629
0.914
0.597
0.523
1.390
1.063
1.413
1.410
0.2535
0.0595
0.4763
0.2916
0.2082
0.4621
Ablanko
Astandart
AE (U/ml)
0.158
0.164
1.063
0.197
0.914
0.734
0.667
0.742
0.674
1.410
0.0208
0.0298
0.2916
0.0138
0.4621
KCl
NaCl
CaCl2
MgCl2
FeCl3
Kontrol
KCl
NaCl
CaCl2
MgCl2
FeCl3
Kontrol
0.260
0.162
1.298
0.925
0.843
1.296
0.314
0.305
1.290
0.898
0.901
1.296
Pengaruh inhibitor
Inhibitor
Asampel
PMSF
STI
EDTA
TLCK
Kontrol
0.178
0.189
0.898
0.208
1.296
Pengaruh berbagai konsentrasi substrat kasein
Konsentrasi
Sampel
Blanko
kasein (%)
0.1
0.314
0.107
0.5
0.387
0.102
1.0
0.374
0.100
1.5
0.624
0.169
2.0
1.296
0.914
AE
residu
(%)
40.90
6.02
101.45
53.28
26.47
100
AE
residu
(%)
54.86
12.88
103.07
63.10
45.06
100
AE
residu
(%)
4.50
6.45
63.10
2.99
100
Standart
AE (U/ml)
0.597
0.561
0.521
0.827
1.410
0.2535
0.3725
0.3905
0.4149
0.4621
Lampiran 4 Data pengaruh suhu, pH dan waktu inkubasi terhadap aktivitas enzim
protease dari dialisat isolat D1T2
Pengaruh suhu
Suhu
Asampel
o
( C)
35
37
40
50
55
60
0.888
1.100
1.083
1.047
1.080
1.047
Pengaruh pH
PH
Asampel
4
6
7
8
10
0.799
1.043
1.047
1.046
1.105
Ablanko
Astandart
AE(U/ml)
AS(U/mg)
0.559
0.796
0.754
0.605
0.750
0.904
1.066
1.462
1.231
1.005
1.280
1.537
0.3893
0.2739
0.4138
0.6630
0.3736
0.1355
2.7281
1.9194
2.8998
4.6461
2.6181
0.9495
Ablanko
Astandart
AE(U/ml)
AS(U/mg)
0.648
0.801
0.605
0.872
0.912
1.139
1.014
1.005
1.330
1.539
0.1845
0.4050
0.6630
0.2279
0.1847
1.2929
2.8381
4.6461
1.5971
1.2943
Astandart
AE(U/ml)
AS(U/mg)
1.163
1.005
1.068
1.217
1.143
0.4119
0.6630
0.3111
0.1530
0.1226
2.8865
4.6461
2.1801
1.0722
0.8591
Pengaruh waktu inkubasi
Waktu
Asampel Ablanko
Inkubasi
(menit)
5
1.031
0.962
10
1.047
0.605
15
1.042
0.951
20
1.144
1.068
25
1.051
0.955
AE
Relatif
(%)
58.72
41.31
62.41
100
56.35
20.44
AE
Relatif
(%)
27.83
61.09
100
34.37
27.86
AE
Relatif
(%)
62.13
100
46.92
23.08
18.49
Lampiran 5 Data pengaruh ion logam, inhibitor dan konsentrasi substrat terhadap
aktivitas enzim protease dari dialisat isolat D1T2
Pengaruh ion logam (5 mM)
Logam
Asampel
Ablanko
(5mM)
Astandart
AE (U/ml)
0.363
0.371
0.414
0.368
0.310
0.605
0.400
0.641
0.794
0.818
0.860
1.005
0.2270
0.2100
0.6789
0.4547
0.3240
0.6630
Ablanko
Astandart
AE (U/ml)
0.310
0.306
0.322
0.461
0.322
0.605
0.850
1.056
0.500
0.751
0.782
1.005
0.3511
0.2960
0.9607
0.5048
0.4135
0.6630
Pengaruh inhibitor
Inhibitor
Asampel
Ablanko
Astandart
AE (U/ml)
PMSF
STI
EDTA
TLCK
Kontrol
0.335
0.315
0.905
0.409
0.605
0.978
0.700
1.400
1.295
1.005
0.1512
0.2042
0.4764
0.1300
0.6630
KCl
NaCl
CaCl2
MgCl2
FeCl3
Kontrol
0.377
0.441
0.844
0.709
0.607
1.047
Pengaruh ion logam (1mM)
Logam
Asampel
(1mM)
KCl
NaCl
CaCl2
MgCl2
FeCl3
Kontrol
0.626
0.676
0.607
0.705
0.639
1.047
0.497
0.446
1.298
0.601
1.047
Pengaruh berbagai konsentrasi substrat kasein
Konsentrasi
Sampel
Blanko
kasein (%)
0.1
0.210
0.096
0.5
0.988
0.550
1.0
1.280
0.841
1.5
0.624
0.169
2.0
1.047
0.605
AE
residu
(%)
34.24
31.67
102.40
68.58
48.87
100
AE
residu
(%)
52.96
44.65
144.91
76.14
62.37
100
AE
residu
(%)
22.81
30.80
71.85
19.61
100
Standart
AE (U/ml)
0.486
1.338
1.518
0.827
1.005
0.1754
0.3335
0.3891
0.4149
0.6630
Lampiran 6 Kurva Lineweaver-Burk pada protease isolat D1T2
Pengaruh berbagai konsentrasi substrat kasein pada ekstrak kasar (A)
Konsentrasi
AE (U/ml)
1/S
1/V
kasein (%)
0.1
0.1754
10
5.7013
0.5
0.3335
2
2.9985
1.0
0.3891
1
2.5700
1.5
0.4149
0.67
2.4102
2.0
0.4621
0.5
2.1640
Pengaruh berbagai konsentrasi substrat kasein pada dialisat (B)
Konsentrasi
AE (U/ml)
1/S
1/V
kasein (%)
0.1
0.2535
10
3.9448
0.5
0.3725
2
2.6846
1.0
0.3905
1
2.5608
1.5
0.4149
0.67
2.4102
2.0
0.6630
0.5
1.5083
7
6
1/V (U/mL)
1/V (U/mL)
5
4
3
y = 0.3566x + 2.1581
R2 = 0.9941
2
1
0
0
5
10
1/[S] (%b/v)
(A)
15
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
y = 0.1922x + 2.077
R2 = 0.7957
0
5
10
1/[S] (%b/vl)
(B)
15
Lampiran 7 Kurva Standart Bradford
[BSA] μg/ml
Absorbansi
0.025
0.168
0.050
0.237
0.075
0.368
0.100
0.464
0.125
0.561
0.150
0.587
0.175
0.591
0.200
0.627
0.225
0.635
0.250
0.639
0.275
0.648
0.300
0.651
0.7
Absorbansi
0.6
0.5
0.4
0.3
y = 4.3703 + 0.0265
R = 99.49
0.2
0.1
0
0
0.05
0.1
[BSA] mg/ml
0.15
0.2
Log BM
Lampiran 8 Kurva standart SDS-PAGE 10%
Pita
Rf (cm)
BM (kDa)
Log BM
1
0.1731
66
1.8195
2
0.2500
45
1.6533
3
0.3077
36
1.5563
4
0.4231
29
1.4624
5
0.4808
24
1.3802
6
0.6154
20
1.3010
7
0.7885
14.20
1.1523
8
0.8654
6.5
0.8129
2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
y = -1.2073x + 1.9814
R2 = 0.9407
0
0.2
0.4
0.6
Rf (cm)
0.8
1
Lampiran 9 Diagram alir penelitian
Sampling
Screening dan isolasi
dari bakteri penghasil
enzim fibrinolitik
Produksi enzim
kasar
Presipitasi ammonium
sulfat (kejenuhan 30-90%)
Analisa aktivitas protease
dan kadar protein
Karakterisasi
enzim
Dialisis dan pemekatan
dengan kantung dialisis
(cut-of 10kD)
Elektroforesis SDS-PAGE
dan Zimografi
Lampiran 10 komposisi media pertumbuhan dan media produksi
•
Media Luria Bertani Broth (LB 10%), pH 7
Yeast ekstrak 0.05 g
•
Tripton
0.1 g
NaCl
0.05 g
Akuadest
100 ml
Media Skim Milk Agar (SMA), pH 7
Agar
4.5 g
Susu skim milk 100 ml
Akuadest
200 ml
(Dengan perbandingan total (1:2 = susu skim : akuadest)
Lampiran 11 Prosedur pembuatan pereaksi kimia
Pereaksi untuk Analisis Akvitas Enzim dan Kadar Protein
•
Kasein 2% b/v
Sebanyak 2 gram kasein Hammarsten atau kasein taknis dilarutkan dalam
buffer universal (tambahkan sedikit-sedikit) sambil distirer dan dipanaskan
(50-60oC) supaya mudah larut, lalu ditera hingga volume total 100ml.
•
Tirosin 5mM
Sebanyak 0.091 gram tirosin dilarutkan dalam akuadest (tambahkan
sedikit-sedikit) sambil distirer, lalu ditera hingga volume total 100ml.
•
TCA 0.1M
Sebanyak 1.634 gram TCA dilarutkan dalam akuadest (tambahkan sedikitsedikit) sambil distirer, lalu di tera hingga volume total 100ml (gunakan
sarung tangan!)
•
Na2CO3 0.4M
Sebanyak 4.2404 gram Na2CO3 dilarutkan dalam 100ml akuadest, lalu
diaduk dengan pengaduk magnetic hingga larut.
•
Pereaksi Folin-Ciocalteau
Sebanyak 25 ml pereaksi Folin-Ciocalteau diencerkan dengan akuadest
hingga volume 50 ml dan diaduk dengan stirrer hingga homogen.
•
Pereaksi Bradford
Stok larutan Bradford dibuat dengan cara melarutkan 0.1 gram
Coomasssie Brilliant Blue R-250 dalam 50 ml etanol 95% v/v dan 100 ml
asam fosfat 85% v/v, lalu ditera dengan akuadest hingga volume 200 ml.
Larutan kerja Bradford dibuat dengan cara mengencerkan 5 ml larutan
stok Bradford dengan akuadest hingga volume 50 ml.
Lampiran 12 Pereaksi untuk analisis SDS-PAGE dan Zimografi
•
Larutan A ( 30% b/v akrilamida; 0.8% b/v bis-akrilamida)
Sebanyak 14.6 gram akrilamida dan 0.4 gram bis-akrilamida dilarutkan
dalam 50 ml akuadest dan diaduk dengan pengaduk magnetic hingga larut
homogen.
•
Larutan B (buffer gel pemisah, Tris-HCl 2M pH 8.8)
Sebanyak 75 ml larutan Tris-HCl 2M pH 8.8 dan 4 ml larutan SDS 10%
(b/v) ditambahkan dengan akuadest hingga volume total 100ml.
•
Larutan C (buffer gel penahan, Tris-HCl 1M pH 6.8)
Sebanyak 6.8 Tris-HCl 1M pH 6.8 dan 4 ml larutan SDS 10% (b/v)
ditambahkan dengan akuadest hingga volume total100ml.
•
Ammonium persulfat 10% (b/v)
Sebanyak 0.1 gram ammonium persulfat dilarutkan dalam satu ml
akuadest.
•
Buffer Elektroforesis
Sebanyak 1.803 gram Tris, 8.648 gram glisin, dan 0.6 gram SDS
dilarutkan dalam 600 ml akuadest, lalu ditera hingga pH 8.3 dengan HCl
1M.
•
Buffer Sampel
Komposisi buffer sampel untuk SDS-PAGE terdiri dari 0.3 ml Tris-HCl
1M pH 6.8, 2.5 ml gliserol 50% (v/v), 1.0 ml SDS 10% (b/v), 0.25 ml 2merkaptoetanol, 0.5 ml bromfenol blue 1% (b/v), dan 0.45 ml akuadest
dengan volume total 5.0 ml. Sementara komposisi buffer sample untuk
zimografi terdiri dari 0.5 gram SDS, 1ml gliserol 50 % (v/v), 1ml
bromfenol blue, 0.625 ml Tris-HCl 1M pH 6.8, dan 2.375 ml akuadest
dengan volume total 5.0 ml.
•
Larutan Pewarna
Sebanyak 0.5 gram Coomasssie Brilliant Blue R-250 dalrutkan dalam
camopuran 225 ml methanol, 50 ml asam asetat glacial, dan 225 akudest
dengan volume total 500ml.
•
Larutan peluntur
Komposisi larutan terdiri dari 50 ml methanol, 50 ml asam asetat glacial,
dan 400 ml akuadest dengan volume total 500 ml.
•
TritonX-1002.5 % (v/v)
Sebanyak 2.5 ml larutan Triton X-100 dilarutkan dalam akuadest hingga
volume total 500ml.
Larutan berbagai buffer
Larutan kerja buffer dibuat dengan cara mengencerkan 25 ml larutan stok
buffer 0.2M dengan akuadest hingga volume total 100 ml. Buffer yang digunakan
dalam penelitian ini adalah buffer buffer universal (pH 4-10), glisin-HCl (pH 8.3),
dan buffer Tris-HCl pH 6.8 dan 8.8.