Polymorphism of fecundity genes (BMPR1B and BMP15) on Kacang, Samosir and Muara goats.
POLIMORFISME GEN FEKUNDITAS
(BMPR1B DAN BMP15) PADA KAMBING KACANG,
SAMOSIR DAN MUARA
MOCHAMAD SYAIFUL RIJAL HASAN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul “Polimorfisme
Gen Fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada Kambing Kacang, Samosir dan
Muara” adalah benar hasil karya saya sendiri dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan
tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juni 2011
Mochamad Syaiful Rijal Hasan
ABSTRACT
MOCHAMAD SYAIFUL RIJAL HASAN. Polymorphism of fecundity genes
(BMPR1B and BMP15) on Kacang, Samosir and Muara goats. Under supervision
of ACHMAD FARAJALLAH and RADEN RORO DYAH PERWITASARI.
Several Indonesian local goats are prolific. Fecundity was controlled by
fecundity genes such as Bone Morphogenetic Protein Receptor 1B (BMPR1B),
Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) and Growth Differentiation Factor 9
(GDF9). The present study aimed to identify the genetic diversity of fecundity
genes (BMPR1B and BMP15) on three Indonesian local goats, namely Kacang,
Samosir, and Muara, using PCR-RFLP and nucleotide sequencing methods. The
PCR-RFLP’s showed that all sample of three Indonesian local goats are
monomorphic. Verification result by nucleotide sequencing found two
substitution were G72T on BMPR1B gene exon 8 and G43A on BMP15 gene
exon 2. Both of the mutation were not part of recognizing site of restriction
enzymes. Furthermore, the genetic diversity was identified for exon 1 and exon 2
of BMP15. Nucleotide sequence of exon 1 of BMP15 gene was monomorphic
among the three Indonesian local goats. On the other hand, there are three mutant
alleles were found on exon 2 among the three Indonesian local goats. Two mutant
alleles of A325G and C398G were found on Kacang goats population. One
mutant allele was C34T on Muara goats population. The population of Samosir
goats have identically sequence of BMP15 exon 2. The phylogenetic tree based on
coding sequence exon 2 showed that Kacang, Samosir and Muara goats clustered
with several local goats in the world. Moreover, the phylogenetic tree also defined
Kacang, Samosir and Muara goats as monoovulation group.
Keyword : BMPR1B, BMP15, gene, Kacang goat, Samosir goat, Muara goat
RINGKASAN
MOCHAMAD SYAIFUL RIJAL HASAN. Polimorfisme Gen Fekunditas
(BMPR1B dan BMP15) pada Kambing Kacang, Samosir dan Muara. Dibimbing
oleh ACHMAD FARAJALLAH dan RADEN RORO DYAH
PERWITASARI.
Indonesia memiliki potensi keanekaragaman hayati yang tinggi. Salah
satunya adalah kambing lokal. Beberapa kambing lokal di Indonesia memiliki
sifat unggul, antara lain bersifat prolifik. Sifat prolifik ini dikendalikan oleh gen
fekunditas, antara lain Bone Morphogenetic Protein Receptor 1B (BMPR1B),
Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) dan Growth Differentiation Factor 9
(GDF9). Gen BMPR1B yang dikenal sebagai FecB terletak pada kromosom 6 dan
diekspresikan oleh sel oosit dan sel granulosa dalam ovarium. Mutasi pada FecB
yang berkaitan dengan sifat prolifik adalah substitusi A746G yang menyebabkan
substitusi asam amino Q249R. Adapun gen BMP15 yang dikenal sebagai FecX
terletak di kromosom X dan hanya diekspresikan di dalam sel-sel oosit. Beberapa
alel mutan pada gen BMP15 yang berhubungan dengan sifat prolifik adalah FecXI
(Inverdale), FecXH (Hanna), FecXB (Belclare), FecXG (Galway), FecXL (Lacaune)
dan FecXR (Rasa Aragonesa). Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi
keragaman genetik gen fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada kambing Kacang,
Samosir dan Muara menggunakan metode PCR-RFLP dan sekuensing nukleotida.
Penelitian ini dibagi menjadi dua tahap. Tahap pertama, PCR-RFLP gen
BMPR1B ekson 8 dengan menggunakan enzim AvaII dan gen BMP15 ekson 2
dengan menggunakan enzim HinfI. Tahap kedua, sekuensing nukleotida gen
BMP15 ekson 1 dan 2.
Hasil PCR-RFLP, baik gen BMPR1B maupun gen BMP15 menunjukkan
bahwa semua sampel dari kambing Kacang, Samosir dan Muara merupakan tipe
liar atau non-prolifik dan bersifat monomorfik. Hal ini tidak sesuai dengan data
lapangan bahwa beberapa sampel yang diperoleh mempunyai jumlah anak
sekelahiran lebih dari satu. Hasil ini mengindikasikan bahwa metode PCR-RFLP
gen BMPR1B dan BMP15 tidak dapat dijadikan sebagai alat deteksi pada kambing
Kacang, Samosir dan Muara. Hasil verifikasi dengan metode sekuensing
menggunakan primer yang sama menunjukkan bahwa mutasi G72T pada gen
BMPR1B dan mutasi G43A pada gen BMP15 bukan bagian dari situs pengenalan
dari enzim restriksi yang digunakan.
Hasil sekuensing nukleotida ruas ekson 1 gen BMP15 tidak menunjukkan
polimorfisme antar ketiga kambing lokal Indonesia, tetapi beberapa situs
ditemukan berbeda dengan kambing-kambing lainnya. Adapun hasil sekuensing
nukleotida pada daerah ekson 2-nya ditemukan 3 varian nukleotida antar ketiga
kambing lokal Indonesia. Populasi kambing Kacang memiliki dua alel mutan
yaitu A325G dan C398G. Populasi kambing Muara menunjukkan satu alel mutan
yaitu C34T, sedangkan populasi kambing Samosir bersifat monomorf.
Pohon filogeni berdasarkan coding sequence ekson 2 menunjukkan bahwa
ketiga kambing lokal Indonesia berada dalam satu kelompok dengan kambingkambing lokal di dunia. Selain itu, pohon filogeni juga menempatkan kambing
dalam kelompok hewan yang bersifat monoovulasi. Dari hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa kondisi prolifik dikendalikan secara aditif dan pleitropik.
Selain itu, diduga ada peranan gen-gen yang lain yang mengatur sifat prolifik pada
kambing.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2011
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB yang wajar
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya Tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
POLIMORFISME GEN FEKUNDITAS
(BMPR1B DAN BMP15) PADA KAMBING KACANG,
SAMOSIR DAN MUARA
MOCHAMAD SYAIFUL RIJAL HASAN
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biosains Hewan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof. Drh. Arief Boediono PhD.
Judul Tesis
: Polimorfisme Gen Fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada
Kambing Kacang, Samosir dan Muara
Nama
: Mochamad Syaiful Rijal Hasan
NRP
: G352090161
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si
Ketua
Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi
Biosains Hewan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Bambang Suryobroto
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr
Tanggal Ujian : 11 Juli 2011
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Buku ini berisi hasil penelitian yang berjudul Polimorfisme Gen
Fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada kambing Kacang, Samosir dan Muara
sebagai prasyarat untuk memperoleh gelar Magister Sains dari Mayor Biosains
Hewan, Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih atas segala bimbingan dan saran
dalam menyelesaikan penelitian ini kepada Bapak Dr. Achmad Farajallah dan Ibu
Dr. R.R. Dyah Perwitasari selaku Dosen Pembimbing. Ucapan Terima kasih
penulis sampaikan kepada Prof. Drh. Arief Boediono PhD. selaku Penguji Luar
Komisi atas saran dan arahannya. Penulis juga menyampaikan terima kasih
kepada Departemen Agama Republik Indonesia atas Program Beasiswa Utusan
Daerah (BUD) pada Sekolah Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor. Ucapan
terimakasih juga penulis sampaikan atas sebagian bantuan dana penelitian dari
kegiatan Kerjasama Kemitraan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi
(KKP3T) tahun 2010 dengan judul “Identifikasi Tiga Gen Fekunditas pada Empat
Jenis Kambing Lokal (Kacang, Peranakan Etawah, Samosir dan Muara)”.
Penulis menyampaikan terima kasih kepada Pimpinan dan Karyawan
Lokalit Kambing Potong Sei putih, Medan serta beberapa pemilik kambing di
Kabupaten Tapanuli Utara dan Kabupaten Samosir. Terima kasih juga kepada zoo
corner community, Dr. Aron Batu Bara, Wildan Najmal Muttaqin M.Si dan Eryk
Andreas M.Pt serta semua teman-teman atas kekeluargaannya.
Ungkapan terima kasih yang tiada tara penulis persembahkan kepada Aba,
Ummi dan Cak Lutfi atas dukungan do’a dan curahan kasih sayangnya. Ungkapan
cinta pada istri dan putraku (Alkhoiriyatur Raudiatul Jannah “DIAH” dan Sayyid
Husein Ahmadinejad “ZEN”) atas kesetiaan, ketulusan dan kesabarannya dalam
mengobarkan semangat tuk terus melangkah dalam susah dan senang menatap
masa depan. Akhirnya tiada gading yang tak retak. Semoga karya ilmiah ini
bermanfaat.
Bogor, Juni 2011
Mochamad Syaiful Rijal Hasan
RIWAYAT HIDUP
Penulis adalah putra kedua dari dua bersaudara dari pasangan H.M. Hasan
Abdus Syafik dan Hj. Siti Rohmah Eja Rahmawati. Penulis lahir di Jember-Jawa
Timur pada 02 Februari 1981. Penulis lulus dari SMUN Kalisat pada tahun 1998,
kemudian melanjutkan pendidikan pada jenjang sarjana di Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Jurusan Biologi, Universitas Negeri
Jember tahun 1999. Pada tahun 2004 penulis dapat menyelesaikan studi S1.
Penulis bekerja sebagai guru swasta yang memegang mata pelajaran
biologi di Madrasah Aliyah Al Badri di Jember hingga saat ini. Pada tahun 2009,
Alhamdulillah penulis mendapat kesempatan memperoleh beasiswa utusan daerah
di Sekolah Pascasarjana Program Studi BioSains Hewan, Institut Pertanian Bogor
dari Departemen Agama Republik Indonesia.
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL………………………………………......….………..
Halaman
xvi
DAFTAR GAMBAR………………………………………………........
xvii
DAFTAR LAMPIRAN……………….…………………………….…...
xvii
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang………………………..………………….………
Tujuan Penelitian……………………………………....………...
Manfaat Penelitian………………………………..…..……...…..
1
4
4
2 GEN FEKUNDITAS (BMPR1B DAN BMP15) PADA
TIGA KAMBING LOKAL INDONESIA
PENDAHULUAN……………………………………...………
BAHAN DAN METODE..............................................................
Waktu dan Tempat………………………………….....……
Pengambilan Sampel Darah Kambing…………………….….
Ekstraksi DNA……………………..………………………....
Amplifikasi Gen BMPR1B dan BMP15…………………...…
Analisis Gen BMPR1B dan BMP15
Menggunakan PCR-RFLP dan Sekuensing…………………
HASIL…………………………………………………….……..
PEMBAHASAN………………………………………………...
SIMPULAN………………………………….……………….....
3
5
6
6
6
7
7
8
9
10
12
POLIMORFISME GEN BMP15 PADA KAMBING KACANG,
SAMOSIR DAN MUARA
PENDAHULUAN…………………………………………….…
BAHAN DAN METODE..............................................................
Sampel DNA dan Amplifikasi Gen BMP15……………..……
Penentuan Genotip dengan Metode Sekuensing…………...
HASIL……………………………………………………………
PEMBAHASAN………………………………...……………….
SIMPULAN……………………………………………………...
13
14
14
14
15
17
19
4
PEMBAHASAN UMUM…………………………………….……..
21
5
SIMPULAN DAN SARAN………………………..………..….…...
25
DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………....
27
LAMPIRAN……………………………………………………………..
33
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Penampilan Tiga Kambing Lokal Indonesia………………………………….
2
2
Amplikon gen BMPR1B……………...…………….……….........…............
9
3
Amplikon gen BMP15 ekson 2…………………………………………….....
9
4 Mutasi substitusi G→T gen BMPRIB nukleotida ke-72
pada kambing Kacang, Samosir dan Muara…………………………..….
10
5 Mutasi substitusi G→A gen BMP15 nukleotida ke-43
pada kambing Kacang, Samosir dan Muara .……………………..…………..
10
6
15
Amplikon gen BMP15 ekson 1 dan 2 pada kambing Kacang………………
7 Mutasi substitusi gen BMP15 pada kambing Kacang ……………….....
16
8 Mutasi substitusi C34T pada kambing Muara ……………………...…
16
9
Pohon filogeni kambing lokal Indonesia berdasarkan daerah
coding sequence gen BMP15 ekson 2 menggunakan program MEGA 4 dengan
metode Neighbour-joining dengan bootstrap 1000x. Angka di percabangan
menunjukkan nilai bootstrap……....................................................……..……
17
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Jumlah sampel darah kambing………………………………...……......
7
2 Alel mutan pada gen BMP15……………….………….…………………….
18
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Informasi sekuens gen BMP15 pada Capra hircus
breed Guizhou White…………………………………………………..
33
2 Beberapa spesies yang digunakan dalam analisis pohon filogeni gen
BMP15 ekson 2…………………………………………………………
35
3 Hasil pensejajaran coding sequence Ekson 2 Gen BMP15 kambing
lokal Indonesia terhadap beberapa spesies Mamalia, burung dan ikan
(No. merujuk pada nama spesies yang ada di lampiran 2). Nomor tiga
baris di bagian atas dibaca secara vertikal).………….………… ……...
36
.
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia memiliki sumber daya alam dengan keragaman genetik yang
melimpah. Salah satu diantaranya adalah ternak kambing lokal Indonesia yang
telah beradaptasi dengan kondisi geografis setempat. Kambing di Indonesia
merupakan ternak ruminansia kecil dengan jumlah paling tinggi di Asia Tenggara
(Sodiq & Taufik 2003).
Beberapa kambing lokal Indonesia seperti kambing Kacang, Samosir dan
Muara memiliki keunggulan karena bersifat prolifik (Gambar 1). Kambing
Kacang merupakan kambing asli Indonesia. Kambing Kacang merupakan
kambing penghasil daging dengan rata-rata litter size 1.56–1.98 anak per
kelahiran (Hoda 2008). Kambing Kacang memiliki ukuran tubuh sedang dengan
corak warna yang sangat beragam mulai dari putih, hitam, coklat ataupun
kombinasi dari ketiga warna tersebut. Kambing Samosir dipelihara oleh penduduk
di Pulau Samosir, Kabupaten Toba Samosir dan sering digunakan sebagai bahan
upacara persembahan salah satu aliran kepercayaan (Parmalim). Kambing
Samosir memiliki ciri khas berupa warna bulu dominan putih dengan ukuran
tubuh sedang. Adapun kambing Muara telah lama beradaptasi di Kecamatan
Muara Kabupaten Tapanuli Utara dengan kondisi topografi yang bergununggunung. Ciri khas Kambing Muara adalah ukuran tubuhnya paling besar diantara
kambing Kacang maupun kambing Samosir. Kambing Muara memiliki corak
warna yang bervariasi seperti pada kambing Kacang.
Sifat prolifik yaitu kemampuan mempunyai anak lebih dari satu dalam
satu kali kelahiran. Sifat prolifik pada ternak ruminansia dapat dibedakan menjadi
dua kelompok, yaitu monozigot dan multizigot. Kelompok monozigot
mengovulasikan satu oosit, kemudian embrio muda yang terbentuk membelah
menjadi dua atau lebih embrio yang mampu hidup. Kelompok ini akan
menghasilkan anak kembar identik. Kelompok multizigot mengovulasikan lebih
dari satu oosit dalam suatu waktu. Apabila ada beberapa oosit yang berhasil
dibuahi maka ternak akan melahirkan lebih dari satu anak dalam satu kali periode
kelahiran.
2
Gambar 1 Penampilan Tiga Kambing Lokal Indonesia.
Salah satu tahapan penting dalam sistem reproduksi adalah proses
pematangan folikel hingga siap untuk diovulasikan yang dikenal dengan
oogenesis. Folikel adalah oosit yang dilapisi oleh dua jenis sel somatik, yaitu sel
granulosa dan sel theka. Tahap perkembangan folikel meliputi primordial, primer,
sekunder, awal tersier (antral atau Graafian), akhir tersier dan pre ovulasi.
Rangkaian proses oogenesis melibatkan beragam sinyal baik berupa
hormon maupun faktor. Hormon merupakan sinyal molekul yang dihasilkan oleh
sel endokrin dan didistribusikan melalui aliran darah menuju sel target atau ke
seluruh tubuh. Beberapa hormon yang berperan dalam proses oogenesis antara
lain Follicle Stimulating Hormone (FSH), estrogen, luteinizing Hormone (LH) dan
progesteron. Hormon FSH berfungsi untuk merangsang pertumbuhan sel-sel
folikel di sekeliling ovum. Folikel primordial akan tumbuh menjadi folikel de
Graaf. Folikel de Graaf akan menghasilkan hormon estrogen yang berfungsi
merangsang kelenjar hipofisis untuk mensekresikan hormon LH. Hormon LH
akan merangsang terjadinya ovulasi. Sisa folikel dari proses ovulasi akan
membentuk korpus luteum yang selanjutnya menghasilkan progesteron. Hormon
3
progesteron berperan dalam menghambat kelenjar hipofisis untuk mensekresikan
FSH dan LH.
Faktor merupakan suatu sinyal molekular yang dihasilkan oleh suatu sel
untuk merangsang kerja dari sel lain di sekitarnya. Faktor diedarkan melalui difusi
cairan matriks ekstra selular. Faktor dikelompokkan sebagai sinyal parakrin. Salah
satu contoh sinyal parakrin yang berperan dalam proses oogenesis adalah anggota
super famili Transforming Growth Factor β (TGF β), diantaranya Bone
Morphogenetic Protein Receptor 1B (BMPR1B) dan Bone Morphogenetic Protein
15 (BMP15). BMP15 merupakan suatu faktor pertumbuhan yang berfungsi dalam
mengatur proliferasi dan diferensiasi sel granulosa di awal perkembangan folikel
(Otsuka et al. 2000). BMPR1B merupakan reseptor bagi beberapa faktor BMP
termasuk BMP15 (ten Dijke et al. 2003).
Sifat prolifik dikendalikan oleh gen-gen yang dikelompokkan sebagai gen
kesuburan (fecundity genes) (Davis 2004). Gen BMPR1B atau activin-like kinase
6 (ALK 6) dikenal sebagai FecB. Gen BMPR1B terletak pada kromosom 6 yang
diekspresikan oleh sel oosit dan sel granulosa. Mutasi substitusi A746G atau pada
tingkat asam amino mutasi Q249R pada FecB akan meningkatkan laju ovulasi
rata-rata 1.5 dan rataan litter size 1.0 pada heterozigot carrier. Mutasi yang sama
pada homozigot carrier akan meningkatkan laju ovulasi rata-rata 3.0 dengan
rataan litter size 1.5 (Mulsant et al. 2001; Souza et al. 2001; Wilson et al. 2001;
Davis 2005).
Gen BMP15 atau GDF9B dikenal sebagai FecX terletak di kromosom X
dan diekspresikan oleh sel oosit. Mutasi pada gen BMP15 pertama kali dilaporkan
oleh Galloway et al. (2000). Mutasi pada FecX berkorelasi dengan peningkatan
laju ovulasi dan litter size pada genotip heterozigot carrier, sedangkan pada
genotip homozigot carrier dapat menyebabkan sifat steril. Ada enam alel mutan
yang sudah diketahui pada gen BMP15 yaitu FecXI (Inverdale), FecXH (Hanna),
FecXB (Belclare), FecXG (Galway), FecXL (Lacaune) dan FecXR (Rasa Aragonesa)
(Galloway et al. 2000; Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007; Martinez-Royo et
al. 2008). Mutasi substitusi Q239Ter pada gen BMP15 yang berkorelasi dengan
sifat prolifik adalah FecXG. Situs mutan tersebut ternyata bisa dikenali sebagai
situs restriksi enzim HinfI. Dengan begitu, deteksi dini terhadap sifat prolifik
4
kemudian dikembangkan oleh Hanrahan et al. (2004) pada domba menggunakan
teknik PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length
Polymorphism).
Metode PCR-RFLP merupakan metode untuk mendeteksi ada tidaknya
mutasi pada situs pemotongan yang khas suatu enzim restriksi. Pada beberapa
populasi ternak, PCR-RFLP terbukti sebagai metode deteksi mutasi substitusi
yang cepat dan akurat. Pemanfaatan teknik PCR-RFLP dapat digunakan untuk
meningkatkan produktivitas hewan ternak melalui skrining dan pendeteksian hasil
persilangan (Pardhesi et al. 2005). Apabila mutasi substitusi tidak terjadi pada
situs pemotongan suatu enzim restriksi, maka metode pendeteksiannya bisa
dilakukan dengan metode SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
ataupun perunutan nukleotida (DNA sequencing). Metode sekuensing DNA lebih
akurat dalam mendeteksi kejadian mutasi tetapi relatif mahal dan membutuhkan
waktu yang lama.
Tujuan penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen fekunditas
(BMPR1B dan BMP15) pada tiga kambing lokal Indonesia, yaitu kambing
Kacang, Samosir dan Muara dengan menggunakan metode PCR-RFLP dan
sekuensing.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini dapat dimanfaatkan sebagai informasi awal tentang
keragaman genetik gen fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada tiga kambing
lokal Indonesia yaitu kambing Kacang, Samosir dan Muara.
Hasil yang
diharapkan adalah apabila metode deteksi cepat PCR-RFLP ditemukan
berkorelasi dengan sifat prolifik, maka hasilnya dapat digunakan sebagai metode
deteksi dini sifat prolifik.
5
GEN FEKUNDITAS (BMPR1B DAN BMP15) PADA
TIGA KAMBING LOKAL INDONESIA
PENDAHULUAN
Sifat prolifik adalah kemampuan untuk melahirkan lebih dari satu anak
sekaligus dalam satu kali periode kelahiran. Sifat prolifik dikendalikan oleh gengen yang dikelompokkan sebagai gen kesuburan (fecundity genes). Ada tiga jenis
gen Fec yang sudah diidentifikasi pada ruminansia kecil, yaitu Bone
Morphogenetic Protein Receptor type 1B (BMPR1B), Growth Differentiation
Factor 9 (GDF9) dan Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) (Galloway et al.
2000; Souza et al. 2001; Hanrahan et al. 2004).
Gen BMPR1B atau activin-like kinase 6 (ALK 6) dikenal sebagai FecB.
Gen BMPR1B terletak pada kromosom 6 yang diekspresikan oleh sel oosit dan
sel-sel granulosa. Mutasi pada FecB terjadi karena substitusi A746G pada cDNA
yang menyebabkan substitusi asam amino Q249R (Mulsant et al. 2001; Souza et
al. 2001; Wilson et al. 2001). Mutan heterozigot carrier akan mengalami
peningkatan laju ovulasi rata-rata 1.5 dengan rataan litter size 1.0. Sedangkan
mutan homozigot carrier akan mengalami peningkatan yang lebih tinggi yaitu
laju ovulasinya rata-rata 3.0 dengan rataan litter size 1.5 (Davis 2005).
Gen BMP15 atau FecX terletak di kromosom X dan diekspresikan oleh sel
oosit. Anggota super famili Transforming Growth Factor β (TGF β) ini disebut
BMP15 karena secara struktural dapat dikelompokkan ke dalam anggota BMP
(Dube et al. 1998). Selain itu, BMP15 juga dikenal sebagai GDF9B karena
kemiripannya dengan GDF9 (Laitinen et al. 1999). Mutasi pada FecX berkorelasi
dengan peningkatan laju ovulasi dan litter size pada genotip heterozigot carrier,
sedangkan pada genotip homozigot carrier dapat menyebabkan sifat steril. Ada
lima alel akibat mutasi titik (single substitution) pada FecX yang telah ditemukan,
yaitu FecXI (Inverdale), FecXH (Hanna), FecXB (Belclare), FecXG (Galway) dan
FecXL (Lacaune) (Galloway et al. 2000; Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007).
Selain itu, ada satu alel yang disebabkan oleh mutasi delesi 17 pb yang disebut
FecXR (Rasa Aragonesa) (Martinez-Royo et al. 2008).
Metode PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment
Length Polymorphism) merupakan metode deteksi mutasi yang cepat dan akurat
6
dalam skala massal. Metode PCR-RFLP memanfaatkan adanya situs pemotongan
yang khas dari suatu enzim restriksi untuk mendeteksi terjadinya mutasi pada
suatu fragmen DNA. Metode sekuensing DNA menghasilkan data yang lebih
akurat karena berdasarkan perunutan nukleotida. Metode sekuensing relatif mahal
dan membutuhkan waktu yang lama.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi keragaman genetik
gen fekunditas (BMPR1B dan BMP15). Populasi ternak yang diteliti adalah tiga
kambing lokal Indonesia meliputi kambing Samosir, kambing Muara dan kambing
Kacang dengan metode PCR-RFLP dan sekuensing.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Mei 2010 sampai dengan Januari
2011 di Laboratorium bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Pengambilan Sampel Darah Kambing
Sampel darah kambing Kacang yang digunakan adalah koleksi Loka
Penelitian Kambing Potong Sei Putih, Sumatera Utara. Berdasarkan catatan yang
tersedia, dari total 25 ekor kambing, 14 ekor bersifat prolifik atau setidaknya
pernah melahirkan anak lebih dari satu per kelahiran, sedangkan 11 ekor yang lain
selalu beranak tunggal (Tabel 1). Kambing Samosir diambil dari peternakan
rakyat di Kabupaten Samosir (60 ekor) dan Kambing Muara di peternakan rakyat
di Kabupaten Tapanuli Utara, Provinsi Sumatera Utara (35 ekor). Pembagian sifat
prolifik atau tidaknya didasarkan pada wawancara terhadap pemilik kambing.
Sampel darah diambil dari vena jugularis menggunakan jarum venoject
yang dihubungkan dengan tabung vakum sekitar 2 ml dari setiap ekor kambing.
Darah yang diperoleh langsung diawetkan dalam alkohol absolut 2x volume
darah.
7
Tabel 1 Jumlah sampel darah kambing
Jenis Kambing
Prolifik
Non Prolifik + Unknown
Kacang
14
11
Samosir
24
36
Muara
9
26
Jumlah
25
60
35
Total
47
73
120
Prolifik: jumlah anak 2-5, Non prolifik: jumlah anak 1, unknown: tidak diketahui
Ekstraksi DNA
Ekstraksi genom DNA dilakukan menggunakan Genomic DNA Mini Kit
for Fresh Blood (GeneAid) yang dimodifikasi untuk sampel darah yang diawetkan
dalam alkohol. Modifikasi yang dilakukan bertujuan untuk menghilangkan
alkohol sebelum dilakukan proses ekstraksi DNA. Sampel darah dalam alkohol
sebanyak 1mL disentrifugasi 2000 g selama 5 menit. Endapan sel dicuci dengan
menambahkan akuades steril hingga volume total 1.5 mL dan didiamkan selama
20 menit. Pencucian ini dilakukan sebanyak dua kali. Sel-sel darah yang telah
bersih dari alkohol disuspensikan dengan bufer pelisis 100 µL, kemudian
ditambahkan enzim Proteinase K 0.01-0.5 µg/mL dan diinkubasi pada suhu 60 0C
selama 30 menit. Pemisahan bahan organik non-DNA dan pemurnian molekul
DNA dilakukan sesuai dengan prosedur dari Genomic DNA Mini Kit.
Amplifikasi Gen BMPR1B dan BMP15
Ruas ekson 8 gen BMPR1B dan ekson 2 gen BMP15 diamplifikasi dengan
mesin TaKaRa Thermal Cycler dalam reaksi PCR 12 µL. Komposisi pereaksi
terdiri atas sampel DNA sekitar 10 ng, primer forward dan reverse masing-masing
0.5 µL 25 mM, dan KAPA Taq Ready Mix DNA polymerase 6 µL (KAPATaq
DNA polymerase 0.05 U/µL, bufer polimerase dengan Mg2+.25 mM dan setiap
dNTP masing-masing 0.4 mM). Kondisi PCR, yaitu predenaturasi 94 0C selama 5
menit, (denaturasi 94 0C selama 60 detik, penempelan primer 58 0C selama 90
detik, pemanjangan 72 0C 90 detik) sebanyak 30 siklus, pemanjangan akhir pada
suhu 72 0C selama 10 menit, dan penyimpanan dilakukan pada suhu 4 0C.
Amplikon dimigrasikan pada elektroforesis gel poliakrilamida 6% dengan
8
menggunakan penanda DNA Ladder 100 pb (Generay Biotech), kemudian
dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Byun et al. 2009).
Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi ruas ekson 8 dari gen
BMPR1B adalah primer forward AF84 5’-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG
dan primer reverse AF85 5’-GATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC yang
akan menghasilkan produk PCR sebesar 137 pb (Wilson et al. 2001). Primer yang
digunakan untuk mengamplifikasi ruas ekson 2 gen BMP15 adalah primer
forward AF86 5’-CTTCTTGTTACTGTATTTCAATGAGAC dan primer reverse
AF87 5’-GATGCAATACTGCCTGCTTG yang akan menghasilkan produk PCR
sebesar 135 pb (Hanrahan et al. 2004).
Analisis Gen BMPR1B dan BMP15
Menggunakan PCR-RFLP dan Sekuensing
Amplikon gen BMPR1B dipotong dengan enzim AvaII (G/GACC)
(Boehringer Mannheim, GmbH-Germany). Sebanyak 3 µL amplikon direaksikan
dengan enzim restriksi AvaII 7.5 U pada suhu 37 0C yang diinapkan semalaman.
Amplikon yang tidak terpotong disebut dengan tipe liar. Hewan tipe liar tidak
memiliki situs pemotongan sehingga panjang fragmen DNAnya tetap 137 pb.
Amplikon yang terpotong akan memiliki panjang fragmen DNA 109 pb dan 28 pb
disebut mutan homozigot carrier. Amplikon yang terpotong dan memiliki tiga
jenis fragmen DNA yaitu 137 pb, 109 pb dan 28 pb disebut mutan heterozigot
carrier.
Amplikon gen BMP15 dipotong dengan enzim Hinf I (G/ACT)
(Boehringer Mannheim, GmbH-Germany). Amplikon sebanyak 3 µL ditambah
enzim HinfI 7.5 U. Suspensi diinkubasi semalam pada suhu 37 0C. Amplikon
yang terpotong menjadi dua fragmen DNA masing-masing 110 pb dan 25 pb
disebut dengan hewan tipe liar. Amplikon yang tidak terpotong mempunyai
panjang fragmen DNA 135 pb disebut mutan FecXG .
Hasil PCR-RFLP kemudian diverifikasi dengan metode sekuensing.
Seluruh amplikon gen BMPR1B dicampur menjadi satu. Hal ini juga dilakukan
pada semua amplikon gen BMP15. Campuran amplikon dibagi menjadi dua
kelompok besar yaitu A (gen BMPR1B) dan B (gen BMP15). Sekuensing
9
dilakukan pada campuran amplikon A dan B menggunakan primer yang sama
dengan amplifikasi awal.
HASIL
Amplifikasi gen BMPR1B menggunakan primer AF84 dan AF85
menghasilkan fragmen DNA dengan panjang 137 pb (Gambar 2A). Hasil
pemotongan enzim AvaII (G/GACC) pada semua sampel memperlihatkan satu
pola yang sama, yaitu amplikon tidak terpotong (Gambar 2B).
1 2 3 4 5 6 M
1 2 3 4 5 6 M
2oo pb
2oo pb
137 pb
137 bp
1oo pb
1oo pb
A
B
Gambar 2 Amplikon gen BMPR1B (A) Amplikon awal (B) Amplikon setelah
dipotong dengan Ava II (M) Marker 100 pb (1-6) Kambing Muara.
Amplifikasi gen BMP15 menggunakan primer AF86 dan AF87
menghasilkan fragmen DNA dengan panjang 135 pb (Gambar 3A). Hasil
pemotongan dengan enzim HinfI (G/ACT) memperlihatkan bahwa semua sampel
terpotong menjadi 110 pb dan 25 pb (Gambar 3B).
1 2 3 4 5 6 M
1 2 3 4 5 6 M
2oo pb
2oo pb
135 pb
110 pb
100 pb
1oo pb
A
B
Gambar 3 Amplikon gen BMP15 ekson 2 (A) Amplikon awal (B) Amplikon
setelah dipotong dengan HinfI (M) Marker 100 pb (1-6) Kambing
Kacang.
Hasil analisis gen BMPR1B dan BMP15 berdasarkan PCR-RFLP pada kambing
Kacang, Samosir dan Muara ini kemudian diverifikasi dengan sekuensing. Hasil
10
sekuensing pada gen BMPR1B dari ketiga kambing lokal Indonesia menunjukkan
adanya mutasi substitusi G→T pada posisi basa nukleotida ke-72 (Gambar 4).
Pada hasil sekuensing nukleotida pada gen BMP15 ditemukan mutasi substitusi
G→A pada posisi basa nukleotida ke-43 (Gambar 5).
Gambar 4 Mutasi substitusi G→T gen BMPRIB nukleotida ke-72 pada kambing
Kacang, Samosir dan Muara.
Gambar 5 Mutasi substitusi G→A gen BMP15 nukleotida ke-43 pada kambing
Kacang, Samosir dan Muara.
PEMBAHASAN
Salah satu faktor yang menentukan keberhasilan metode PCR-RFLP
adalah kerja enzim restriksi yang maksimal. Satu unit enzim restriksi adalah
kemampuan untuk memotong substrat DNA sebanyak 1 μg dalam 50 μL reaksi
selama 60 menit. Pada penelitian ini, PCR-RFLP dilakukan dengan menggunakan
enzim restriksi yang cukup tinggi yaitu 7.5 U dan waktu yang cukup lama yaitu
diinkubasi selama semalam. Hal ini untuk menjamin bahwa semua amplikon
dapat terpotong dengan sempurna. Oleh karena itu, kondisi amplikon gen
BMPR1B yang tidak terpotong bukan disebabkan enzim restriksi tidak bekerja
dengan baik, tetapi disebabkan amplikon tidak memiliki situs pemotongan enzim
AvaII (G/GACC).
11
Hasil PCR-RFLP gen BMPR1B dan BMP15 pada kambing Kacang,
Samosir dan Muara menyimpulkan bahwa ketiga kambing lokal Indonesia
merupakan tipe liar. Ternak dengan genotip tipe liar bersifat non prolifik (Wilson
et al. 2001; Hanrahan et al. 2004). Hal ini berlawanan dengan fakta bahwa
beberapa sampel yang diperoleh di lapangan dari ketiga kambing lokal Indonesia
ini bersifat prolifik. Oleh karena itu, metode PCR-RFLP terhadap gen BMPR1B
dan BMP15 tidak dapat digunakan sebagai alat untuk mendeteksi sifat prolifik
pada ketiga kambing lokal Indonesia. Selain pada kambing Indonesia, metode
PCR-RFLP juga tidak bisa digunakan untuk mendeteksi sifat prolifik berdasarkan
gen BMPR1B dan BMP15 kambing lokal Iran (Deldar-Tajangookeh et al. 2009),
enam jenis kambing China, yaitu Boer, persilangan Boer x Huanghuai (BH),
Huanghuai, Haimen, Nubi dan Matou (Hua et al. 2008). Selain pada kambing,
metode
deteksi
sifat
prolifik
menggunakan
metode
PCR-RFLP
yang
dikembangkan oleh (Davis et al. 2002; Hanrahan et al. 2004), ternyata tidak bisa
bekerja dengan baik pada domba Sangsari Iran (Kasiriyan et al. 2009), 19 domba
prolifik dari berbagai negara (Davis et al. 2006), domba Shal (Ghaffari et al.
2009), lima jenis domba Mesir, yaitu Rahmani, Ossimi, Awassi, Barki dan
persilangan Awassi x Barki (EL-Hanafy & El-Saadani 2009), dan lima jenis
domba Mediterania dan Afrika Utara, yaitu Barbarine, Queue Fine de L’ Quest
(Tunisia), Noire de Thibar (Tunisia/Perancis), Sicilo-Sarde (Italia) dan D’man
(Maroko) (Vacca et al. 2010). Selain itu, Chu et al. (2010) mengungkapkan
bahwa polimorfisme gen BMPR1B pada kambing Jining Grey tidak berkorelasi
dengan sifat prolifik. Polley et al. (2009) menyatakan bahwa pada kambing Black
Bengal India, gen BMP15 adalah monomorfik, sedangkan polimorfisme pada gen
BMPR1B ditemukan berkorelasi dengan sifat prolifik.
Beberapa kejadian yang paralel dengan hasil PCR-RFLP gen BMPR1B
dan BMP15 yang monomorfik pada tiga kambing lokal Indonesia menunjukkan
bahwa SNP (single nucleotide polymorphisme) yang dijadikan dasar untuk
membuat metode PCR-RFLP hanya berlaku pada satu bangsa ternak saja. Hal ini
berarti analisis korelasi yang telah dibuat (Davis et al. 2002; Hanrahan et al. 2004)
hanya berlaku untuk satu bangsa ternak saja. Walaupun begitu, penetapan sifat
prolifik dalam penelitian ini adalah berbasis jumlah anak yang dilahirkan. Adapun
12
gen BMP1RB dan BMP15 bekerja pada sel granulosa (Dube et al.1998; Mulsant et
al. 2001) sehingga ada peluang kambing Kacang, Samosir dan Muara memiliki
lebih dari satu oosit yang diovulasikan.
SIMPULAN
Hasil PCR-RFLP gen BMPR1B dan BMP15 pada kambing Kacang,
Samosir dan Muara menunjukkan bahwa semua sampel merupakan tipe liar. Hasil
sekuensing pada kambing Kacang, Samosir dan Muara menunjukkan mutasi
substitusi G72T pada gen BMPR1B dan mutasi substitusi G43A pada gen BMP15.
Kedua mutasi ini tidak berkaitan dengan situs restriksi pada enzim AvaII dan
HinfI.
13
POLIMORFISME GEN BMP15 PADA KAMBING KACANG,
SAMOSIR DAN MUARA
PENDAHULUAN
Super famili Transforming Growth Factor β (TGF β) merupakan suatu
faktor pertumbuhan berupa molekul protein yang berfungsi sebagai sinyal ekstra
seluler. Super famili TGF β terdiri dari TGF β
1,2,3
, Anti Mullerian Hormone
(AMH), 2 Inhibin (A dan B), 3 Aktivin (A,B, dan AB), sekitar 20 macam Bone
Morphogenetic Protein (BMP1 – BMP20) dan setidaknya 9 Growth Differentiation
Factors (GDF1-GDF9) (Dirangkum oleh Knight dan Glister 2006).
Gen Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) atau FecX terletak di
kromosom X yang ekuivalen dengan Xp11.2-p11.4 pada manusia dan
diekspresikan hanya pada sel oosit (Galloway et al. 2000). BMP15 berfungsi
dalam mengatur proliferasi dan diferensiasi sel granulosa di awal perkembangan
folikel (Otsuka et al. 2000). Mutasi pada gen BMP15 dapat meningkatkan laju
ovulasi dan litter size pada mutan heterozigot carrier dan menyebabkan sifat steril
pada mutan homozigot carrier. Ada enam alel mutan pada Fec X yang telah
ditemukan yaitu lima alel berupa mutasi titik yaitu Fec XI (Inverdale), Fec XH
(Hanna), Fec XB (Belclare), Fec XG (Galway) dan Fec XL (Lacaune) (Galloway et
al. 2000; Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007) dan satu alel berupa mutasi
delesi 17 pb yaitu Fec XR (Rasa Aragonesa) (Martinez-Royo et al. 2008). Mutasi
substitusi pada Fec XI, Fec XL dan Fec XB menyebabkan adanya perubahan asam
amino non conserve berturut-turut pada posisi 31, 53 dan 99 pada proprotein
BMP15. Mutasi substitusi Fec XH dan Fec XG menyebabkan stop kodon prematur
berturut-turut pada posisi 291 dan 239 dari proprotein BMP15. Adapun mutasi
delesi (Fec XR) mengubah kerangka pembacaan kodon mRNA yang menyebabkan
stop kodon prematur pada posisi 208 dari proprotein BMP15.
Metode sekuensing merupakan pengembangan teknik yang berkaitan
dengan DNA. Metode ini menghasilkan informasi yang lebih akurat karena
berdasarkan pada perunutan nukleotida dari suatu fragmen DNA. Penelitian ini
bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman genetik gen BMP15 pada tiga
kambing lokal Indonesia yaitu kambing Kacang, Samosir dan Muara.
14
BAHAN DAN METODE
Sampel DNA dan Amplifikasi Gen BMP15
Jumlah dan jenis sampel DNA kambing yang dipergunakan sama dengan
sampel DNA pada bab sebelumnya. Amplifikasi gen BMP15 dilakukan dengan
mesin TaKaRa Thermal Cycler. Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi
gen BMP15 ekson 1 dan ekson 2 didesain dengan mengacu pada Capra hircus
breed Guizhou White berdasarkan data GenBank dengan No. Akses FJ429281
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Lampiran1). Pasangan primer forward AF218
5’-GATGCAAAGAGGACAATTTAGAAGACC dan primer reverse AF219 5’CCCACCAGAACAATATAGTATGATAACTC digunakan untuk amplifikasi ekson 1.
Amplifikasi ekson 2 dilakukan dengan menggunakan pasangan primer forward
AF222 5’-TGCAGGCTCCTGGCACATACAGAC dan primer reverse AF223 5’TCACCTGCATGTGCAGGACTGGG. Reaksi PCR dilakukan dalam volume 12 µL,
yang terdiri atas sampel DNA sekitar 10 ng, primer forward dan reverse masingmasing 0.5 µL 25 mM, dan KAPA Taq Ready Mix DNA polymerase 6 µL
(KAPATaq DNA polymerase 0.05 U/µL, bufer polimerase dengan Mg2+.25 mM
dan setiap dNTP masing-masing 0.4 mM). Kondisi PCR, yaitu predenaturasi 94
0
C, selama 5 menit, (denaturasi 94 0C, 60’, penempelan primer ekson 1 60 0C,
90’, pemanjangan 72 0C, 90’) sebanyak 30 siklus, pemanjangan akhir pada suhu
72 0C selama 10 menit, dan penyimpanan dilakukan pada suhu 4 0C. Kondisi PCR
untuk ekson 2 sama kecuali penempelan primer yaitu 64
0
C. Amplikon
dimigrasikan pada gel poliakrilamida 6% dengan penanda DNA Ladder 100 pb
(Generay Biotech) yang dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Byun et al. 2009).
Penentuan Genotip dengan Metode Sekuensing
Amplikon dari jenis kambing yang sama dicampur, sehingga ada tiga
kelompok besar yaitu sampel kambing Kacang (K), kambing Samosir (S), dan
kambing Muara (M). Proses sekuensing dilakukan pada hasil pencampuran
amplikon dengan menggunakan primer yang sama seperti proses amplifikasi awal.
Hasil sekuensing berupa grafik elektroforegram diedit secara manual dengan
software Bioedit versi 7.0.9.0 (Hall 1999). Urutan nukleotida yang sudah benar
15
kemudian disejajarkan dan dianalisis lebih lanjut dengan program MEGA4.0
(Tamura et al. 2007) dan Genetyx-win 4.1.
Analisis filogeni kambing lokal Indonesia dilakukan berdasarkan daerah
coding sequence gen BMP15 ekson 2 menggunakan metode Neighbour-joining
(NJ) dengan bootstrap 1000x. Data sekuen pembanding yang digunakan diperoleh
dari data GenBank yaitu Pongo abelii : XM_002831651, Pan troglodytes :
XM_529247,
Macaca
mulatta
:
XM_001083980,
Equus
caballus
:
XM_001496223, Jining Grey : EU743938, Homo sapiens : AF082350, Gallus
gallus : AY729025, Bos Taurus : DQ463368, Yunling Black : EU847284, Boer :
EU847289, Black Bengal : EU888137, Guizhou White : FJ429281, Markhoz :
GU732196, Ovis aries : AF236079, Mus musculus : NM_009757, Rattus
norvegicus : NM_021670, Bubalus bubalis : EF375880 dan Carassius gibelio :
HQ179985. (Lampiran 2 dan 3).
HASIL
Amplifikasi gen BMP15 ekson 1 yang diapit oleh primer forward AF218
dan primer reverse AF219 menghasilkan fragmen DNA sepanjang 574 pb
(Gambar 6A). Amplifikasi gen BMP15 ekson 2 yang diapit oleh primer forward
AF222 dan primer reverse AF223 menghasilkan fragmen DNA sepanjang 861 pb
(Gambar 6B).
1 2 3 4 5 6 M
1 2 3 4 5 6 M
861 pb
574 pb
100 pb
100 pb
A
B
Gambar 6 Amplikon gen BMP15 ekson 1 dan 2 pada kambing Kacang (A) ekson
1 = 574 pb (B) ekson 2 = 861 pb (M) Marker 100 pb (1-6) Kambing
Kacang.
Hasil sekuensing menunjukkan bahwa gen BMP15 pada daerah
ekson1 memiliki urutan nukleotida yang identik pada ketiga populasi kambing
lokal Indonesia (kambing Kacang, Samosir dan Muara). Pada daerah ekson 2
16
ditemukan 3 varian nukleotida yang berbeda antar populasi kambing lokal
Indonesia. Pada populasi kambing Kacang ditemukan dua macam mutasi
substitusi (Gambar 7). Pertama, transisi A→G pada posisi nukleotida ke-325 yang
bersifat mutasi bisu karena tidak menyebabkan perubahan asam amino ke-108
yaitu tetap sebagai lisin. Kedua, transversi C→G pada posisi nukleotida ke-398.
Mutasi ini bersifat mutasi netral karena menyebabkan perubahan asam glutamat
menjadi glutamin pada posisi asam amino ke-133 namun tidak merubah fungsi
protein.
A
B
Gambar 7 Mutasi substitusi gen BMP15 pada kambing Kacang (A) Mutasi
substitusi A325G (B) Mutasi substitusi C398G.
Gambar 8 Mutasi substitusi C34T pada kambing Muara.
Populasi kambing Muara menunjukkan satu mutasi substitusi C34T (Gambar 8).
Mutasi ini tidak menyebabkan adanya perubahan asam amino pada posisi ke-11
yaitu tetap sebagai leusin. Pada populasi kambing Samosir tidak ditemukan
adanya variasi nukleotida.
Hasil analisis pohon filogeni berdasarkan daerah coding sequence ekson 2
menunjukkan bahwa ketiga kambing lokal Indonesia berada dalam satu kelompok
17
dengan berbagai jenis kambing di dunia, seperti Boer, Ghuizou White, Black
Bengal, Markhoz, ataupun Yunling Black (Gambar 9).
Gambar 7 Pohon filogeni kambing lokal Indonesia berdasarkan daerah coding
sequence gen BMP15 ekson 2 menggunakan program MEGA 4
dengan metode Neighbour-joining dengan bootstrap 1000x. Angka di
percabangan menunjukkan nilai bootstrap.
Pada pohon filogeni tampak percabangan yang memisahkan kelompok hewan
yang bersifat monoovulasi dengan kelompok hewan yang bersifat poliovulasi
dengan nilai bootstrap 100. Kelompok hewan yang bersifat monoovulasi meliputi
beberapa hewan ruminansia dan primata. Kelompok hewan yang bersifat
poliovulasi terdiri atas Mus musculus dan Rattus norvegicus yang merupakan
hewan rodensia. Adapun Gallus gallus dan Carassius gibelio terlihat berada pada
kelompok terluar dalam pohon filogeni.
PEMBAHASAN
Gen BMP15 pada kambing terdiri dari dua ekson dan satu intron yang
menyandikan sebanyak 394 asam amino berdasarkan Capra hircus breed Guizhou
White
pada
basis
data
GenBank
dengan
No.
Akses
FJ429281
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Lampiran 1). Analisis sekuen gen BMP 15
18
menunjukkan bahwa ketiga populasi kambing lokal Indonesia (kambing Kacang,
Samosir dan Muara) memiliki urutan nukleotida yang identik pada ekson 1. Hal
ini kemungkinan karena pada daerah ekson 1 terdapat daerah yang menyandikan
bagian sinyal peptida dalam pembentukan protein BMP15 sehingga bersifat sangat
stabil. Ada enam alel mutan pada gen BMP15 yang telah diketahui berkorelasi
dengan sifat prolifik pada mutan heterozigot carrier dan menyebabkan sifat steril
pada mutan homozigot carrier. Mutasi pada keenam alel ini semuanya terjadi
pada bagian ekson 2 (Tabel 2).
Tabel 2. Alel mutan pada gen BMP15
Nama Alel
I
Mutasi DNA
Mutasi Protein
Ekson
Domba
Referensi
FecX (Inverdal)
T579A
V31D
2
Romney
Galloway et al. (2000)
FecXH (Hanna)
C544T
Q23stop
2
Romney
Galloway et al. (2000)
G
C718T
Q239Ter
2
B
G1100T
S99I
2
Belcrare
Hanrahan et al. (2004)
L
G635A
C53Y
2
Lacaune
Bodin et al. (2007)
FecX (Galway)
FecX (Belclare)
FecX (Lacaune)
R
FecX (R.Aragonesa) del c.525_541
W154NfsX55
2
Belcrare,Cambridge Hanrahan et al. (2004)
Rasa Aragonesa
Royo,A.M. et al (2008)
Polimorfisme ditemukan pada gen BMP15 ekson 2 tiga kambing lokal
Indonesia. Pada populasi kambing Kacang ditemukan ada dua jenis mutasi.
Pertama, mutasi bisu yaitu transisi A325G . Kedua, mutasi netral yaitu transversi
C398G yang menyebabkan perubahan asam glutamat menjadi glutamin namun
tidak merubah fungsi BMP15. Asam glutamat adalah asam amino yang bermuatan
negatif sedangkan glutamin adalah asam amino dengan rantai samping yang tidak
bermuatan. Populasi kambing Muara hanya mempunyai satu mutasi bisu yaitu
C34T, sedangkan populasi kambing Samosir tidak mengalami mutasi.
Fungsi BMP15 pada setiap spesies bersifat khas (specific species) terkait
dengan perbedaan laju ovulasi antar species (Hashimoto et al. 2005). BMP15 pada
mamalia berfungsi sebagai faktor pertumbuhan dan proliferasi sel granulosa.
BMP15 juga berperan dalam menghambat sensitivitas folikel terhadap Follicle
Stimulating Hormone (FSH) dengan menekan ekspresi dari reseptor FSH (Otsuka
et al. 2000). Penelitian yang dilakukan oleh Yan et al. (2001) menunjukkan bahwa
tikus yang sudah diinaktivasi (knock out) gen BMP15 nya tidak menunjukkan sifat
steril tetapi hanya mengalami penurunan laju ovulasi (sub fertil). Mc Mahon et al.
19
(2008) menyimpulkan bahwa sifat poliovulasi ini ternyata dipengaruhi oleh
jumlah ekspresi gen BMP15 yang lebih sedikit. Hal ini berdasarkan penelitiannya
dengan menggunakan tikus transgenik oocyt specific overexpression BMP15.
Mutasi gen BMP15 pada ruminansia kecil menyebabkan sifat prolifik pada
genotip heterozigot dan sifat steril pada genotip homozigot (Galloway et al. 2000;
Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007; Martinez-Royo et al. 2008). Zhang et al.
(2009) mengungkapkan bahwa pada beberapa jenis sapi ditemukan adanya mutasi
delesi 4 pb yang menyebabkan perubahan reading frame dan menghasilkan stop
kodon prematur, namun mutasi ini tidak berkorelasi dengan sifat prolifik pada
genotip heterozigot. Polimorfisme gen BMP15 pada manusia diketahui
berhubungan dengan human dizygotic (DZ) namun tidak signifikan (Zhao et al.
2008). Pada ikan zebra, BMP15 berfungsi untuk mencegah terjadinya
perkembangan dan pematangan prematur oosit dengan menekan sensitivitas
folikel terhadap maturation inducing hormone (MIH) pada pertumbuhan awal dari
folikel (Clelland et al. 2007).
SIMPULAN
Hasil sekuensing daerah ekson 1 menunjukkan bahwa kambing Kacang,
Samosir dan Muara memiliki urutan basa nukleotida yang identik. Polimorfisme
ditemukan pada daerah ekson 2 karena ada tiga varian mutan. Populasi kambing
Kacang memiliki dua jenis alel mutan yaitu A325G dan C398G. Pada Populasi
kambing Muara ada satu alel mutan yaitu C34T, sedangkan populasi kambing
Samosir tidak memiliki varian mutan. Analisis pohon filogeni memperlihatkan
bahwa kambing Kacang, Samosir dan Muara terletak dalam satu kelompok
dengan beberapa kambing lokal di dunia. Pada pohon filogeni tampak
percabangan yang memperlihatkan hubungan genetik antara kelompok hewan
monoovulasi dan poliovulasi.
20
21
PEMBAHASAN UMUM
Hasil PCR-RFLP gen BMPR1B dan BMP15 pada tiga kambing lokal
Indonesia (kambing Kacang, Samosir dan Muara) memperlihatkan bahwa semua
sampel monomorfik yaitu bersifat tipe liar. Metode deteksi PCR-RFLP gen
BMPR1B dan BMP15 seperti yang dilaporkan pada beberapa penelitian (Galloway
et al. 2000; Wilson et al. 2001; Davis et al. 2002; Hanrahan et al. 2004)
mengungkapkan bahwa sampel yang bersifat tipe liar adalah non prolifik. Hal ini
tidak sesuai dengan fakta bahwa beberapa sampel kambing Kacang, Samosir dan
Muara yang diperoleh di lapangan bersifat prolifik. Hasil sekuensing gen
BMPR1B dan BMP15 dengan primer yang sama ternyata memperlihatkan adanya
polimorfisme pada kedua gen tersebut. Namun alel mutan yang ditemukan pada
gen BMPR1B dan BMP15 ini tidak berkorelasi dengan situs pemotongan enzim
restriksi. Hal ini menyimpulkan bahwa metode PCR-RFLP gen BMPR1B dan
BMP15 ini tidak dapat digunakan sebagai alat deteksi pada populasi kambing
Kacang, Samosir dan Muara. Deteksi sifat prolifik berdasarkan metode PCRRFLP gen BMPR1B pada beberapa jenis domba Cina menunjukkan bahwa gen
FecB berkaitan dengan sifat prolifik yang tinggi pada ternak seperti Huyang,
Small Tail Han, Cele, Duolang dan Chinese Merino strain prolifik, sebaliknya
pada ternak yang bersifat non prolifik seperti Mongolia, Chinese Merino, Tan,
Xinjiang, Hulunbeier, Inner Mongolia FineWool dan Northeastern Half-fuzz tidak
ditemukan gen FecB. Adanya perbedaan distribusi gen FecB pada beberapa jenis
domba Cina menunjukkan bahwa gen BMPR1B sangat berkorelasi dengan
perbedaan bangsa pada ternak (Dirangkum oleh Hua & Yang 2009). Untuk
mengembangkan metode penanda genetik seperti Marker-assisted selection
membutuhkan tahapan yang cukup panjang sehingga harus diperhatikan rasio
antara keuntungan dan biaya yang dibutuhkan (Davis & DeNise 1998). Pada
penelitian ini, selanjutnya lebih difokuskan untuk mengidentifikasi keragaman
genetik gen BMP15 ekson 1 dan ekson 2 pada ketiga kambing lokal Indonesia.
Sifat prolifik secara alamiah disebabkan pematangan folikel yang terjadi
secara serentak sehingga menghasilkan lebih dari satu folikel matang. Gen
BMP15 mengekspresikan protein yang berfungsi sebagai sinyal molekular untuk
22
menginduksi kerja dari sistem hormonal selama proses pembentukan folikel.
Protein BMP15 memiliki dua peran penting yaitu pertama, sebagai faktor
pertumbuhan dan proliferasi sel granulosa. Kedua, menghambat sensitivitas
folikel terhadap FSH dengan menekan ekspresi dari reseptor FSH (Otsuka et al.
2000). Ada enam alel mutan pada gen BMP15 yang diketahui berkorelasi dengan
sifat prolifik pada genotip heterozigot carrier dan sifat steril pada genotip
homozigot carrier yaitu T579A, C544T, C718T, G1100T, G635A dan delesi
525_541 (Galloway et al. 2000; Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007;
Martinez-Royo et al. 2008).
Mutasi yang terjadi pada gen BMP15 diketahui dapat menyebabkan
pertumbuhan dan proliferasi sel granulosa menjadi terhambat, sebaliknya ekspresi
dari reseptor FSH menjadi maksimal. Hal ini menyebabkan terbentuknya
beberapa folikel yang lebih kecil dan lebih sensitif terhadap FSH. Folikel-folikel
ini kemudian mengalami pematangan dini (Fabr
(BMPR1B DAN BMP15) PADA KAMBING KACANG,
SAMOSIR DAN MUARA
MOCHAMAD SYAIFUL RIJAL HASAN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul “Polimorfisme
Gen Fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada Kambing Kacang, Samosir dan
Muara” adalah benar hasil karya saya sendiri dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan
tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juni 2011
Mochamad Syaiful Rijal Hasan
ABSTRACT
MOCHAMAD SYAIFUL RIJAL HASAN. Polymorphism of fecundity genes
(BMPR1B and BMP15) on Kacang, Samosir and Muara goats. Under supervision
of ACHMAD FARAJALLAH and RADEN RORO DYAH PERWITASARI.
Several Indonesian local goats are prolific. Fecundity was controlled by
fecundity genes such as Bone Morphogenetic Protein Receptor 1B (BMPR1B),
Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) and Growth Differentiation Factor 9
(GDF9). The present study aimed to identify the genetic diversity of fecundity
genes (BMPR1B and BMP15) on three Indonesian local goats, namely Kacang,
Samosir, and Muara, using PCR-RFLP and nucleotide sequencing methods. The
PCR-RFLP’s showed that all sample of three Indonesian local goats are
monomorphic. Verification result by nucleotide sequencing found two
substitution were G72T on BMPR1B gene exon 8 and G43A on BMP15 gene
exon 2. Both of the mutation were not part of recognizing site of restriction
enzymes. Furthermore, the genetic diversity was identified for exon 1 and exon 2
of BMP15. Nucleotide sequence of exon 1 of BMP15 gene was monomorphic
among the three Indonesian local goats. On the other hand, there are three mutant
alleles were found on exon 2 among the three Indonesian local goats. Two mutant
alleles of A325G and C398G were found on Kacang goats population. One
mutant allele was C34T on Muara goats population. The population of Samosir
goats have identically sequence of BMP15 exon 2. The phylogenetic tree based on
coding sequence exon 2 showed that Kacang, Samosir and Muara goats clustered
with several local goats in the world. Moreover, the phylogenetic tree also defined
Kacang, Samosir and Muara goats as monoovulation group.
Keyword : BMPR1B, BMP15, gene, Kacang goat, Samosir goat, Muara goat
RINGKASAN
MOCHAMAD SYAIFUL RIJAL HASAN. Polimorfisme Gen Fekunditas
(BMPR1B dan BMP15) pada Kambing Kacang, Samosir dan Muara. Dibimbing
oleh ACHMAD FARAJALLAH dan RADEN RORO DYAH
PERWITASARI.
Indonesia memiliki potensi keanekaragaman hayati yang tinggi. Salah
satunya adalah kambing lokal. Beberapa kambing lokal di Indonesia memiliki
sifat unggul, antara lain bersifat prolifik. Sifat prolifik ini dikendalikan oleh gen
fekunditas, antara lain Bone Morphogenetic Protein Receptor 1B (BMPR1B),
Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) dan Growth Differentiation Factor 9
(GDF9). Gen BMPR1B yang dikenal sebagai FecB terletak pada kromosom 6 dan
diekspresikan oleh sel oosit dan sel granulosa dalam ovarium. Mutasi pada FecB
yang berkaitan dengan sifat prolifik adalah substitusi A746G yang menyebabkan
substitusi asam amino Q249R. Adapun gen BMP15 yang dikenal sebagai FecX
terletak di kromosom X dan hanya diekspresikan di dalam sel-sel oosit. Beberapa
alel mutan pada gen BMP15 yang berhubungan dengan sifat prolifik adalah FecXI
(Inverdale), FecXH (Hanna), FecXB (Belclare), FecXG (Galway), FecXL (Lacaune)
dan FecXR (Rasa Aragonesa). Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi
keragaman genetik gen fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada kambing Kacang,
Samosir dan Muara menggunakan metode PCR-RFLP dan sekuensing nukleotida.
Penelitian ini dibagi menjadi dua tahap. Tahap pertama, PCR-RFLP gen
BMPR1B ekson 8 dengan menggunakan enzim AvaII dan gen BMP15 ekson 2
dengan menggunakan enzim HinfI. Tahap kedua, sekuensing nukleotida gen
BMP15 ekson 1 dan 2.
Hasil PCR-RFLP, baik gen BMPR1B maupun gen BMP15 menunjukkan
bahwa semua sampel dari kambing Kacang, Samosir dan Muara merupakan tipe
liar atau non-prolifik dan bersifat monomorfik. Hal ini tidak sesuai dengan data
lapangan bahwa beberapa sampel yang diperoleh mempunyai jumlah anak
sekelahiran lebih dari satu. Hasil ini mengindikasikan bahwa metode PCR-RFLP
gen BMPR1B dan BMP15 tidak dapat dijadikan sebagai alat deteksi pada kambing
Kacang, Samosir dan Muara. Hasil verifikasi dengan metode sekuensing
menggunakan primer yang sama menunjukkan bahwa mutasi G72T pada gen
BMPR1B dan mutasi G43A pada gen BMP15 bukan bagian dari situs pengenalan
dari enzim restriksi yang digunakan.
Hasil sekuensing nukleotida ruas ekson 1 gen BMP15 tidak menunjukkan
polimorfisme antar ketiga kambing lokal Indonesia, tetapi beberapa situs
ditemukan berbeda dengan kambing-kambing lainnya. Adapun hasil sekuensing
nukleotida pada daerah ekson 2-nya ditemukan 3 varian nukleotida antar ketiga
kambing lokal Indonesia. Populasi kambing Kacang memiliki dua alel mutan
yaitu A325G dan C398G. Populasi kambing Muara menunjukkan satu alel mutan
yaitu C34T, sedangkan populasi kambing Samosir bersifat monomorf.
Pohon filogeni berdasarkan coding sequence ekson 2 menunjukkan bahwa
ketiga kambing lokal Indonesia berada dalam satu kelompok dengan kambingkambing lokal di dunia. Selain itu, pohon filogeni juga menempatkan kambing
dalam kelompok hewan yang bersifat monoovulasi. Dari hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa kondisi prolifik dikendalikan secara aditif dan pleitropik.
Selain itu, diduga ada peranan gen-gen yang lain yang mengatur sifat prolifik pada
kambing.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2011
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB yang wajar
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya Tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
POLIMORFISME GEN FEKUNDITAS
(BMPR1B DAN BMP15) PADA KAMBING KACANG,
SAMOSIR DAN MUARA
MOCHAMAD SYAIFUL RIJAL HASAN
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biosains Hewan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof. Drh. Arief Boediono PhD.
Judul Tesis
: Polimorfisme Gen Fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada
Kambing Kacang, Samosir dan Muara
Nama
: Mochamad Syaiful Rijal Hasan
NRP
: G352090161
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si
Ketua
Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi
Biosains Hewan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Bambang Suryobroto
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr
Tanggal Ujian : 11 Juli 2011
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Buku ini berisi hasil penelitian yang berjudul Polimorfisme Gen
Fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada kambing Kacang, Samosir dan Muara
sebagai prasyarat untuk memperoleh gelar Magister Sains dari Mayor Biosains
Hewan, Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih atas segala bimbingan dan saran
dalam menyelesaikan penelitian ini kepada Bapak Dr. Achmad Farajallah dan Ibu
Dr. R.R. Dyah Perwitasari selaku Dosen Pembimbing. Ucapan Terima kasih
penulis sampaikan kepada Prof. Drh. Arief Boediono PhD. selaku Penguji Luar
Komisi atas saran dan arahannya. Penulis juga menyampaikan terima kasih
kepada Departemen Agama Republik Indonesia atas Program Beasiswa Utusan
Daerah (BUD) pada Sekolah Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor. Ucapan
terimakasih juga penulis sampaikan atas sebagian bantuan dana penelitian dari
kegiatan Kerjasama Kemitraan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi
(KKP3T) tahun 2010 dengan judul “Identifikasi Tiga Gen Fekunditas pada Empat
Jenis Kambing Lokal (Kacang, Peranakan Etawah, Samosir dan Muara)”.
Penulis menyampaikan terima kasih kepada Pimpinan dan Karyawan
Lokalit Kambing Potong Sei putih, Medan serta beberapa pemilik kambing di
Kabupaten Tapanuli Utara dan Kabupaten Samosir. Terima kasih juga kepada zoo
corner community, Dr. Aron Batu Bara, Wildan Najmal Muttaqin M.Si dan Eryk
Andreas M.Pt serta semua teman-teman atas kekeluargaannya.
Ungkapan terima kasih yang tiada tara penulis persembahkan kepada Aba,
Ummi dan Cak Lutfi atas dukungan do’a dan curahan kasih sayangnya. Ungkapan
cinta pada istri dan putraku (Alkhoiriyatur Raudiatul Jannah “DIAH” dan Sayyid
Husein Ahmadinejad “ZEN”) atas kesetiaan, ketulusan dan kesabarannya dalam
mengobarkan semangat tuk terus melangkah dalam susah dan senang menatap
masa depan. Akhirnya tiada gading yang tak retak. Semoga karya ilmiah ini
bermanfaat.
Bogor, Juni 2011
Mochamad Syaiful Rijal Hasan
RIWAYAT HIDUP
Penulis adalah putra kedua dari dua bersaudara dari pasangan H.M. Hasan
Abdus Syafik dan Hj. Siti Rohmah Eja Rahmawati. Penulis lahir di Jember-Jawa
Timur pada 02 Februari 1981. Penulis lulus dari SMUN Kalisat pada tahun 1998,
kemudian melanjutkan pendidikan pada jenjang sarjana di Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Jurusan Biologi, Universitas Negeri
Jember tahun 1999. Pada tahun 2004 penulis dapat menyelesaikan studi S1.
Penulis bekerja sebagai guru swasta yang memegang mata pelajaran
biologi di Madrasah Aliyah Al Badri di Jember hingga saat ini. Pada tahun 2009,
Alhamdulillah penulis mendapat kesempatan memperoleh beasiswa utusan daerah
di Sekolah Pascasarjana Program Studi BioSains Hewan, Institut Pertanian Bogor
dari Departemen Agama Republik Indonesia.
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL………………………………………......….………..
Halaman
xvi
DAFTAR GAMBAR………………………………………………........
xvii
DAFTAR LAMPIRAN……………….…………………………….…...
xvii
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang………………………..………………….………
Tujuan Penelitian……………………………………....………...
Manfaat Penelitian………………………………..…..……...…..
1
4
4
2 GEN FEKUNDITAS (BMPR1B DAN BMP15) PADA
TIGA KAMBING LOKAL INDONESIA
PENDAHULUAN……………………………………...………
BAHAN DAN METODE..............................................................
Waktu dan Tempat………………………………….....……
Pengambilan Sampel Darah Kambing…………………….….
Ekstraksi DNA……………………..………………………....
Amplifikasi Gen BMPR1B dan BMP15…………………...…
Analisis Gen BMPR1B dan BMP15
Menggunakan PCR-RFLP dan Sekuensing…………………
HASIL…………………………………………………….……..
PEMBAHASAN………………………………………………...
SIMPULAN………………………………….……………….....
3
5
6
6
6
7
7
8
9
10
12
POLIMORFISME GEN BMP15 PADA KAMBING KACANG,
SAMOSIR DAN MUARA
PENDAHULUAN…………………………………………….…
BAHAN DAN METODE..............................................................
Sampel DNA dan Amplifikasi Gen BMP15……………..……
Penentuan Genotip dengan Metode Sekuensing…………...
HASIL……………………………………………………………
PEMBAHASAN………………………………...……………….
SIMPULAN……………………………………………………...
13
14
14
14
15
17
19
4
PEMBAHASAN UMUM…………………………………….……..
21
5
SIMPULAN DAN SARAN………………………..………..….…...
25
DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………....
27
LAMPIRAN……………………………………………………………..
33
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Penampilan Tiga Kambing Lokal Indonesia………………………………….
2
2
Amplikon gen BMPR1B……………...…………….……….........…............
9
3
Amplikon gen BMP15 ekson 2…………………………………………….....
9
4 Mutasi substitusi G→T gen BMPRIB nukleotida ke-72
pada kambing Kacang, Samosir dan Muara…………………………..….
10
5 Mutasi substitusi G→A gen BMP15 nukleotida ke-43
pada kambing Kacang, Samosir dan Muara .……………………..…………..
10
6
15
Amplikon gen BMP15 ekson 1 dan 2 pada kambing Kacang………………
7 Mutasi substitusi gen BMP15 pada kambing Kacang ……………….....
16
8 Mutasi substitusi C34T pada kambing Muara ……………………...…
16
9
Pohon filogeni kambing lokal Indonesia berdasarkan daerah
coding sequence gen BMP15 ekson 2 menggunakan program MEGA 4 dengan
metode Neighbour-joining dengan bootstrap 1000x. Angka di percabangan
menunjukkan nilai bootstrap……....................................................……..……
17
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Jumlah sampel darah kambing………………………………...……......
7
2 Alel mutan pada gen BMP15……………….………….…………………….
18
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Informasi sekuens gen BMP15 pada Capra hircus
breed Guizhou White…………………………………………………..
33
2 Beberapa spesies yang digunakan dalam analisis pohon filogeni gen
BMP15 ekson 2…………………………………………………………
35
3 Hasil pensejajaran coding sequence Ekson 2 Gen BMP15 kambing
lokal Indonesia terhadap beberapa spesies Mamalia, burung dan ikan
(No. merujuk pada nama spesies yang ada di lampiran 2). Nomor tiga
baris di bagian atas dibaca secara vertikal).………….………… ……...
36
.
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia memiliki sumber daya alam dengan keragaman genetik yang
melimpah. Salah satu diantaranya adalah ternak kambing lokal Indonesia yang
telah beradaptasi dengan kondisi geografis setempat. Kambing di Indonesia
merupakan ternak ruminansia kecil dengan jumlah paling tinggi di Asia Tenggara
(Sodiq & Taufik 2003).
Beberapa kambing lokal Indonesia seperti kambing Kacang, Samosir dan
Muara memiliki keunggulan karena bersifat prolifik (Gambar 1). Kambing
Kacang merupakan kambing asli Indonesia. Kambing Kacang merupakan
kambing penghasil daging dengan rata-rata litter size 1.56–1.98 anak per
kelahiran (Hoda 2008). Kambing Kacang memiliki ukuran tubuh sedang dengan
corak warna yang sangat beragam mulai dari putih, hitam, coklat ataupun
kombinasi dari ketiga warna tersebut. Kambing Samosir dipelihara oleh penduduk
di Pulau Samosir, Kabupaten Toba Samosir dan sering digunakan sebagai bahan
upacara persembahan salah satu aliran kepercayaan (Parmalim). Kambing
Samosir memiliki ciri khas berupa warna bulu dominan putih dengan ukuran
tubuh sedang. Adapun kambing Muara telah lama beradaptasi di Kecamatan
Muara Kabupaten Tapanuli Utara dengan kondisi topografi yang bergununggunung. Ciri khas Kambing Muara adalah ukuran tubuhnya paling besar diantara
kambing Kacang maupun kambing Samosir. Kambing Muara memiliki corak
warna yang bervariasi seperti pada kambing Kacang.
Sifat prolifik yaitu kemampuan mempunyai anak lebih dari satu dalam
satu kali kelahiran. Sifat prolifik pada ternak ruminansia dapat dibedakan menjadi
dua kelompok, yaitu monozigot dan multizigot. Kelompok monozigot
mengovulasikan satu oosit, kemudian embrio muda yang terbentuk membelah
menjadi dua atau lebih embrio yang mampu hidup. Kelompok ini akan
menghasilkan anak kembar identik. Kelompok multizigot mengovulasikan lebih
dari satu oosit dalam suatu waktu. Apabila ada beberapa oosit yang berhasil
dibuahi maka ternak akan melahirkan lebih dari satu anak dalam satu kali periode
kelahiran.
2
Gambar 1 Penampilan Tiga Kambing Lokal Indonesia.
Salah satu tahapan penting dalam sistem reproduksi adalah proses
pematangan folikel hingga siap untuk diovulasikan yang dikenal dengan
oogenesis. Folikel adalah oosit yang dilapisi oleh dua jenis sel somatik, yaitu sel
granulosa dan sel theka. Tahap perkembangan folikel meliputi primordial, primer,
sekunder, awal tersier (antral atau Graafian), akhir tersier dan pre ovulasi.
Rangkaian proses oogenesis melibatkan beragam sinyal baik berupa
hormon maupun faktor. Hormon merupakan sinyal molekul yang dihasilkan oleh
sel endokrin dan didistribusikan melalui aliran darah menuju sel target atau ke
seluruh tubuh. Beberapa hormon yang berperan dalam proses oogenesis antara
lain Follicle Stimulating Hormone (FSH), estrogen, luteinizing Hormone (LH) dan
progesteron. Hormon FSH berfungsi untuk merangsang pertumbuhan sel-sel
folikel di sekeliling ovum. Folikel primordial akan tumbuh menjadi folikel de
Graaf. Folikel de Graaf akan menghasilkan hormon estrogen yang berfungsi
merangsang kelenjar hipofisis untuk mensekresikan hormon LH. Hormon LH
akan merangsang terjadinya ovulasi. Sisa folikel dari proses ovulasi akan
membentuk korpus luteum yang selanjutnya menghasilkan progesteron. Hormon
3
progesteron berperan dalam menghambat kelenjar hipofisis untuk mensekresikan
FSH dan LH.
Faktor merupakan suatu sinyal molekular yang dihasilkan oleh suatu sel
untuk merangsang kerja dari sel lain di sekitarnya. Faktor diedarkan melalui difusi
cairan matriks ekstra selular. Faktor dikelompokkan sebagai sinyal parakrin. Salah
satu contoh sinyal parakrin yang berperan dalam proses oogenesis adalah anggota
super famili Transforming Growth Factor β (TGF β), diantaranya Bone
Morphogenetic Protein Receptor 1B (BMPR1B) dan Bone Morphogenetic Protein
15 (BMP15). BMP15 merupakan suatu faktor pertumbuhan yang berfungsi dalam
mengatur proliferasi dan diferensiasi sel granulosa di awal perkembangan folikel
(Otsuka et al. 2000). BMPR1B merupakan reseptor bagi beberapa faktor BMP
termasuk BMP15 (ten Dijke et al. 2003).
Sifat prolifik dikendalikan oleh gen-gen yang dikelompokkan sebagai gen
kesuburan (fecundity genes) (Davis 2004). Gen BMPR1B atau activin-like kinase
6 (ALK 6) dikenal sebagai FecB. Gen BMPR1B terletak pada kromosom 6 yang
diekspresikan oleh sel oosit dan sel granulosa. Mutasi substitusi A746G atau pada
tingkat asam amino mutasi Q249R pada FecB akan meningkatkan laju ovulasi
rata-rata 1.5 dan rataan litter size 1.0 pada heterozigot carrier. Mutasi yang sama
pada homozigot carrier akan meningkatkan laju ovulasi rata-rata 3.0 dengan
rataan litter size 1.5 (Mulsant et al. 2001; Souza et al. 2001; Wilson et al. 2001;
Davis 2005).
Gen BMP15 atau GDF9B dikenal sebagai FecX terletak di kromosom X
dan diekspresikan oleh sel oosit. Mutasi pada gen BMP15 pertama kali dilaporkan
oleh Galloway et al. (2000). Mutasi pada FecX berkorelasi dengan peningkatan
laju ovulasi dan litter size pada genotip heterozigot carrier, sedangkan pada
genotip homozigot carrier dapat menyebabkan sifat steril. Ada enam alel mutan
yang sudah diketahui pada gen BMP15 yaitu FecXI (Inverdale), FecXH (Hanna),
FecXB (Belclare), FecXG (Galway), FecXL (Lacaune) dan FecXR (Rasa Aragonesa)
(Galloway et al. 2000; Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007; Martinez-Royo et
al. 2008). Mutasi substitusi Q239Ter pada gen BMP15 yang berkorelasi dengan
sifat prolifik adalah FecXG. Situs mutan tersebut ternyata bisa dikenali sebagai
situs restriksi enzim HinfI. Dengan begitu, deteksi dini terhadap sifat prolifik
4
kemudian dikembangkan oleh Hanrahan et al. (2004) pada domba menggunakan
teknik PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length
Polymorphism).
Metode PCR-RFLP merupakan metode untuk mendeteksi ada tidaknya
mutasi pada situs pemotongan yang khas suatu enzim restriksi. Pada beberapa
populasi ternak, PCR-RFLP terbukti sebagai metode deteksi mutasi substitusi
yang cepat dan akurat. Pemanfaatan teknik PCR-RFLP dapat digunakan untuk
meningkatkan produktivitas hewan ternak melalui skrining dan pendeteksian hasil
persilangan (Pardhesi et al. 2005). Apabila mutasi substitusi tidak terjadi pada
situs pemotongan suatu enzim restriksi, maka metode pendeteksiannya bisa
dilakukan dengan metode SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
ataupun perunutan nukleotida (DNA sequencing). Metode sekuensing DNA lebih
akurat dalam mendeteksi kejadian mutasi tetapi relatif mahal dan membutuhkan
waktu yang lama.
Tujuan penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen fekunditas
(BMPR1B dan BMP15) pada tiga kambing lokal Indonesia, yaitu kambing
Kacang, Samosir dan Muara dengan menggunakan metode PCR-RFLP dan
sekuensing.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini dapat dimanfaatkan sebagai informasi awal tentang
keragaman genetik gen fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada tiga kambing
lokal Indonesia yaitu kambing Kacang, Samosir dan Muara.
Hasil yang
diharapkan adalah apabila metode deteksi cepat PCR-RFLP ditemukan
berkorelasi dengan sifat prolifik, maka hasilnya dapat digunakan sebagai metode
deteksi dini sifat prolifik.
5
GEN FEKUNDITAS (BMPR1B DAN BMP15) PADA
TIGA KAMBING LOKAL INDONESIA
PENDAHULUAN
Sifat prolifik adalah kemampuan untuk melahirkan lebih dari satu anak
sekaligus dalam satu kali periode kelahiran. Sifat prolifik dikendalikan oleh gengen yang dikelompokkan sebagai gen kesuburan (fecundity genes). Ada tiga jenis
gen Fec yang sudah diidentifikasi pada ruminansia kecil, yaitu Bone
Morphogenetic Protein Receptor type 1B (BMPR1B), Growth Differentiation
Factor 9 (GDF9) dan Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) (Galloway et al.
2000; Souza et al. 2001; Hanrahan et al. 2004).
Gen BMPR1B atau activin-like kinase 6 (ALK 6) dikenal sebagai FecB.
Gen BMPR1B terletak pada kromosom 6 yang diekspresikan oleh sel oosit dan
sel-sel granulosa. Mutasi pada FecB terjadi karena substitusi A746G pada cDNA
yang menyebabkan substitusi asam amino Q249R (Mulsant et al. 2001; Souza et
al. 2001; Wilson et al. 2001). Mutan heterozigot carrier akan mengalami
peningkatan laju ovulasi rata-rata 1.5 dengan rataan litter size 1.0. Sedangkan
mutan homozigot carrier akan mengalami peningkatan yang lebih tinggi yaitu
laju ovulasinya rata-rata 3.0 dengan rataan litter size 1.5 (Davis 2005).
Gen BMP15 atau FecX terletak di kromosom X dan diekspresikan oleh sel
oosit. Anggota super famili Transforming Growth Factor β (TGF β) ini disebut
BMP15 karena secara struktural dapat dikelompokkan ke dalam anggota BMP
(Dube et al. 1998). Selain itu, BMP15 juga dikenal sebagai GDF9B karena
kemiripannya dengan GDF9 (Laitinen et al. 1999). Mutasi pada FecX berkorelasi
dengan peningkatan laju ovulasi dan litter size pada genotip heterozigot carrier,
sedangkan pada genotip homozigot carrier dapat menyebabkan sifat steril. Ada
lima alel akibat mutasi titik (single substitution) pada FecX yang telah ditemukan,
yaitu FecXI (Inverdale), FecXH (Hanna), FecXB (Belclare), FecXG (Galway) dan
FecXL (Lacaune) (Galloway et al. 2000; Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007).
Selain itu, ada satu alel yang disebabkan oleh mutasi delesi 17 pb yang disebut
FecXR (Rasa Aragonesa) (Martinez-Royo et al. 2008).
Metode PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment
Length Polymorphism) merupakan metode deteksi mutasi yang cepat dan akurat
6
dalam skala massal. Metode PCR-RFLP memanfaatkan adanya situs pemotongan
yang khas dari suatu enzim restriksi untuk mendeteksi terjadinya mutasi pada
suatu fragmen DNA. Metode sekuensing DNA menghasilkan data yang lebih
akurat karena berdasarkan perunutan nukleotida. Metode sekuensing relatif mahal
dan membutuhkan waktu yang lama.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi keragaman genetik
gen fekunditas (BMPR1B dan BMP15). Populasi ternak yang diteliti adalah tiga
kambing lokal Indonesia meliputi kambing Samosir, kambing Muara dan kambing
Kacang dengan metode PCR-RFLP dan sekuensing.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Mei 2010 sampai dengan Januari
2011 di Laboratorium bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Pengambilan Sampel Darah Kambing
Sampel darah kambing Kacang yang digunakan adalah koleksi Loka
Penelitian Kambing Potong Sei Putih, Sumatera Utara. Berdasarkan catatan yang
tersedia, dari total 25 ekor kambing, 14 ekor bersifat prolifik atau setidaknya
pernah melahirkan anak lebih dari satu per kelahiran, sedangkan 11 ekor yang lain
selalu beranak tunggal (Tabel 1). Kambing Samosir diambil dari peternakan
rakyat di Kabupaten Samosir (60 ekor) dan Kambing Muara di peternakan rakyat
di Kabupaten Tapanuli Utara, Provinsi Sumatera Utara (35 ekor). Pembagian sifat
prolifik atau tidaknya didasarkan pada wawancara terhadap pemilik kambing.
Sampel darah diambil dari vena jugularis menggunakan jarum venoject
yang dihubungkan dengan tabung vakum sekitar 2 ml dari setiap ekor kambing.
Darah yang diperoleh langsung diawetkan dalam alkohol absolut 2x volume
darah.
7
Tabel 1 Jumlah sampel darah kambing
Jenis Kambing
Prolifik
Non Prolifik + Unknown
Kacang
14
11
Samosir
24
36
Muara
9
26
Jumlah
25
60
35
Total
47
73
120
Prolifik: jumlah anak 2-5, Non prolifik: jumlah anak 1, unknown: tidak diketahui
Ekstraksi DNA
Ekstraksi genom DNA dilakukan menggunakan Genomic DNA Mini Kit
for Fresh Blood (GeneAid) yang dimodifikasi untuk sampel darah yang diawetkan
dalam alkohol. Modifikasi yang dilakukan bertujuan untuk menghilangkan
alkohol sebelum dilakukan proses ekstraksi DNA. Sampel darah dalam alkohol
sebanyak 1mL disentrifugasi 2000 g selama 5 menit. Endapan sel dicuci dengan
menambahkan akuades steril hingga volume total 1.5 mL dan didiamkan selama
20 menit. Pencucian ini dilakukan sebanyak dua kali. Sel-sel darah yang telah
bersih dari alkohol disuspensikan dengan bufer pelisis 100 µL, kemudian
ditambahkan enzim Proteinase K 0.01-0.5 µg/mL dan diinkubasi pada suhu 60 0C
selama 30 menit. Pemisahan bahan organik non-DNA dan pemurnian molekul
DNA dilakukan sesuai dengan prosedur dari Genomic DNA Mini Kit.
Amplifikasi Gen BMPR1B dan BMP15
Ruas ekson 8 gen BMPR1B dan ekson 2 gen BMP15 diamplifikasi dengan
mesin TaKaRa Thermal Cycler dalam reaksi PCR 12 µL. Komposisi pereaksi
terdiri atas sampel DNA sekitar 10 ng, primer forward dan reverse masing-masing
0.5 µL 25 mM, dan KAPA Taq Ready Mix DNA polymerase 6 µL (KAPATaq
DNA polymerase 0.05 U/µL, bufer polimerase dengan Mg2+.25 mM dan setiap
dNTP masing-masing 0.4 mM). Kondisi PCR, yaitu predenaturasi 94 0C selama 5
menit, (denaturasi 94 0C selama 60 detik, penempelan primer 58 0C selama 90
detik, pemanjangan 72 0C 90 detik) sebanyak 30 siklus, pemanjangan akhir pada
suhu 72 0C selama 10 menit, dan penyimpanan dilakukan pada suhu 4 0C.
Amplikon dimigrasikan pada elektroforesis gel poliakrilamida 6% dengan
8
menggunakan penanda DNA Ladder 100 pb (Generay Biotech), kemudian
dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Byun et al. 2009).
Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi ruas ekson 8 dari gen
BMPR1B adalah primer forward AF84 5’-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG
dan primer reverse AF85 5’-GATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC yang
akan menghasilkan produk PCR sebesar 137 pb (Wilson et al. 2001). Primer yang
digunakan untuk mengamplifikasi ruas ekson 2 gen BMP15 adalah primer
forward AF86 5’-CTTCTTGTTACTGTATTTCAATGAGAC dan primer reverse
AF87 5’-GATGCAATACTGCCTGCTTG yang akan menghasilkan produk PCR
sebesar 135 pb (Hanrahan et al. 2004).
Analisis Gen BMPR1B dan BMP15
Menggunakan PCR-RFLP dan Sekuensing
Amplikon gen BMPR1B dipotong dengan enzim AvaII (G/GACC)
(Boehringer Mannheim, GmbH-Germany). Sebanyak 3 µL amplikon direaksikan
dengan enzim restriksi AvaII 7.5 U pada suhu 37 0C yang diinapkan semalaman.
Amplikon yang tidak terpotong disebut dengan tipe liar. Hewan tipe liar tidak
memiliki situs pemotongan sehingga panjang fragmen DNAnya tetap 137 pb.
Amplikon yang terpotong akan memiliki panjang fragmen DNA 109 pb dan 28 pb
disebut mutan homozigot carrier. Amplikon yang terpotong dan memiliki tiga
jenis fragmen DNA yaitu 137 pb, 109 pb dan 28 pb disebut mutan heterozigot
carrier.
Amplikon gen BMP15 dipotong dengan enzim Hinf I (G/ACT)
(Boehringer Mannheim, GmbH-Germany). Amplikon sebanyak 3 µL ditambah
enzim HinfI 7.5 U. Suspensi diinkubasi semalam pada suhu 37 0C. Amplikon
yang terpotong menjadi dua fragmen DNA masing-masing 110 pb dan 25 pb
disebut dengan hewan tipe liar. Amplikon yang tidak terpotong mempunyai
panjang fragmen DNA 135 pb disebut mutan FecXG .
Hasil PCR-RFLP kemudian diverifikasi dengan metode sekuensing.
Seluruh amplikon gen BMPR1B dicampur menjadi satu. Hal ini juga dilakukan
pada semua amplikon gen BMP15. Campuran amplikon dibagi menjadi dua
kelompok besar yaitu A (gen BMPR1B) dan B (gen BMP15). Sekuensing
9
dilakukan pada campuran amplikon A dan B menggunakan primer yang sama
dengan amplifikasi awal.
HASIL
Amplifikasi gen BMPR1B menggunakan primer AF84 dan AF85
menghasilkan fragmen DNA dengan panjang 137 pb (Gambar 2A). Hasil
pemotongan enzim AvaII (G/GACC) pada semua sampel memperlihatkan satu
pola yang sama, yaitu amplikon tidak terpotong (Gambar 2B).
1 2 3 4 5 6 M
1 2 3 4 5 6 M
2oo pb
2oo pb
137 pb
137 bp
1oo pb
1oo pb
A
B
Gambar 2 Amplikon gen BMPR1B (A) Amplikon awal (B) Amplikon setelah
dipotong dengan Ava II (M) Marker 100 pb (1-6) Kambing Muara.
Amplifikasi gen BMP15 menggunakan primer AF86 dan AF87
menghasilkan fragmen DNA dengan panjang 135 pb (Gambar 3A). Hasil
pemotongan dengan enzim HinfI (G/ACT) memperlihatkan bahwa semua sampel
terpotong menjadi 110 pb dan 25 pb (Gambar 3B).
1 2 3 4 5 6 M
1 2 3 4 5 6 M
2oo pb
2oo pb
135 pb
110 pb
100 pb
1oo pb
A
B
Gambar 3 Amplikon gen BMP15 ekson 2 (A) Amplikon awal (B) Amplikon
setelah dipotong dengan HinfI (M) Marker 100 pb (1-6) Kambing
Kacang.
Hasil analisis gen BMPR1B dan BMP15 berdasarkan PCR-RFLP pada kambing
Kacang, Samosir dan Muara ini kemudian diverifikasi dengan sekuensing. Hasil
10
sekuensing pada gen BMPR1B dari ketiga kambing lokal Indonesia menunjukkan
adanya mutasi substitusi G→T pada posisi basa nukleotida ke-72 (Gambar 4).
Pada hasil sekuensing nukleotida pada gen BMP15 ditemukan mutasi substitusi
G→A pada posisi basa nukleotida ke-43 (Gambar 5).
Gambar 4 Mutasi substitusi G→T gen BMPRIB nukleotida ke-72 pada kambing
Kacang, Samosir dan Muara.
Gambar 5 Mutasi substitusi G→A gen BMP15 nukleotida ke-43 pada kambing
Kacang, Samosir dan Muara.
PEMBAHASAN
Salah satu faktor yang menentukan keberhasilan metode PCR-RFLP
adalah kerja enzim restriksi yang maksimal. Satu unit enzim restriksi adalah
kemampuan untuk memotong substrat DNA sebanyak 1 μg dalam 50 μL reaksi
selama 60 menit. Pada penelitian ini, PCR-RFLP dilakukan dengan menggunakan
enzim restriksi yang cukup tinggi yaitu 7.5 U dan waktu yang cukup lama yaitu
diinkubasi selama semalam. Hal ini untuk menjamin bahwa semua amplikon
dapat terpotong dengan sempurna. Oleh karena itu, kondisi amplikon gen
BMPR1B yang tidak terpotong bukan disebabkan enzim restriksi tidak bekerja
dengan baik, tetapi disebabkan amplikon tidak memiliki situs pemotongan enzim
AvaII (G/GACC).
11
Hasil PCR-RFLP gen BMPR1B dan BMP15 pada kambing Kacang,
Samosir dan Muara menyimpulkan bahwa ketiga kambing lokal Indonesia
merupakan tipe liar. Ternak dengan genotip tipe liar bersifat non prolifik (Wilson
et al. 2001; Hanrahan et al. 2004). Hal ini berlawanan dengan fakta bahwa
beberapa sampel yang diperoleh di lapangan dari ketiga kambing lokal Indonesia
ini bersifat prolifik. Oleh karena itu, metode PCR-RFLP terhadap gen BMPR1B
dan BMP15 tidak dapat digunakan sebagai alat untuk mendeteksi sifat prolifik
pada ketiga kambing lokal Indonesia. Selain pada kambing Indonesia, metode
PCR-RFLP juga tidak bisa digunakan untuk mendeteksi sifat prolifik berdasarkan
gen BMPR1B dan BMP15 kambing lokal Iran (Deldar-Tajangookeh et al. 2009),
enam jenis kambing China, yaitu Boer, persilangan Boer x Huanghuai (BH),
Huanghuai, Haimen, Nubi dan Matou (Hua et al. 2008). Selain pada kambing,
metode
deteksi
sifat
prolifik
menggunakan
metode
PCR-RFLP
yang
dikembangkan oleh (Davis et al. 2002; Hanrahan et al. 2004), ternyata tidak bisa
bekerja dengan baik pada domba Sangsari Iran (Kasiriyan et al. 2009), 19 domba
prolifik dari berbagai negara (Davis et al. 2006), domba Shal (Ghaffari et al.
2009), lima jenis domba Mesir, yaitu Rahmani, Ossimi, Awassi, Barki dan
persilangan Awassi x Barki (EL-Hanafy & El-Saadani 2009), dan lima jenis
domba Mediterania dan Afrika Utara, yaitu Barbarine, Queue Fine de L’ Quest
(Tunisia), Noire de Thibar (Tunisia/Perancis), Sicilo-Sarde (Italia) dan D’man
(Maroko) (Vacca et al. 2010). Selain itu, Chu et al. (2010) mengungkapkan
bahwa polimorfisme gen BMPR1B pada kambing Jining Grey tidak berkorelasi
dengan sifat prolifik. Polley et al. (2009) menyatakan bahwa pada kambing Black
Bengal India, gen BMP15 adalah monomorfik, sedangkan polimorfisme pada gen
BMPR1B ditemukan berkorelasi dengan sifat prolifik.
Beberapa kejadian yang paralel dengan hasil PCR-RFLP gen BMPR1B
dan BMP15 yang monomorfik pada tiga kambing lokal Indonesia menunjukkan
bahwa SNP (single nucleotide polymorphisme) yang dijadikan dasar untuk
membuat metode PCR-RFLP hanya berlaku pada satu bangsa ternak saja. Hal ini
berarti analisis korelasi yang telah dibuat (Davis et al. 2002; Hanrahan et al. 2004)
hanya berlaku untuk satu bangsa ternak saja. Walaupun begitu, penetapan sifat
prolifik dalam penelitian ini adalah berbasis jumlah anak yang dilahirkan. Adapun
12
gen BMP1RB dan BMP15 bekerja pada sel granulosa (Dube et al.1998; Mulsant et
al. 2001) sehingga ada peluang kambing Kacang, Samosir dan Muara memiliki
lebih dari satu oosit yang diovulasikan.
SIMPULAN
Hasil PCR-RFLP gen BMPR1B dan BMP15 pada kambing Kacang,
Samosir dan Muara menunjukkan bahwa semua sampel merupakan tipe liar. Hasil
sekuensing pada kambing Kacang, Samosir dan Muara menunjukkan mutasi
substitusi G72T pada gen BMPR1B dan mutasi substitusi G43A pada gen BMP15.
Kedua mutasi ini tidak berkaitan dengan situs restriksi pada enzim AvaII dan
HinfI.
13
POLIMORFISME GEN BMP15 PADA KAMBING KACANG,
SAMOSIR DAN MUARA
PENDAHULUAN
Super famili Transforming Growth Factor β (TGF β) merupakan suatu
faktor pertumbuhan berupa molekul protein yang berfungsi sebagai sinyal ekstra
seluler. Super famili TGF β terdiri dari TGF β
1,2,3
, Anti Mullerian Hormone
(AMH), 2 Inhibin (A dan B), 3 Aktivin (A,B, dan AB), sekitar 20 macam Bone
Morphogenetic Protein (BMP1 – BMP20) dan setidaknya 9 Growth Differentiation
Factors (GDF1-GDF9) (Dirangkum oleh Knight dan Glister 2006).
Gen Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) atau FecX terletak di
kromosom X yang ekuivalen dengan Xp11.2-p11.4 pada manusia dan
diekspresikan hanya pada sel oosit (Galloway et al. 2000). BMP15 berfungsi
dalam mengatur proliferasi dan diferensiasi sel granulosa di awal perkembangan
folikel (Otsuka et al. 2000). Mutasi pada gen BMP15 dapat meningkatkan laju
ovulasi dan litter size pada mutan heterozigot carrier dan menyebabkan sifat steril
pada mutan homozigot carrier. Ada enam alel mutan pada Fec X yang telah
ditemukan yaitu lima alel berupa mutasi titik yaitu Fec XI (Inverdale), Fec XH
(Hanna), Fec XB (Belclare), Fec XG (Galway) dan Fec XL (Lacaune) (Galloway et
al. 2000; Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007) dan satu alel berupa mutasi
delesi 17 pb yaitu Fec XR (Rasa Aragonesa) (Martinez-Royo et al. 2008). Mutasi
substitusi pada Fec XI, Fec XL dan Fec XB menyebabkan adanya perubahan asam
amino non conserve berturut-turut pada posisi 31, 53 dan 99 pada proprotein
BMP15. Mutasi substitusi Fec XH dan Fec XG menyebabkan stop kodon prematur
berturut-turut pada posisi 291 dan 239 dari proprotein BMP15. Adapun mutasi
delesi (Fec XR) mengubah kerangka pembacaan kodon mRNA yang menyebabkan
stop kodon prematur pada posisi 208 dari proprotein BMP15.
Metode sekuensing merupakan pengembangan teknik yang berkaitan
dengan DNA. Metode ini menghasilkan informasi yang lebih akurat karena
berdasarkan pada perunutan nukleotida dari suatu fragmen DNA. Penelitian ini
bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman genetik gen BMP15 pada tiga
kambing lokal Indonesia yaitu kambing Kacang, Samosir dan Muara.
14
BAHAN DAN METODE
Sampel DNA dan Amplifikasi Gen BMP15
Jumlah dan jenis sampel DNA kambing yang dipergunakan sama dengan
sampel DNA pada bab sebelumnya. Amplifikasi gen BMP15 dilakukan dengan
mesin TaKaRa Thermal Cycler. Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi
gen BMP15 ekson 1 dan ekson 2 didesain dengan mengacu pada Capra hircus
breed Guizhou White berdasarkan data GenBank dengan No. Akses FJ429281
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Lampiran1). Pasangan primer forward AF218
5’-GATGCAAAGAGGACAATTTAGAAGACC dan primer reverse AF219 5’CCCACCAGAACAATATAGTATGATAACTC digunakan untuk amplifikasi ekson 1.
Amplifikasi ekson 2 dilakukan dengan menggunakan pasangan primer forward
AF222 5’-TGCAGGCTCCTGGCACATACAGAC dan primer reverse AF223 5’TCACCTGCATGTGCAGGACTGGG. Reaksi PCR dilakukan dalam volume 12 µL,
yang terdiri atas sampel DNA sekitar 10 ng, primer forward dan reverse masingmasing 0.5 µL 25 mM, dan KAPA Taq Ready Mix DNA polymerase 6 µL
(KAPATaq DNA polymerase 0.05 U/µL, bufer polimerase dengan Mg2+.25 mM
dan setiap dNTP masing-masing 0.4 mM). Kondisi PCR, yaitu predenaturasi 94
0
C, selama 5 menit, (denaturasi 94 0C, 60’, penempelan primer ekson 1 60 0C,
90’, pemanjangan 72 0C, 90’) sebanyak 30 siklus, pemanjangan akhir pada suhu
72 0C selama 10 menit, dan penyimpanan dilakukan pada suhu 4 0C. Kondisi PCR
untuk ekson 2 sama kecuali penempelan primer yaitu 64
0
C. Amplikon
dimigrasikan pada gel poliakrilamida 6% dengan penanda DNA Ladder 100 pb
(Generay Biotech) yang dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Byun et al. 2009).
Penentuan Genotip dengan Metode Sekuensing
Amplikon dari jenis kambing yang sama dicampur, sehingga ada tiga
kelompok besar yaitu sampel kambing Kacang (K), kambing Samosir (S), dan
kambing Muara (M). Proses sekuensing dilakukan pada hasil pencampuran
amplikon dengan menggunakan primer yang sama seperti proses amplifikasi awal.
Hasil sekuensing berupa grafik elektroforegram diedit secara manual dengan
software Bioedit versi 7.0.9.0 (Hall 1999). Urutan nukleotida yang sudah benar
15
kemudian disejajarkan dan dianalisis lebih lanjut dengan program MEGA4.0
(Tamura et al. 2007) dan Genetyx-win 4.1.
Analisis filogeni kambing lokal Indonesia dilakukan berdasarkan daerah
coding sequence gen BMP15 ekson 2 menggunakan metode Neighbour-joining
(NJ) dengan bootstrap 1000x. Data sekuen pembanding yang digunakan diperoleh
dari data GenBank yaitu Pongo abelii : XM_002831651, Pan troglodytes :
XM_529247,
Macaca
mulatta
:
XM_001083980,
Equus
caballus
:
XM_001496223, Jining Grey : EU743938, Homo sapiens : AF082350, Gallus
gallus : AY729025, Bos Taurus : DQ463368, Yunling Black : EU847284, Boer :
EU847289, Black Bengal : EU888137, Guizhou White : FJ429281, Markhoz :
GU732196, Ovis aries : AF236079, Mus musculus : NM_009757, Rattus
norvegicus : NM_021670, Bubalus bubalis : EF375880 dan Carassius gibelio :
HQ179985. (Lampiran 2 dan 3).
HASIL
Amplifikasi gen BMP15 ekson 1 yang diapit oleh primer forward AF218
dan primer reverse AF219 menghasilkan fragmen DNA sepanjang 574 pb
(Gambar 6A). Amplifikasi gen BMP15 ekson 2 yang diapit oleh primer forward
AF222 dan primer reverse AF223 menghasilkan fragmen DNA sepanjang 861 pb
(Gambar 6B).
1 2 3 4 5 6 M
1 2 3 4 5 6 M
861 pb
574 pb
100 pb
100 pb
A
B
Gambar 6 Amplikon gen BMP15 ekson 1 dan 2 pada kambing Kacang (A) ekson
1 = 574 pb (B) ekson 2 = 861 pb (M) Marker 100 pb (1-6) Kambing
Kacang.
Hasil sekuensing menunjukkan bahwa gen BMP15 pada daerah
ekson1 memiliki urutan nukleotida yang identik pada ketiga populasi kambing
lokal Indonesia (kambing Kacang, Samosir dan Muara). Pada daerah ekson 2
16
ditemukan 3 varian nukleotida yang berbeda antar populasi kambing lokal
Indonesia. Pada populasi kambing Kacang ditemukan dua macam mutasi
substitusi (Gambar 7). Pertama, transisi A→G pada posisi nukleotida ke-325 yang
bersifat mutasi bisu karena tidak menyebabkan perubahan asam amino ke-108
yaitu tetap sebagai lisin. Kedua, transversi C→G pada posisi nukleotida ke-398.
Mutasi ini bersifat mutasi netral karena menyebabkan perubahan asam glutamat
menjadi glutamin pada posisi asam amino ke-133 namun tidak merubah fungsi
protein.
A
B
Gambar 7 Mutasi substitusi gen BMP15 pada kambing Kacang (A) Mutasi
substitusi A325G (B) Mutasi substitusi C398G.
Gambar 8 Mutasi substitusi C34T pada kambing Muara.
Populasi kambing Muara menunjukkan satu mutasi substitusi C34T (Gambar 8).
Mutasi ini tidak menyebabkan adanya perubahan asam amino pada posisi ke-11
yaitu tetap sebagai leusin. Pada populasi kambing Samosir tidak ditemukan
adanya variasi nukleotida.
Hasil analisis pohon filogeni berdasarkan daerah coding sequence ekson 2
menunjukkan bahwa ketiga kambing lokal Indonesia berada dalam satu kelompok
17
dengan berbagai jenis kambing di dunia, seperti Boer, Ghuizou White, Black
Bengal, Markhoz, ataupun Yunling Black (Gambar 9).
Gambar 7 Pohon filogeni kambing lokal Indonesia berdasarkan daerah coding
sequence gen BMP15 ekson 2 menggunakan program MEGA 4
dengan metode Neighbour-joining dengan bootstrap 1000x. Angka di
percabangan menunjukkan nilai bootstrap.
Pada pohon filogeni tampak percabangan yang memisahkan kelompok hewan
yang bersifat monoovulasi dengan kelompok hewan yang bersifat poliovulasi
dengan nilai bootstrap 100. Kelompok hewan yang bersifat monoovulasi meliputi
beberapa hewan ruminansia dan primata. Kelompok hewan yang bersifat
poliovulasi terdiri atas Mus musculus dan Rattus norvegicus yang merupakan
hewan rodensia. Adapun Gallus gallus dan Carassius gibelio terlihat berada pada
kelompok terluar dalam pohon filogeni.
PEMBAHASAN
Gen BMP15 pada kambing terdiri dari dua ekson dan satu intron yang
menyandikan sebanyak 394 asam amino berdasarkan Capra hircus breed Guizhou
White
pada
basis
data
GenBank
dengan
No.
Akses
FJ429281
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Lampiran 1). Analisis sekuen gen BMP 15
18
menunjukkan bahwa ketiga populasi kambing lokal Indonesia (kambing Kacang,
Samosir dan Muara) memiliki urutan nukleotida yang identik pada ekson 1. Hal
ini kemungkinan karena pada daerah ekson 1 terdapat daerah yang menyandikan
bagian sinyal peptida dalam pembentukan protein BMP15 sehingga bersifat sangat
stabil. Ada enam alel mutan pada gen BMP15 yang telah diketahui berkorelasi
dengan sifat prolifik pada mutan heterozigot carrier dan menyebabkan sifat steril
pada mutan homozigot carrier. Mutasi pada keenam alel ini semuanya terjadi
pada bagian ekson 2 (Tabel 2).
Tabel 2. Alel mutan pada gen BMP15
Nama Alel
I
Mutasi DNA
Mutasi Protein
Ekson
Domba
Referensi
FecX (Inverdal)
T579A
V31D
2
Romney
Galloway et al. (2000)
FecXH (Hanna)
C544T
Q23stop
2
Romney
Galloway et al. (2000)
G
C718T
Q239Ter
2
B
G1100T
S99I
2
Belcrare
Hanrahan et al. (2004)
L
G635A
C53Y
2
Lacaune
Bodin et al. (2007)
FecX (Galway)
FecX (Belclare)
FecX (Lacaune)
R
FecX (R.Aragonesa) del c.525_541
W154NfsX55
2
Belcrare,Cambridge Hanrahan et al. (2004)
Rasa Aragonesa
Royo,A.M. et al (2008)
Polimorfisme ditemukan pada gen BMP15 ekson 2 tiga kambing lokal
Indonesia. Pada populasi kambing Kacang ditemukan ada dua jenis mutasi.
Pertama, mutasi bisu yaitu transisi A325G . Kedua, mutasi netral yaitu transversi
C398G yang menyebabkan perubahan asam glutamat menjadi glutamin namun
tidak merubah fungsi BMP15. Asam glutamat adalah asam amino yang bermuatan
negatif sedangkan glutamin adalah asam amino dengan rantai samping yang tidak
bermuatan. Populasi kambing Muara hanya mempunyai satu mutasi bisu yaitu
C34T, sedangkan populasi kambing Samosir tidak mengalami mutasi.
Fungsi BMP15 pada setiap spesies bersifat khas (specific species) terkait
dengan perbedaan laju ovulasi antar species (Hashimoto et al. 2005). BMP15 pada
mamalia berfungsi sebagai faktor pertumbuhan dan proliferasi sel granulosa.
BMP15 juga berperan dalam menghambat sensitivitas folikel terhadap Follicle
Stimulating Hormone (FSH) dengan menekan ekspresi dari reseptor FSH (Otsuka
et al. 2000). Penelitian yang dilakukan oleh Yan et al. (2001) menunjukkan bahwa
tikus yang sudah diinaktivasi (knock out) gen BMP15 nya tidak menunjukkan sifat
steril tetapi hanya mengalami penurunan laju ovulasi (sub fertil). Mc Mahon et al.
19
(2008) menyimpulkan bahwa sifat poliovulasi ini ternyata dipengaruhi oleh
jumlah ekspresi gen BMP15 yang lebih sedikit. Hal ini berdasarkan penelitiannya
dengan menggunakan tikus transgenik oocyt specific overexpression BMP15.
Mutasi gen BMP15 pada ruminansia kecil menyebabkan sifat prolifik pada
genotip heterozigot dan sifat steril pada genotip homozigot (Galloway et al. 2000;
Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007; Martinez-Royo et al. 2008). Zhang et al.
(2009) mengungkapkan bahwa pada beberapa jenis sapi ditemukan adanya mutasi
delesi 4 pb yang menyebabkan perubahan reading frame dan menghasilkan stop
kodon prematur, namun mutasi ini tidak berkorelasi dengan sifat prolifik pada
genotip heterozigot. Polimorfisme gen BMP15 pada manusia diketahui
berhubungan dengan human dizygotic (DZ) namun tidak signifikan (Zhao et al.
2008). Pada ikan zebra, BMP15 berfungsi untuk mencegah terjadinya
perkembangan dan pematangan prematur oosit dengan menekan sensitivitas
folikel terhadap maturation inducing hormone (MIH) pada pertumbuhan awal dari
folikel (Clelland et al. 2007).
SIMPULAN
Hasil sekuensing daerah ekson 1 menunjukkan bahwa kambing Kacang,
Samosir dan Muara memiliki urutan basa nukleotida yang identik. Polimorfisme
ditemukan pada daerah ekson 2 karena ada tiga varian mutan. Populasi kambing
Kacang memiliki dua jenis alel mutan yaitu A325G dan C398G. Pada Populasi
kambing Muara ada satu alel mutan yaitu C34T, sedangkan populasi kambing
Samosir tidak memiliki varian mutan. Analisis pohon filogeni memperlihatkan
bahwa kambing Kacang, Samosir dan Muara terletak dalam satu kelompok
dengan beberapa kambing lokal di dunia. Pada pohon filogeni tampak
percabangan yang memperlihatkan hubungan genetik antara kelompok hewan
monoovulasi dan poliovulasi.
20
21
PEMBAHASAN UMUM
Hasil PCR-RFLP gen BMPR1B dan BMP15 pada tiga kambing lokal
Indonesia (kambing Kacang, Samosir dan Muara) memperlihatkan bahwa semua
sampel monomorfik yaitu bersifat tipe liar. Metode deteksi PCR-RFLP gen
BMPR1B dan BMP15 seperti yang dilaporkan pada beberapa penelitian (Galloway
et al. 2000; Wilson et al. 2001; Davis et al. 2002; Hanrahan et al. 2004)
mengungkapkan bahwa sampel yang bersifat tipe liar adalah non prolifik. Hal ini
tidak sesuai dengan fakta bahwa beberapa sampel kambing Kacang, Samosir dan
Muara yang diperoleh di lapangan bersifat prolifik. Hasil sekuensing gen
BMPR1B dan BMP15 dengan primer yang sama ternyata memperlihatkan adanya
polimorfisme pada kedua gen tersebut. Namun alel mutan yang ditemukan pada
gen BMPR1B dan BMP15 ini tidak berkorelasi dengan situs pemotongan enzim
restriksi. Hal ini menyimpulkan bahwa metode PCR-RFLP gen BMPR1B dan
BMP15 ini tidak dapat digunakan sebagai alat deteksi pada populasi kambing
Kacang, Samosir dan Muara. Deteksi sifat prolifik berdasarkan metode PCRRFLP gen BMPR1B pada beberapa jenis domba Cina menunjukkan bahwa gen
FecB berkaitan dengan sifat prolifik yang tinggi pada ternak seperti Huyang,
Small Tail Han, Cele, Duolang dan Chinese Merino strain prolifik, sebaliknya
pada ternak yang bersifat non prolifik seperti Mongolia, Chinese Merino, Tan,
Xinjiang, Hulunbeier, Inner Mongolia FineWool dan Northeastern Half-fuzz tidak
ditemukan gen FecB. Adanya perbedaan distribusi gen FecB pada beberapa jenis
domba Cina menunjukkan bahwa gen BMPR1B sangat berkorelasi dengan
perbedaan bangsa pada ternak (Dirangkum oleh Hua & Yang 2009). Untuk
mengembangkan metode penanda genetik seperti Marker-assisted selection
membutuhkan tahapan yang cukup panjang sehingga harus diperhatikan rasio
antara keuntungan dan biaya yang dibutuhkan (Davis & DeNise 1998). Pada
penelitian ini, selanjutnya lebih difokuskan untuk mengidentifikasi keragaman
genetik gen BMP15 ekson 1 dan ekson 2 pada ketiga kambing lokal Indonesia.
Sifat prolifik secara alamiah disebabkan pematangan folikel yang terjadi
secara serentak sehingga menghasilkan lebih dari satu folikel matang. Gen
BMP15 mengekspresikan protein yang berfungsi sebagai sinyal molekular untuk
22
menginduksi kerja dari sistem hormonal selama proses pembentukan folikel.
Protein BMP15 memiliki dua peran penting yaitu pertama, sebagai faktor
pertumbuhan dan proliferasi sel granulosa. Kedua, menghambat sensitivitas
folikel terhadap FSH dengan menekan ekspresi dari reseptor FSH (Otsuka et al.
2000). Ada enam alel mutan pada gen BMP15 yang diketahui berkorelasi dengan
sifat prolifik pada genotip heterozigot carrier dan sifat steril pada genotip
homozigot carrier yaitu T579A, C544T, C718T, G1100T, G635A dan delesi
525_541 (Galloway et al. 2000; Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007;
Martinez-Royo et al. 2008).
Mutasi yang terjadi pada gen BMP15 diketahui dapat menyebabkan
pertumbuhan dan proliferasi sel granulosa menjadi terhambat, sebaliknya ekspresi
dari reseptor FSH menjadi maksimal. Hal ini menyebabkan terbentuknya
beberapa folikel yang lebih kecil dan lebih sensitif terhadap FSH. Folikel-folikel
ini kemudian mengalami pematangan dini (Fabr