Isolasi dan Pemurnian Bakteri dari Cairan Kantung Tumbuhan Fermentasi Isolat Bakteri Penyiapan Bakteri Uji Pengujian Aktivitas Antibakteri Supernatan Hasil Fermentasi

4.3 Metode Penelitian

4.3.1 Isolasi dan Pemurnian Bakteri dari Cairan Kantung Tumbuhan

Kantong Semar Sebanyak 10 mL cairan dari kantung tanaman kantong semar diambil secara aseptis, lalu disuspensikan dalam 10 mL kaldu nutrien dan diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu kamar. Satu ose suspensi ditanamkan pada agar nutrien pH 5,0 20 mL dalam cawan petri, lalu diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu kamar. Masing-masing koloni bakteri yang tumbuh ditanamkan kembali dalam agar nutrien baru. Biakan-biakan tersebut diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu kamar.

4.3.2 Fermentasi Isolat Bakteri

Biakan murni dari setiap isolat bakteri disuspensikan dalam air suling steril di tabung-tabung reaksi dengan bantuan vorteks. Kekeruhan biakan diatur agar sama dengan kekeruhan tabung Mc Farland No. III, yang sebanding dengan 10 3 sel bakterimL. Sebanyak 1 mL masing-masing suspensi 10 ditambahkan pada 19 mL kaldu nutrien dalam labu Erlenmeyer 50 mL. Seluruh biakan dikocok di atas pengocok orbital dengan kecepatan 200 rpm selama 48 jam pada suhu kamar. Cairan hasil fermentasi dimasukkan ke tabung-tabung Eppendorf 1,5 mL, lalu disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm. Supernatannya dipindahkan ke tabung baru, sedangkan endapan sel bakteri dibuang.

4.3.3 Penyiapan Bakteri Uji

Biakan murni dari kedua bakteri uji Escherichia coli dan Bacillus subtilis disuspensikan dalam air suling steril di tabung reaksi dengan bantuan vorteks. Kekeruhan biakan diatur agar sama dengan kekeruhan tabung Mc Farland No. III.

4.3.4 Pengujian Aktivitas Antibakteri Supernatan Hasil Fermentasi

terhadap Bakteri Uji Masing-masing 0,2 mL suspensi bakteri E. coli dan B. substilis 1 ditambahkan ke 20 mL agar nutrien cair dalam cawan petri, dihomogenkan, lalu dibiarkan membeku pada suhu kamar. Setelah membeku, agar tersebut dilubangi menggunakan perforator. Sebanyak 50 µL supernatan dimasukkan ke dalam masing-masing lubang pencadang menggunakan mikropipet, lalu diinkubasikan selama 18-24 jam dalam inkubator bersuhu 37-38 C. Zone hambat bening yang terjadi di sekitar lubang pencadang diamati dan diukur.

4.3.5 Identifikasi Isolat Bakteri Penghasil Senyawa Antibakteri A.