Produksi Embrio In Vitro Dari Oosit Hasil Autotransplantasi Heterotopik Ovarium Mencit
PRODUKSI EMBRIO IN VITRO DARI OOSIT HASIL
AUTOTRANSPLANTASI HETEROTOPIK
OVARIUM MENCIT
NURBARIAH
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Produksi Embrio
In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi Heterotopik Ovarium Mencit adalah
benar hasil karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
pernah dipublikasikan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber data dan
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Mei 2007
Nurbariah
NRP B051040021
ABSTRAK
NURBARIAH. Produksi Embrio In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi
Heterotopik Ovarium Mencit. Dibimbing oleh ITA DJUWITA dan IMAN
SUPRIATNA.
Penelitian ini dilakukan untuk mempelajari kemampuan oosit yang
dikoleksi dari ovarium transplan heterotopik untuk produksi embrio in vitro dan
mengetahui pengaruh induksi pregnant mare’s serum gonadotrophin (PMSG)
terhadap peningkatan jumlah oosit dari ovarium transplan heterotopik. Teknik
transplantasi yang digunakan adalah heterotopik autotransplantasi pada kapsula
ginjal mencit betina umur empat minggu dengan perlakuan oosit hasil transplan
ovarium (OT) dan oosit hasil transplan ovarium dan induksi PMSG (OTP).
Dilakukan perlakuan pembanding tanpa transplantasi ovarium (OSO) dengan
mencit yang diinduksi PMSG dan human chorionic gonadothropin (hCG)
masing-masing dengan dosis 5 IU intraperitoneal (i.p.) interval 48 jam untuk
mendapatkan oosit matang in vivo. Induksi PMSG dilakukan 48 jam dan hCG 14
jam sebelum koleksi oosit. Koleksi oosit dari ovarium transplan dilakukan pada
hari ke-21 setelah transplantasi kemudian dimatangkan secara in vitro selama 24
jam. Oosit hasil pematangan in vivo dan in vitro difertilisasi in vitro dengan
sperma vas deferen mencit jantan dilanjutkan dengan kultur perkembangan
embrio. Pematangan dan fertilisasi oosit serta kultur embrio in vitro menggunakan
medium kalium simplex optimized medium (KSOM) pada inkubator CO2 5% suhu
37 ºC. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa jumlah oosit yang dikoleksi dari
perlakuan OT dan OTP tidak berbeda secara signifikan namun kedua perlakuan
tersebut menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan perlakuan OSO. Oosit
yang mencapai metafase II (Mt-II) pada perlakuan OT (52.38%) dan OTP
(53.19%) secara signifikan tidak berbeda namun menunjukkan perbedaan
signifikan dengan perlakuan OSO (84.85%). Tingkat fertilisasi tidak berbeda
secara signifikan diantara ketiga perlakuan namun perkembangan embrio
menunjukkan perbedan signifikan antara perlakuan OSO (60.19%) dengan OT
(30.43%) dan OTP (30%). Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh
disimpulkan bahwa dari ovarium transplan heterotopik dapat dihasilkan oosit
yang dapat digunakan untuk produksi embrio in vitro. Induksi dengan
menggunakan PMSG tidak mempengaruhi perolehan jumlah oosit yang dikoleksi
dari ovarium transplan. Oosit hasil transplantasi ovarium menunjukkan
kemampuan untuk matang in vitro mencapai tahap Mt-II dan setelah difertilisasi
mampu berkembang menjadi embrio.
Kata kunci: ovarium, oosit, embrio in vitro, autotransplantasi heterotopik, induksi
PMSG.
ABSTRACT
NURBARIAH. Embryo In Vitro Production Using Oocytes Collected from
Heterotopic Autografted Mice Ovary. Under the direction of ITA DJUWITA and
IMAN SUPRIATNA.
The aim of this study was to examine the capability of oocyte collected
from heterotopic autografted mice ovary in embryo in vitro production and the
influenced of pregnant mare’s serum gonadotrophin (PMSG) induction on the
number of oocytes collected from heterotopic autografted mice ovary. Ovarian
tissue from four weeks old mice were transplanted under the kidney capsules of
ovariectomized mice. The grafted mice were grouped into two; group one was
mice without induction PMSG (OT) and group two treated with 5 IU PMSG
induction (OTP). The third group was mice without grafted ovary and treated with
PMSG and human chorionic gonadothropin (hCG) induction (OSO). Induction of
PMSG was injected 48 hours before oocytes collection while hCG was injected 14
h before oocytes collection. Tweenty one days after grafting or fourty eight h after
PMSG injection, oocytes were collected from the two groups and matured in vitro
for 24 h. Matured oocytes were then fertilized in vitro with vas deferens sperm
followed by embryo in vitro development. Oocytes in vitro maturation and
fertilization and embryo in vitro development were done in kalium simplex
optimized medium (KSOM) in 5% CO2 incubator. The results showed that the
number of oocytes collected from group OT and OTP were not significantly
different, but both showed significantly different with the OSO group. Under in
vitro culture conditions, the number of matured oocytes that reached metaphase-II
stage in group OT (52.38%) and OTP (53.19%) were not significantly different,
but significantly different with those from group OSO (84.85%). Although the
oocytes fertilization rate were not significantly different among the three groups,
the embryo development rate showed significantly different between OSO
(60.19%) with OT (30.43%) and OTP (30%). In conclusion, the oocytes collected
from heterotopic grafted ovary can be used in embryo in vitro production after
sequential matured and fertilized in vitro. The induction of PMSG on the mice
with grafted ovary did not increased the collected number of oocytes.
Keywords: ovary, oocyte, embryo in vitro, heterotopic autografted, PMSG
induction
RINGKASAN
NURBARIAH. Produksi Embrio In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi
Heterotopik Ovarium Mencit. Dibimbing oleh ITA DJUWITA dan IMAN
SUPRIATNA.
Transplantasi jaringan ovarium dapat digunakan sebagai metoda alternatif
penyimpanan dan penyelamatan ovarium dalam rangka penyelamatan fungsi
reproduksi dan salah satu upaya mendukung konservasi satwa langka. Ovarium
dapat ditransplantasi pada kapsula ginjal karena memiliki sistem vaskularisasi
yang baik sehingga akan mempercepat persembuhan ovarium dan perkembangan
folikel pascatransplantasi sehingga ovarium masih dapat digunakan dalam
program produksi embrio in vitro. Perkembangan folikel pada ovarium dapat
diinduksi dengan hormon gonadotrophin eksogenous sehingga penyuntikan
pregnant mare’s serum gonadothropin (PMSG) sebelum pengambilan ovarium
transplan dapat mengoptimalkan perolehan oosit untuk digunakan dalam produksi
embrio in vitro. Oleh karena itu tujuan dari penelitian ini adalah mempelajari
kemampuan oosit yang dikoleksi dari ovarium transplan heterotopik untuk
produksi embrio in vitro dan mengetahui pengaruh induksi PMSG terhadap
peningkatan jumlah oosit dari ovarium transplan heterotopik.
Teknik transplantasi yang digunakan adalah heterotopik autotransplantasi
pada kapsula ginjal mencit betina umur empat minggu dengan perlakuan oosit
hasil transplan ovarium (OT) dan oosit hasil transplan ovarium dan induksi PMSG
(OTP). Dilakukan perlakuan pembanding tanpa transplantasi ovarium (OSO)
dengan mencit yang diinduksi PMSG dan human chorionic gonadothropin (hCG)
masing-masing dengan dosis 5 IU intraperitoneal (i.p.) interval 48 jam untuk
mendapatkan oosit matang in vivo. Induksi PMSG dilakukan 48 jam dan hCG 14
jam sebelum koleksi oosit. Koleksi oosit dari ovarium transplan dilakukan pada
hari ke-21 setelah transplantasi kemudian dimatangkan secara in vitro selama 24
jam. Oosit yang mencapai tahap metafase II (Mt-II) ditandai dengan terbentuknya
polar bodi I. Tingkat pematangan dihitung dari jumlah oosit yang mencapai Mt-II
per jumlah oosit yang dikultur. Oosit hasil pematangan in vivo dan in vitro
difertilisasi in vitro dengan sperma vas deferen mencit jantan dilanjutkan dengan
kultur perkembangan embrio. Keberhasilan fertilisasi ditandai dengan
terbentuknya pronukleus jantan dan betina. Tingkat fertilisasi dihitung dari jumlah
oosit yang terfertilisasi per jumlah oosit yang diinseminasi. Perkembangan embrio
diperoleh dengan menghitung jumlah embrio yang berhasil membelah
dibandingkan dengan jumlah yang dikultur. Pematangan dan fertilisasi oosit serta
kultur embrio in vitro menggunakan medium kalium simplex optimized medium
(KSOM) pada inkubator CO2 5% suhu 37 ºC. Data yang diperoleh dari hasil
penelitian dianalisis dengan sidik ragam menggunakan general linear method
(GLM). Perbedaan antar perlakuan diuji dengan Duncan multiple range test
(DMRT).
Keberhasilan transplantasi ovarium di kapsula ginjal ditandai dengan
terjadinya pertumbuhan dan perkembangan folikel serta dibuktikan dengan
terdapatnya oosit yang berhasil dikoleksi dari folikel antral. Hasil yang diperoleh
menunjukkan bahwa jumlah oosit yang dikoleksi dari perlakuan OT (9±2.83 per
ekor dan 4.5±1.41 per ovarium) dan OTP (10.9±5.10 per ekor dan 5.45±2.55 per
ovarium) tidak berbeda secara signifikan namun kedua perlakuan tersebut
menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan perlakuan OSO (17.6±5.69 per
ekor dan 8.77±2.84 per ovarium). Secara alamiah oosit yang dapat diovulasikan
oleh mencit tanpa induksi gonadotrophin adalah 7-13 oosit tergantung strain.
Hasil tersebut menunjukkan bahwa induksi PMSG tidak meningkatkan jumlah
oosit pada ovarium transplan heterotopik. Hal ini disebabkan kemungkinan lokasi
transplantasi ovarium (heterotopik) tidak dapat memberikan respon terhadap
induksi gonadotrophin secara normal. Namun demikian, dengan teknik
transplantasi ovarium heterotopik memungkinkan ovarium digunakan sebagai
sumber oosit untuk dapat dipergunakan lebih lanjut.
Oosit yang mencapai metafase II (Mt-II) pada perlakuan OT (52.38%) dan
OTP (53.19%) secara signifikan tidak berbeda namun menunjukkan perbedaan
signifikan dengan perlakuan OSO (84.85%). Hal ini menunjukkan bahwa oosit
dari ovarium transplan heterotopik memiliki viabilitas untuk matang in vitro
mencapai Mt-II selain itu tidak terdapat perbedaan secara signifikan hasil oosit
yang mencapai Mt-II antara perlakuan OT (52.38%) dan OTP (53.19%) diduga
bahwa induksi PMSG secara in vivo terhadap ovarium transplan heterotopik tidak
mempengaruhi jumlah dan kualitas oosit yang terkoleksi sehingga tidak
mempengaruhi tingkat pematangan oosit secara in vitro. Dalam kultur
pematangan oosit in vitro, kualitas oosit dan medium mempengaruhi tingkat
pematangan oosit. Oosit yang dikoleksi dari perlakuan OT dan OTP hanya oosit
yang dikelilingi oleh sel-sel kumulus kompak, karena keberadaan sel-sel kumulus
dapat mendukung proses pematangan in vitro oosit sehingga inti oosit dapat
mencapai tahap Mt-II. Medium yang digunakan dalam pematangan oosit in vitro
dapat memberikan pengaruh bukan hanya pada oosit tapi juga terhadap
perkembangan embrio.
Jumlah oosit yang terfertilisasi in vitro (tingkat fertilisasi) pada perlakuan
OT (52.50%), OTP (66.67%) dan OSO (64.38%) tidak menunjukkan perbedaan
yang signifikan. Hal ini menunjukkan bahwa oosit yang diperoleh dari ovarium
transplan heterotopik dan matang secara in vitro mampu terfertilisasi. Tidak
semua oosit yang telah matang baik secara in vitro maupun in vivo mampu
terfertilisasi. Kegagalan fertilisasi dapat dipengaruhi oleh tingkat pematangan
oosit (baik inti dan sitoplasma), kemampuan sperma membuahi oosit (kapasitasi
dan reaksi akrosom) dan kegagalan sperma mengalami kondensasi dalam
sitoplasma oosit sehingga terjadi kegagalan pembentukan pronukleus (PN) jantan.
Oleh karena itu walaupun oosit yang berasal dari pematangan in vivo (OSO) telah
mengalami pematangan inti dan sitoplasma namun tingkat fertilisasi in vitro juga
dipengaruhi oleh kualitas dan kemampuan sperma yang digunakan. Keberhasilan
fertilisasi sangat ditentukan oleh interaksi antara oosit dengan sperma dan
medium. Kemampuan oosit respon terhadap aktivasi sperma menunjukkan
keberhasilan pematangan oosit. Sehingga meskipun sperma mampu memasuki
oosit namun ketidakcukupan pematangan pada oosit akan menyebabkan proses
selanjutnya terhambat sehingga menyebabkan kegagalan fertilisasi. Kemampuan
oosit untuk merespon penetrasi sperma diperoleh secara bertahap sebelum ovulasi
ketika oosit mengalami pematangan inti dan sitoplasma.
Persentase perkembangan embrio yang mencapai tahap pembelahan 2-4
sel pada perlakuan OT (30.43%) dan OTP (30.00%) tidak menunjukkan
perbedaan yang signifikan, namun jika kedua perlakuan (OT dan OTP)
dibandingkan dengan perlakuan OSO (60.19%) menunjukkan perbedaan yang
signifikan. Terdapat perbedaan persentase antara perlakuan OT (30.43%) dan
OTP (30.00%) akan tetapi setelah diuji secara statistik perkembangan embrio
yang diperoleh secara signifikan tidak berbeda. Hal ini diduga karena oosit yang
diperoleh pada perlakuan OT dan OTP berasal dari pematangan in vitro. Diduga
bahwa dalam proses pematangan oosit in vitro terjadi ketidaksempurnaan
pematangan terutama pematangan sitoplasma. Pematangan inti dapat diamati
secara jelas yang ditandai dengan pengeluaran polar bodi namun pematangan
sitoplasma dapat diketahui dari kemampuan oosit terfertilisasi dan kemampuan
perkembangan embrio. Ketidakcukupan proses pematangan sitoplasma pada oosit
akan mempengaruhi perpindahan atau pertukaran kontrol perkembangan maternal
ke embrio dan akan mempengaruhi perkembangan embrio. Pada penelitian ini
tingkat perkembangan embrio yang diperoleh dari perlakuan transplantasi masih
sangat rendah. Seperti hasil dari koleksi oosit, pematangan dan fertilisasi in vitro
pada penelitian ini, pemberian PMSG pada ovarium transplan heterotopik tidak
memberikan pengaruh yang berbeda termasuk dalam perkembangan embrio. Hal
ini diduga karena perkembangan embrio in vitro dipengaruhi oleh kualitas oosit
dan medium yang digunakan. Perbedaan kondisi kultur mempengaruhi faktorfaktor sitoplasma sehingga mempengaruhi kemampuan oosit untuk terfertilisasi
dan keberhasilan embriogenesis. Perkembangan tahap awal embrio tergantung
pada lingkungan pematangan oosit, ketika sistem pematangan in vitro tidak
memberikan lingkungan yang cocok bagi oosit walaupun dapat terbentuk
kematangan inti dan terjadi fertilisasi namun hasil akhir adalah rendahnya
perkembangan embrio yang diperoleh. Oleh karena itu kualitas embrio dapat
ditingkatkan dengan kultur pada kondisi lingkungan yang optimal.
Berdasarkan hasil yang diperoleh maka disimpulkan bahwa dari ovarium
transplan heterotopik dapat dihasilkan oosit yang memiki potensi untuk digunakan
dalam produksi embrio in vitro. Induksi dengan menggunakan PMSG tidak
mempengaruhi perolehan jumlah oosit yang dikoleksi dari ovarium transplan
heterotopik. Oosit hasil transplantasi ovarium menunjukkan kemampuan untuk
matang in vitro mencapai tahap metafase II dan setelah difertilisasi mampu
berkembang menjadi embrio.
Kata kunci: ovarium, oosit, embrio in vitro, autotransplantasi heterotopik, induksi
PMSG.
© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2007
Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari
Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya
PRODUKSI EMBRIO IN VITRO DARI OOSIT HASIL
AUTOTRANSPLANTASI HETEROTOPIK
OVARIUM MENCIT
NURBARIAH
Tesis
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biologi Reproduksi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
Judul Tesis
Nama
NRP
: Produksi Embrio In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi
Heterotopik Ovarium Mencit
: Nurbariah
: B051040021
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. drh. Ita Djuwita, M.Phil
Ketua
Dr. drh. Iman Supriatna
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Reproduksi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. drh. Tuty L. Yusuf, M.S
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S
Tanggal Ujian : 11 Mei 2007
Tanggal Lulus : 24 Mei 2007
PRODUKSI EMBRIO IN VITRO DARI OOSIT HASIL
AUTOTRANSPLANTASI HETEROTOPIK
OVARIUM MENCIT
NURBARIAH
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Produksi Embrio
In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi Heterotopik Ovarium Mencit adalah
benar hasil karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
pernah dipublikasikan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber data dan
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Mei 2007
Nurbariah
NRP B051040021
ABSTRAK
NURBARIAH. Produksi Embrio In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi
Heterotopik Ovarium Mencit. Dibimbing oleh ITA DJUWITA dan IMAN
SUPRIATNA.
Penelitian ini dilakukan untuk mempelajari kemampuan oosit yang
dikoleksi dari ovarium transplan heterotopik untuk produksi embrio in vitro dan
mengetahui pengaruh induksi pregnant mare’s serum gonadotrophin (PMSG)
terhadap peningkatan jumlah oosit dari ovarium transplan heterotopik. Teknik
transplantasi yang digunakan adalah heterotopik autotransplantasi pada kapsula
ginjal mencit betina umur empat minggu dengan perlakuan oosit hasil transplan
ovarium (OT) dan oosit hasil transplan ovarium dan induksi PMSG (OTP).
Dilakukan perlakuan pembanding tanpa transplantasi ovarium (OSO) dengan
mencit yang diinduksi PMSG dan human chorionic gonadothropin (hCG)
masing-masing dengan dosis 5 IU intraperitoneal (i.p.) interval 48 jam untuk
mendapatkan oosit matang in vivo. Induksi PMSG dilakukan 48 jam dan hCG 14
jam sebelum koleksi oosit. Koleksi oosit dari ovarium transplan dilakukan pada
hari ke-21 setelah transplantasi kemudian dimatangkan secara in vitro selama 24
jam. Oosit hasil pematangan in vivo dan in vitro difertilisasi in vitro dengan
sperma vas deferen mencit jantan dilanjutkan dengan kultur perkembangan
embrio. Pematangan dan fertilisasi oosit serta kultur embrio in vitro menggunakan
medium kalium simplex optimized medium (KSOM) pada inkubator CO2 5% suhu
37 ºC. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa jumlah oosit yang dikoleksi dari
perlakuan OT dan OTP tidak berbeda secara signifikan namun kedua perlakuan
tersebut menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan perlakuan OSO. Oosit
yang mencapai metafase II (Mt-II) pada perlakuan OT (52.38%) dan OTP
(53.19%) secara signifikan tidak berbeda namun menunjukkan perbedaan
signifikan dengan perlakuan OSO (84.85%). Tingkat fertilisasi tidak berbeda
secara signifikan diantara ketiga perlakuan namun perkembangan embrio
menunjukkan perbedan signifikan antara perlakuan OSO (60.19%) dengan OT
(30.43%) dan OTP (30%). Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh
disimpulkan bahwa dari ovarium transplan heterotopik dapat dihasilkan oosit
yang dapat digunakan untuk produksi embrio in vitro. Induksi dengan
menggunakan PMSG tidak mempengaruhi perolehan jumlah oosit yang dikoleksi
dari ovarium transplan. Oosit hasil transplantasi ovarium menunjukkan
kemampuan untuk matang in vitro mencapai tahap Mt-II dan setelah difertilisasi
mampu berkembang menjadi embrio.
Kata kunci: ovarium, oosit, embrio in vitro, autotransplantasi heterotopik, induksi
PMSG.
ABSTRACT
NURBARIAH. Embryo In Vitro Production Using Oocytes Collected from
Heterotopic Autografted Mice Ovary. Under the direction of ITA DJUWITA and
IMAN SUPRIATNA.
The aim of this study was to examine the capability of oocyte collected
from heterotopic autografted mice ovary in embryo in vitro production and the
influenced of pregnant mare’s serum gonadotrophin (PMSG) induction on the
number of oocytes collected from heterotopic autografted mice ovary. Ovarian
tissue from four weeks old mice were transplanted under the kidney capsules of
ovariectomized mice. The grafted mice were grouped into two; group one was
mice without induction PMSG (OT) and group two treated with 5 IU PMSG
induction (OTP). The third group was mice without grafted ovary and treated with
PMSG and human chorionic gonadothropin (hCG) induction (OSO). Induction of
PMSG was injected 48 hours before oocytes collection while hCG was injected 14
h before oocytes collection. Tweenty one days after grafting or fourty eight h after
PMSG injection, oocytes were collected from the two groups and matured in vitro
for 24 h. Matured oocytes were then fertilized in vitro with vas deferens sperm
followed by embryo in vitro development. Oocytes in vitro maturation and
fertilization and embryo in vitro development were done in kalium simplex
optimized medium (KSOM) in 5% CO2 incubator. The results showed that the
number of oocytes collected from group OT and OTP were not significantly
different, but both showed significantly different with the OSO group. Under in
vitro culture conditions, the number of matured oocytes that reached metaphase-II
stage in group OT (52.38%) and OTP (53.19%) were not significantly different,
but significantly different with those from group OSO (84.85%). Although the
oocytes fertilization rate were not significantly different among the three groups,
the embryo development rate showed significantly different between OSO
(60.19%) with OT (30.43%) and OTP (30%). In conclusion, the oocytes collected
from heterotopic grafted ovary can be used in embryo in vitro production after
sequential matured and fertilized in vitro. The induction of PMSG on the mice
with grafted ovary did not increased the collected number of oocytes.
Keywords: ovary, oocyte, embryo in vitro, heterotopic autografted, PMSG
induction
RINGKASAN
NURBARIAH. Produksi Embrio In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi
Heterotopik Ovarium Mencit. Dibimbing oleh ITA DJUWITA dan IMAN
SUPRIATNA.
Transplantasi jaringan ovarium dapat digunakan sebagai metoda alternatif
penyimpanan dan penyelamatan ovarium dalam rangka penyelamatan fungsi
reproduksi dan salah satu upaya mendukung konservasi satwa langka. Ovarium
dapat ditransplantasi pada kapsula ginjal karena memiliki sistem vaskularisasi
yang baik sehingga akan mempercepat persembuhan ovarium dan perkembangan
folikel pascatransplantasi sehingga ovarium masih dapat digunakan dalam
program produksi embrio in vitro. Perkembangan folikel pada ovarium dapat
diinduksi dengan hormon gonadotrophin eksogenous sehingga penyuntikan
pregnant mare’s serum gonadothropin (PMSG) sebelum pengambilan ovarium
transplan dapat mengoptimalkan perolehan oosit untuk digunakan dalam produksi
embrio in vitro. Oleh karena itu tujuan dari penelitian ini adalah mempelajari
kemampuan oosit yang dikoleksi dari ovarium transplan heterotopik untuk
produksi embrio in vitro dan mengetahui pengaruh induksi PMSG terhadap
peningkatan jumlah oosit dari ovarium transplan heterotopik.
Teknik transplantasi yang digunakan adalah heterotopik autotransplantasi
pada kapsula ginjal mencit betina umur empat minggu dengan perlakuan oosit
hasil transplan ovarium (OT) dan oosit hasil transplan ovarium dan induksi PMSG
(OTP). Dilakukan perlakuan pembanding tanpa transplantasi ovarium (OSO)
dengan mencit yang diinduksi PMSG dan human chorionic gonadothropin (hCG)
masing-masing dengan dosis 5 IU intraperitoneal (i.p.) interval 48 jam untuk
mendapatkan oosit matang in vivo. Induksi PMSG dilakukan 48 jam dan hCG 14
jam sebelum koleksi oosit. Koleksi oosit dari ovarium transplan dilakukan pada
hari ke-21 setelah transplantasi kemudian dimatangkan secara in vitro selama 24
jam. Oosit yang mencapai tahap metafase II (Mt-II) ditandai dengan terbentuknya
polar bodi I. Tingkat pematangan dihitung dari jumlah oosit yang mencapai Mt-II
per jumlah oosit yang dikultur. Oosit hasil pematangan in vivo dan in vitro
difertilisasi in vitro dengan sperma vas deferen mencit jantan dilanjutkan dengan
kultur perkembangan embrio. Keberhasilan fertilisasi ditandai dengan
terbentuknya pronukleus jantan dan betina. Tingkat fertilisasi dihitung dari jumlah
oosit yang terfertilisasi per jumlah oosit yang diinseminasi. Perkembangan embrio
diperoleh dengan menghitung jumlah embrio yang berhasil membelah
dibandingkan dengan jumlah yang dikultur. Pematangan dan fertilisasi oosit serta
kultur embrio in vitro menggunakan medium kalium simplex optimized medium
(KSOM) pada inkubator CO2 5% suhu 37 ºC. Data yang diperoleh dari hasil
penelitian dianalisis dengan sidik ragam menggunakan general linear method
(GLM). Perbedaan antar perlakuan diuji dengan Duncan multiple range test
(DMRT).
Keberhasilan transplantasi ovarium di kapsula ginjal ditandai dengan
terjadinya pertumbuhan dan perkembangan folikel serta dibuktikan dengan
terdapatnya oosit yang berhasil dikoleksi dari folikel antral. Hasil yang diperoleh
menunjukkan bahwa jumlah oosit yang dikoleksi dari perlakuan OT (9±2.83 per
ekor dan 4.5±1.41 per ovarium) dan OTP (10.9±5.10 per ekor dan 5.45±2.55 per
ovarium) tidak berbeda secara signifikan namun kedua perlakuan tersebut
menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan perlakuan OSO (17.6±5.69 per
ekor dan 8.77±2.84 per ovarium). Secara alamiah oosit yang dapat diovulasikan
oleh mencit tanpa induksi gonadotrophin adalah 7-13 oosit tergantung strain.
Hasil tersebut menunjukkan bahwa induksi PMSG tidak meningkatkan jumlah
oosit pada ovarium transplan heterotopik. Hal ini disebabkan kemungkinan lokasi
transplantasi ovarium (heterotopik) tidak dapat memberikan respon terhadap
induksi gonadotrophin secara normal. Namun demikian, dengan teknik
transplantasi ovarium heterotopik memungkinkan ovarium digunakan sebagai
sumber oosit untuk dapat dipergunakan lebih lanjut.
Oosit yang mencapai metafase II (Mt-II) pada perlakuan OT (52.38%) dan
OTP (53.19%) secara signifikan tidak berbeda namun menunjukkan perbedaan
signifikan dengan perlakuan OSO (84.85%). Hal ini menunjukkan bahwa oosit
dari ovarium transplan heterotopik memiliki viabilitas untuk matang in vitro
mencapai Mt-II selain itu tidak terdapat perbedaan secara signifikan hasil oosit
yang mencapai Mt-II antara perlakuan OT (52.38%) dan OTP (53.19%) diduga
bahwa induksi PMSG secara in vivo terhadap ovarium transplan heterotopik tidak
mempengaruhi jumlah dan kualitas oosit yang terkoleksi sehingga tidak
mempengaruhi tingkat pematangan oosit secara in vitro. Dalam kultur
pematangan oosit in vitro, kualitas oosit dan medium mempengaruhi tingkat
pematangan oosit. Oosit yang dikoleksi dari perlakuan OT dan OTP hanya oosit
yang dikelilingi oleh sel-sel kumulus kompak, karena keberadaan sel-sel kumulus
dapat mendukung proses pematangan in vitro oosit sehingga inti oosit dapat
mencapai tahap Mt-II. Medium yang digunakan dalam pematangan oosit in vitro
dapat memberikan pengaruh bukan hanya pada oosit tapi juga terhadap
perkembangan embrio.
Jumlah oosit yang terfertilisasi in vitro (tingkat fertilisasi) pada perlakuan
OT (52.50%), OTP (66.67%) dan OSO (64.38%) tidak menunjukkan perbedaan
yang signifikan. Hal ini menunjukkan bahwa oosit yang diperoleh dari ovarium
transplan heterotopik dan matang secara in vitro mampu terfertilisasi. Tidak
semua oosit yang telah matang baik secara in vitro maupun in vivo mampu
terfertilisasi. Kegagalan fertilisasi dapat dipengaruhi oleh tingkat pematangan
oosit (baik inti dan sitoplasma), kemampuan sperma membuahi oosit (kapasitasi
dan reaksi akrosom) dan kegagalan sperma mengalami kondensasi dalam
sitoplasma oosit sehingga terjadi kegagalan pembentukan pronukleus (PN) jantan.
Oleh karena itu walaupun oosit yang berasal dari pematangan in vivo (OSO) telah
mengalami pematangan inti dan sitoplasma namun tingkat fertilisasi in vitro juga
dipengaruhi oleh kualitas dan kemampuan sperma yang digunakan. Keberhasilan
fertilisasi sangat ditentukan oleh interaksi antara oosit dengan sperma dan
medium. Kemampuan oosit respon terhadap aktivasi sperma menunjukkan
keberhasilan pematangan oosit. Sehingga meskipun sperma mampu memasuki
oosit namun ketidakcukupan pematangan pada oosit akan menyebabkan proses
selanjutnya terhambat sehingga menyebabkan kegagalan fertilisasi. Kemampuan
oosit untuk merespon penetrasi sperma diperoleh secara bertahap sebelum ovulasi
ketika oosit mengalami pematangan inti dan sitoplasma.
Persentase perkembangan embrio yang mencapai tahap pembelahan 2-4
sel pada perlakuan OT (30.43%) dan OTP (30.00%) tidak menunjukkan
perbedaan yang signifikan, namun jika kedua perlakuan (OT dan OTP)
dibandingkan dengan perlakuan OSO (60.19%) menunjukkan perbedaan yang
signifikan. Terdapat perbedaan persentase antara perlakuan OT (30.43%) dan
OTP (30.00%) akan tetapi setelah diuji secara statistik perkembangan embrio
yang diperoleh secara signifikan tidak berbeda. Hal ini diduga karena oosit yang
diperoleh pada perlakuan OT dan OTP berasal dari pematangan in vitro. Diduga
bahwa dalam proses pematangan oosit in vitro terjadi ketidaksempurnaan
pematangan terutama pematangan sitoplasma. Pematangan inti dapat diamati
secara jelas yang ditandai dengan pengeluaran polar bodi namun pematangan
sitoplasma dapat diketahui dari kemampuan oosit terfertilisasi dan kemampuan
perkembangan embrio. Ketidakcukupan proses pematangan sitoplasma pada oosit
akan mempengaruhi perpindahan atau pertukaran kontrol perkembangan maternal
ke embrio dan akan mempengaruhi perkembangan embrio. Pada penelitian ini
tingkat perkembangan embrio yang diperoleh dari perlakuan transplantasi masih
sangat rendah. Seperti hasil dari koleksi oosit, pematangan dan fertilisasi in vitro
pada penelitian ini, pemberian PMSG pada ovarium transplan heterotopik tidak
memberikan pengaruh yang berbeda termasuk dalam perkembangan embrio. Hal
ini diduga karena perkembangan embrio in vitro dipengaruhi oleh kualitas oosit
dan medium yang digunakan. Perbedaan kondisi kultur mempengaruhi faktorfaktor sitoplasma sehingga mempengaruhi kemampuan oosit untuk terfertilisasi
dan keberhasilan embriogenesis. Perkembangan tahap awal embrio tergantung
pada lingkungan pematangan oosit, ketika sistem pematangan in vitro tidak
memberikan lingkungan yang cocok bagi oosit walaupun dapat terbentuk
kematangan inti dan terjadi fertilisasi namun hasil akhir adalah rendahnya
perkembangan embrio yang diperoleh. Oleh karena itu kualitas embrio dapat
ditingkatkan dengan kultur pada kondisi lingkungan yang optimal.
Berdasarkan hasil yang diperoleh maka disimpulkan bahwa dari ovarium
transplan heterotopik dapat dihasilkan oosit yang memiki potensi untuk digunakan
dalam produksi embrio in vitro. Induksi dengan menggunakan PMSG tidak
mempengaruhi perolehan jumlah oosit yang dikoleksi dari ovarium transplan
heterotopik. Oosit hasil transplantasi ovarium menunjukkan kemampuan untuk
matang in vitro mencapai tahap metafase II dan setelah difertilisasi mampu
berkembang menjadi embrio.
Kata kunci: ovarium, oosit, embrio in vitro, autotransplantasi heterotopik, induksi
PMSG.
© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2007
Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari
Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya
PRODUKSI EMBRIO IN VITRO DARI OOSIT HASIL
AUTOTRANSPLANTASI HETEROTOPIK
OVARIUM MENCIT
NURBARIAH
Tesis
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biologi Reproduksi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
Judul Tesis
Nama
NRP
: Produksi Embrio In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi
Heterotopik Ovarium Mencit
: Nurbariah
: B051040021
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. drh. Ita Djuwita, M.Phil
Ketua
Dr. drh. Iman Supriatna
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Reproduksi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. drh. Tuty L. Yusuf, M.S
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S
Tanggal Ujian : 11 Mei 2007
Tanggal Lulus : 24 Mei 2007
PRAKATA
Alhamdulillah, puji syukur senantiasa kehadirat Allah SWT atas segala
limpahan karunia dan rahmat-Nya sehingga penelitian dan penulisan tesis ini
berhasil diselesaikan. Penelitian yang telah dilaksanakan mengangkat tema
mengenai transplantasi dengan judul Produksi Embrio In Vitro dari Oosit Hasil
Autotransplantasi Heterotopik Ovarium Mencit.
Penulis mengucapkan terimakasih dan penghargaan yang tinggi kepada
Ibu Dr. drh Ita Djuwita, M.Phil dan Bapak Dr. drh. Iman Supriatna selaku ketua
dan anggota komisi pembimbing yang telah meluangkan waktu untuk
memberikan bimbingan, nasehat, masukan dan saran serta dorongan semangat
yang begitu besar sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan
merampungkan tesis ini. Ungkapan terima kasih juga ditujukan pada Bapak Dr.
drh. Agus Setiadi sebagai penguji luar komisi yang telah memberikan masukan
dan saran kepada penulis. Terima kasih kepada Ibu Dr. drh. Tuty L. Yusuf, M.S,
selaku Ketua Program Studi Biologi Reproduksi beserta seluruh staf pengajar
Program Studi Biologi Reproduksi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi
FKH IPB. Terima kasih kepada Laboratorium Embriologi, Departemen Anatomi,
Fisiologi dan Farmakologi FKH IPB serta Unit Pelaksana Teknis (UPT) Hewan
Laboratorium FKH IPB atas bantuan fasilitas pendukung sehingga penelitian
dapat berjalan dengan baik.
Penulis juga menyampaikan rasa terima kasih yang mendalam kepada drh.
Wahono Esthi Prasetyaningtyas M.Si, drh. Hamny, M.Si, Dr. drh. I Wayan Batan,
M.Si, Ir. Thomas Mata Hine, M.Si, Ir. Bayu Rosadi, M.Si, Wito Prawigit, M.Si,
Suparmin Fathan, M.Si, Heppi Iromo, M.Si, Roza Helmita, S.Si, Yanie P.
Ritonga, M.Si, Yuli Erina, M.Si, Elita Agustina, M.Si, Dhona Arianti, M.Si,
Adnan Albahry, M.Si, Bonita Ayu Novelani, M.Si, Nurul, M.Si, Anovia, SP, Ida,
S.Si, Nadia, S.Pi, drh. Ena, drh. Rini, Evi, S.Pi, Rinrin, SP, Uca, S.Pi, Silvi, S.Hut,
rekan-rekan mahasiswa Program Studi Biologi Reproduksi, keluarga besar
Laboratorium Embriologi dan berbagai pihak yang tidak dapat disebutkan satu
persatu, atas semangat, bantuan dan dorongan yang diberikan.
Terima kasih tak terhingga selamanya kepada yang tercinta ayahanda dan
ibunda serta saudaraku tersayang (Kak Fitri, Iir dan Beni) atas segala cinta, doa,
dukungan semangat, dukungan moril dan materil yang tiada henti diberikan
kepada penulis selama ini.
Akhir kata penulis mengharapkan semoga tesis ini dan apa yang telah
dihasilkan dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan, bagi pembaca
pada umumnya dan penulis pada khususnya.
Bogor, Mei 2007
Nurbariah
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Banda Aceh pada tanggal 25 Oktober 1978 dari
pasangan H. Poniman Usman dan Dra. Hj. Sarwati Hamzah. Penulis merupakan
putri ke dua dari empat bersaudara.
Pendidikan sarjana ditempuh di Program Studi Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh
dan gelar sarjana diraih pada tahun 2003. Pada tahun 2004, penulis diterima
sebagai mahasiswa program master pada Program Studi Biologi Reproduksi,
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL............................................................................................
xiv
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................
xv
DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................
xvi
PENDAHULUAN
Latar Belakang ........................................................................................
Tujuan Penelitian ....................................................................................
Manfaat Penelitian ..................................................................................
1
3
3
TINJAUAN PUSTAKA
Perkembangan Folikel dan Oosit ............................................................
Autotransplantasi Heterotopik Ovarium .................................................
Superovulasi............................................................................................
Pematangan Oosit In Vitro ......................................................................
Fertilisasi In Vitro ...................................................................................
Perkembangan Embrio In Vitro ..............................................................
4
8
10
12
14
18
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat penelitian .................................................................
Materi Penelitian .....................................................................................
Rancangan Percobaan .............................................................................
Metode Penelitian
Koleksi Ovarium ...............................................................................
Autotransplantasi Heterotopik ..........................................................
Koleksi Oosit dari Ovarium Transplan Heterotopik .........................
Pematangan Oosit In Vitro ................................................................
Fertilisasi Oosit In Vitro....................................................................
Perkembangan Embrio In Vitro ........................................................
Evaluasi Data ..........................................................................................
Analisis Data ...........................................................................................
22
22
22
23
23
24
24
24
HASIL DAN PEMBAHASAN
Koleksi Oosit dari Ovarium Transplan Heterotopik ...............................
Pematangan Oosit In Vitro .....................................................................
Fertilisasi In Vitro ...................................................................................
Perkembangan Embrio In Vitro ..............................................................
25
27
30
32
SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................
35
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................
36
LAMPIRAN.....................................................................................................
45
21
21
21
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Jumlah oosit terkoleksi dari ovarium transplan dengan dan tanpa induksi
PMSG.........................................................................................................
25
2 Tingkat fertilisasi oosit secara in vitro .......................................................
31
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Perkembangan folikel ................................................................................
6
2 Aktivitas meiosis pada oosit ......................................................................
7
3 Proses rekrutmen, seleksi dan dominan pada ovarium selama
perkembangan folikel.................................................................................
11
4
Interaksi oosit-sperma dalam proses fertilisasi ..........................................
15
5 Perubahan pada sperma selama reaksi akrosom ........................................
17
6 Oosit yang mampu mencapai kematangan tahap metafase II ....................
27
7 Pematangan oosit secara in vitro................................................................
29
8 Oosit terfertilisasi in vitro ..........................................................................
30
9 Perbandingan perkembangan embrio in vitro dari perlakuan transplantasi
dan tanpa transplantasi ...............................................................................
32
10 Perkembangan embrio in vitro ...................................................................
33
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Komposisi medium koleksi ovarium dan oosit (phosphate buffered
saline).........................................................................................................
45
2 Komposisi medium KSOM........................................................................
46
3 Pengenceran hormon superovulasi.............................................................
48
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Reproduksi merupakan aktivitas yang penting bagi keberlangsungan hidup
suatu spesies. Aktivitas reproduksi dapat berhadapan dengan kendala yang
menyebabkan prosesnya terganggu antara lain akibat campur tangan manusia pada
suatu populasi spesies dan kematian mendadak pada hewan langka yang
menyebabkan berkurangnya jumlah populasi suatu spesies hewan tertentu. Pada
wanita, organ reproduksi dapat terganggu karena pengaruh efek samping dari
kemo- atau radioterapi pada pengobatan penyakit kanker yang dapat
mempengaruhi ovarium sebagai organ reproduksi primer.
Dalam fungsinya sebagai organ reproduksi primer, ovarium merupakan
penghasil sel telur (oosit) dan hormon. Oosit pada ovarium berkembang
bersamaan dengan perkembangan folikel. Saat lahir pada korteks ovarium
mamalia terdapat banyak kumpulan folikel primordial sebagai sumber oosit yang
akan berkembang dan dapat mencapai tahap ovulasi saat pubertas (Fortune 1994).
Pada hewan langka yang mati atau hewan ternak yang dipotong, pada korteks
ovarium masih dapat ditemukan folikel primordial dalam jumlah banyak dan
dapat digunakan lebih lanjut. Bahkan pada wanita muda pasien kanker yang akan
menjalani kemo- atau radioterapi dilakukan ovariektomi sebelum terapi agar
ovarium dapat disimpan beku dan digunakan kembali kemudian hari pascaterapi.
Koleksi jaringan ovarium yang mengandung folikel primordial dapat dilakukan
setiap saat tanpa memperhatikan usia atau siklus estrus dan pemanfaatan folikel
primordial merupakan salah satu cara untuk penyimpanan oosit dalam jumlah
besar (Shaw et al. 2000).
Terdapat beberapa metoda pemanfaatan ovarium yang telah dikembangkan
untuk penyelamatan fertilitas antara lain penyimpanan jaringan ovarium yang
mengandung folikel primordial secara in vitro dalam bentuk beku untuk jangka
waktu yang lama atau penyimpanan secara in vivo dengan teknik transplantasi
(Sonmezer & Oktay 2004) dan kultur in vitro jaringan ovarium atau folikel
preantral (Wu et al. 2001). Transplantasi ovarium merupakan pemindahan
sebagian atau seluruh jaringan ovarium. Prosedur transplantasi dilakukan untuk
penyimpanan ovarium dan perkembangan folikel secara in vivo. Folikel preantral
terutama folikel primordial dan primer dari ovarium beku atau segar dapat
dipergunakan kembali dengan menumbuhkan secara in vivo menggunakan teknik
transplantasi atau dikultur in vitro untuk perkembangan mencapai folikel antral
dan menghasilkan oosit matang (Liu et al. 2000, Newton & Illingworth 2001).
Oosit yang dikoleksi dari folikel antral ovarium hasil transplantasi masih dapat
dimatangkan, difertilisasi dan dikultur in vitro hingga diperoleh embrio
selanjutnya embrio dapat ditransfer ke induk resipien untuk menghasilkan
keturunan (Liu et al. 2001). Selain itu beberapa penelitian yang telah dilakukan
menunjukkan keberhasilan transplantasi ovarium ternyata dapat memulihkan
fungsi reproduksi pada mencit (Candy et al. 2000, Mohammad et al. 2004),
primata (Schnorr et al. 2002) dan manusia (Silber et al. 2005).
Berdasarkan hubungan donor dan resipien, transplantasi dapat dilakukan
pada individu yang sama (autotransplantasi); individu yang berbeda tapi masih
satu spesies (allotransplantasi) atau individu yang berbeda dari spesies yang
berbeda (xenotransplantasi). Pada autotransplantasi hampir tidak ada penolakan
jaringan oleh tubuh resipien karena ovarium yang ditransplantasikan merupakan
jaringan individu sendiri. Berdasarkan tempat transplantasi, ovarium dapat
ditransplantasikan di tempat semula (ortotopik) pada bursa ovarium (Candy et al.
2000) dan di tempat lain (heterotopik) diluar bursa ovarium seperti subkutan
(Mohammad et al. 2003, Schnorr et al. 2002), kapsula ginjal (Gook et al. 2001,
Liu et al. 2001) dan intraperitoneal (Rosendahl et al. 2006, Salehnia 2002).
Transplantasi secara ortotopik umum dilakukan jika ingin melihat viabilitas
ovarium sampai dihasilkan keturunan. Pada transplantasi heterotopik meskipun
evaluasi tidak dapat dilakukan sampai dihasilkan keturunan karena tidak
memungkinkan untuk terjadi ovulasi dan fertilisasi secara in vivo, akan tetapi
masih dapat dikoleksi folikel atau oosit dari ovarium transplan dan dapat
dikembangkan secara in vitro.
Daerah kapsula ginjal merupakan salah satu tempat yang sering digunakan
untuk transplantasi heterotopik. Pada daerah kapsula ginjal, besar dan jumlah
potongan jaringan ovarium yang dapat ditransplantasikan terbatas akan tetapi
tempat ini memiliki vaskularisasi yang baik (Cox et al. 1996). Autotransplantasi
ovarium pada kapsula ginjal dapat mengembalikan fungsi reproduksi pada hari
ketujuh setelah transplantasi dengan kembalinya siklus estrus, morfologi dan
jumlah folikel (Mohamad 2003).
Hormon gonadotrophin eksogenous umum digunakan pada manusia dan
hewan untuk menginduksi perkembangan folikel sehingga meningkatkan jumlah
oosit yang dapat dipergunakan dalam bidang biologi dan teknologi reproduksi
bantuan (Zudova et al. 2004). Oleh karena itu penyuntikan pregnant mare’s
serum gonadotrophin (PMSG) sebelum pengambilan ovarium transplan
heterotopik dapat mengoptimalkan perolehan oosit untuk digunakan dalam
produksi embrio in vitro. Berdasarkan pengamatan histologis, perlakuan dengan
induksi
PMSG
terhadap
ovarium
transplan
heterotopik
terbukti
dapat
meningkatkan jumlah folikel tersier (Setiadi 2004). Namun demikian gambaran
histologis hanya memberikan informasi tentang perkembangan folikel. Untuk
dapat dipergunakan pada produksi embrio in vitro maka harus diketahui viabilitas
oosit yang dapat diperoleh dari ovarium setelah transplantasi. Sehingga diperlukan
kajian lebih lanjut untuk mengetahui pengaruh induksi PMSG terhadap jumlah
dan viabilitas oosit dari ovarium transplan heterotopik. Hal ini akan memberikan
informasi tambahan potensi ovarium sebagai sumber oosit sehingga dapat
digunakan untuk produksi embrio in vitro.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah mempelajari kemampuan oosit yang
dikoleksi dari ovarium autotransplantasi heterotopik untuk produksi embrio in
vitro dan mengetahui pengaruh induksi PMSG terhadap peningkatan jumlah oosit
dari ovarium autotransplantasi heterotopik.
Manfaat Penelitian
Hasil dari penelitian diharapkan dapat memberikan informasi mengenai
transplantasi ovarium dan viabilitas oosit yang diperoleh. Sehingga dapat
diaplikasikan untuk mendukung pemanfaatan ovarium bagi pembentukan bank
gamet/embrio serta mendukung salah satu upaya konservasi satwa langka melalui
teknologi reproduksi bantuan.
TINJAUAN PUSTAKA
Perkembangan Folikel dan Oosit
Secara anatomis, organ reproduksi betina terdiri atas sepasang ovarium
dan saluran reproduksi yaitu tuba Falopii, uterus, serviks dan vagina. Ovarium
merupakan organ reproduksi primer dengan ukuran yang bervariasi antara spesies.
Sebagai organ reproduksi primer, ovarium berfungsi untuk menghasilkan oosit
yang berkembang bersama dengan perkembangan folikel. Oleh karena itu folikel
ovarium disebut juga sebagai unit struktural dan fungsional dari ovarium yang
merupakan lingkungan yang penting bagi pertumbuhan dan perkembangan oosit
(Itoh et al. 2002). Selain menghasilkan oosit, ovarium juga menghasilkan hormon
reproduksi seperti estrogen dan progesteron. Ovarium terletak di dalam rongga
pelvis pada ventral ginjal terbungkus dalam suatu bursa ovarium yang transparan,
menggantung dan bertaut melalui mesovarium ke uterus. Berdasarkan dari
gambaran histologis terlihat bahwa ovarium terbagi atas dua bagian yaitu korteks
(bagian lateral) dan medula (bagian medial). Pada korteks ovarium dapat
ditemukan kumpulan folikel dengan berbagai tahapan perkembangan. Folikelfolikel ini akan berkembang menjadi folikel matang dan mengovulasikan oosit
sedangkan pada bagian medula ovarium terdapat pembuluh darah, saraf dan
jaringan ikat (Senger 1999). Bagian korteks dilapisi oleh satu lapisan epitelium
kuboid rendah dan stroma pada bagian korteks terdiri atas jaringan ikat longgar.
Perkembangan folikel di dalam ovarium dikenal dengan nama
folikulogenesis merupakan proses perkembangan folikel yang berawal dari
terbentuknya folikel primordial sampai berkembang menjadi folikel matang dan
siap melakukan proses ovulasi. Folikel primordial akan berkembang menjadi
folikel primer, sekunder, tersier, de Graaf dan pada akhirnya oosit akan
diovulasikan. Proses folikulogenesis ini disertai dengan proses pertumbuhan dan
pematangan oosit yang merupakan bagian dari proses oogonesis yaitu proses yang
menghasilkan oosit yang haploid. Perkembangan folikel pada ovarium
dipengaruhi oleh endokrin dan mekanisme intraovarian yang mengatur proses
pertumbuhan oosit dan proliferasi serta diferensiasi sel somatik (Itoh et al. 2002,
Thomas & Van der Hayden 2006). Perkembangan folikel tergantung pada
keberadaan faktor yang merangsang pertumbuhan folikel dan menghindarkan
folikel dari peristiwa apoptosis. Faktor yang mempengaruhi perkembangan folikel
antara lain gonadotrophin, hormon steroid dan beberapa faktor pertumbuhan
(Quirk et al. 2004). Follicle stimulating hormone (FSH) merupakan
gonadotrophin yang berperan dalam proses proliferasi dan diferensiasi folikel
sedangkan estrogen adalah hormon yang dihasilkan oleh sel granulosa dan sel teka
diketahui berperan dalam pembentukan rongga folikel. Diantara beberapa faktor
pertumbuhan yang berperan dalam perkembangan folikel adalah epidermal
growth factor (EGF), transforming growth factor (TGF), basic fibroblast-like
growth factor (bFGF), vascular epithelial growth factor (VEGF) dan nerve
growth factor (NGF) (Van den Hurk et al. 1997).
Perkembangan folikel berdasarkan morfologinya dapat dibedakan atas
folikel preantral dan folikel antral. Folikel preantral merupakan tahapan folikel
yang belum memiliki antrum sedangkan folikel antral merupakan tahapan folikel
yang telah memiliki antrum. Saat lahir pada korteks ovarium mamalia terdapat
banyak kumpulan folikel primordial dan dapat dipergunakan sebagai sumber
oosit. Folikel primordial yang terdapat pada korteks ovarium memiliki jumlah
yang lebih banyak dibanding folikel antral. Folikel primordial merupakan bentuk
awal dari folikel yang mengandung oosit diselaputi oleh selapis sel somatis
berbentuk pipih. Folikel primordial akan mengalami pertumbuhan menjadi folikel
primer dan sekunder, ketiga bentuk folikel ini digolongkan ke dalam folikel
preantral. Tahap pertama pertumbuhan folikel primordial
AUTOTRANSPLANTASI HETEROTOPIK
OVARIUM MENCIT
NURBARIAH
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Produksi Embrio
In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi Heterotopik Ovarium Mencit adalah
benar hasil karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
pernah dipublikasikan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber data dan
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Mei 2007
Nurbariah
NRP B051040021
ABSTRAK
NURBARIAH. Produksi Embrio In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi
Heterotopik Ovarium Mencit. Dibimbing oleh ITA DJUWITA dan IMAN
SUPRIATNA.
Penelitian ini dilakukan untuk mempelajari kemampuan oosit yang
dikoleksi dari ovarium transplan heterotopik untuk produksi embrio in vitro dan
mengetahui pengaruh induksi pregnant mare’s serum gonadotrophin (PMSG)
terhadap peningkatan jumlah oosit dari ovarium transplan heterotopik. Teknik
transplantasi yang digunakan adalah heterotopik autotransplantasi pada kapsula
ginjal mencit betina umur empat minggu dengan perlakuan oosit hasil transplan
ovarium (OT) dan oosit hasil transplan ovarium dan induksi PMSG (OTP).
Dilakukan perlakuan pembanding tanpa transplantasi ovarium (OSO) dengan
mencit yang diinduksi PMSG dan human chorionic gonadothropin (hCG)
masing-masing dengan dosis 5 IU intraperitoneal (i.p.) interval 48 jam untuk
mendapatkan oosit matang in vivo. Induksi PMSG dilakukan 48 jam dan hCG 14
jam sebelum koleksi oosit. Koleksi oosit dari ovarium transplan dilakukan pada
hari ke-21 setelah transplantasi kemudian dimatangkan secara in vitro selama 24
jam. Oosit hasil pematangan in vivo dan in vitro difertilisasi in vitro dengan
sperma vas deferen mencit jantan dilanjutkan dengan kultur perkembangan
embrio. Pematangan dan fertilisasi oosit serta kultur embrio in vitro menggunakan
medium kalium simplex optimized medium (KSOM) pada inkubator CO2 5% suhu
37 ºC. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa jumlah oosit yang dikoleksi dari
perlakuan OT dan OTP tidak berbeda secara signifikan namun kedua perlakuan
tersebut menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan perlakuan OSO. Oosit
yang mencapai metafase II (Mt-II) pada perlakuan OT (52.38%) dan OTP
(53.19%) secara signifikan tidak berbeda namun menunjukkan perbedaan
signifikan dengan perlakuan OSO (84.85%). Tingkat fertilisasi tidak berbeda
secara signifikan diantara ketiga perlakuan namun perkembangan embrio
menunjukkan perbedan signifikan antara perlakuan OSO (60.19%) dengan OT
(30.43%) dan OTP (30%). Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh
disimpulkan bahwa dari ovarium transplan heterotopik dapat dihasilkan oosit
yang dapat digunakan untuk produksi embrio in vitro. Induksi dengan
menggunakan PMSG tidak mempengaruhi perolehan jumlah oosit yang dikoleksi
dari ovarium transplan. Oosit hasil transplantasi ovarium menunjukkan
kemampuan untuk matang in vitro mencapai tahap Mt-II dan setelah difertilisasi
mampu berkembang menjadi embrio.
Kata kunci: ovarium, oosit, embrio in vitro, autotransplantasi heterotopik, induksi
PMSG.
ABSTRACT
NURBARIAH. Embryo In Vitro Production Using Oocytes Collected from
Heterotopic Autografted Mice Ovary. Under the direction of ITA DJUWITA and
IMAN SUPRIATNA.
The aim of this study was to examine the capability of oocyte collected
from heterotopic autografted mice ovary in embryo in vitro production and the
influenced of pregnant mare’s serum gonadotrophin (PMSG) induction on the
number of oocytes collected from heterotopic autografted mice ovary. Ovarian
tissue from four weeks old mice were transplanted under the kidney capsules of
ovariectomized mice. The grafted mice were grouped into two; group one was
mice without induction PMSG (OT) and group two treated with 5 IU PMSG
induction (OTP). The third group was mice without grafted ovary and treated with
PMSG and human chorionic gonadothropin (hCG) induction (OSO). Induction of
PMSG was injected 48 hours before oocytes collection while hCG was injected 14
h before oocytes collection. Tweenty one days after grafting or fourty eight h after
PMSG injection, oocytes were collected from the two groups and matured in vitro
for 24 h. Matured oocytes were then fertilized in vitro with vas deferens sperm
followed by embryo in vitro development. Oocytes in vitro maturation and
fertilization and embryo in vitro development were done in kalium simplex
optimized medium (KSOM) in 5% CO2 incubator. The results showed that the
number of oocytes collected from group OT and OTP were not significantly
different, but both showed significantly different with the OSO group. Under in
vitro culture conditions, the number of matured oocytes that reached metaphase-II
stage in group OT (52.38%) and OTP (53.19%) were not significantly different,
but significantly different with those from group OSO (84.85%). Although the
oocytes fertilization rate were not significantly different among the three groups,
the embryo development rate showed significantly different between OSO
(60.19%) with OT (30.43%) and OTP (30%). In conclusion, the oocytes collected
from heterotopic grafted ovary can be used in embryo in vitro production after
sequential matured and fertilized in vitro. The induction of PMSG on the mice
with grafted ovary did not increased the collected number of oocytes.
Keywords: ovary, oocyte, embryo in vitro, heterotopic autografted, PMSG
induction
RINGKASAN
NURBARIAH. Produksi Embrio In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi
Heterotopik Ovarium Mencit. Dibimbing oleh ITA DJUWITA dan IMAN
SUPRIATNA.
Transplantasi jaringan ovarium dapat digunakan sebagai metoda alternatif
penyimpanan dan penyelamatan ovarium dalam rangka penyelamatan fungsi
reproduksi dan salah satu upaya mendukung konservasi satwa langka. Ovarium
dapat ditransplantasi pada kapsula ginjal karena memiliki sistem vaskularisasi
yang baik sehingga akan mempercepat persembuhan ovarium dan perkembangan
folikel pascatransplantasi sehingga ovarium masih dapat digunakan dalam
program produksi embrio in vitro. Perkembangan folikel pada ovarium dapat
diinduksi dengan hormon gonadotrophin eksogenous sehingga penyuntikan
pregnant mare’s serum gonadothropin (PMSG) sebelum pengambilan ovarium
transplan dapat mengoptimalkan perolehan oosit untuk digunakan dalam produksi
embrio in vitro. Oleh karena itu tujuan dari penelitian ini adalah mempelajari
kemampuan oosit yang dikoleksi dari ovarium transplan heterotopik untuk
produksi embrio in vitro dan mengetahui pengaruh induksi PMSG terhadap
peningkatan jumlah oosit dari ovarium transplan heterotopik.
Teknik transplantasi yang digunakan adalah heterotopik autotransplantasi
pada kapsula ginjal mencit betina umur empat minggu dengan perlakuan oosit
hasil transplan ovarium (OT) dan oosit hasil transplan ovarium dan induksi PMSG
(OTP). Dilakukan perlakuan pembanding tanpa transplantasi ovarium (OSO)
dengan mencit yang diinduksi PMSG dan human chorionic gonadothropin (hCG)
masing-masing dengan dosis 5 IU intraperitoneal (i.p.) interval 48 jam untuk
mendapatkan oosit matang in vivo. Induksi PMSG dilakukan 48 jam dan hCG 14
jam sebelum koleksi oosit. Koleksi oosit dari ovarium transplan dilakukan pada
hari ke-21 setelah transplantasi kemudian dimatangkan secara in vitro selama 24
jam. Oosit yang mencapai tahap metafase II (Mt-II) ditandai dengan terbentuknya
polar bodi I. Tingkat pematangan dihitung dari jumlah oosit yang mencapai Mt-II
per jumlah oosit yang dikultur. Oosit hasil pematangan in vivo dan in vitro
difertilisasi in vitro dengan sperma vas deferen mencit jantan dilanjutkan dengan
kultur perkembangan embrio. Keberhasilan fertilisasi ditandai dengan
terbentuknya pronukleus jantan dan betina. Tingkat fertilisasi dihitung dari jumlah
oosit yang terfertilisasi per jumlah oosit yang diinseminasi. Perkembangan embrio
diperoleh dengan menghitung jumlah embrio yang berhasil membelah
dibandingkan dengan jumlah yang dikultur. Pematangan dan fertilisasi oosit serta
kultur embrio in vitro menggunakan medium kalium simplex optimized medium
(KSOM) pada inkubator CO2 5% suhu 37 ºC. Data yang diperoleh dari hasil
penelitian dianalisis dengan sidik ragam menggunakan general linear method
(GLM). Perbedaan antar perlakuan diuji dengan Duncan multiple range test
(DMRT).
Keberhasilan transplantasi ovarium di kapsula ginjal ditandai dengan
terjadinya pertumbuhan dan perkembangan folikel serta dibuktikan dengan
terdapatnya oosit yang berhasil dikoleksi dari folikel antral. Hasil yang diperoleh
menunjukkan bahwa jumlah oosit yang dikoleksi dari perlakuan OT (9±2.83 per
ekor dan 4.5±1.41 per ovarium) dan OTP (10.9±5.10 per ekor dan 5.45±2.55 per
ovarium) tidak berbeda secara signifikan namun kedua perlakuan tersebut
menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan perlakuan OSO (17.6±5.69 per
ekor dan 8.77±2.84 per ovarium). Secara alamiah oosit yang dapat diovulasikan
oleh mencit tanpa induksi gonadotrophin adalah 7-13 oosit tergantung strain.
Hasil tersebut menunjukkan bahwa induksi PMSG tidak meningkatkan jumlah
oosit pada ovarium transplan heterotopik. Hal ini disebabkan kemungkinan lokasi
transplantasi ovarium (heterotopik) tidak dapat memberikan respon terhadap
induksi gonadotrophin secara normal. Namun demikian, dengan teknik
transplantasi ovarium heterotopik memungkinkan ovarium digunakan sebagai
sumber oosit untuk dapat dipergunakan lebih lanjut.
Oosit yang mencapai metafase II (Mt-II) pada perlakuan OT (52.38%) dan
OTP (53.19%) secara signifikan tidak berbeda namun menunjukkan perbedaan
signifikan dengan perlakuan OSO (84.85%). Hal ini menunjukkan bahwa oosit
dari ovarium transplan heterotopik memiliki viabilitas untuk matang in vitro
mencapai Mt-II selain itu tidak terdapat perbedaan secara signifikan hasil oosit
yang mencapai Mt-II antara perlakuan OT (52.38%) dan OTP (53.19%) diduga
bahwa induksi PMSG secara in vivo terhadap ovarium transplan heterotopik tidak
mempengaruhi jumlah dan kualitas oosit yang terkoleksi sehingga tidak
mempengaruhi tingkat pematangan oosit secara in vitro. Dalam kultur
pematangan oosit in vitro, kualitas oosit dan medium mempengaruhi tingkat
pematangan oosit. Oosit yang dikoleksi dari perlakuan OT dan OTP hanya oosit
yang dikelilingi oleh sel-sel kumulus kompak, karena keberadaan sel-sel kumulus
dapat mendukung proses pematangan in vitro oosit sehingga inti oosit dapat
mencapai tahap Mt-II. Medium yang digunakan dalam pematangan oosit in vitro
dapat memberikan pengaruh bukan hanya pada oosit tapi juga terhadap
perkembangan embrio.
Jumlah oosit yang terfertilisasi in vitro (tingkat fertilisasi) pada perlakuan
OT (52.50%), OTP (66.67%) dan OSO (64.38%) tidak menunjukkan perbedaan
yang signifikan. Hal ini menunjukkan bahwa oosit yang diperoleh dari ovarium
transplan heterotopik dan matang secara in vitro mampu terfertilisasi. Tidak
semua oosit yang telah matang baik secara in vitro maupun in vivo mampu
terfertilisasi. Kegagalan fertilisasi dapat dipengaruhi oleh tingkat pematangan
oosit (baik inti dan sitoplasma), kemampuan sperma membuahi oosit (kapasitasi
dan reaksi akrosom) dan kegagalan sperma mengalami kondensasi dalam
sitoplasma oosit sehingga terjadi kegagalan pembentukan pronukleus (PN) jantan.
Oleh karena itu walaupun oosit yang berasal dari pematangan in vivo (OSO) telah
mengalami pematangan inti dan sitoplasma namun tingkat fertilisasi in vitro juga
dipengaruhi oleh kualitas dan kemampuan sperma yang digunakan. Keberhasilan
fertilisasi sangat ditentukan oleh interaksi antara oosit dengan sperma dan
medium. Kemampuan oosit respon terhadap aktivasi sperma menunjukkan
keberhasilan pematangan oosit. Sehingga meskipun sperma mampu memasuki
oosit namun ketidakcukupan pematangan pada oosit akan menyebabkan proses
selanjutnya terhambat sehingga menyebabkan kegagalan fertilisasi. Kemampuan
oosit untuk merespon penetrasi sperma diperoleh secara bertahap sebelum ovulasi
ketika oosit mengalami pematangan inti dan sitoplasma.
Persentase perkembangan embrio yang mencapai tahap pembelahan 2-4
sel pada perlakuan OT (30.43%) dan OTP (30.00%) tidak menunjukkan
perbedaan yang signifikan, namun jika kedua perlakuan (OT dan OTP)
dibandingkan dengan perlakuan OSO (60.19%) menunjukkan perbedaan yang
signifikan. Terdapat perbedaan persentase antara perlakuan OT (30.43%) dan
OTP (30.00%) akan tetapi setelah diuji secara statistik perkembangan embrio
yang diperoleh secara signifikan tidak berbeda. Hal ini diduga karena oosit yang
diperoleh pada perlakuan OT dan OTP berasal dari pematangan in vitro. Diduga
bahwa dalam proses pematangan oosit in vitro terjadi ketidaksempurnaan
pematangan terutama pematangan sitoplasma. Pematangan inti dapat diamati
secara jelas yang ditandai dengan pengeluaran polar bodi namun pematangan
sitoplasma dapat diketahui dari kemampuan oosit terfertilisasi dan kemampuan
perkembangan embrio. Ketidakcukupan proses pematangan sitoplasma pada oosit
akan mempengaruhi perpindahan atau pertukaran kontrol perkembangan maternal
ke embrio dan akan mempengaruhi perkembangan embrio. Pada penelitian ini
tingkat perkembangan embrio yang diperoleh dari perlakuan transplantasi masih
sangat rendah. Seperti hasil dari koleksi oosit, pematangan dan fertilisasi in vitro
pada penelitian ini, pemberian PMSG pada ovarium transplan heterotopik tidak
memberikan pengaruh yang berbeda termasuk dalam perkembangan embrio. Hal
ini diduga karena perkembangan embrio in vitro dipengaruhi oleh kualitas oosit
dan medium yang digunakan. Perbedaan kondisi kultur mempengaruhi faktorfaktor sitoplasma sehingga mempengaruhi kemampuan oosit untuk terfertilisasi
dan keberhasilan embriogenesis. Perkembangan tahap awal embrio tergantung
pada lingkungan pematangan oosit, ketika sistem pematangan in vitro tidak
memberikan lingkungan yang cocok bagi oosit walaupun dapat terbentuk
kematangan inti dan terjadi fertilisasi namun hasil akhir adalah rendahnya
perkembangan embrio yang diperoleh. Oleh karena itu kualitas embrio dapat
ditingkatkan dengan kultur pada kondisi lingkungan yang optimal.
Berdasarkan hasil yang diperoleh maka disimpulkan bahwa dari ovarium
transplan heterotopik dapat dihasilkan oosit yang memiki potensi untuk digunakan
dalam produksi embrio in vitro. Induksi dengan menggunakan PMSG tidak
mempengaruhi perolehan jumlah oosit yang dikoleksi dari ovarium transplan
heterotopik. Oosit hasil transplantasi ovarium menunjukkan kemampuan untuk
matang in vitro mencapai tahap metafase II dan setelah difertilisasi mampu
berkembang menjadi embrio.
Kata kunci: ovarium, oosit, embrio in vitro, autotransplantasi heterotopik, induksi
PMSG.
© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2007
Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari
Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya
PRODUKSI EMBRIO IN VITRO DARI OOSIT HASIL
AUTOTRANSPLANTASI HETEROTOPIK
OVARIUM MENCIT
NURBARIAH
Tesis
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biologi Reproduksi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
Judul Tesis
Nama
NRP
: Produksi Embrio In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi
Heterotopik Ovarium Mencit
: Nurbariah
: B051040021
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. drh. Ita Djuwita, M.Phil
Ketua
Dr. drh. Iman Supriatna
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Reproduksi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. drh. Tuty L. Yusuf, M.S
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S
Tanggal Ujian : 11 Mei 2007
Tanggal Lulus : 24 Mei 2007
PRODUKSI EMBRIO IN VITRO DARI OOSIT HASIL
AUTOTRANSPLANTASI HETEROTOPIK
OVARIUM MENCIT
NURBARIAH
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Produksi Embrio
In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi Heterotopik Ovarium Mencit adalah
benar hasil karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
pernah dipublikasikan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber data dan
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Mei 2007
Nurbariah
NRP B051040021
ABSTRAK
NURBARIAH. Produksi Embrio In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi
Heterotopik Ovarium Mencit. Dibimbing oleh ITA DJUWITA dan IMAN
SUPRIATNA.
Penelitian ini dilakukan untuk mempelajari kemampuan oosit yang
dikoleksi dari ovarium transplan heterotopik untuk produksi embrio in vitro dan
mengetahui pengaruh induksi pregnant mare’s serum gonadotrophin (PMSG)
terhadap peningkatan jumlah oosit dari ovarium transplan heterotopik. Teknik
transplantasi yang digunakan adalah heterotopik autotransplantasi pada kapsula
ginjal mencit betina umur empat minggu dengan perlakuan oosit hasil transplan
ovarium (OT) dan oosit hasil transplan ovarium dan induksi PMSG (OTP).
Dilakukan perlakuan pembanding tanpa transplantasi ovarium (OSO) dengan
mencit yang diinduksi PMSG dan human chorionic gonadothropin (hCG)
masing-masing dengan dosis 5 IU intraperitoneal (i.p.) interval 48 jam untuk
mendapatkan oosit matang in vivo. Induksi PMSG dilakukan 48 jam dan hCG 14
jam sebelum koleksi oosit. Koleksi oosit dari ovarium transplan dilakukan pada
hari ke-21 setelah transplantasi kemudian dimatangkan secara in vitro selama 24
jam. Oosit hasil pematangan in vivo dan in vitro difertilisasi in vitro dengan
sperma vas deferen mencit jantan dilanjutkan dengan kultur perkembangan
embrio. Pematangan dan fertilisasi oosit serta kultur embrio in vitro menggunakan
medium kalium simplex optimized medium (KSOM) pada inkubator CO2 5% suhu
37 ºC. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa jumlah oosit yang dikoleksi dari
perlakuan OT dan OTP tidak berbeda secara signifikan namun kedua perlakuan
tersebut menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan perlakuan OSO. Oosit
yang mencapai metafase II (Mt-II) pada perlakuan OT (52.38%) dan OTP
(53.19%) secara signifikan tidak berbeda namun menunjukkan perbedaan
signifikan dengan perlakuan OSO (84.85%). Tingkat fertilisasi tidak berbeda
secara signifikan diantara ketiga perlakuan namun perkembangan embrio
menunjukkan perbedan signifikan antara perlakuan OSO (60.19%) dengan OT
(30.43%) dan OTP (30%). Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh
disimpulkan bahwa dari ovarium transplan heterotopik dapat dihasilkan oosit
yang dapat digunakan untuk produksi embrio in vitro. Induksi dengan
menggunakan PMSG tidak mempengaruhi perolehan jumlah oosit yang dikoleksi
dari ovarium transplan. Oosit hasil transplantasi ovarium menunjukkan
kemampuan untuk matang in vitro mencapai tahap Mt-II dan setelah difertilisasi
mampu berkembang menjadi embrio.
Kata kunci: ovarium, oosit, embrio in vitro, autotransplantasi heterotopik, induksi
PMSG.
ABSTRACT
NURBARIAH. Embryo In Vitro Production Using Oocytes Collected from
Heterotopic Autografted Mice Ovary. Under the direction of ITA DJUWITA and
IMAN SUPRIATNA.
The aim of this study was to examine the capability of oocyte collected
from heterotopic autografted mice ovary in embryo in vitro production and the
influenced of pregnant mare’s serum gonadotrophin (PMSG) induction on the
number of oocytes collected from heterotopic autografted mice ovary. Ovarian
tissue from four weeks old mice were transplanted under the kidney capsules of
ovariectomized mice. The grafted mice were grouped into two; group one was
mice without induction PMSG (OT) and group two treated with 5 IU PMSG
induction (OTP). The third group was mice without grafted ovary and treated with
PMSG and human chorionic gonadothropin (hCG) induction (OSO). Induction of
PMSG was injected 48 hours before oocytes collection while hCG was injected 14
h before oocytes collection. Tweenty one days after grafting or fourty eight h after
PMSG injection, oocytes were collected from the two groups and matured in vitro
for 24 h. Matured oocytes were then fertilized in vitro with vas deferens sperm
followed by embryo in vitro development. Oocytes in vitro maturation and
fertilization and embryo in vitro development were done in kalium simplex
optimized medium (KSOM) in 5% CO2 incubator. The results showed that the
number of oocytes collected from group OT and OTP were not significantly
different, but both showed significantly different with the OSO group. Under in
vitro culture conditions, the number of matured oocytes that reached metaphase-II
stage in group OT (52.38%) and OTP (53.19%) were not significantly different,
but significantly different with those from group OSO (84.85%). Although the
oocytes fertilization rate were not significantly different among the three groups,
the embryo development rate showed significantly different between OSO
(60.19%) with OT (30.43%) and OTP (30%). In conclusion, the oocytes collected
from heterotopic grafted ovary can be used in embryo in vitro production after
sequential matured and fertilized in vitro. The induction of PMSG on the mice
with grafted ovary did not increased the collected number of oocytes.
Keywords: ovary, oocyte, embryo in vitro, heterotopic autografted, PMSG
induction
RINGKASAN
NURBARIAH. Produksi Embrio In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi
Heterotopik Ovarium Mencit. Dibimbing oleh ITA DJUWITA dan IMAN
SUPRIATNA.
Transplantasi jaringan ovarium dapat digunakan sebagai metoda alternatif
penyimpanan dan penyelamatan ovarium dalam rangka penyelamatan fungsi
reproduksi dan salah satu upaya mendukung konservasi satwa langka. Ovarium
dapat ditransplantasi pada kapsula ginjal karena memiliki sistem vaskularisasi
yang baik sehingga akan mempercepat persembuhan ovarium dan perkembangan
folikel pascatransplantasi sehingga ovarium masih dapat digunakan dalam
program produksi embrio in vitro. Perkembangan folikel pada ovarium dapat
diinduksi dengan hormon gonadotrophin eksogenous sehingga penyuntikan
pregnant mare’s serum gonadothropin (PMSG) sebelum pengambilan ovarium
transplan dapat mengoptimalkan perolehan oosit untuk digunakan dalam produksi
embrio in vitro. Oleh karena itu tujuan dari penelitian ini adalah mempelajari
kemampuan oosit yang dikoleksi dari ovarium transplan heterotopik untuk
produksi embrio in vitro dan mengetahui pengaruh induksi PMSG terhadap
peningkatan jumlah oosit dari ovarium transplan heterotopik.
Teknik transplantasi yang digunakan adalah heterotopik autotransplantasi
pada kapsula ginjal mencit betina umur empat minggu dengan perlakuan oosit
hasil transplan ovarium (OT) dan oosit hasil transplan ovarium dan induksi PMSG
(OTP). Dilakukan perlakuan pembanding tanpa transplantasi ovarium (OSO)
dengan mencit yang diinduksi PMSG dan human chorionic gonadothropin (hCG)
masing-masing dengan dosis 5 IU intraperitoneal (i.p.) interval 48 jam untuk
mendapatkan oosit matang in vivo. Induksi PMSG dilakukan 48 jam dan hCG 14
jam sebelum koleksi oosit. Koleksi oosit dari ovarium transplan dilakukan pada
hari ke-21 setelah transplantasi kemudian dimatangkan secara in vitro selama 24
jam. Oosit yang mencapai tahap metafase II (Mt-II) ditandai dengan terbentuknya
polar bodi I. Tingkat pematangan dihitung dari jumlah oosit yang mencapai Mt-II
per jumlah oosit yang dikultur. Oosit hasil pematangan in vivo dan in vitro
difertilisasi in vitro dengan sperma vas deferen mencit jantan dilanjutkan dengan
kultur perkembangan embrio. Keberhasilan fertilisasi ditandai dengan
terbentuknya pronukleus jantan dan betina. Tingkat fertilisasi dihitung dari jumlah
oosit yang terfertilisasi per jumlah oosit yang diinseminasi. Perkembangan embrio
diperoleh dengan menghitung jumlah embrio yang berhasil membelah
dibandingkan dengan jumlah yang dikultur. Pematangan dan fertilisasi oosit serta
kultur embrio in vitro menggunakan medium kalium simplex optimized medium
(KSOM) pada inkubator CO2 5% suhu 37 ºC. Data yang diperoleh dari hasil
penelitian dianalisis dengan sidik ragam menggunakan general linear method
(GLM). Perbedaan antar perlakuan diuji dengan Duncan multiple range test
(DMRT).
Keberhasilan transplantasi ovarium di kapsula ginjal ditandai dengan
terjadinya pertumbuhan dan perkembangan folikel serta dibuktikan dengan
terdapatnya oosit yang berhasil dikoleksi dari folikel antral. Hasil yang diperoleh
menunjukkan bahwa jumlah oosit yang dikoleksi dari perlakuan OT (9±2.83 per
ekor dan 4.5±1.41 per ovarium) dan OTP (10.9±5.10 per ekor dan 5.45±2.55 per
ovarium) tidak berbeda secara signifikan namun kedua perlakuan tersebut
menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan perlakuan OSO (17.6±5.69 per
ekor dan 8.77±2.84 per ovarium). Secara alamiah oosit yang dapat diovulasikan
oleh mencit tanpa induksi gonadotrophin adalah 7-13 oosit tergantung strain.
Hasil tersebut menunjukkan bahwa induksi PMSG tidak meningkatkan jumlah
oosit pada ovarium transplan heterotopik. Hal ini disebabkan kemungkinan lokasi
transplantasi ovarium (heterotopik) tidak dapat memberikan respon terhadap
induksi gonadotrophin secara normal. Namun demikian, dengan teknik
transplantasi ovarium heterotopik memungkinkan ovarium digunakan sebagai
sumber oosit untuk dapat dipergunakan lebih lanjut.
Oosit yang mencapai metafase II (Mt-II) pada perlakuan OT (52.38%) dan
OTP (53.19%) secara signifikan tidak berbeda namun menunjukkan perbedaan
signifikan dengan perlakuan OSO (84.85%). Hal ini menunjukkan bahwa oosit
dari ovarium transplan heterotopik memiliki viabilitas untuk matang in vitro
mencapai Mt-II selain itu tidak terdapat perbedaan secara signifikan hasil oosit
yang mencapai Mt-II antara perlakuan OT (52.38%) dan OTP (53.19%) diduga
bahwa induksi PMSG secara in vivo terhadap ovarium transplan heterotopik tidak
mempengaruhi jumlah dan kualitas oosit yang terkoleksi sehingga tidak
mempengaruhi tingkat pematangan oosit secara in vitro. Dalam kultur
pematangan oosit in vitro, kualitas oosit dan medium mempengaruhi tingkat
pematangan oosit. Oosit yang dikoleksi dari perlakuan OT dan OTP hanya oosit
yang dikelilingi oleh sel-sel kumulus kompak, karena keberadaan sel-sel kumulus
dapat mendukung proses pematangan in vitro oosit sehingga inti oosit dapat
mencapai tahap Mt-II. Medium yang digunakan dalam pematangan oosit in vitro
dapat memberikan pengaruh bukan hanya pada oosit tapi juga terhadap
perkembangan embrio.
Jumlah oosit yang terfertilisasi in vitro (tingkat fertilisasi) pada perlakuan
OT (52.50%), OTP (66.67%) dan OSO (64.38%) tidak menunjukkan perbedaan
yang signifikan. Hal ini menunjukkan bahwa oosit yang diperoleh dari ovarium
transplan heterotopik dan matang secara in vitro mampu terfertilisasi. Tidak
semua oosit yang telah matang baik secara in vitro maupun in vivo mampu
terfertilisasi. Kegagalan fertilisasi dapat dipengaruhi oleh tingkat pematangan
oosit (baik inti dan sitoplasma), kemampuan sperma membuahi oosit (kapasitasi
dan reaksi akrosom) dan kegagalan sperma mengalami kondensasi dalam
sitoplasma oosit sehingga terjadi kegagalan pembentukan pronukleus (PN) jantan.
Oleh karena itu walaupun oosit yang berasal dari pematangan in vivo (OSO) telah
mengalami pematangan inti dan sitoplasma namun tingkat fertilisasi in vitro juga
dipengaruhi oleh kualitas dan kemampuan sperma yang digunakan. Keberhasilan
fertilisasi sangat ditentukan oleh interaksi antara oosit dengan sperma dan
medium. Kemampuan oosit respon terhadap aktivasi sperma menunjukkan
keberhasilan pematangan oosit. Sehingga meskipun sperma mampu memasuki
oosit namun ketidakcukupan pematangan pada oosit akan menyebabkan proses
selanjutnya terhambat sehingga menyebabkan kegagalan fertilisasi. Kemampuan
oosit untuk merespon penetrasi sperma diperoleh secara bertahap sebelum ovulasi
ketika oosit mengalami pematangan inti dan sitoplasma.
Persentase perkembangan embrio yang mencapai tahap pembelahan 2-4
sel pada perlakuan OT (30.43%) dan OTP (30.00%) tidak menunjukkan
perbedaan yang signifikan, namun jika kedua perlakuan (OT dan OTP)
dibandingkan dengan perlakuan OSO (60.19%) menunjukkan perbedaan yang
signifikan. Terdapat perbedaan persentase antara perlakuan OT (30.43%) dan
OTP (30.00%) akan tetapi setelah diuji secara statistik perkembangan embrio
yang diperoleh secara signifikan tidak berbeda. Hal ini diduga karena oosit yang
diperoleh pada perlakuan OT dan OTP berasal dari pematangan in vitro. Diduga
bahwa dalam proses pematangan oosit in vitro terjadi ketidaksempurnaan
pematangan terutama pematangan sitoplasma. Pematangan inti dapat diamati
secara jelas yang ditandai dengan pengeluaran polar bodi namun pematangan
sitoplasma dapat diketahui dari kemampuan oosit terfertilisasi dan kemampuan
perkembangan embrio. Ketidakcukupan proses pematangan sitoplasma pada oosit
akan mempengaruhi perpindahan atau pertukaran kontrol perkembangan maternal
ke embrio dan akan mempengaruhi perkembangan embrio. Pada penelitian ini
tingkat perkembangan embrio yang diperoleh dari perlakuan transplantasi masih
sangat rendah. Seperti hasil dari koleksi oosit, pematangan dan fertilisasi in vitro
pada penelitian ini, pemberian PMSG pada ovarium transplan heterotopik tidak
memberikan pengaruh yang berbeda termasuk dalam perkembangan embrio. Hal
ini diduga karena perkembangan embrio in vitro dipengaruhi oleh kualitas oosit
dan medium yang digunakan. Perbedaan kondisi kultur mempengaruhi faktorfaktor sitoplasma sehingga mempengaruhi kemampuan oosit untuk terfertilisasi
dan keberhasilan embriogenesis. Perkembangan tahap awal embrio tergantung
pada lingkungan pematangan oosit, ketika sistem pematangan in vitro tidak
memberikan lingkungan yang cocok bagi oosit walaupun dapat terbentuk
kematangan inti dan terjadi fertilisasi namun hasil akhir adalah rendahnya
perkembangan embrio yang diperoleh. Oleh karena itu kualitas embrio dapat
ditingkatkan dengan kultur pada kondisi lingkungan yang optimal.
Berdasarkan hasil yang diperoleh maka disimpulkan bahwa dari ovarium
transplan heterotopik dapat dihasilkan oosit yang memiki potensi untuk digunakan
dalam produksi embrio in vitro. Induksi dengan menggunakan PMSG tidak
mempengaruhi perolehan jumlah oosit yang dikoleksi dari ovarium transplan
heterotopik. Oosit hasil transplantasi ovarium menunjukkan kemampuan untuk
matang in vitro mencapai tahap metafase II dan setelah difertilisasi mampu
berkembang menjadi embrio.
Kata kunci: ovarium, oosit, embrio in vitro, autotransplantasi heterotopik, induksi
PMSG.
© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2007
Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari
Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya
PRODUKSI EMBRIO IN VITRO DARI OOSIT HASIL
AUTOTRANSPLANTASI HETEROTOPIK
OVARIUM MENCIT
NURBARIAH
Tesis
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biologi Reproduksi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
Judul Tesis
Nama
NRP
: Produksi Embrio In Vitro dari Oosit Hasil Autotransplantasi
Heterotopik Ovarium Mencit
: Nurbariah
: B051040021
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. drh. Ita Djuwita, M.Phil
Ketua
Dr. drh. Iman Supriatna
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Reproduksi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. drh. Tuty L. Yusuf, M.S
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S
Tanggal Ujian : 11 Mei 2007
Tanggal Lulus : 24 Mei 2007
PRAKATA
Alhamdulillah, puji syukur senantiasa kehadirat Allah SWT atas segala
limpahan karunia dan rahmat-Nya sehingga penelitian dan penulisan tesis ini
berhasil diselesaikan. Penelitian yang telah dilaksanakan mengangkat tema
mengenai transplantasi dengan judul Produksi Embrio In Vitro dari Oosit Hasil
Autotransplantasi Heterotopik Ovarium Mencit.
Penulis mengucapkan terimakasih dan penghargaan yang tinggi kepada
Ibu Dr. drh Ita Djuwita, M.Phil dan Bapak Dr. drh. Iman Supriatna selaku ketua
dan anggota komisi pembimbing yang telah meluangkan waktu untuk
memberikan bimbingan, nasehat, masukan dan saran serta dorongan semangat
yang begitu besar sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan
merampungkan tesis ini. Ungkapan terima kasih juga ditujukan pada Bapak Dr.
drh. Agus Setiadi sebagai penguji luar komisi yang telah memberikan masukan
dan saran kepada penulis. Terima kasih kepada Ibu Dr. drh. Tuty L. Yusuf, M.S,
selaku Ketua Program Studi Biologi Reproduksi beserta seluruh staf pengajar
Program Studi Biologi Reproduksi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi
FKH IPB. Terima kasih kepada Laboratorium Embriologi, Departemen Anatomi,
Fisiologi dan Farmakologi FKH IPB serta Unit Pelaksana Teknis (UPT) Hewan
Laboratorium FKH IPB atas bantuan fasilitas pendukung sehingga penelitian
dapat berjalan dengan baik.
Penulis juga menyampaikan rasa terima kasih yang mendalam kepada drh.
Wahono Esthi Prasetyaningtyas M.Si, drh. Hamny, M.Si, Dr. drh. I Wayan Batan,
M.Si, Ir. Thomas Mata Hine, M.Si, Ir. Bayu Rosadi, M.Si, Wito Prawigit, M.Si,
Suparmin Fathan, M.Si, Heppi Iromo, M.Si, Roza Helmita, S.Si, Yanie P.
Ritonga, M.Si, Yuli Erina, M.Si, Elita Agustina, M.Si, Dhona Arianti, M.Si,
Adnan Albahry, M.Si, Bonita Ayu Novelani, M.Si, Nurul, M.Si, Anovia, SP, Ida,
S.Si, Nadia, S.Pi, drh. Ena, drh. Rini, Evi, S.Pi, Rinrin, SP, Uca, S.Pi, Silvi, S.Hut,
rekan-rekan mahasiswa Program Studi Biologi Reproduksi, keluarga besar
Laboratorium Embriologi dan berbagai pihak yang tidak dapat disebutkan satu
persatu, atas semangat, bantuan dan dorongan yang diberikan.
Terima kasih tak terhingga selamanya kepada yang tercinta ayahanda dan
ibunda serta saudaraku tersayang (Kak Fitri, Iir dan Beni) atas segala cinta, doa,
dukungan semangat, dukungan moril dan materil yang tiada henti diberikan
kepada penulis selama ini.
Akhir kata penulis mengharapkan semoga tesis ini dan apa yang telah
dihasilkan dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan, bagi pembaca
pada umumnya dan penulis pada khususnya.
Bogor, Mei 2007
Nurbariah
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Banda Aceh pada tanggal 25 Oktober 1978 dari
pasangan H. Poniman Usman dan Dra. Hj. Sarwati Hamzah. Penulis merupakan
putri ke dua dari empat bersaudara.
Pendidikan sarjana ditempuh di Program Studi Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh
dan gelar sarjana diraih pada tahun 2003. Pada tahun 2004, penulis diterima
sebagai mahasiswa program master pada Program Studi Biologi Reproduksi,
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL............................................................................................
xiv
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................
xv
DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................
xvi
PENDAHULUAN
Latar Belakang ........................................................................................
Tujuan Penelitian ....................................................................................
Manfaat Penelitian ..................................................................................
1
3
3
TINJAUAN PUSTAKA
Perkembangan Folikel dan Oosit ............................................................
Autotransplantasi Heterotopik Ovarium .................................................
Superovulasi............................................................................................
Pematangan Oosit In Vitro ......................................................................
Fertilisasi In Vitro ...................................................................................
Perkembangan Embrio In Vitro ..............................................................
4
8
10
12
14
18
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat penelitian .................................................................
Materi Penelitian .....................................................................................
Rancangan Percobaan .............................................................................
Metode Penelitian
Koleksi Ovarium ...............................................................................
Autotransplantasi Heterotopik ..........................................................
Koleksi Oosit dari Ovarium Transplan Heterotopik .........................
Pematangan Oosit In Vitro ................................................................
Fertilisasi Oosit In Vitro....................................................................
Perkembangan Embrio In Vitro ........................................................
Evaluasi Data ..........................................................................................
Analisis Data ...........................................................................................
22
22
22
23
23
24
24
24
HASIL DAN PEMBAHASAN
Koleksi Oosit dari Ovarium Transplan Heterotopik ...............................
Pematangan Oosit In Vitro .....................................................................
Fertilisasi In Vitro ...................................................................................
Perkembangan Embrio In Vitro ..............................................................
25
27
30
32
SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................
35
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................
36
LAMPIRAN.....................................................................................................
45
21
21
21
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Jumlah oosit terkoleksi dari ovarium transplan dengan dan tanpa induksi
PMSG.........................................................................................................
25
2 Tingkat fertilisasi oosit secara in vitro .......................................................
31
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Perkembangan folikel ................................................................................
6
2 Aktivitas meiosis pada oosit ......................................................................
7
3 Proses rekrutmen, seleksi dan dominan pada ovarium selama
perkembangan folikel.................................................................................
11
4
Interaksi oosit-sperma dalam proses fertilisasi ..........................................
15
5 Perubahan pada sperma selama reaksi akrosom ........................................
17
6 Oosit yang mampu mencapai kematangan tahap metafase II ....................
27
7 Pematangan oosit secara in vitro................................................................
29
8 Oosit terfertilisasi in vitro ..........................................................................
30
9 Perbandingan perkembangan embrio in vitro dari perlakuan transplantasi
dan tanpa transplantasi ...............................................................................
32
10 Perkembangan embrio in vitro ...................................................................
33
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Komposisi medium koleksi ovarium dan oosit (phosphate buffered
saline).........................................................................................................
45
2 Komposisi medium KSOM........................................................................
46
3 Pengenceran hormon superovulasi.............................................................
48
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Reproduksi merupakan aktivitas yang penting bagi keberlangsungan hidup
suatu spesies. Aktivitas reproduksi dapat berhadapan dengan kendala yang
menyebabkan prosesnya terganggu antara lain akibat campur tangan manusia pada
suatu populasi spesies dan kematian mendadak pada hewan langka yang
menyebabkan berkurangnya jumlah populasi suatu spesies hewan tertentu. Pada
wanita, organ reproduksi dapat terganggu karena pengaruh efek samping dari
kemo- atau radioterapi pada pengobatan penyakit kanker yang dapat
mempengaruhi ovarium sebagai organ reproduksi primer.
Dalam fungsinya sebagai organ reproduksi primer, ovarium merupakan
penghasil sel telur (oosit) dan hormon. Oosit pada ovarium berkembang
bersamaan dengan perkembangan folikel. Saat lahir pada korteks ovarium
mamalia terdapat banyak kumpulan folikel primordial sebagai sumber oosit yang
akan berkembang dan dapat mencapai tahap ovulasi saat pubertas (Fortune 1994).
Pada hewan langka yang mati atau hewan ternak yang dipotong, pada korteks
ovarium masih dapat ditemukan folikel primordial dalam jumlah banyak dan
dapat digunakan lebih lanjut. Bahkan pada wanita muda pasien kanker yang akan
menjalani kemo- atau radioterapi dilakukan ovariektomi sebelum terapi agar
ovarium dapat disimpan beku dan digunakan kembali kemudian hari pascaterapi.
Koleksi jaringan ovarium yang mengandung folikel primordial dapat dilakukan
setiap saat tanpa memperhatikan usia atau siklus estrus dan pemanfaatan folikel
primordial merupakan salah satu cara untuk penyimpanan oosit dalam jumlah
besar (Shaw et al. 2000).
Terdapat beberapa metoda pemanfaatan ovarium yang telah dikembangkan
untuk penyelamatan fertilitas antara lain penyimpanan jaringan ovarium yang
mengandung folikel primordial secara in vitro dalam bentuk beku untuk jangka
waktu yang lama atau penyimpanan secara in vivo dengan teknik transplantasi
(Sonmezer & Oktay 2004) dan kultur in vitro jaringan ovarium atau folikel
preantral (Wu et al. 2001). Transplantasi ovarium merupakan pemindahan
sebagian atau seluruh jaringan ovarium. Prosedur transplantasi dilakukan untuk
penyimpanan ovarium dan perkembangan folikel secara in vivo. Folikel preantral
terutama folikel primordial dan primer dari ovarium beku atau segar dapat
dipergunakan kembali dengan menumbuhkan secara in vivo menggunakan teknik
transplantasi atau dikultur in vitro untuk perkembangan mencapai folikel antral
dan menghasilkan oosit matang (Liu et al. 2000, Newton & Illingworth 2001).
Oosit yang dikoleksi dari folikel antral ovarium hasil transplantasi masih dapat
dimatangkan, difertilisasi dan dikultur in vitro hingga diperoleh embrio
selanjutnya embrio dapat ditransfer ke induk resipien untuk menghasilkan
keturunan (Liu et al. 2001). Selain itu beberapa penelitian yang telah dilakukan
menunjukkan keberhasilan transplantasi ovarium ternyata dapat memulihkan
fungsi reproduksi pada mencit (Candy et al. 2000, Mohammad et al. 2004),
primata (Schnorr et al. 2002) dan manusia (Silber et al. 2005).
Berdasarkan hubungan donor dan resipien, transplantasi dapat dilakukan
pada individu yang sama (autotransplantasi); individu yang berbeda tapi masih
satu spesies (allotransplantasi) atau individu yang berbeda dari spesies yang
berbeda (xenotransplantasi). Pada autotransplantasi hampir tidak ada penolakan
jaringan oleh tubuh resipien karena ovarium yang ditransplantasikan merupakan
jaringan individu sendiri. Berdasarkan tempat transplantasi, ovarium dapat
ditransplantasikan di tempat semula (ortotopik) pada bursa ovarium (Candy et al.
2000) dan di tempat lain (heterotopik) diluar bursa ovarium seperti subkutan
(Mohammad et al. 2003, Schnorr et al. 2002), kapsula ginjal (Gook et al. 2001,
Liu et al. 2001) dan intraperitoneal (Rosendahl et al. 2006, Salehnia 2002).
Transplantasi secara ortotopik umum dilakukan jika ingin melihat viabilitas
ovarium sampai dihasilkan keturunan. Pada transplantasi heterotopik meskipun
evaluasi tidak dapat dilakukan sampai dihasilkan keturunan karena tidak
memungkinkan untuk terjadi ovulasi dan fertilisasi secara in vivo, akan tetapi
masih dapat dikoleksi folikel atau oosit dari ovarium transplan dan dapat
dikembangkan secara in vitro.
Daerah kapsula ginjal merupakan salah satu tempat yang sering digunakan
untuk transplantasi heterotopik. Pada daerah kapsula ginjal, besar dan jumlah
potongan jaringan ovarium yang dapat ditransplantasikan terbatas akan tetapi
tempat ini memiliki vaskularisasi yang baik (Cox et al. 1996). Autotransplantasi
ovarium pada kapsula ginjal dapat mengembalikan fungsi reproduksi pada hari
ketujuh setelah transplantasi dengan kembalinya siklus estrus, morfologi dan
jumlah folikel (Mohamad 2003).
Hormon gonadotrophin eksogenous umum digunakan pada manusia dan
hewan untuk menginduksi perkembangan folikel sehingga meningkatkan jumlah
oosit yang dapat dipergunakan dalam bidang biologi dan teknologi reproduksi
bantuan (Zudova et al. 2004). Oleh karena itu penyuntikan pregnant mare’s
serum gonadotrophin (PMSG) sebelum pengambilan ovarium transplan
heterotopik dapat mengoptimalkan perolehan oosit untuk digunakan dalam
produksi embrio in vitro. Berdasarkan pengamatan histologis, perlakuan dengan
induksi
PMSG
terhadap
ovarium
transplan
heterotopik
terbukti
dapat
meningkatkan jumlah folikel tersier (Setiadi 2004). Namun demikian gambaran
histologis hanya memberikan informasi tentang perkembangan folikel. Untuk
dapat dipergunakan pada produksi embrio in vitro maka harus diketahui viabilitas
oosit yang dapat diperoleh dari ovarium setelah transplantasi. Sehingga diperlukan
kajian lebih lanjut untuk mengetahui pengaruh induksi PMSG terhadap jumlah
dan viabilitas oosit dari ovarium transplan heterotopik. Hal ini akan memberikan
informasi tambahan potensi ovarium sebagai sumber oosit sehingga dapat
digunakan untuk produksi embrio in vitro.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah mempelajari kemampuan oosit yang
dikoleksi dari ovarium autotransplantasi heterotopik untuk produksi embrio in
vitro dan mengetahui pengaruh induksi PMSG terhadap peningkatan jumlah oosit
dari ovarium autotransplantasi heterotopik.
Manfaat Penelitian
Hasil dari penelitian diharapkan dapat memberikan informasi mengenai
transplantasi ovarium dan viabilitas oosit yang diperoleh. Sehingga dapat
diaplikasikan untuk mendukung pemanfaatan ovarium bagi pembentukan bank
gamet/embrio serta mendukung salah satu upaya konservasi satwa langka melalui
teknologi reproduksi bantuan.
TINJAUAN PUSTAKA
Perkembangan Folikel dan Oosit
Secara anatomis, organ reproduksi betina terdiri atas sepasang ovarium
dan saluran reproduksi yaitu tuba Falopii, uterus, serviks dan vagina. Ovarium
merupakan organ reproduksi primer dengan ukuran yang bervariasi antara spesies.
Sebagai organ reproduksi primer, ovarium berfungsi untuk menghasilkan oosit
yang berkembang bersama dengan perkembangan folikel. Oleh karena itu folikel
ovarium disebut juga sebagai unit struktural dan fungsional dari ovarium yang
merupakan lingkungan yang penting bagi pertumbuhan dan perkembangan oosit
(Itoh et al. 2002). Selain menghasilkan oosit, ovarium juga menghasilkan hormon
reproduksi seperti estrogen dan progesteron. Ovarium terletak di dalam rongga
pelvis pada ventral ginjal terbungkus dalam suatu bursa ovarium yang transparan,
menggantung dan bertaut melalui mesovarium ke uterus. Berdasarkan dari
gambaran histologis terlihat bahwa ovarium terbagi atas dua bagian yaitu korteks
(bagian lateral) dan medula (bagian medial). Pada korteks ovarium dapat
ditemukan kumpulan folikel dengan berbagai tahapan perkembangan. Folikelfolikel ini akan berkembang menjadi folikel matang dan mengovulasikan oosit
sedangkan pada bagian medula ovarium terdapat pembuluh darah, saraf dan
jaringan ikat (Senger 1999). Bagian korteks dilapisi oleh satu lapisan epitelium
kuboid rendah dan stroma pada bagian korteks terdiri atas jaringan ikat longgar.
Perkembangan folikel di dalam ovarium dikenal dengan nama
folikulogenesis merupakan proses perkembangan folikel yang berawal dari
terbentuknya folikel primordial sampai berkembang menjadi folikel matang dan
siap melakukan proses ovulasi. Folikel primordial akan berkembang menjadi
folikel primer, sekunder, tersier, de Graaf dan pada akhirnya oosit akan
diovulasikan. Proses folikulogenesis ini disertai dengan proses pertumbuhan dan
pematangan oosit yang merupakan bagian dari proses oogonesis yaitu proses yang
menghasilkan oosit yang haploid. Perkembangan folikel pada ovarium
dipengaruhi oleh endokrin dan mekanisme intraovarian yang mengatur proses
pertumbuhan oosit dan proliferasi serta diferensiasi sel somatik (Itoh et al. 2002,
Thomas & Van der Hayden 2006). Perkembangan folikel tergantung pada
keberadaan faktor yang merangsang pertumbuhan folikel dan menghindarkan
folikel dari peristiwa apoptosis. Faktor yang mempengaruhi perkembangan folikel
antara lain gonadotrophin, hormon steroid dan beberapa faktor pertumbuhan
(Quirk et al. 2004). Follicle stimulating hormone (FSH) merupakan
gonadotrophin yang berperan dalam proses proliferasi dan diferensiasi folikel
sedangkan estrogen adalah hormon yang dihasilkan oleh sel granulosa dan sel teka
diketahui berperan dalam pembentukan rongga folikel. Diantara beberapa faktor
pertumbuhan yang berperan dalam perkembangan folikel adalah epidermal
growth factor (EGF), transforming growth factor (TGF), basic fibroblast-like
growth factor (bFGF), vascular epithelial growth factor (VEGF) dan nerve
growth factor (NGF) (Van den Hurk et al. 1997).
Perkembangan folikel berdasarkan morfologinya dapat dibedakan atas
folikel preantral dan folikel antral. Folikel preantral merupakan tahapan folikel
yang belum memiliki antrum sedangkan folikel antral merupakan tahapan folikel
yang telah memiliki antrum. Saat lahir pada korteks ovarium mamalia terdapat
banyak kumpulan folikel primordial dan dapat dipergunakan sebagai sumber
oosit. Folikel primordial yang terdapat pada korteks ovarium memiliki jumlah
yang lebih banyak dibanding folikel antral. Folikel primordial merupakan bentuk
awal dari folikel yang mengandung oosit diselaputi oleh selapis sel somatis
berbentuk pipih. Folikel primordial akan mengalami pertumbuhan menjadi folikel
primer dan sekunder, ketiga bentuk folikel ini digolongkan ke dalam folikel
preantral. Tahap pertama pertumbuhan folikel primordial