UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI MINYAK ATSIRI BUAH KEMUKUS (Piper cubeba L.f.) SECARA IN VITRO DAN IN SILICO PADA BAKTERI SHIGELLA FLEXNERI

Disusun untuk memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Muhammadiyah Yogyakarta

Disusun Oleh : TRI HANDRIANTO

20120350044

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH YOGYAKARTA

i

SHIGELLA FLEXNERI

Disusun untuk memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Muhammadiyah Yogyakarta

Disusun Oleh : TRI HANDRIANTO

20120350044

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH YOGYAKARTA

ii Nama : Tri Handrianto NIM : 2012 035 0044 Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa Karya Tulis Ilmiah yang saya tulis benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan tercantumkan nama dalam Daftar Pustaka bagian akhir Karya Tulis Ilmiah ini.

Apabila di kemudian hari terbukti atau dibuktikan Karya Tulis Ilmiah ini hasil jiplakan, maka saya bersedia menerima sanksi atas perbuatan tersebut.

Yogyakarta, 21 Desember 2016 Yang membuat pernyataan

Tri Handrianto NIM: 20120350044

iii

Dan hendaklah diantara kamu ada segolongan orang yang menyeru kepada kebajikan, menyuruh berbuat kepada yang ma’ruf, dan mencegah dari yang

mungkar. Dan mereka itulah orang-orang yang beruntung. (QS. Ali Imran 104)

Sebaik-baiknya manusia adalah yang berguna bagi orang lain. Pengabdian bukan pengorbanan tapi kehormatan. Pengabdian adalah persembahan dari hati yang tak

pernah mati.

PERSEMBAHAN

Karya tulis ini penulis persembahkan untuk :

Kedua orangtuaku tercinta, Bapak Kasmo dan Ibu Sri Andari AMK.,S.Pd,; Saudara ku Mas Prasetyo Utomo, S.E dan Mas Aris Prabowo, S.Sn;

Semua sahabat dan rekan seperjuangan menimba ilmu;

Guru-guru saya sejak Taman Kanak-kanak hingga Perguruan Tinggi; Almamater Farmasi Universitas Muhammadiyah Yogyakarta

iv

berjudul “Uji Aktivitas Anti Bakteri Minyak Atsiri Buah Kemukus (Piper cubeba L.f.) Secara In Vitro dan In Silico pada Bakteri Shigella flexneri”.

Meskipun banyak hambatan yang penulis alami dalam proses pengerjaannya, akhirnya karya tulis ilmiah ini dapat penulis selesaikan tepat pada waktunya.

Penyusunan Karya Tulis Ilmiah ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak, maka dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada :

1. Bapak dr. H. Ardi Pramono, Sp.An., M.Kes. selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.

2. Ibu Sabtanti Harimurti, Ph.D., Apt selaku ketua Program Studi Farmasi Universitas Muhammadiyah Yogyakarta

3. Bapak Hari Widada, M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing yang telah membantu dan membimbing dalam mengerjakan Karya Tulis ini.

4. Bapak Rifki Febriansah, M.Sc., Apt dan Bapak Puguh Novi Arsito, M.Sc., Apt selaku dosen penguji 1 dan dosen penguji 2.

5. Bapak Kasmo dan Ibu Sri Andari Amk.,S.Pd selaku orang tua penulis. 6. Bapak dan Ibu Dosen Program Studi Farmasi Universitas

Muhammadiyah Yogyakarta.

7. Sahabat dan teman teman Gangster, SimSimi, dan Aspartic yang selalu memberikan dukungan motivasi serta masukan kepada penulis.

8. Mas Shosa, Mas Mala, Tamam, Nazila, dan Ajeng Inggit yang berkontribusi secara langsung dalam pelaksanaan penulisan.

9. Semua pihak yang telah memberikan kontribusi baik secara langsung maupun tidak langsung dalam proses penyusunan Karya Tulis Ilmiah ini. Tentunya ada hal-hal yang ingin penulis berikan dalam dunia kesehatan dari hasil karya tulis ini. Oleh karena itu diharapkan semoga karya tulis ini dapat menjadi hal yang berguna bagi kita bersama.

v

Yogyakarta, Desember 2016 Penulis

viii

Gambar 3. Instrumen GC-MS ... 16

Gambar 4. Prinsip Dasar Molecular Docking ... 19

Gambar 5. Kerangka konsep ... 21

Gambar 6. Skema Cara Kerja ... 32

Gambar 7. Kromatogram Hasil Pemisahan Kromatografi Gas Sampel Minyak Atsiri Buah Kemukus………...36

Gambar 8. Struktur Kimia 5 senyawa dengan kelimpahan tertinggi ... 38

Gambar 9. Visualisasi sisi aktif protein DNA Gyrase sub-unit B (3TTZ)……44

Gambar 10. Hasil Visualisasi (a) Ligan Asli, (b) Ciprofloxacin dan (c) 1H-cycloprop[e]azulene………...48

ix

kemukus………. 36

Tabel 2. Hasil Diameter Zona Inhibisi Masing-Masing Konsentrasi Minyak Atsiri……….. 41 Tabel 3. Visualisasi masing-masing ligan………... 45 Tabel 4. Interaksi Ligan dengan Protein target………...………... 47

x

Lampiran 2. Tabel Hasil Uji Aktivitas dan Grafik Diameter Zona Inhibisi 60 Lampiran 3. Kondisi GC-MS………..……….. 61 Lampiran 4. Kromatogram………..………... 62 Lampiran 5. Hasil MS Dugaan Senyawa Alpha Cubebene berdasarkan hasil

kelimpahan tertinggi…….………. 63

Lampiran 6. Hasil MS Dugaan Senyawa Copaene berdasarkan hasil

kelimpahan tertinggi…..………..………... 64 Lampiran 7. Hasil MS Dugaan Senyawa Germacrene D berdasarkan hasil

kelimpahan tertinggi ….……..……….………... 65 Lampiran 8. Hasil MS Dugaan Senyawa 1H-Cycloprop[e]azulene

berdasarkan hasil kelimpahan tertinggi……… 66 Lampiran 9. Hasil MS Dugaan Senyawa Spathulanol berdasarkan hasil

kelimpahan tertinggi……….………...……….. 67 Lampiran 10. Hasil Konformasi Terbaik Penambatan Molekul Tiap

Ligan..……... 68 Lampiran 11. Foto : Uji Kirby Bauer…………...……...………..………… 69

Lampiran 12. Data Analisis SPSS………...………....……….. 70 Lampiran 13. Interaksi Ligan dengan Protein Target………..……. 71

xiii By : Tri Handrianto

20120350044 ABSTRACT

Infectious diseases are still a major cause of morbidity and mortality, one of which is an infection of the digestive tract. Infections caused by bacteria known as bacillary dysentery. The most common cause of diarrhea is Shigella, especially Shigella flexneri

and Shigella dysenteriae. Cubeb plant (Piper cubeba L.) empirically used to treat colitis

and dysentery. This study aims to determine the content and the potential of the main compounds in the volatile oil cubeb fruit (Piper cubeba L.f.) against Shigella flexneri,

also recognizing the great affinity for DNA gyrase protein in bacteria Shigella flexneri

by in silico. This research was a laboratory experimental method by in vitro and in silico. Data analysis was performed with the classification test Inhibition Zone Diameter (DZI) according to Clinical and Laboratory Standards Institute, one way ANOVA, and Autodock test. From the analysis, Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) based on the five highest peaks found in cubeb fruit are alpha cubebene, copaene, germacrene D, 1H-cycloprop[e]azulene and spatulanol. The

minimum inhibitory levels cubeb fruit essential oil (Piper cubeba L.f.) that required to

inhibit the bacteria Shigella flexneri is 10%. The average value DZI (Inhibition Zone

Diameter) obtained from each concentration of essential oils of cubeb fruit (Piper cubeba L.f.) that can inhibit the bacteria Shigella flexneri is at a concentration of 10%

was 8 mm; concentration of 20% is 8,5 mm; concentration of 40% is 9.5 mm; concentration of 80% is 11 mm. In silico result is 1H-cycloprop[e]azulene as dominant

Compounds in cubeb fruit have the highest affinity towards protein DNA gyrase in bacteria Shigella flexneri with a bond energy value -7,3 kcal / mol.

Keyword : Essential oil, Cubebe, Shigella flexneri, Antibacterial test, Molecular

1 A. Latar Belakang Penelitian

Ditengah munculnya new-emerging disease, penyakit infeksi tetap menjadi

masalah kesehatan masyarakat yang penting di seluruh belahan dunia. Penyakit infeksi masih menjadi penyebab utama kesakitan dan kematian, salah satunya adalah infeksi saluran pencernaan. Penyakit infeksi saluran pencernaan dapat disebabkan oleh virus, bakteri dan protozoa. Infeksi yang disebabkan oleh bakteri dikenal sebagai disentri basiler yang disebabkan oleh bakteri Shigella. Penyebab

diare yang tersering adalah Shigella, khususnya Shigella flexneri dan Shigella dysenteriae (Zein, 2004). Data profil kesehatan Indonesia tahun 2010

menyebutkan bahwa jumlah kasus diare yang ditemukan sekitar 213.435 penderita dengan jumlah 1.289 kematian, dan sekitar 70–80% dari jumlah tersebut terjadi pada anak-anak terutama usia dibawah 5 tahun. Dari data tersebut dapat diperkirakan bahwa selama 20–30 tahun ke depan diare dan beberapa penyakit infeksi lainnya akan tetap menjadi perhatian sebagai penyebab masalah kesehatan di dunia (Depkes, 2010)

Tanaman kemukus (Piper cubeba L.) merupakan salah satu tanaman yang

secara empirik digunakan untuk mengobati masuk angin, radang usus, disentri, perut mulas, kencing nanah, radang selaput lendir, asma, ekspektoran dan bronkhitis (Sudarsono et.al., 1996). Tanaman obat yang tergolong rempah-rempah

merupakan suatu anugerah bagi makhluk hidup dan merupakan salah satu tanda kekuasaan Allah SWT. Hal tersebut dituangkan dalam firman Allah surat An-Nahl (16) ayat 11 yang berbunyi :

Artinya :

“Dia menumbuhkan bagi kamu dengan air hujan itu tanam-tanaman; zaitun, kurma, anggur dan segala macam buah-buahan. Sesungguhnya pada yang demikian itu benar-benar ada tanda (kekuasaan Allah) bagi kaum yang berfikir”. (QS. An-Nahl : 11)

Telah dilakukan uji anti bakteri senyawa kemukus dengan bakteri

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Shigella dysentriae, dan Candida albicans

dan diperoleh kesimpulan bahwa senyawa buah kemukus dapat menghambat bakteri senyawa Shigella dysentriae pada konsentrasi 10% (Irianingsih, 2004).

Penelitian lain menyatakan kesetaraan dari minyak atsiri untuk larutan uji 3000 bpj, 4000 bpj, 5000 bpj, 6000 bpj, dan 7000 bpj terhadap pertumbuhan Escherichia coli

dengan pembanding k1oramfenikol secara berturut-turut adalah sebagai berikut: 12,1 bpj; 13,3 bpj; 14,1 bpj; 14,5 bpj; dan 14,7 bpj. (Murti, 2007).

Pada penelitian ini akan dilakukan analisis kandungan dan uji in silico

terhadap kandungan utama dalam minyak atsiri kemukus, sehingga diketahui komponen apakah yang berkontribusi utama dalam aktivitas antibakterinya.

ikatan, maupun afinitas suatu ligan (obat) dengan reseptornya, maupun enzim dengan substrat atau inhibitor-nya. Metode in silico juga dapat digunakan untuk

memprediksi apakah suatu senyawa memiliki aktivitas atau tidak, dan berguna dalam pengembangan senyawa dengan aktifitas yang lebih baik. Dengan semakin berkembangnya penggunaan obat tradisional maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap efek khasiat obat tradisional (kemukus) yang diduga memiliki khasiat yang menguntungkan bagi manusia.

B. Rumusan Masalah

1. Apakah kandungan senyawa utama dalam minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.) berdasarkan analisis Gas Chromatography-Mass Spectrometry

(GC-MS)?

2. Berapa Kadar Hambat Minimum dan Diameter Zona Inhibisi masing masing konsentrasi minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.) yang dapat

menghambat bakteri Shigella flexneri?

3. Berapakah skor afinitas senyawa penambatan molekul tertinggi dari 5 senyawa utama minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.) terhadap protein DNA gyrase pada bakteri Shigella flexneri secara in silico?

C. Keaslian penelitian

Penelitian yang telah dilakukan sebelumnya dilakukan oleh Irianingsih (2004) dengan judul Uji Aktivitas Antimikroba Minyak Atsiri Buah Kemukus (Piper cubeba L.f.) terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923, Shigella dysentriae, dan Candida albicans secara in vitro serta pemeriksaan kandungannya

(Piper cubeba L.f.) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Sthaphylococcus aureus

ATCC 25923 dengan nilai KBM sebesar 0,156 % v/v, Shigella dysentriae dengan

nilai KBM sebesar 10% dan Candida albicans dengan nilai KBM sebesar 10% dan

5 komponen terbesar minyak atsiri buah kemukus antara lain kopaena (12,61%), germakrena-d (15,9%), kariofilen (13,25%), delta kadinol (10,22%) dan ledol (8,76 %).

Penelitian yang lain dilakukan oleh Murti (2007) berjudul Antibakteri Minyak Buah Kemukus (Piper cubeba L.f.) terhadap Escherichia coli dan

kesetaraannya dibandingkan kloramfenikol serta profil KLT minyak atsirinya. Adapun kesetaraan dari minyak atsiri untuk larutan uji 3000 bpj, 4000 bpj, 5000 bpj, 6000 bpj, dan 7000 bpj terhadap pertumbuhan Escherichia coli dengan

pembanding k1oramfenikol secara berturut-turut adalah sebagai berikut: 12,1 bpj; 13,3 bpj; 14,1 bpj; 14,5 bpj; dan 14,7 bpj. Sedangkan pada penelitian ini dilakukan analisis terhadap buah kemukus (Piper cubeba L.f.) sebagai antibakteri terhadap

bakteri Shigella flexneri.

D. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui senyawa penyusun utama minyak atsiri buah kemukus secara Gas Chromatography-Mass Spectrometry.

2. Mengetahui Kadar Hambat Minimum dan Diameter Zona Inhibisi masing-masing konsentrasi minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f) yang dapat

senyawa utama minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.) terhadap

protein DNA gyrase pada bakteri Shigella flexneri secara in silico.

E. Manfaat Penelitian

Hasil dari penelitian ini diharapkan mampu digunakan sebagai sumber informasi dasar untuk penelitian berikutnya baik mengenai alternatif pengatasan infeksi dengan herbal, maupun untuk studi formulasi lanjutan agar tanaman kemukus yang memiliki aktivitas antibakteri tersedia dalam bentuk sediaan agar siap dimanfaatkan secara optimal.

6 A. Tinjauan Pustaka

1. Disentri a. Definisi

Disentri basiler (Shigellosis) adalah penyakit infeksi usus akut

yang secara umum disebabkan oleh Shigella flexneri 70,6 %, Shigella sonnei 17,6 %, Shigella boydii 5,9 %, dan Shigella dysenteriae 5,9 %.

Anggota genus Shigella yang memiliki persentase tertinggi sebagai

penyebab disentri adalah Shigella flexneri (Santoso, et.al., 2004).

b. Epidemiologi

Diare merupakan salah satu masalah kesehatan yang masih menjadi penyebab utama tingginya morbiditas dan mortalitas pada anak di negara berkembang termasuk di Indonesia. Menurut WHO angka kesakitan diare pada tahun 2010 yaitu sebanyak 411 penderita per 1.000 penduduk. Berdasarkan data profil kesehatan Indonesia tahun 2010 jumlah kasus diare yang ditemukan sekitar 213.435 penderita dengan jumlah kematian 1.289, dan sekitar 70–80% dari jumlah tersebut terjadi pada anak-anak terutama usia dibawah 5 tahun. Dari data tersebut dapat diperkirakan bahwa selama 20–30 tahun ke depan diare dan beberapa penyakit infeksi lainnya akan tetap menjadi perhatian sebagai penyebab masalah kesehatan di dunia (Depkes, 2010)

Dari data-data tersebut diatas tampak bahwa diare, baik yang disebabkan oleh virus, bakteri dan protozoa masih merupakan masalah kesehatan masyarakat utama yang perlu penanganan dan kajian dari berbagai aspek.

c. Etiologi

Berdasarkan etiologinya, penyakit diare dapat disebabkan oleh mikroorganisme seperti bakteri, virus dan protozoa. Mikroorganisme penyebab diare terutama pada anak yang paling banyak ditemukan di negara berkembang antara lain Escherichia coli enterotoksigenik, Shigella, Campylobacter jejuni, dan Cryptosporidium (Juffrie et.al.,

2010). d. Klasifikasi

Penyakit infeksi saluran pencernaan dapat disebabkan oleh bakteri dan protozoa. Infeksi yang disebabkan oleh bakteri dikenal sebagai disentri basiler yang disebabkan oleh bakteri Shigella, sedangkan

infeksi yang disebabkan oleh protozoa dikenal sebagai disentri amuba (Ismail et.al., 1997).

Penyebab diare yang terpenting dan tersering adalah Shigella,

salah satunya Shigella flexneri. Entamoeba histolytica merupakan

penyebab disentri pada anak yang usianya di atas lima tahun dan jarang ditemukan pada balita (Nelson & Walda, 2000).

e. Patologi

Shigellosis menyebar dengan cara transmisi fecal-oral. Cara

penularan lain meliputi konsumsi makanan yang terkontaminasi atau air, kontak dengan benda mati yang terkontaminasi, dan kontak seksual. Vektor seperti lalat dapat menyebarkan penyakit dengan fisik mengangkut kotoran yang terinfeksi (Sureshbabu, 2016).

Sedikitnya 10 Shigella dysenteriae basil dapat menyebabkan

penyakit klinis, sedangkan 100-200 basil diperlukan untuk Shigella sonnei atau infeksi Shigella flexneri. Virulen Shigella dapat menahan

pH rendah asam lambung. Masa inkubasi bervariasi dari 12 jam sampai 7 hari, tapi biasanya 2-4 hari; masa inkubasi berbanding terbalik dengan beban bakteri. Penyakit ini menular selama orang yang terinfeksi mengeluarkan organisme tersebut dalam tinja. pengeluaran bakteri biasanya berhenti dalam waktu 4 minggu dari onset penyakit; jarang dapat bertahan selama berbulan-bulan (Sureshbabu, 2016).

f. Pengobatan

Pada infeksi ringan umumnya dapat sembuh sendiri, penyakit akan sembuh pada 4-7 hari. Minum lebih banyak cairan untuk menghindarkan kehabisan cairan, jika pasien sudah pada tahap dehidrasi maka dapat diatasi dengan rehidrasi oral. Pada pasien dengan diare berat disertai dehidrasi dan pasien yang muntah berlebihan sehingga tidak dapat dilakukan rehidrasi oral maka harus dilakukan rehidrasi intravena. Umumnya pada anak kecil terutama bayi lebih rentan kehabisan cairan

jika diare. Untuk infeksi berat Shigella dapat diobati dengan

menggunakan antibiotika termasuk ofloksasin, norfloksasin dan siprofloksasin (Dipiro et.al.,2008).

2. Shigella Flexneri

Gambar 1. Shigella flexneri

(Sumber : CDC, 2013)

Kingdom : Bacteria Phylum : Proteobacteria

Class : Gammaproteobacteria Order : Enterobacteriales Family : Enterobacteriaceae Genus : Shigella

Species : Shigella flexneri

(Castellani & Chalmers, 1919)

Shigella flexneri merupakan bakteri gram negatif, nonmotile, dan

berbentuk batang. Shigella flexneri dapat menyebabkan Shigellosis (disentri

basiler) dengan cara menginvasi epitel usus besar. Bakteri Shigella flexneri

mampu menyerang dan memecah sel-sel epitel dan sel dendrit kemudian masuk ke sitosol (Lucchini et.al., 2005).

3. Kemukus a. Morfologi

Kemukus (Piper cubeba L.) merupakan perdu merambat dengan

tinggi sampai 15 meter (Heyne, 1987). Berupa buah berbentuk hampir bulat, bau khas, rasa agak pedas dan pahit, bergaris tengah lebih umumnya kurang 5 mm, pada bagian pangkal terdapat tonjolan panjang menyerupai tangkai, panjang tonjolan 5-10 mm, tebal kurang dari 1 mm, kadang-kadang bagian pangkal di daerah tonjolan agak cekung. Permukaan luar umumnya berkerut keras seperti anyaman jala, kadang-kadang rata, warna cokelat tua atau cokelat kelabu sampai hitam, permukaan dalam licin, berwarna cokelat muda. Kulit biji berwarna cokelat tua, berkeriput. Inti biji terdiri dari perisperm, di bagian atas terdapat endosperm yang kecil dengan embrio di dalamnya (Depkes, 2008).

b. Taksonomi

Gambar 2. Buah kemukus (Piper cubeba L.f.) Sumber : Tjitrosoepomo, 1994

Kingdom :Plantae

Subkingdom : Tracheobionta Super Divisi : Spermatophyta

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Dicotyledonae Bangsa : Piperales Suku : Piperaceae Marga : Piper

Jenis : Piper cubeba L. (PLANTAMOR, 2012)

c. Kandungan Kimia

Pada buah yang telah dikeringkan mengandung lebih dari 10% minyak atsiri yang terdiri dari senyawa-senyawa monoterpen (sabinene

50%, carene, α-thujane, 1,4-cineol dan 1,8-cineol) dan senyawa

senyawa seskuiterpen (copaene, α- dan β-cubebane, δ-cadinene, coryophyllene, germacrene, cubebol). Meskipun senyawa-senyawa

monoterpen masih mendominasi, namun yang memberikan sumbangan lebih besar pada karakteristik aromanya adalah senyawa seskuitepen. Selain itu buah kemukus juga mengandung senyawa lignin yang terdiri

dari cubebin, hinokinin elusin, dihidroclusin, cubebinin yatein cubebinolide, cadigerine, iso yatein (2R, 3R) -2-(3”,4”- methylen-dioxybenzyl)-3-(3’,4’dimethoxybenzil)buyrolactone (Sudarsono et.al.,

Terpenoid secara garis besar adalah senyawa yang termasuk ke dalam golongan hidrokarbon yang sering ditemukan pada tanaman obat. Terpenoid merupakan metabolit sekunder pada tanaman yang memiliki efek farmakologis seperti antivirus, antibakteri, antimalaria, antiradang, penghambat sintesis kolesterol dan anti kanker (Nassar & Abdalrahim, 2011)

Sehubungan dengan kandungan zat-zatnya, buah kemukus banyak dimanfaatkan untuk mengobati masuk angin, radang usus, disentri, perut mulas, kencing nanah, raja singa, radang selaput lendir, asma, serta ekspektoran dan bronkitis (Sudarsono et.al., 1996).

4. Antibakteri

Berdasarkan spektrum kerjanya, anti bakteri dapat digolongkan sebagai antibakteri dengan spektrum luas yang efektif baik untuk bakteri gram positif maupun bakteri gram negatif, contohnya tetrasiklin dan kloramfenikol. Antibakteri dengan spektrum sempit, yang hanya efektif untuk bakteri gram positif atau gram negatif saja seperti eritromisin, klindamisin, kanamisin hanya bekerja pada bakteri gram-positif sedang streptomisin, gentamisin, hanya bekerja pada bakteri gram-negatif.

Sedangkan berdasarkan mekanisme kerjanya, antibakteri dapat digolongkan dalam 5 kelompok, yaitu:

a. Antibakteri yang mengganggu metabolisme sel bakteri b. Antibakteri yang menghambat dinding sel bakteri

d. Antibakteri yang menghambat sintesis protein sel bakteri e. Antibakteri yang menghambat sintesis asam nukleat sel bakteri

(Ganiswara, dkk., 1995) Salah satu obat yang bisa digunakan sebagai antibiotik bakteri

Shigella adalah Ciprofloxacin. Ciprofloxacin merupakan antibiotik

spektrum luas (broad spectrum) golongan florokuinolon yang paling umum

digunakan (Mohanasundaram & Shantha, 2000) dengan mekanisme kerja menghambat DNA gyrase (topoisomerase II) dan topoisomerase IV yang

terdapat dalam bakteri (Marians & Hiasa, 1997). Penghambatan terhadap enzim yang terlibat dalam replikasi, rekombinasi dan reparasi DNA tersebut mengakibatkan penghambatan terhadap pertumbuhan sel bakteri (Sarro, 2001).

Ciprofloxacin digunakan untuk pengobatan infeksi yang disebabkan

oleh bakteri Gram negatif seperti E. coli, Proteus mirabilis, Klibsiella sp, Shigella sp., Enterobacter, Chlamydia sp, Salmonella sp, dan P. aeruginosa

serta bakteri gram positif tertentu. Mekanisme kerja dari antibiotik ini yaitu dengan menghambat proses terbentuknya superkoil DNA yang berikatan dengan enzim DNA gyrase sub unit A yaitu suatu enzim yang penting pada replikasi dan perbaikan DNA. Resistensi bakteri terhadap antibiotik ini dapat terjadi karena adanya mutasi gen yang mengkode polipeptida sub unit A enzim DNA gyrase (Jawetz dkk., 2001). Menurut Cushnie and Lamb (2005) senyawa flavonoid dapat berikatan dengan peptidoglikan pada dinding sel bakteri sehingga terjadi pengendapan protein yang selanjutnya

dapat menghambat proses biosintesis peptidoglikan dan menghambat DNA gyrase. Alkaloid dapat merusak sintesis dinding sel sehingga dapat menyebabkan sel menjadi lisis.

5. Destilasi

Destilasi didefinisikan sebagai sebuah proses dimana campuran dua atau lebih zat liquid atau vapor dipisahkan menjadi komponen fraksi yang

murni, dengan pengaplikasian dari perpindahan massa dan panas (Komariah

et.al., 2009). Destilasi adalah suatu metode yang digunakan untuk

memurnikan cairan-cairan berdasarkan pada perbedaan titik didih. Jenis jenis destilasi yang digunakan antara lain (Ketaren, 1987) :

a. Destilasi sederhana

Metode ini digunakan untuk memurnikan cairan-cairan yang tidak terurai pada titik didihnya dari pengotor-pengotor nonvolatile atau

memisahkan cairan yang memiliki titik didih paling sedikit antara 70-80_⁰C.

b. Destilasi terfraksi konstituen

Metode ini digunakan bila suatu campuran cairan yang berbeda titik didih sekitar 30_⁰ C atau lebih.

c. Destilasi vakum

Metode ini digunakan untuk memurnikan cairan-cairan organik yang terurai pada atau dibawah titik didih normalnya atau cairan yang memiliki titik didih sangat tinggi dimana sulit untuk dilakukan pada tekanan biasa.

d. Destilasi uap

Metode ini digunakan untuk memurnikan senyawa organik yang

volatile, tidak bercampur dengan air, mempunyai tekanan uap yang

tinggi pada 100_⁰ C dan mengandung pengotor-pengotor non volatile.

6. Kromatografi Gas dan Spektrometri Massa

Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dengan arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam adsorbsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion (Depkes, 2008).

Teknik kromatografi umum menggunakan fase gerak gas pembawa Helium. Gas Helium digunakan karena bersifat inert. Kolom yang digunakan adalah kolom kapiler dan kolom paket. Kolom kapiler memiliki panjang antara 10 hingga 120 meter dengan diameter internal 0,1 hingga 0,5 mm. Kolom paket memiliki panjang 1 hingga 5 meter dengan diameter internal antara 2 hingga 4 mm (Crawford Scientific, 2015).

Proses pemisahan dalam GC diawali dengan sampel yang diinjeksikan ke inlet kemudian diuapkan dan dibawa ke kolom oleh gas pembawa. Senyawa akan dipisahkan berdasarkan karakteristik molekul dan interaksi dengan fase diam. Senyawa yang tidak berinteraksi melewati kolom dengan lebih cepat (Douglas, 2015). Waktu yang dibutuhkan senyawa untuk

melewati kolom disebut retention time (Rt) yang digunakan untuk

membedakan satu senyawa dengan senyawa yang lain (Douglas, 2015). Spektrometri massa merupakan teknik analisis yang didasarkan pada perubahan komponen cuplikan menjadi ion-ion gas dan memisahkannya berdasarkan perbandingan massa terhadap muatan (m/e). Komponen instrumen MS antara lain ruang ionisasi, mass analyzer dan detector (JEOL,

2006).

Gambar 3. Ilustrasi skematis instrumen GC-MS (Crawford Scientific, 2015)

Senyawa dari GC menuju ke MS melalui ruang ionisasi. Ionisasi terjadi apabila suatu molekul berbentuk gas disinari oleh suatu elektron yang berenergi tinggi dalam sistem hampa, maka akan terjadi ionisasi. Ion molekul terbentuk sedangkan ion yang tidak stabil pecah menjadi ion-ion yang lebih kecil (Watson, 1994). Luaran yang dihasilkan berupa spektrum yang ditunjukan dengan nilai massa fragmen (m/z). Semakin tinggi spektrum menunjukan banyaknya fragmen yang terdeteksi. Spektrometri massa dapat memberikan informasi kualitatif dan kuantitatif tentang susunan atom dalam molekul zat-zat organik dan anorganik (Watson, 1994).

7. Uji Aktivitas Antibakteri

Uji aktivitas antibakteri digunakan untuk mengetahui kemampuan antibakteri untuk menghambat pertumbuhan atau membunuh bakteri pada konsentrasi tertentu. Uji ini bertujuan untuk menentukan aktivitas bakteri tertentu terhadap terapi antibakteri pada organisme yang terinfeksi (FDA, 2009). Tes sensitivitas antibakteri diklasifikasikan menjadi:

a. Difusi

Metode difusi digunakan dengan cara menempatkan cakram kertas filter yang mengandung sejumlah obat tertentu diatas permukaan medium padat yang telah ditanam pada permukaan dengan organisme uji. Setelah inkubasi, diameter zona inhibisi disekitar cakram diukur sebagai ukuran inhibisi obat melawan organisme uji (Jawetz et.al.,

2001). b. Dilusi

Metode dilusi digunakan dengan cara mengukur Minimum Inhibitory Concentration (MIC) dan Minimum Bactericidal Concentration (MBC) dengan membuat seri pengenceran agen

antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai MIC, sedangkan larutan yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai MBC. Terdapat jenis dilusi yang lain yaitu dilusi padat yang serupa dengan dilusi cair namun menggunakan media padat (Pratiwi, 2008).

8. Metode Kirby Bauer

Metode Kirby Bauer adalah metode yang digunakan untuk menguji

sensitivitas suatu senyawa antibakteri terhadap mikroorganisme patogen aerob maupun anaerob penyebab penyakit. Metode ini dipublikasi oleh W.Kirby dan A.Bauer dan kemudian dibakukan oleh WHO pada tahun 1961 (Hudzicki, 2009).

Tujuan dari uji kepekaan Kirby Bauer untuk menentukan sensitivitas

atau resistensi dari aerobik patogen dan bakteri anaerob fakultatif untuk berbagai senyawa antimikroba. Hal ini dapat untuk membantu dokter dalam memilih pilihan pengobatan untuk pasiennya. Organisme patogen ditanam di agar dengan disk kertas diresapi penyaring antimikroba. Ada atau tidak adanya pertumbuhan sekitar cakram adalah ukuran tidak langsung dari kemampuan senyawa yang menghambat organisme itu (Hudzicki, 2009).

Penentuan resistensi bakteri terhadap antimikroba adalah bagian penting dari manajemen infeksi pada pasien. Metode Kirby Bauer telah

dibakukan dan merupakan metode yang layak untuk laboratorium dengan sumber daya minimal untuk memanfaatkan metode otomatis yang lebih baru untuk pengujian dilusi. Cakram kertas yang memiliki diameter 6 mm diresapi dengan konsentrasi senyawa antimikroba ditempatkan pada agar piring, senyawa yang diserap ke dalam disk itu mulai berdifusi ke dalam agar-agar sekitarnya. Tingkat difusi dari antimikroba melalui agar tergantung pada difusi dan sifat kelarutan obat dalam agar juga tergantung pada berat molekul senyawa antimikroba. Molekul yang lebih besar akan

menyebar lebih lambat dibanding senyawa dengan berat molekul rendah (Hudzicki, 2009).

9. Uji in Silico

a. Penambatan Molekuler

Penambatan molekuler adalah metode komputasi yang bertujuan meniru peristiwa interaksi suatu molekul ligan dengan protein yang menjadi tergetnya pada uji in-vitro (Motiejunas & Wade, 2006). Pada

umumnya tujuan utama penambatan molekuler juga digunakan untuk mendapat nilai energi ikatan konformasi yang paling rendah dengan afinitas yang paling tinggi. Pada dasarnya cara kerja dari beberapa aplikasi tersebut digambarkan pada Gambar 4.

Gambar 4. Prinsip dasar Molecular Docking

(Kroemer, 2007) R : Reseptor

A : Ligan yang cocok dengan reseptor B : Ligan yang tidak cocok dengan reseptor

C : Ligan yang cocok dengan reseptor dalam konformasi yang lain

√ : Ikatan ligan cocok dengan reseptor X : Ikatan ligan tidak cocok dengan reseptor

Ada beberapa aplikasi yang umum digunakan untuk melakukan

virtual screening dengan metode penambatan molekuler antara lain

dengan PLANTS (Protein Ligand Ant System), GOLD, MOE

(Molecular Operating Environment), MVD (Molegro Virtual Docking) dan Autodock (Kroemer, 2007).

b. Autodock Vina

Autodock Vina merupakan aplikasi penambatan molekul protein

dan ligan. Autodock Vina memiliki kerja yang sama dengan aplikasi Autodock Tool 4. Pada penerapannya Autodock Vina ini menggunakan

fungsi skor energi interaksi untuk memperkirakan afinitas protein dan ligan, jenis ikatan yang mungkin terjadi, serta menentukan konformasi paling baik. Skor penambatan ini diestimasikan sebagai binding energy

yang memiliki satuan Kkal/mol (Morris et.al., 2009). Percobaan Autodock Vina digunakan untuk memprediksi dimana dan bagaimana

ligan yang dapat berikatan dengan protein yang paling baik. Sesuai standar, melakukan percobaan ulang pada pasangan ligan dan protein dapat menghasilkan berbagai model ikatan yang berbeda. (Jaghoori

et.al., 2016). Dalam hal akurasi penambatan molekul, nilai root-mean-square-deviation(RMSD) kurang dari 2 Å secara umum digunakan dan

telah menjadi pertimbangan hasil penambatan molekul yang dikatakan berhasil. Kriteria yang sama telah digunakan di penelitian molekul yang lain seperti Glide, Surflex, GOLD dan FlexX. Ambang batas RSMD <2 Å yang paling banyak digunakan (Erikson et.al., 2004).

B. Kerangka konsep

Gambar 5. Kerangka konsep

Penyakit infeksi saluran pencernaan dapat disebabkan oleh virus, bakteri dan protozoa. Infeksi yang disebabkan oleh bakteri dikenal sebagai disentri basiler yang disebabkan oleh bakteri Shigella. Penyebab diare yang tersering

adalah Shigella, khususnya Shigella flexneri dan Shigella dysenteriae (Zein,

2004). Beberapa jenis bakteri Shigella telah menjadi kebal terhadap antibiotik, Shigella flexneri

Disentri

Pengobatan

Antibiotik Herbal

Piper cubeba L.f.

GC-MS

Uji In Silico

Uji InVitro

Penambatan Molekul

Destilasi

seperti kotrimoksazol, ampisilin dan tetrasiklin (Bush & Perez, 2014), maka diperlukan suatu terapi komplementer atau terapi anti bakteri lain untuk mengatasi kasus resistensi tersebut. Penggunaan bahan alam misalnya menggunakan kemukus dapat menjadi solusi untuk kasus ini.

C. Hipotesis

Dari penelitian ini, dirumuskan hipotesis sebagai berikut :

1. Minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.) mengandung senyawa

golongan terpenoid yang dapat digunakan sebagai antibakteri yang dianalisis secara Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS).

2. Kadar Hambat Minimum konsentrasi minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.) yang diperlukan untuk menghambat Shigella flexneri sebesar

10%.

3. Senyawa marker buah kemukus yaitu cubebene memiliki afinitas paling

baik terhadap protein DNA Gyrase pada bakteri Shigella flexneri secara in silico.

23 A. Desain Penelitian

Desain penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratoris dan penelitian eksploratif dengan metode in vitro dan in silico.

B. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Teknologi Farmasi FKIK UMY, Laboratorium Penelitian FKIK UMY, Central of Essential Oil Studies UII dan

Laboratorium Kimia Organik Fakultas MIPA UGM dari bulan Januari hingga Juni 2016.

C. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel Penelitian

a. Analisis Kandungan Kimia Gas Chromatography-Mass Spectrometry

(GC-MS)

Variabel bebas : Minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.)

Variabel tergantung : Nilai waktu retensi (Rt) rasio muatan (m/z) Variabel terkendali : Kondisi GC-MS

b. Uji Aktivitas Antibakteri

Variabel bebas` : Konsentrasi minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.)

Variabel tergantung : Nilai DZI masing masing konsentrasi minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.)

Variabel terkendali : Media pertumbuhan bakteri dan suhu. c. Uji In Silico dengan Autodock Vina

Variabel bebas : Bentuk konformasi ikatan antara ligan dan protein target

Variabel tergantung : Skor penambatan molekul

Variabel terkendali : Hardware, software, struktur ligan, dan protein

Target DNA gyrase

2. Definisi Operasional

a. Waktu retensi/ retention time (Rt) adalah waktu yang dibutuhkan oleh

senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor.

b. Kadar Hambat Minimum (KHM)/ Minimum Inhibitory Concentration

(MIC) adalah konsentrasi minimal antibakteri yang dapat menghambat aktivitas bakteri.

c. Diameter Zona Inhibisi (DZI) adalah diameter yang berupa zona bening yang menunjukan daya hambat suatu senyawa anti bakteri terhadap bakteri yang diuji dalam satuan milimeter (mm).

d. Skor penambatan adalah nilai ikatan energi suatu senyawa terhadap proteinnya yang semakin minimum nilainya dianggap semakin baik dan memiliki afinitas yang lebih tinggi yang dinyatakan dengan satuan Kkal/mol.

D. Instrumen Penelitian 1. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan meliputi bejana, blender Phillips®_seri

2071,sarung tangan Sensi Gloves® _{(Handscoon Non Steril), masker Sensi}

Mask®_{,pinset Baku}®_{, mikropipet Socorex}® _{skala 10-100µl, pipet ukur}

Pyrex®_{, pipet tetes Pyrex}®_{, timbangan analitik Metller Toledo Scale brite}®_,

gelas beker Pyrex®_{, dan gelas ukur Pyrex}®_{, alat GC-MS QP2010S}

Shimadzu®_{,seperangkat Personal Computer (PC) dengan sistem operasi}

adalah Linux Ubuntu 12.04 LTS 64-bit, prosessor Pentium(R) Dual-Core

CPU E6600 @ 3.06 GHz, memory 2048 MB RAM. Aplikasi yang digunakan adalah Libre Office Calc 4.0, DS Visualizer, Autodock Tools, Open Babel dan Marvin Sketch. Kapas lidi, ose steril yang berasal dari Lab

Mikrobiologi FKIK UMY. 2. Bahan Penelitian

Kemukus (Piper cubeba L.f.) diperoleh dari pedagang tanaman herbal

di Desa Mayungan, Kecamatan Banguntapan, Kabupaten Bantul, Daerah Istimewa Yogyakarta, Aquades yang dibeli dari toko Brata Chem, NaCL fisiologis, BHI yang berasal dari Lab Mikrobiologi FKIK UMY,

ciprofloxacin iv Dexa medica®, Protein DNA gyrase yang diunduh dari

E. Cara Kerja

1. Determinasi Tanaman

Determinasi buah kemukus (Piper cubeba L.f.) dilakukan di

laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi UGM. 2. Penyiapan Bahan

Buah kemukus (Piper cubeba L.f.) sebanyak 500 gram yang sudah

bersih dan kering dihaluskan dengan blender hingga halus merata, setelah

halus dimasukan dalam wadah tertutup rapat. 3. Penyulingan buah kemukus

Pembuatan ekstrak dilakukan dengan metode destilasi rebus. Serbuk halus buah kemukus sebanyak 500 gram dan aquades sebanyak 2500 ml dimasukkan kedalam panci destilasi. Kemudian dipanaskan menggunakan kompor hingga didapatkan destilat yang ditampung dalam gelas ukur. Selanjutnya minyak atsiri yang berwarna bening kekuningan dipisahkan dengan air menggunakan pipet tetes dan dimasukan dalam wadah.

4. Analisis Kandungan Kimia Metode GC-MS

Analisis ini dilakukan untuk mendeteksi keberadaan senyawa-senyawa dalam ekstrak buah kemukus (Piper cubeba L,f.) dapat digunakan

sebagai antibakteri. Pemisahan senyawa dengan GC menggunakan kolom AGILENTJ % W DB-1 dengan panjang 30 meter. Fase gerak menggunakan gas pembawa helium dengan kecepatan 0,54 ml/menit. Sistem pemanasan diatur dari suhu 50 hingga 260_⁰C dengan peningkatan sebesar 5_⁰C setiap menit. Dalam instrumen MS digunakan energi ionisasi sebesar 70 Ev.

Hasilnya akan diamati melalui spektra yang diamati berdasarkan berat molekul dan waktu retensi senyawa yang diinginkan.

5. Uji In Silico dengan Autodock Vina

a. Instalasi Aplikasi Autodock dan Aplikasi Pendukung

Autodock Vina merupakan aplikasi untuk melakukan proses

penambatan molekul. DS Visualizer untuk preparasi protein uji dan

ligan asli, Marvin Sketch untuk preparasi ligan atau senyawa ligan yang

akan diuji. AutoDockTools untuk melakukan penambatan molekuler

agar dapat dieksekusi oleh aplikasi Autodock Vina untuk mengukur nilai

RMSD dan Open Babel untuk mengkonversi hasil PDBQT menjadi

PDB sehingga dapat divisiualisasikan menggunakan DS Visualizer.

b. Penyiapan Protein Target dan Ligan Uji

Protein yang akan digunakan sebagai reseptor uji diunduh dari situs resmi protein data bank (www.rscb.org) dalam format “.pdb”. Berkas

protein/reseptor yang digunakan adalah DNA gyrase dengan kode

protein 3TTZ. Setelah mendapatkan protein target dilakukan preparasi melakukan DS Visualizer dengan memastikan ligan bebas dari molekul air. Reseptor disimpan dalam format PDB. Hal tersebut juga dilakukan pada ligan asli sebagai ligan uji.

c. Konversi Protein dan Ligan dalam Format PDBQT

Untuk menjalankan fungsi aplikasi Autodock Vina, berkas reseptor target dan ligan uji harus dikonversi terlebih dahulu menggunakan aplikasi Autodock Tools. Dalam tahapan proses konversi berkas protein

yang sudah dipreparasi ditambahkan atom hidrogen dan disimpan dalam bentuk PDBQT dengan menggunakan menggunakan tahapan preparasi

Grid Parameter File.

d. Preparasi Grid Parameter File

Proses ini merupakan proses lanjutan dari langkah sebelumnya. Aplikasi

Autodock Tools yang masih terbuka kemudian dipilih bagian Grid dan

dipilih ligan melalui fungsi Set Map Types dan dilanjutkan penyiapan Grid Box. Grid Box merupakan penentuan area untuk simulasi

penambatan. Kemudian hasil output disimpan dalam bentuk PDBQT.

e. Penambatan Molekuler dengan Autodock Vina

Sebelum menjalankan fungsi penambatan molekuler berkas reseptor.pdbqt dan ligan.pdbqt berada pada folder yang sama. Kemudian menu RUN dibuka dan klik CMD dan menunggu prosesnya selesai. Pada folder Vina akan muncul beberapa konformasi hasil

penambatan.

f. Visualisasi Penambatan Molekul

Hasil penambatan molekul divisualisasikan menggunakan DS Visualizer. Sebelum visualisasi berkas hasil penambatan dengan format PDBQT dirubah menjadi berkas PDB menggunakan aplikasi Open Babel. Setelah didapatkan berkas PDB, berkas reseptor.pdb menggunakan DS Visualizer dan dipilih hasil penambatan dan dimasukan ligan hasil penambatan molekul dan melihat visualisasi menggunakan menu define ligand dan ligan interaction untuk

mengidentifikasi dengan lebih mudah background diganti warna putih

dan dicantumkan label residu asam amino tempat hasil penambatan berikatan.

g. Validasi Molecular Docking

Validasi molecular docking bertujuan untuk menentukan apakah protein

yang digunakan untuk molecular docking dapat digunakan atau tidak.

Validasi molecular docking ini dilakukan dengan cara menentukan nilai

RSMD. Nilai validitas RSMD yang dipersyaratkan adalah <2.00 Å. 6. Uji Aktivitas Antibakteri

a. Sterilisasi Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang akan digunakan terlebih dahulu disterilisasi, seperti alat-alat gelas disterilisasi menggunakan oven dengan suhu 170° C selama 2 jam. Ose dan pinset disterilkan menggunakan bunsen. Media nutrien agar disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121° C selama 15 menit dan aquades disterilkan dengan penangas hingga mendidih selama 15 menit. Sampel yang telah dibuat variasi konsentrasi, semua alat, dan bahan kecuali suspensi bakteri sebelum pengujian dilakukan sterilisasi menggunakan sinar UV selama 30 menit.

b. Pembuatan kontrol positif

Kontrol positif yang digunakan adalah larutan Ciprofloxacin 0,2% yang akan diubah konsentrasinya menjadi 5 μg/ml. Larutan kontrol positif

dibuat dengan cara diambil 25 uL larutan Ciprofloxacin injeksi

ditambahkan Aqua Pro Injection hingga 10 ml.

c. Pembuatan kontrol negatif

Kontrol negatif yang digunakan adalah n-heksana. d. Pembuatan larutan uji

Konsentrasi minyak atsiri buah kemukus dibuat larutan induk dengan 100% dengan melakukan n-heksana. Selanjutnya dibuat variasi konsentrasi 10%, 20%, 40%, 80% dengan cara membuat 0,5 ml; 1 ml; 2 ml; 4 ml minyak atsiri buah kemukus ditambahkan pelarut n-heksana hingga volume 5 ml.

e. Pembuatan media agar

Mac Conkey Agar 20,6 gram dimasukan ke dalam 2 erlenmeyer 250 mL.

Ditambahkan air suling masing-masing sebanyak 200 mL. Dipanaskan diatas pemanas sampai larut sempurna kemudian ditutup dengan bundle.

Disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit, dituangkan ke dalam plate, dimasukan dalam almari pendingin dan siap

f. Preparasi Bakteri

Bakteri Shigella flexneri diambil dan dimasukan ke dalam larutan NaCl

fisiologis dan diinkubasi selama 2-4 jam pada suhu 37°C. Setelah itu larutan supensi bakteri diambil sebanyak 1 ml dan ditambahkan dengan menggunakan nutrient BHI dengan perbandingan BHI dibanding

suspensi bakteri (9:1) sambil dihomogenkan. g. Uji Kadar Hambat Antibakteri

Suspensi bakteri yang terbentuk kemudian diusap secara merata pada cawan petri yang telah berisi media nutrien agar menggunakan kapas lidi steril. Cakram kertas direndam dengan larutan uji sesuai dengan masing-masing konsentrasi. Cakram kertas yang berisi masing-masing konsentrasi minyak atsiri kemukus, kontrol positif, kontrol negatif kemudian ditempelkan pada permukaan media agar. Perlakuan ini dilakukan replikasi. Selanjutnya diinkubasi pada 37°C selama 24 jam. Hasilnya dapat dilihat dengan terbentuknya diameter hambatan secara radial (DZI) di sekitar cakram kertas dan diukur diameternya dengan satuan milimeter (mm). Selanjutnya dibandingkan diameter hambat kontrol positif, kontrol negatif dan minyak atsiri.

F. Skema Langkah Kerja

Gambar 6. Skema Cara Kerja 80%

10% 20% 40%

Kontrol Positif Kontrol Negatif

Ciprofloxacin

n-heksana Minyak Atsiri Buah

Kemukus

Analisis GC-MS

Uji in silico

DNA gyrase Uji in Vitro

Metode Kirby Bauer

Destilasi Rebus Buah Kemukus

G. Analisis Data

1. Analisis Kandungan Kimia Metode GC-MS

Analisis kandungan senyawa buah kemukus (Piper cubeba L.f.) dilakukan

dengan cara melihat sprektra dan mengamati waktu retensi setiap senyawa yang timbul dalam bentuk puncak-puncak (peak) kemudian dibandingkan

dengan standar yang bersumber pada WILEY 229 dan NIST 62. 2. Hasil Uji Penambatan Molekul

Hasil akhir yang akan diperoleh dari uji in silico adalah skor penambatan

molekul pada masing-masing variabel. Dari data penelitian ini dianalisis perbandingan antara skor penambatan masing-masing senyawa uji dengan senyawa pembanding dan perbandingan hasil visualisasi dalam bentuk 3D dengan menggunakan aplikasi VMD (Visual Molecular Dynamics).

3. Analisis Uji Aktivitas Antibakteri

Data yang diperoleh pada pengujian ini adalah nilai DZI pada masing-masing konsentrasi. Perbedaan data penelitian antara masing-masing-masing-masing konsentrasi minyak atsiri kemukus dan antibiotik standar Ciprofloxacin

dilakukan analisis parametrik dengan uji one way ANOVA menggunakan

34 A. Determinasi Tanaman

Hasil determinasi sampel tanaman yang dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada yang menyatakan bahwa sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah benar Piper cubeba L.f. yang ditunjukan pada lampiran 1.

B. Pengumpulan dan Penyiapan Bahan

Buah kemukus yang akan dianalisis berasal dari pedagang tanaman herbal di Desa Mayungan, Kecamatan Banguntapan, Kabupaten Bantul, Daerah Istimewa Yogyakarta. Buah kemukus dicuci hingga bersih dari kotoran yang menempel kemudian dihaluskan dan ditimbang. Serbuk buah kemukus digunakan agar memudahkan penyarian dan memperluas kontak antara bahan dengan air.

C. Hasil Destilasi Minyak Atsiri

Metode yang digunakan untuk mendapatkan minyak atsiri yaitu metode destilasi rebus. Metode ini dipilih karena minyak atsiri yang dihasilkan tidak berhubungan langsung dengan udara luar sehingga tidak mudah menguap dan volume minyak atsiri yang dihasilkan dapat langsung diketahui jumlahnya karena dilengkapi dengan skala. Minyak atsiri yang diperoleh berupa cairan berwarna kuning jernih dan berbau khas kemukus sejumlah 35 ml.

Pada pelaksanaan destilasi minyak atsiri ini perlu diperhatikan ukuran bahan tanaman yang seragam dan ruang antara bahan yang cukup agar air dapat berpenetrasi. Penyebaran harus merata dalam ketel sehingga penyari dapat menembus bahan secara merata dan menyeluruh. Buah kemukus yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah kemukus yang dikeringkan dengan cara dijemur dibawah sinar matahari dan ditutup kain hitam.

Minyak atsiri yang didapatkan dari proses destilasi adalah 35 ml dari 500 gram bahan baku serbuk minyak atsiri. Minyak atsiri tersebut kemudian dianalisis menggunakan GC-MS dan dilarutkan dengan n-heksana dalam pembuatan konsentrasi minyak atsiri dalam uji aktivitas antibakteri pada

Shigella flexneri.

D. Hasil Analisis GC-MS

GC-MS dapat memberikan data kualitatif dan kuantitatif senyawa yang menjadi komponen minyak atsiri karena AUC yang ditunjukan pada kromatogram berbanding lurus dengan konsentrasi masing masing komponen yang terdapat pada sampel. Analisis kromatografi gas akan mendapat kemungkinan jumlah komponen minyak atsiri dan kadar masing-masing. Sedangkan untuk menentukan jenis komponen minyak atsiri tersebut dilakukan analisis dengan MS selanjutnya diidentifikasi dengan spektra yang berasal dari NIST dan WILEY.

Analisis dengan GC-MS dilakukan dengan menginjeksi 1 μL larutan ke dalam tempat injeksi. Uap cuplikan ini kemudian dibawa oleh gas pembawa masuk ke dalam kolom. Kolom akan memisahkan komponen-komponen

minyak atsiri sehingga dapat dideteksi oleh detektor dan dihasilkan suatu kromatogram. Identifikasi komponen-komponen senyawa kimia dalam minyak atsiri buah kemukus menggunakan alat GC-MS. Lingkaran merah pada gambar 7 menunjukkan 5 senyawa dengan kelimpahan tertinggi dalam minyak atsiri buah kemukus.

Gambar 7. Kromatogram Hasil Pemisahan Kromatografi Gas Sampel Minyak Atsiri Buah Kemukus

Tabel 1. Senyawa dengan kelimpahan tertinggi pada kromatogram GC-MS minyak atsiri buah kemukus

No . Senyaw a Wakt u retens i Puncak (%AUC)

SI BM Perkiraan Senyawa Acuan

1 I 25,380 10 (12,32)

96 204 alpha-cubebene NIST 62

2 II 26,203 11 (26,32)

96 204 copaene NIST 62

3 III 27,082 12 (13,08)

95 204 germacrene-D WILEY 229

4 IV 18,383 18 (4,16) 97 204

1H-cycloprop[e]azulene

NIST 12 5 V 29,706 23 (7,92) 83 222 spathulanol WILEY 229

Identifikasi komponen-komponen senyawa kimia dalam minyak atsiri buah kemukus menggunakan alat GC-MS-QP2010S SHIMADZU menghasilkan 30 puncak kromatogram yang dapat dilihat pada gambar 7. Dari 30 puncak yang muncul dipilih 5 puncak yang merupakan puncak utama (lingkaran merah) yaitu nomor 10, 11, 12, 18, dan 23 yang masing-masing diperkirakan mengandung alpha-cubebene, copaene, germacrene-D, 1H-cycloprop[e]azulene, dan spathulanol.

Analisis kandungan minyak atsiri buah kemukus pada penelitian ini dilakukan

dengan analisis spektra massa yang didasarkan pada ”base peak” (puncak dasar)

dan Similarity Index (SI) dengan perbandingan spektra dari NIST 62 dan Wiley

299.LIB. Base peak merupakan puncak yang paling besar limpahannya dalam

spektrum dan diberi harga 100%. Jika nilai SI mendekati 100% maka senyawa yang terdeteksi memiliki tingkat kemiripan dengan data pembanding. Peak nomor 18

dipilih dikarenakan peak nomor 20 yang lebih tinggi sama dengan peak 12 yang

diduga mengandung germacrene D.

Dari tabel 1 dapat diketahui bahwa minyak atsiri buah kemukus terdiri dari golongan seskuiterpen yaitu alpha cubebene, copaene, germacrene D, 1H-cycloprop[e]azulene dan spatulanol. Struktur senyawa penyusun minyak atsiri

Gambar 8. Prediksi struktur kimia 5 senyawa dengan kelimpahan tertinggi menurut hasil GC-MS

Secara kimia, minyak atsiri buah kemukus terdiri dari senyawa golongan monoterpen dan seskuiterpen berupa isoprena C10 dan C15 dengan titik didih yang

berbeda (titik didih monoterpen 140-180°C, titik didih seskuiterpen >200°C) (Padmawinata, 1987).

Senyawa pada puncak dasar 10 dengan waktu retensi 25,380 menit dan SI = 96 mirip dengan senyawa alpha-cubebene dengan rumus molekul C15H24. Spektra

massa ligan I dan spektra massa senyawa alpha-cubebene dapat dilihat pada

lampiran 5. Berdasarkan analisis data GC-MS, ligan I memiliki indeks kemiripan /

Similarity Index (SI) (SI) = 96 dengan alpha-cubebene, sehingga ligan I dapat 1H

cycloprop[e]azulene

alpha-cubebene copaene

germacrene D

dikatakan sebagai alpha-cubebene, yang merupakan senyawa golongan seskuiterpen.

Senyawa pada puncak dasar 11 dengan waktu retensi 26,203 menit dan SI=96 mirip dengan senyawa copaene dengan rumus molekul C15H24. Spektra

massa ligan II dan spektra massa senyawa copaene dapat dilihat pada lampiran 5.

Berdasarkan analisis data GC-MS, ligan II memiliki indeks kemiripan /Similarity Index (SI) = 96 dengan copaene, sehingga ligan II dapat dikatakan sebagai copaene,

yang merupakan senyawa golongan seskuiterpen.

Senyawa pada puncak dasar 12 dengan waktu retensi 27,082 menit dan SI=95 mirip dengan senyawa germacrene-D dengan rumus molekul C15H24.

Spektra massa ligan III dan spektra massa senyawa germacrene-D dapat dilihat

pada lampiran 5. Berdasarkan analisis data GC-MS, ligan III memiliki indeks kemiripan (SI) = 95 dengan germacrene-D, sehingga ligan III dapat dikatakan

sebagai germacrene-D, yang merupakan senyawa golongan seskuiterpen.

Senyawa pada puncak dasar 18 dengan waktu retensi 18,383 menit dan SI=97 mirip dengan senyawa 1H-cycloprop[e]azulene dengan rumus molekul

C15H24. Spektra massa senyawa 1H-cycloprop[e]azulene dapat dilihat pada gambar

12. Berdasarkan analisis data GC-MS, ligan IV memiliki indeks kemiripan (SI) = 97 dengan 1H-cycloprop[e]azulene, sehingga ligan IV dapat dikatakan sebagai 1H-cycloprop[e]azulene, yang merupakan senyawa golongan seskuiterpen.

Senyawa pada puncak dasar 23 dengan waktu retensi 7,92 menit dan SI=83 mirip dengan senyawa spathulanol dengan rumus molekul C15H24O. Spektra massa

GC-MS, ligan V memiliki indeks kemiripan (SI) = 83 dengan spathulanol, sehingga,

ligan V dapat dikatakan sebagai spathulanol, yang merupakan senyawa golongan seskuiterpen.

Hasil GC-MS menunjukan bahwa 5 komponen utama dari minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.) yang dianalisis pada penelitian ini, berbeda

dengan 5 komponen utama dari minyak atsiri buah kemukus yang dianalisis oleh penelitian-penelitian sebelumnya. Perbedaan hasil analisis GC-MS minyak atsiri dapat disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain: perbedaan tempat/daerah pengambilan sampel, perlakuan pasca panen misal pengeringan dan penyimpanan, serta kondisi operasional alat yang digunakan dalam mendeteksi komponen tersebut khususnya kolom yang digunakan.

Komponen kimia dari minyak atsiri bervariasi tergantung daerah geografi, umur tanaman, iklim lokal, musim dan kondisi eksperimen (Yuksel et.al., 2006;

Senthilkumar, 2009). Selain itu juga perlakuan panen dan pasca panen dapat mempengaruhi komposisi minyak atsiri (Olonisakun et.al., 2006).

E. Hasil Analisis Uji Aktifitas Antibakteri

Metode yang digunakan dalam uji antibakteri minyak atsiri buah kemukus adalah metode difusi. Metode difusi dilakukan dengan cakram kertas menggunakan bakteri Shigella flexneri yang merupakan bakteri yang bersifat patogen pada

manusia. Uji antibakteri ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan minyak atsiri buah kemukus dalam menghambat pertumbuhan bakteri dengan mengetahui Kadar Hambat Minimal (KHM) suatu bakteri. Pengujian aktivitas antibakteri minyak atsiri buah kemukus dilakukan pada konsentrasi 80%, 40%, 20%, dan 10%. Metode

difusi ini dipilih karena pada metode ini pertumbuhan bakteri dapat teramati dengan jelas, sehingga dapat memudahkan dalam pengamatan terhadap bakteri uji. Diameter hambat pertumbuhan bakteri ini ditandai dengan zona bening disekitar cakram kertas, sedangkan warna keruh pada agar menunjukan adanya pertumbuhan bakteri. Pengujian antibakteri ini juga dilakukan pada kontrol negatif yang berupa pelarut dari sampel yaitu n-heksana, dan juga kontrol positif Ciprofloxacin5 μg/ml.

Pemilihan n-heksana, dikarenakan n-heksana tidak mempunyai aktivitas antibakteri

dan bersifat nonpolar sama seperti minyak atsiri sehingga kedua senyawa tersebut

dapat saling larut sesuai prinsip “like dissolved like”. N-heksana telah digunakan

sebagai pelarut minyak atsiri umbi teki (Cyperus rotundus L.) (Solihah, 2008). Data

aktivitas penghambatan minyak atsiri buah kemukus dapat dilihat pada tabel 2. Tabel 2. Hasil Diameter Zona Inhibisi Masing-Masing Konsentrasi

Minyak Atsiri

Zat Uji Diameter Zona Inhibisi (DZI) (mm)

Rata-Rata DZI

Minyak Atsiri

Konsentrasi Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3

80% 12 10 11 11

40% 10 10 9 9,5

20% 9 8 8 8,5

10% 8 8 8 8

Kontrol Positif Ciprofloxacin 42 40 39 40,3

Kontrol Negatif N-Heksana 0 0 0 0

Dari tabel 2 dapat dilihat bahwa semakin besar konsentrasi minyak atsiri buah kemukus maka semakin besar juga diameter zona inhibisi dan semakin besar aktivitas penghambatan pertumbuhan bakteri. Semakin besar konsentrasi zat yang terdapat pada cakram kertas akan memperbesar kemampuan difusi zat tersebut pada

media sehingga mempermudah penetrasi zat dalam menghambat pertumbuhan bakteri (Pelczar, 1986).

Menurut CLSI (Clinical and Laboratory Standart Institute) kekuatan

antibakteri dibagi menjadi 3 yaitu susceptible (dapat diterima) jika menghasilkan

diameter zona inhibisi lebih dari 21 mm, intermediate jika memiliki zona hambat

antara 16 mm - 20 mm dan katagori resisten jika diameter zona inhibisi kurang dari 15 mm. Berdasarkan pengkategorian tersebut dalam penilitian ini diperoleh hasil pada konsentrasi 80% minyak atsiri buah kemukus yang merupakan konsentrasi tertinggi dengan rata-rata DZI tertinggi yaitu 11 mm dan masuk kategori resisten.

Aktivitas kerja minyak atsiri dalam menghambat pertumbuhan antibakteri yaitu dengan menghambat enzim topoisomerase II (DNA gyrase). Uji kontrol positif

menggunakan antibiotik Ciprofloxacin dimana Ciprofloxacin merupakan terapi lini

pertama untuk diare basiler.

Ciprofloxacin merupakan antibiotika bakteriosida yang bekerja dengan

menghambat enzim topoisomerase II (DNA gyrase). Pengujian aktivitas antibakteri

terhadap Ciprofloxacin dilakukan dengan konsentrasi 5 μg/ml. Dengan 3 kali

replikasi menunjukan diameter zona inhibisi sebesar 42 mm, 40 mm, dan 39 mm didapatkan hasil rata-rata 40,3 mm.

Selanjutnya untuk melihat signifikansi diantara hasil rata-rata setiap konsentrasi tersebut dilakukan uji normalitas data sebagai syarat pengujian. Dari hasil uji normalitas diketahui bahwa data yang digunakan pada penelitian ini berdistribusi normal ditunjukan dengan nilai P value untuk DZI yaitu 0,689 (p>0,05) dan nilai P

value untuk konsentrasi yaitu 0,538 (p>0,05). Untuk mengetahui pengaruh antara

masing-masing konsentrasi terhadap nilai DZI dilakukan uji one way ANOVA,

diperoleh hasil nilai signifikansi 0,02 (p<0,05) yang berarti terdapat pengaruh yang signifikan antara besar konsentrasi terhadap nilai DZI.

F. Hasil Analisis Uji Penambatan Molekul 1. Visualisasi Sisi Aktif DNA gyrase subunit B

Untuk mengetahui sisi aktif dari protein DNA gyrase subunit B maka

dilakukan visualisasi protein target secara tiga dimensi melalui aplikasi

Discovery Studio Visualizer. Hasil visualisasi ditunjukan pada gambar 9.

Gambar 9. Visualisasi sisi aktif protein DNA gyrase

subunit B (3TTZ) 2. Visualisasi Ligan dengan Marvin Sketch

Ligan yang digunakan untuk sampel uji penambatan molekul adalah senyawa-senyawa seskuiterpen yang memiliki aktivitas antibakteri yang signifikan. Berdasarkan hasil uji aktivitas antibakteri diketahui pada konsentrasi minyak atsiri mulai 10% hingga 80% pertumbuhan bakteri

Shigella flexneri. Pada Analisis GC-MS diketahui bahwa minyak atsiri buah

kemukus memiliki kandungan senyawa seskuiterpen seperti mengandung

alpha-cubebene, copaene, germacrene-D, 1H-cycloprop[e]azulene, dan spathulanol. Dalam uji ini sebagai pembanding digunakan Ciprofloxacin.

Tabel 3. Visualisasi ligan menggunakan Marvin Sketch

Nama Ligan Visualisasi

2-[(3S,4R)-4-{[(3,4-

dichloro-5-methyl-1H- pyrrol-2-

yl)carbonyl]amino}-3-fluoropiperidin-

1-yl]-1,3-thiazole-5-carboxylic acid

Ciprofloxacin

alpha cubebene

copaene

germacrene-D

spathulanol

3. Interaksi Ligan terhadap Protein Target Visualisasi

Hasil penambatanantara ligan dan protein target akan menghasilkan 9 konformasi yang berisi informasi energi dari masing-masing konformasi. Hal yang perlu diperhatikan dalam analisis hasil docking adalah melalui

energi ikatan (binding energy). Konformasi terbaik dapat dilihat melalui

fungsi scoring yang ditunjukan dalam energi ikatan atau binding energy (ΔG) yang memiliki satuan dalam Kkal/mol. Nilai energi ikatan menggambarkan kekuatan ikatan yang terjadi antara ligan dan protein target.

Energi ikatan memiliki hubungan dengan konstanta inhibisi. Semakin kecil nilai konstanta inhibisi maka akan semakin kecil pula energi ikatan. Dari hal itu diketahui bahwa semakin kecil energi ikatan antara konstanta inhibisi, maka interaksi antara ligan dan enzim akan semakin disukai (Prasetia, 2011). Hasil skor penambatan molekul setiap konformasi setiap ligan terhadap protein target dapat dilihat pada lampiran 10. Sedangkan nilai energi ikatan dan konstanta inhibisi terbaik serta interaksi antara masing-masing ligan dengan protein target dapat dilihat pada tabel 4.

Tabel 4. Interaksi Ligan dengan Protein target

Ligan Energi Ikatan

(Kkal/mol)

Protein

1H-cycloprop[e]azulene

-7,3 ILE 86, ILE102, ILE175

Ciprofloxacin -7,1 ASP81, GLU58, PRO87, GLY85,

ARG84, ARG44, THR173

alpha-cubebene -6,7 LEU205

germacrene-D -6,7 ASN54, SER55, VAL79, GLU 58,

ASP54

Copaene -6,4 ILE86, ILE175

2-[(3S,4R)-4-{[(3,4- dichloro-5-methyl-1H- pyrrol-2- yl)carbonyl]amino}-3-fluoropiperidin- 1-yl]-1,3-thiazole-5-carboxylic acid

-6,2 ILE51, ILE 86, ILE 102, ILE175, SER55, ASN54

Spathulanol -6,2 ILE86, PRO87

Berdasarkan tabel 4 senyawa yang memiliki energi ikatan paling tinggi adalah 1H-cycloprop[e]azulene dengan energi ikatan sebesar -7,3

Kkal/mol dan mengikat residu dari protein target yaitu Isoleusin 86 (ILE86), Isoleusin 102(ILE102), Isoleusin 175 (ILE175). Residu ligan asli antara lain Isoleusin 51 (ILE51), Isoleusin 86 (ILE 86), Isoleusin 102 (ILE102), Isoleusin 175 (ILE175), Serin 55 (SER55), Asparginin 54 (ASN54) Residu ligan Ciprofloxacin (kontrol positif) antara lain Aspartic acid ke 81

(ASP81), Glutamic Acid 58 (GLU58), Prolin 58 (PRO87), Glisin 85 (GLY85), Arginin 84 (ARG84), Arginin 144 (ARG144) dan Threonine 173 (THR173). Hasil Visualisasi ditunjukan pada Gambar 10.

(a)

(c) (b)

Gambar 10. Hasil Visualisasi (a) Ligan Asli, (b) Ciprofloxacin dan

G. Pembahasan

Kemukus merupakan salah satu tanaman yang mengandung terpenoid yang merupakan metabolit sekunder pada tanaman yang memiliki efek farmakologis seperti antivirus, antibakteri, antimalaria, antiradang, penghambat sintesis kolesterol dan anti kanker (Nassar & Abdalrahim, 2010). Metode Kirby Bauer digunakan untuk menentukan sensitifitas

bakteri terhadap antibakteri. Dalam penelitian ini digunakan media Mac Conkey dan menggunakan BHI (brain heart infusion) sebagai nutrien.

Penggunaan Mac Conkey sebagai media dipilih karena media ini spesifik untuk bakteri gram negatif. Dalam metode ini digunakan cakram kertas untuk mengaplikasikan agen antibakteri. Cakram kertas yang telah diaplikasikan dengan masing-masing sampel selanjutnya akan menyerap masing-masing konsentrasi larutan uji. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan variasi konsentrasi bertujuan untuk mengetahui perbedaan nilai DZI antar konsentrasi. Nilai DZI dapat diinterpretasikan untuk mengetahui KHM konsentrasi minyak atsiri. KHM berfungsi untuk mengetahui konsentrasi minimal minyak atsiri yang dapat menghambat pertumbuhan Shigella flexneri. Konsentrasi yang digunakan adalah 10%,

20%, 40%, 80%.

Dalam penelitian aktivitas antibakteri ini digunakan kontrol positif

Ciprofloxacin dan kontrol negatif n-heksana. Kontrol positif digunakan

sebagai pembanding aktivitas antibakteri dengan antibiotik yang digunakan masyarakat. Sedangkan kontrol negatif berfungsi untuk mengetahui apakah

pelarut memiliki efek antibakteri atau tidak. Penggunaan Ciprofloxacin

sebagai kontrol positif disamping karena merupakan terapi lini pertama pada pengobatan diare basiler juga dikarenakan ciprofloxacin dan anti

bakteri minyak atsiri buah kemukus memiliki kesamaan mekanisme yaitu menghambat pertumbuhan DNA.

Hasil penelitian membuktikan bahwa masing-masing konsentrasi mulai dari konsentrasi 10% memiliki aktivitas antibakteri. Menurut CLSI menunjukan antibiotik Ciprofloxacin senstitif terhadap bakteri keluarga Enterobacteriaceae apabila memiliki DZI >21 mm. Berdasarkan data yang

didapat diketahui Ciprofloxacin masih sensitif terhadap bakteri Shigella flexnery. Nilai DZI masing-masing konsentrasi masuk kategori resisten

karena memiliki DZI<15mm berdasarkan hal tersebut diketahui bahwa kekuatan penghambatan masing-masing konsentrasi masih lebih rendah dari Ciprofloxacin yang merupakan kontrol positif.

Uji identifikasi dilakukan secera GC-MS analisis GC digunakan kolom AGILENTJ%W DB-1 yang merupakan kolom yang bersifat nonpolar. Fase diam nonpolar digunakan karena sampel yang digunakan adalah minyak atsiri yang bersifat nonpolar. Berdasarkan hasil identifikasi GC-MS ini minyak atsiri buah kemukus mengandung 5 senyawa tertinggi yaitu alpha-cubebene, copaene, germacrene-D, 1H-cycloprop[e]azulene,

dan spathulanol yang merupakan senyawa terpenoid. Mekanisme

molekuler senyawa tersebut diteliti dengan uji in silico menggunakan molecular docking. Aplikasi yang digunakan dalam pengujian in silico

adalah Autodock Vina. Protein yang digunakan adalah DNA gyrase. Ligan

yang digunakan dalam uji adalah alpha-cubebene, copaene, germacrene-D, 1H-cycloprop[e]azulene, dan spathulanol. Berdasarkan uji tersebut

senyawa yang diuji memiliki afinitas terhadap protein target. Senyawa 1H-cycloprop[e]azulene dalam minyak atsiri buah kemukus memiliki afinitas

terbaik dan memiliki aktifitas yang sama dengan antibiotik Ciprofloxacin

yaitu menghambat protein DNA gyrase.Dalam minyak atsiri buah kemukus Piper cubeba L.f., senyawa 1H-cycloprop[e]azulen merupakan salah satu

dari 5 senyawa dengan kelimpahan tertinggi dan juga merupakan senyawa yang paling potensial memiliki aktifitas penghambatan terhadap bakteri

Shigella flexneri dengan nilai energi ikatan -7,3 Kkal/mol. Hal ini

dikarenakan senyawa tersebut memiliki energi ikatan paling tinggi dan memiliki residu yang sama dengan ligan asli yaitu Isoleusin 86 (ILE86), Isoleusin 102 (ILE102), Isoleusin 175 (ILE175).

52 A. Kesimpulan

1. Senyawa penyusun utama minyak atsiri buah kemukus berdasarkan 5 puncak tertinggi Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) yaitu alpha cubebene, copaene, germacrene D, 1H-cycloprop[e]azulene dan spatulanol.

2. Kadar Hambat Minimum minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.)

yang diperlukan untuk menghambat bakteri Shigella flexneri adalah 10%.

Nilai rata-rata DZI (Diameter Zona Inhibisi) yang diperoleh dari masing-masing konsentrasi minyak atsiri buah kemukus (Piper cubeba L.f.) yang

dapat menghambat bakteri Shigella flexneri adalah pada konsentrasi 10%

adalah 8 mm; konsentrasi 20% adalah 8,5 mm; konsentrasi 40% adalah 9,5 mm; konsentrasi 80% adalah 11 mm.

3. Senyawa dominan buah kemukus 1H-cycloprop[e]azulene memiliki

afinitas paling tinggi terhadap protein DNA gyrase pada bakteri Shigella flexneri secara in silico dengan nilai energi ikatan -7,3 kkal /mol.

B. Saran

1. Diperlukan penelitian yang lebih mendalam hingga tahap isolasi sehingga diperoleh isolat yang dapat spesifik menghambat bakteri Shigella flexneri.

2. Diperlukan uji aktivitas antibakteri minyak atsiri buah kemukus terhadap bakteri lain seperti pada jenis bakteri gram positif atau gram negatif lainnya.

54

http://www.merckmanuals.com/professional/infectious-disease/gram-negative_bacilli/shigellosis.html

Castellani, A., Chalmers, A.J. (1919). Manual of Tropical Medicine, 3rd ed.

Williams, Wood and Co., New York. P.937.

CDC. (2011). Shigellosis. Diakses 9 Mei, 2016, from

http://www.cdc.gov/ncezid/dfwed/PDFs/Shigella-Overview-508.pdf Chusin & Lamb, 2005, Antimicrobial activity of flavonoids, International Journal

of Antimicrobial Agents, (26): 343–356.

Crawford Scientific. (2015). Fundamental GC-MS Introduction. CHROMacademy , e-learning for the analytical chemistry community. Diakses 30 Juni 2015.

http://www.chromacademy.com/resolver-november2010_understanding_gcms_part_1.html

Departemen Kesehatan RI. (2008). Farmakope Herbal Indonesia. Edisi 1. Jakarta

Departemen Kesehatan RI. (2008). Pusat Penyuluhan Kesehatan Masyarakat.

Depkes :Jakarta.

Depkes. Laporan riset kesehatan dasar 2010. (2010). Jakarta: Badan Penelitian dan

Pengembangan Kesehatan Kementrian Kesehatan Republik Indonesia.. Dipiro, J.T., Talbert, R.L., Yee, G.C., Matzke, G.R., Wells, B.G., Posey, L.M.

(2008). Pharmacotherapy : A Pathophysiologic Approach. 17th Ed. Mc

Graw Hill p.2038

Douglas, F. (2015). GC/MS analysis. Scientific Testimony, an online journal Ditjen POM. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Cetakan

Pertama. Depkes RI. Jakarta.

Erickson Jon A., Mehran Jalaie, Daniel H. Robertson, Richard A. Lewis, dan Michal Vieth. (2004). Lessons in Molecular Recognition: The Effects of Ligand and Protein Flexibility on Molecular Docking Accuracy. J. Med.

FDA, (2009). Updating Labeling for Susceptibility Test Information in Systemic Antibacterial Drug Products and Antimicrobial Susceptibility Testing Devices. Rockville

Ganiswara, Sulistia G. (1995). Farmakologi dan Terapi edisi 4. Jakarta: Gaya Baru

p.586.

Harborne, J.B., (1987). Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan. Penerbit ITB Bandung. Bandung p.5

Heyne, K. (1987). Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid 2. Badan Litbang

Kehutanan, penerjemah. Jakarta: Yayasan Sarana Wana Jaya. Terjemahan dari: De Nuttige Planten van Indonesie.

Hudzicki, J. (2009). Kirby Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test, [Protocol].

American Society of Microbiology.

Ismail, D., Sutrisno, R., Manginah, P., Retnohastuti. (1997). Pengertian sikap dan Perilaku Masyarakat terhadap Diare. Kumpulan Naskah PITV, BKGAI

(Badan Koordinasi Gastro Internologi Anak Indonesia).

Irianingsih, E. (2004). Uji Aktivitas Antimikroba Minyak Atsiri Buah Kemukus (Piper cubeba, L.f.) terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923, Shigella dysentriae, dan Candida albicans secara in vitro serta pemeriksaan

kandungannya dengan GC-MS. [Skripsi].

Jaghoori M.M., Bleijlevens B., Olabarriaga S.D. 1001 Ways to run AutoDock Vina for virtual screening. J Comput Aided Mol Des (2016) 30:238

Japan Electron Optics Laboratory (JEOL). (2006). Mass Spectrometers: a short explanation fot the absolute novice USA

Juffrie, M., Soenarto S.S.Y, Oswary H, Arief S, Rosalina I, Mulyani N.S. (2010).

Gastroenterohepatologi. Jakarta: Badan Penerbit IDAI., p. 87.

Jawetz, E., Joseph, M., Edward, A., A., Geo, F., B., Janet, S., B., dan Nicholas L., O. (2001). Mikrobiologi Kedokteran. Edisi I. Penerjemah: Mudihardi, E.,

Kuntaman, Waito, E., B., Mertamiasih, M., Harsono, S., Alimsardjono, L. Jakarta: Penerbit Salemba Medika. p. 235.

TRI HANDRIANTO 7

dengan MS selanjutnya diidentifikasi dengan spektra yang berasal dari NIST dan WILEY. Analisis dengan GC-MS dilakukan dengan menginjeksi 1 μL larutan ke dalam tempat injeksi. Uap cuplikan ini kemudian dibawa oleh gas pembawa masuk ke dalam kolom. Kolom akan memisahkan komponen-komponen minyak atsiri sehingga dapat dideteksi oleh detektor dan dihasilkan suatu kromatogram. Identifikasi komponen-komponen senyawa kimia dalam minyak atsiri buah kemukus menggunakan alat GC-MS-QP2010S SHIMADZU menghasilkan 30 puncak kromatogram yang dapat dilihat pada gambar 1.

Gambar 1. Kromatogram Hasil Pemisahan Kromatografi Gas Sampel Minyak Atsiri Buah Kemukus

Sedangkan identifikasi 30 puncak yang terdapat pada gambar 1 tersaji pada tabel 1.

Tabel 1. Identifikasi Senyawa dan Struktur Hasil GC-MS Senyawa Minyak Atsiri Buah Kemukus.

No Puncak

Nama Senyawa

Struktur 1

Alpha.-Thujene

2 Alpha.-pinene

3 Sabinene

4 Beta.-Pinene

5 Alpha.-Phellandrene

6 Sabinene

7 Beta.-Ocimene

8 L.-Linalool

9 Bicyclogermac rene

10 Alpha.-Cubebene

11 Copaene

TRI HANDRIANTO 8 13

Alpha.-Gurjunene

14 Caryophyllene

15 Germacrene-D

16 Alpha cubebene

17 Alpha.-Humulene

18 1H-Cycloprop e azulene

19 Alpha.-amorphene

20 Germacrene-D

21 Myristicin

22 Bicyclo germacrene

23 Spathulenol

24 Delta.-Cadinene

25 Naphtalene

26 Nerolidol

27 Trans-Isodillapiole

28 1H-Cycloprop-e-azulene

29 Alpha.-asarone

30 Naphtalene

Dari 30 puncak yang muncul yang memiliki kelimpahan tertinggi adalah copaene. Analisis kandungan

minyak atsiri buah kemukus pada penelitian ini dilakukan dengan analisis spektra massa yang didasarkan pada ”base peak” (puncak

dasar) dan Similarity Index (SI)

dengan perbandingan spektra dari NIST 62 dan Wiley 299.LIB. Base

peak merupakan puncak yang paling

besar limpahannya dalam spektrum dan diberi harga 100%. Jika nilai SI mendekati 100% maka senyawa yang terdeteksi memiliki tingkat kemiripan dengan data pembanding.

Dari tabel 1 dapat diketahui bahwa minyak atsiri buah kemukus

TRI HANDRIANTO 9

terdiri dari golongan seskuiterpen dan

yang memiliki kelimpahan tertinggi adalah copaene. Senyawa pada

puncak dasar 11 dengan waktu retensi 26,203 menit dan SI=96 mirip dengan senyawa copaene dengan rumus

molekul C15H24, yang merupakan senyawa golongan seskuiterpen.

Hasil Analisis Uji Penambatan Molekul

Visualisasi Sisi Aktif DNA gyrase

subunit B

Untuk mengetahui sisi aktif dari protein DNA gyrase subunit B

maka dilakukan visualisasi protein target secara tiga dimensi melalui aplikasi Discovery Studio Visualizer.

Hasil visualisasi ditunjukan pada gambar 2.

Gambar 2. Visualisasi sisi aktif protein DNA gyrase subunit B

(3TTZ)

Visualisasi Ligan dengan Marvin Sketch

Ligan yang digunakan untuk sampel uji penambatan molekul adalah senyawa seskuiterpen yang memiliki aktivitas antibakteri yang signifikan. Pada hasil analisis GC-MS diketahui bahwa senyawa dengan kelimpahan tertinggi minyak atsiri buah kemukus merupakan senyawa seskuiterpen yaitu copaene. Dalam

uji ini sebagai pembanding digunakan

Ciprofloxacin.

Hasil penambatanantara ligan dan protein target akan menghasilkan 9 konformasi yang berisi informasi energi dari masing-masing konformasi. Hal yang perlu diperhatikan dalam analisis hasil docking adalah melalui energi ikatan

(binding energy). Konformasi terbaik

dapat dilihat melalui fungsi scoring

yang ditunjukan dalam energi ikatan atau binding energy (ΔG) yang

memiliki satuan dalam Kkal/mol. Tabel 2. Interaksi Ligan dengan Protein target.

TRI HANDRIANTO 10

Berdasarkan tabel 2 senyawa yang memiliki energi ikatan paling tinggi adalah copaene dengan energi

ikatan sebesar -6,4 Kkal/mol dan mengikat residu dari protein target yaitu Isoleusin 86 (ILE86), dan Isoleusin 175 (ILE175). Residu ligan asli antara lain Isoleusin 51 (ILE51), Isoleusin 86 (ILE 86), Isoleusin 102 (ILE102), Isoleusin 175 (ILE175), Serin 55 (SER55), Asparginin 54 (ASN54). Residu ligan Ciprofloxacin

(kontrol positif) antara lain Aspartic acid ke 81 (ASP81), Glutamic Acid

58 (GLU58), Prolin 58 (PRO87), Glisin 85 (GLY85), Arginin 84 (ARG84), Arginin 144 (ARG144) dan Threonine 173 (THR173). Hasil Visualisasi ditunjukan pada Gambar 3.

DISKUSI

Kemukus merupakan salah satu tanaman yang mengandung terpenoid yang merupakan metabolit sekunder pada tanaman yang memiliki efek farmakologis seperti antivirus, antibakteri, antimalaria, antiradang, penghambat sintesis kolesterol dan anti kanker (Nassar & Abdalrahim, 2010).

Dalam penelitian aktivitas antibakteri ini digunakan kontrol positif Ciprofloxacin. Kontrol positif

digunakan sebagai pembanding

Ligan Energi

Ikatan (Kkal/mol)

Protein

Ciprofloxacin -7,1 ASP81,

GLU58, PRO87, GLY85, ARG84, ARG44, THR173

Copaene -6,4 ILE86,

ILE175

2-[(3S,4R)-4-{[(3,4- dichloro-5-methyl-1H- pyrrol-2-

yl)carbonyl]amino}-3-fluoropiperidin-

1-yl]-1,3-thiazole-5-carboxylic acid

-6,2 ILE51, ILE 86, ILE 102, ILE175, SER55,

ASN54 _{Gambar 3. Hasil Visualisasi (a) Ligan}

Asli, (b) Ciprofloxacin dan

TRI HANDRIANTO 11

aktivitas antibakteri dengan antibiotik yang digunakan masyarakat. Sedangkan kontrol negatif berfungsi untuk mengetahui apakah pelarut memiliki efek antibakteri atau tidak. Penggunaan Ciprofloxacin sebagai

kontrol positif disamping karena merupakan terapi lini pertama pada pengobatan diare basiler juga dikarenakan ciprofloxacin dan anti

bakteri minyak atsiri buah kemukus memiliki kesamaan mekanisme yaitu menghambat pertumbuhan DNA.

Uji identifikasi dilakukan secera GC-MS analisis GC digunakan kolom AGILENTJ%W DB-1 yang merupakan kolom yang bersifat nonpolar. Fase diam nonpolar digunakan karena sampel yang digunakan adalah minyak atsiri yang bersifat nonpolar. Berdasarkan hasil identifikasi GC-MS ini minyak atsiri buah kemukus mengandung senyawa tertinggi yaitu copaene, yang

merupakan senyawa terpenoid. Mekanisme molekuler senyawa tersebut diteliti dengan uji in silico

menggunakan molecular docking.

Aplikasi yang digunakan dalam pengujian in silico adalah Autodock Vina. Protein yang digunakan adalah

DNA gyrase. Ligan yang digunakan

dalam uji adalah, copaene.

Berdasarkan uji tersebut senyawa yang diuji memiliki afinitas terhadap protein target. Senyawa copaene

dalam minyak atsiri buah kemukus memiliki aktifitas yang sama dengan antibiotik Ciprofloxacin yaitu

menghambat protein DNA gyrase.

Dalam minyak atsiri buah kemukus

Piper cubeba L.f., senyawa copaene

merupakan senyawa dengan kelimpahan tertinggi dan juga merupakan senyawa yang potensial memiliki aktifitas penghambatan terhadap bakteri Shigella flexneri

dengan nilai energi ikatan -6,4 Kkal/mol. Selain dikarenakan senyawa tersebut memiliki energi ikatan yang tinggi dan memiliki residu yang sama dengan ligan asli yaitu Isoleusin 86 (ILE86), dan Isoleusin 175 (ILE175).

KESIMPULAN

Senyawa penyusun utama minyak atsiri buah kemukus berdasarkan puncak tertinggi Gas Chromatography-Mass Spectrometry

(GC-MS) yaitu copaene. Senyawa copaene memiliki afinitas terhadap

protein DNA gyrase pada bakteri

TRI HANDRIANTO 12

dengan nilai energi ikatan -6,4 kkal /mol.

DAFTAR PUSTAKA Sudarsono,Pudjoarinto,A.,

Gunawan,.Wahyuono,S.,

Donatus,I.A., Dradjad,M., Wibowo,S S., Ngatidjan, (1996).

Tumbuhan Obat Hasil

Penelitian,Sifat-Sifat dan

Penggunaannya, Pusat Penelitian

Obat Tradisional, Universitas

Gadjah Mada Yogyakarta

Zein,Umar. (2004). Diare Akut

Disebabkan Bakteri. Diakses

tanggal 26 Oktober 2015, dari http://library.usu.ac.id/download/f k/penydalam-umar5.pdf

Nassar, Z., Abdalrahim, Amin M.S. 2010. The Parmalogical Properties of terpenoid from Sandoricum Koetjape. Journal Medcentral.