Peranan β Karoten dan Nutrasetikal Galohgor dalam Proliferasi, Diferensiasi, dan Ekspresi Gen pada Sel Epitel Usus (CMT 93) dan Mammae (HC11)
PERANAN β-KAROTEN DAN NUTRASETIKAL GALOHGOR DALAM
PROLIFERASI, DIFERENSIASI, DAN EKSPRESI GEN SEL EPITEL
USUS (CMT-93) DAN SEL KELENJAR MAMMAE (HC11)
KATRIN ROOSITA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Peranan β-Karoten
dan Nutrasetikal Galohgor dalam Proliferasi, Diferensiasi, dan Ekspresi Gen pada
Sel Epitel Usus (CMT-93) dan Sel Kelenjar Mammae (HC11) adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2014
Katrin Roosita
NIM I160200951
RINGKASAN
Katrin Roosita. Peranan β-Karoten dan Nutrasetikal Galohgor dalam Proliferasi,
Diferensiasi, dan Ekspresi Gen pada Sel Epitel Usus (CMT-93) dan Sel Kelenjar
Mammae (HC11). Dibimbing oleh RIMBAWAN, ITA DJUWITA, M. RIZAL
M. DAMANIK, dan CLARA M. KUSHARTO.
Pangan yang memiliki khasiat untuk kesehatan, baik untuk pencegahan
maupun pengobatan, disebut sebagai nutrasetikal (Kalra 2003; Syamsudin 2013).
Salah satu nutrasetikal yang biasa dikonsumsi oleh masyarakat Sunda secara turun
temurun untuk meningkatkan kesehatan dan produksi air susu ibu (ASI),
khususnya pada masa nifas (postpartum), adalah Galohgor. Nutrasetikal
Galohgor terbuat dari 56 jenis tanaman. Selain mengandung berbagai senyawa
aktif dan berbagai jenis zat gizi makro, yang cukup banyak terdapat dalam
nutrasetikal Galohgor adalah β-karoten (Roosita et al. 2003; Pratiwi 2010).
β-karoten merupakan provitamin A yang dapat diubah menjadi retinal,
retinol, atau asam retinoat pada berbagai sel tubuh (Bhatti et al. 2003).
Metabolisme retinal menjadi asam retinoat memerlukan serangkaian enzim
aldehida dehidrogenase yang merupakan hasil ekspresi kelompok gen ALDH
(Jackson et al. 2011).
Asam retinoat berperan dalam pengaturan ekspresi gen koneksin. Koneksin
adalah molekul protein yang menyusun gap junction. Gap junction merupakan
struktur pada membran sel berupa saluran penghubung antara dua sel yang
berdekatan atau bertetangga (Baldi et al. 2008; Gropper et al. 2009; Solomon
2001).
Struktur gap junction sangat dominan pada sel-sel kelenjar mammae yang
aktif mensintesis kasein, yaitu pada periode laktogenesis. Perkembangan gap
junction yang baik sangat penting untuk mempertahankan sintesis dan sekresi air
susu (ASI) karena peranannya dalam menjaga permeabilitas membran sitoplasma,
metabolisme, dan diferensiasi sel (Cruciani dan Mikalsen 2006; Neville 2009;
Talhouk et al. 2005).
Sebagian besar zat gizi untuk proses fisiologis dan metabolisme dalam
tubuh, termasuk sintesis susu, berasal dari makanan hasil proses penyerapan zat
gizi di sel usus. Sel usus dan sel mammae memiliki perbedaan peranan dalam
tubuh serta memiliki lingkungan intraseluler dan ekstraseluler yang berbeda. Oleh
karena itu, dalam studi in vitro ini digunakan sel galur murni CMT-93 dan HC11.
CMT-93 mampu menunjukkan fenotipe sel epitel usus, sedangkan sel HC11
dengan induksi hormon dan faktor pertumbuhan dapat menunjukkan fenotipe
kelenjar mammae pada kondisi in vivo.
Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa β-karoten dalam
nutrasetikal Galohgor berperan dalam proses laktogenesis dan menganalisis
mekanisme β-karoten dalam nutrasetikal Galohgor dalam proliferasi, diferensiasi,
dan ekspresi gen pada sel epitel usus (CMT-93) dan sel kelenjar mammae
(HC11).
Penelitian ini dilaksanakan di tiga laboratorium utama, yaitu Laboratory of
Food and Enviromental Science, Division Food Science and Biotechnology,
Faculty of Agriculture, Kyoto University, Japan; dan Laboratorium Embriologi
dan Laboratorium Layanana Terpadu, Fakultas Kedokteran Hewan IPB.
Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari hingga Oktober 2013.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain β-karoten dengan
kemurnian 99% (Sigma) yang dilarutkan dalam pelarut tetrahydrofuran (THF)
(Sigma) hingga konsentrasi akhir dalam medium 1.25%. Nutrasetikal Galohgor
dibuat dari 56 jenis tanaman dengan dua metode berbeda, yaitu drum dryer untuk
Galohgor serbuk, dan ekstraksi menggunakan etanol untuk Galohgor ekstrak.
Medium kultur sel terdiri atas DMEM (Gibco) dan RPMI 1640 (Biowest). Jenis
antibiotik yang digunakan meliputi penisilin, streptomisin, dan gentamisin.
Hormon dan faktor pertumbuhan yang digunakan untuk proliferasi dan
diferensiasi HC11 meliputi insulin, EGF, hidrokortison, dan prolaktin (Sigma).
Serum yang digunakan untuk kedua jenis sel adalah heat-inactivated Fetal Bovine
Serum (FBS). Kit 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
(MTT) (Roche) digunakan untuk analisis proliferasi sel. Kit Rneasy (Qiagen)
digunakan untuk isolasi RNA dan One-Step RT-PCR Pre Mix Kit (Intron
Biotechnology) digunakan untuk analisis reverse transriptase polymerase chain
reaction (RT PCR).
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan metode in vitro
menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). Kontrol dan perlakuan ditentukan
dengan perbedaan konsentrasi β-karoten dalam larutan medium, yaitu sebesar 0,
0.5, 1.5, dan 5.0 µM/mL. Unit percobaan dalam penelitian ini adalah sel epitel
saluran cerna (CMT-93) dan sel kelenjar mammae (HC11) dalam cawan kultur.
Jumlah ulangan parameter ekspresi gen dan diferensiasi sel berjumlah tiga atau
empat, sedangkan untuk proliferasi sel masing-masing enam ulangan.
Konsentrasi sel pada awal kultur dalam setiap cawan/ulangan sebesar 1 x 105
sel/mL.
Parameter yang diamati meliputi: 1) proliferasi sel dengan MTT assays; 2)
morfologi sel dengan pengamatan langsung di bawah mikroskop fluorescent dan
inverted (Olympus), 3) morfologi mammosfer untuk identifikasi diferensiasi sel
mammae, 4) ekspresi gen Aldh1a2, casein (Csn2), dan koneksin 43 (Cx43)
dengan metode RT-PCR dan gel elektroforesis.
Data yang telah terkumpul ditabulasi dan semua data kualitatif disajikan
secara deskriptif. Data kuantitatif diuji dengan menggunakan Analysis of
Variance (ANOVA) yang dilanjutkan dengan uji lanjut menggunakan uji Duncan
untuk menentukan beda nyata antar perlakuan.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa β-karoten dan Galohgor ekstrak (GE)
pada konsentrasi suprafisiologis[5.0μM] dapat menekan proliferasi sel epitel usus
(CMT-93) secara signifikan (p
PROLIFERASI, DIFERENSIASI, DAN EKSPRESI GEN SEL EPITEL
USUS (CMT-93) DAN SEL KELENJAR MAMMAE (HC11)
KATRIN ROOSITA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Peranan β-Karoten
dan Nutrasetikal Galohgor dalam Proliferasi, Diferensiasi, dan Ekspresi Gen pada
Sel Epitel Usus (CMT-93) dan Sel Kelenjar Mammae (HC11) adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2014
Katrin Roosita
NIM I160200951
RINGKASAN
Katrin Roosita. Peranan β-Karoten dan Nutrasetikal Galohgor dalam Proliferasi,
Diferensiasi, dan Ekspresi Gen pada Sel Epitel Usus (CMT-93) dan Sel Kelenjar
Mammae (HC11). Dibimbing oleh RIMBAWAN, ITA DJUWITA, M. RIZAL
M. DAMANIK, dan CLARA M. KUSHARTO.
Pangan yang memiliki khasiat untuk kesehatan, baik untuk pencegahan
maupun pengobatan, disebut sebagai nutrasetikal (Kalra 2003; Syamsudin 2013).
Salah satu nutrasetikal yang biasa dikonsumsi oleh masyarakat Sunda secara turun
temurun untuk meningkatkan kesehatan dan produksi air susu ibu (ASI),
khususnya pada masa nifas (postpartum), adalah Galohgor. Nutrasetikal
Galohgor terbuat dari 56 jenis tanaman. Selain mengandung berbagai senyawa
aktif dan berbagai jenis zat gizi makro, yang cukup banyak terdapat dalam
nutrasetikal Galohgor adalah β-karoten (Roosita et al. 2003; Pratiwi 2010).
β-karoten merupakan provitamin A yang dapat diubah menjadi retinal,
retinol, atau asam retinoat pada berbagai sel tubuh (Bhatti et al. 2003).
Metabolisme retinal menjadi asam retinoat memerlukan serangkaian enzim
aldehida dehidrogenase yang merupakan hasil ekspresi kelompok gen ALDH
(Jackson et al. 2011).
Asam retinoat berperan dalam pengaturan ekspresi gen koneksin. Koneksin
adalah molekul protein yang menyusun gap junction. Gap junction merupakan
struktur pada membran sel berupa saluran penghubung antara dua sel yang
berdekatan atau bertetangga (Baldi et al. 2008; Gropper et al. 2009; Solomon
2001).
Struktur gap junction sangat dominan pada sel-sel kelenjar mammae yang
aktif mensintesis kasein, yaitu pada periode laktogenesis. Perkembangan gap
junction yang baik sangat penting untuk mempertahankan sintesis dan sekresi air
susu (ASI) karena peranannya dalam menjaga permeabilitas membran sitoplasma,
metabolisme, dan diferensiasi sel (Cruciani dan Mikalsen 2006; Neville 2009;
Talhouk et al. 2005).
Sebagian besar zat gizi untuk proses fisiologis dan metabolisme dalam
tubuh, termasuk sintesis susu, berasal dari makanan hasil proses penyerapan zat
gizi di sel usus. Sel usus dan sel mammae memiliki perbedaan peranan dalam
tubuh serta memiliki lingkungan intraseluler dan ekstraseluler yang berbeda. Oleh
karena itu, dalam studi in vitro ini digunakan sel galur murni CMT-93 dan HC11.
CMT-93 mampu menunjukkan fenotipe sel epitel usus, sedangkan sel HC11
dengan induksi hormon dan faktor pertumbuhan dapat menunjukkan fenotipe
kelenjar mammae pada kondisi in vivo.
Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa β-karoten dalam
nutrasetikal Galohgor berperan dalam proses laktogenesis dan menganalisis
mekanisme β-karoten dalam nutrasetikal Galohgor dalam proliferasi, diferensiasi,
dan ekspresi gen pada sel epitel usus (CMT-93) dan sel kelenjar mammae
(HC11).
Penelitian ini dilaksanakan di tiga laboratorium utama, yaitu Laboratory of
Food and Enviromental Science, Division Food Science and Biotechnology,
Faculty of Agriculture, Kyoto University, Japan; dan Laboratorium Embriologi
dan Laboratorium Layanana Terpadu, Fakultas Kedokteran Hewan IPB.
Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari hingga Oktober 2013.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain β-karoten dengan
kemurnian 99% (Sigma) yang dilarutkan dalam pelarut tetrahydrofuran (THF)
(Sigma) hingga konsentrasi akhir dalam medium 1.25%. Nutrasetikal Galohgor
dibuat dari 56 jenis tanaman dengan dua metode berbeda, yaitu drum dryer untuk
Galohgor serbuk, dan ekstraksi menggunakan etanol untuk Galohgor ekstrak.
Medium kultur sel terdiri atas DMEM (Gibco) dan RPMI 1640 (Biowest). Jenis
antibiotik yang digunakan meliputi penisilin, streptomisin, dan gentamisin.
Hormon dan faktor pertumbuhan yang digunakan untuk proliferasi dan
diferensiasi HC11 meliputi insulin, EGF, hidrokortison, dan prolaktin (Sigma).
Serum yang digunakan untuk kedua jenis sel adalah heat-inactivated Fetal Bovine
Serum (FBS). Kit 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
(MTT) (Roche) digunakan untuk analisis proliferasi sel. Kit Rneasy (Qiagen)
digunakan untuk isolasi RNA dan One-Step RT-PCR Pre Mix Kit (Intron
Biotechnology) digunakan untuk analisis reverse transriptase polymerase chain
reaction (RT PCR).
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan metode in vitro
menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). Kontrol dan perlakuan ditentukan
dengan perbedaan konsentrasi β-karoten dalam larutan medium, yaitu sebesar 0,
0.5, 1.5, dan 5.0 µM/mL. Unit percobaan dalam penelitian ini adalah sel epitel
saluran cerna (CMT-93) dan sel kelenjar mammae (HC11) dalam cawan kultur.
Jumlah ulangan parameter ekspresi gen dan diferensiasi sel berjumlah tiga atau
empat, sedangkan untuk proliferasi sel masing-masing enam ulangan.
Konsentrasi sel pada awal kultur dalam setiap cawan/ulangan sebesar 1 x 105
sel/mL.
Parameter yang diamati meliputi: 1) proliferasi sel dengan MTT assays; 2)
morfologi sel dengan pengamatan langsung di bawah mikroskop fluorescent dan
inverted (Olympus), 3) morfologi mammosfer untuk identifikasi diferensiasi sel
mammae, 4) ekspresi gen Aldh1a2, casein (Csn2), dan koneksin 43 (Cx43)
dengan metode RT-PCR dan gel elektroforesis.
Data yang telah terkumpul ditabulasi dan semua data kualitatif disajikan
secara deskriptif. Data kuantitatif diuji dengan menggunakan Analysis of
Variance (ANOVA) yang dilanjutkan dengan uji lanjut menggunakan uji Duncan
untuk menentukan beda nyata antar perlakuan.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa β-karoten dan Galohgor ekstrak (GE)
pada konsentrasi suprafisiologis[5.0μM] dapat menekan proliferasi sel epitel usus
(CMT-93) secara signifikan (p