Sintesis Lacto N Biose I Secara Enzimatis Dari Laktosa Dan Glcnac Menggunakan Enzim Lactose Phosphorylase Dan Lacto N Biose I Phosphorylase

SINTESIS LACTO-N-BIOSE I SECARA ENZIMATIS DARI
LAKTOSA DAN GlcNAc MENGGUNAKAN ENZIM
LACTOSE PHOSPHORYLASE DAN LACTO-N-BIOSE I
PHOSPHORYLASE

WARSONO EL KIYAT

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2017

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Sintesis Lacto-N-Biose I
secara Enzimatis dari Laktosa dan GlcNAc Menggunakan Enzim Lactose
Phosphorylase dan Lacto-N-Biose I Phosphorylase adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada
perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2017
Warsono El Kiyat
NIM F251140431

RINGKASAN
WARSONO EL KIYAT. F251140431. Sintesis Lacto-N-Biose I secara Enzimatis
dari Laktosa dan GlcNAc Menggunakan Enzim Lactose Phosphorylase dan LactoN-Biose I Phosphorylase. Di bawah bimbingan SLAMET BUDIJANTO dan
ELVIRA SYAMSIR.
Lacto-N-biose I (LNB) merupakan salah satu jenis prebiotik yang saat ini
telah banyak dikaji khususnya terkait aktivitasnya sebagai bifidus factor. Beberapa
penelitian melaporkan bahwa LNB secara signifikan dapat meningkatkan aktivitas
mikroflora yang hidup di dalam usus bayi dan balita. Senyawa ini secara alami
terdapat di dalam human milk oligosaccharide, akan tetapi seiring dengan
perkembangan teknologi, LNB dapat disintesis secara enzimatis. Saat ini, sintesis
LNB telah banyak dilakukan, akan tetapi rendemen yang dihasilkan masih rendah
dan membutuhkan waktu sintesis yang lama. Oleh karena itu, diperlukan metode
yang efisien untuk menghasilkan rendemen tinggi dan dilakukan dengan waktu
proses yang singkat. Diketahui bahwa enzim, substrat dan fosfat pada sintesis LNB

diyakini dapat mempengaruhi rendemen yang dihasilkan.
Pada penelitian ini, dilakukan sintesis LNB secara enzimatis dari laktosa dan
GlcNAc dengan menggunakan enzim lactose phosphorylase (LP) dan lacto-Nbiose I phosphorylase (LNBP) sebagai katalis. Tujuan penelitian ini yaitu untuk
melakukan purifikasi dan karakterisasi enzim LP dan LNBP yang digunakan untuk
sintesis LNB. Selain itu diteliti juga pengaruh penambahan enzim, substrat dan
fosfat terhadap rendemen LNB yang dihasilkan.
Preparasi kultur bakteri dilakukan meliputi transformasi plasmid, prekulturisasi dan kulturisasi bakteri. Kemudian dilanjutkan dengan purifikasi enzim
dengan menggunakan kromatografi afinitas ion logam imobilisasi seperti: preparasi
kolom, pemurnian enzim dan konsentrasi enzim. Setelah itu, dilakukan
karakterisasi enzim untuk menentukan aktivitas enzim pada berbagai suhu inkubasi,
pH dan konsentrasi substrat. Selanjutnya, dilakukan analisis secara kuantitatif dari
sintesis LNB menggunakan high performance liquid chromatography.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kondisi optimum katalisis enzim LP
terjadi pada suhu 37oC, pH 6 dengan konsentrasi substrat 15 mM, sedangkan
kondisi optimum katalisis enzim LNBP terjadi pada suhu 35oC, pH 7 dengan
konsentrasi substrat 10 mM. Aktivitas spesifik enzim LP cukup tinggi (18,64 U/mg),
sementara enzim LNBP sangat kecil (0,013 U/mg). Peningkatan konsentrasi enzim
LP dan fosfat pada sintesis LNB tidak mempengaruhi rendemen yang dihasilkan,
sedangkan konsentrasi substrat berpengaruh nyata terhadap rendemen. Sintesis
LNB dari laktosa dan GlcNAc menggunakan enzim LP dan LNBP mampu

menghasilkan rendemen hingga 75,3%. Metode ini dapat digunakan sebagai
alternatif untuk sintesis LNB dari substrat yang lebih murah yang banyak tersedia
di alam.
Kata kunci: prebiotik, lacto-N-biose I, laktosa, GlcNAc, LP, LNBP

SUMMARY
WARSONO EL KIYAT. F251140431. Enzymatic Synthesis of Lacto-N-Biose I
from Lactose and GlcNAc using Lactose Phosphorylase and Lacto-N-Biose I
Phosphorylase. Supervised by SLAMET BUDIJANTO and ELVIRA SYAMSIR.
Lacto-N-biose I (LNB) is prebiotic that has been studied especially its activity
as bifidus factor. Recent studies reported LNB significantly increases the
population of infant’s intestinal microorganisms. This compound naturally exists as
core structure in human milk oligosaccharide. Practically, LNB can be synthesized
by the enzymatic reaction but the yield is relatively low and it takes a long time.
However, it is important to develop an efficient method of LNB synthesis to obtain
a high yield of LNB in a shorter time incubation. In the enzymatic synthesis of LNB,
enzyme, phosphate and substrate are known to affect the yield.
In this study, enzymatic synthesis of LNB from lactose and GlcNAc was
carried out by using lactose phosphorylase (LP) and lacto-N-biose I phosphorylase
(LNB) as catalysts. This study aimed to purify and characterize LP and LNBP as

enzymatic agents of LNB synthesis. Furthermore, the effect of enzyme, phosphate,
and substrate on the yield of LNB was evaluated.
Preparation of bacteria culture was carried includes transformation of plasmid,
preculture, and culturing bacteria. The enzymes were purified using immobilized
metal ion affinity chromatography (IMAC) which covered: preparation of the
column, enzyme purification, and enzyme concentration. Furthermore, the enzymes
were characterized to determine its activity in different incubation temperatures, pH
and substrate concentrations. The LNB concentration was determined
quantitatively by high-performance liquid chromatography.
The results showed that the optimum condition of LP was obtained in 15 mM
substrate, 37oC and pH 6, while LNBP optimally phosphorylazed 10 mM substrate
in 35oC and pH 7. The specific activity of LP was high (18.64 U/mg), but the
specific activity LNBP was relatively low (0.013 U/mg). Increasing of LP and
phosphate concentration did not affect yield. Furthermore, the addition of substrate
significantly increased the yield. Enzymatic synthesis of LNB from lactose and
GlcNAc produced the yield up to 75.3%. This enzymatic synthesis may be
applicable to be an alternative of LNB synthesis.
Keywords: prebiotic, lacto-N-biose I, lactose, GlcNAc, LP, LNBP

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2017

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

SINTESIS LACTO-N-BIOSE I SECARA ENZIMATIS DARI
LAKTOSA DAN GlcNAc MENGGUNAKAN ENZIM
LACTOSE PHOSPHORYLASE DAN LACTO-N-BIOSE I
PHOSPHORYLASE

WARSONO EL KIYAT

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Pangan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2017

Penguji luar komisi pada ujian tesis: Dr-Ing. Azis Boing Sitanggang, STP MSc

Judul Tesis : Sintesis Lacto-N-Biose I secara Enzimatis dari Laktosa dan
GlcNAc Menggunakan Enzim Lactose Phosphorylase dan
Lacto-N-Biose I Phosphorylase
Nama
: Warsono El Kiyat
NIM
: F251140431

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Prof Dr

Ir

Slamet Budiianto. MApr
Ketua

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Ilmu Pangan

Dr Ir Harsi Dewantari Kusumaningrum

Tanggal Ujian: 6 Januari 2017

ranggal

Lulus:

1

2 JAN 2017

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Subhanahu Wa Ta’ala atas
limpahan rahmat dan segala karunia-Nya sehingga penulisan tesis ini dapat
diselesaikan. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Ir. Slamet
Budijanto, M.Agr selaku ketua komisi pembimbing yang telah mencurahkan waktu
dan pemikirannya untuk membantu penulis dalam menyelesaikan studi dan tugas
akhir. Terima kasih kepada anggota komisi pembimbing Dr. Ir. Elvira Syamsir, MSi
yang telah banyak memberikan saran dan bimbingan sehingga penelitian tesis ini
dapat diselesaikan. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Prof. Dr.
Haruhide Mori, BSc. MAgr dan Dr. Wataru Sabrui, BSc. MAgr yang telah
mengizinkan penulis untuk melaksanakan penelitian di Laboratorium Biokimia
Fakultas Pertanian Universitas Hokkaido serta menyediakan waktunya dalam
membimbing penulis selama penelitian. Kepada dosen penguji sidang tesis, Dr.Ing. Azis Boing Sitanggang, STP, MSc, terima kasih telah membantu penulis dalam
menyelesaikan studinya sehingga akhirnya penulis mendapatkan gelar magister
sains.
Ungkapan terima kasih tak terhingga dihaturkan kepada Abah Caskiyat, Mine
Sawi, Kang Darya, Yu Tarsinah, Kang Wita, Mba Era, Mas Qodir, Mba Ninda,
Tika, Rike Diana dan seluruh keluarga yang senantiasa memberikan doa dan

dukungan sehingga penulis bisa mencapai tahap ini. Terima kasih kepada temanteman Program Studi Ilmu Pangan IPB, Bogor Science Club, Komunitas One Day
One Journal, PPI Hokkaido dan PPI Polandia yang telah memberikan dukungan
dan bantuannya kepada penulis.
Akhir kata, penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang
telah membantu dalam penyusunan tesis ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2017
Warsono El Kiyat

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

ix

DAFTAR GAMBAR

ix

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang

Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Hipotesis
Manfaat Penelitian

1
1
3
4
4
4

2 TINJAUAN PUSTAKA
Prebiotik bagi Kesehatan Bayi
Aktivitas Prebiotik HMO (Human Milk Oligosaccharide)
Lacto-N-Biose I sebagai Prebiotik
Sintesis Lacto-N-Biose I
Laktosa
GlcNAc (2-Acetomido-2-Deoxy-D-Glucose)
Gal1P (α-D-Galactose 1-Phosphate)

Enzim Lactose Phosphorylase (LP)
Enzim Lacto-N-Biose I Phosphorylase (LNBP)

5
5
5
6
8
10
10
10
11
11

3 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan dan Alat
Tahapan Penelitian
Prosedur Penelitian
Preparasi Kultur Bakteri
Purifikasi Enzim dengan Kromatografi Afinitas Ion Logam
Imobilisasi
Karakterisasi Enzim LP
Karakterisasi Enzim LNBP
Sintesis Lacto-N-Biose I
Rancangan Penelitian dan Analisis Data

12
12
12
12
13
13
14
15
16
17
18

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Enzim Lactose Phosphorylase
Suhu Optimum Enzim LP
Nilai pH Optimum Enzim LP
Konsentrasi Substrat Optimum Enzim LP
Nilai KM dan Vmaks Enzim LP
Karakteristik Enzim Lacto-N-Biose I Phosphorylase
Suhu Optimum Enzim LNBP
Nilai pH Optimum Enzim LNBP
Konsentrasi Substrat Optimum Enzim LNBP
Nilai KM dan Vmaks Enzim LNBP
Sintesis Lacto-N-Biose I pada Berbagai Konsentrasi Enzim LP

19
19
19
20
21
22
22
22
23
24
25
26

Sintesis Lacto-N-Biose I pada Berbagai Konsentrasi Fosfat
Sintesis Lacto-N-Biose I pada Berbagai Konsentrasi Substrat

27
29

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

30
30
31

DAFTAR PUSTAKA

32

RIWAYAT HIDUP

38

DAFTAR TABEL
1 Penelitian aktivitas prebiotik lacto-N-biose I pada berbagai
mikroorganisme
2 Penelitian sintesis lacto-N-biose I
3 Komposisi bahan pada formula 1, 2, 3, 4, 5 dan 6

7
9
17

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

Skema reaksi kimia sintesis lacto-N-biose I
Struktur kimia lacto-N-biose I
Diagram alir tahapan penelitian
Pola aktivitas fosforolitik enzim LP pada berbagai suhu
Pola aktivitas fosforolitik enzim LP pada berbagai pH
Pola aktivitas fosforolitik enzim LP pada berbagai konsentrasi
substrat
Pola aktivitas fosforolitik enzim LNBP pada berbagai suhu
Pola aktivitas fosforolitik enzim LNBP pada berbagai pH
Pola aktivitas fosforolitik enzim LNBP pada berbagai konsentrasi
substrat
Grafik Linewaever-Burk aktivitas fosforolitik enzim LNBP
Perubahan konsentrasi LNB selama waktu inkubasi pada berbagai
konsentrasi enzim LP
Perubahan konsentrasi LNB selama waktu inkubasi pada berbagai
konsentrasi fosfat
Persamaan reaksi sintesis LNB dari laktosa dan GlcNAc
Perubahan konsentrasi LNB selama waktu inkubasi pada berbagai
konsentrasi substrat

4
6
13
19
19
21
23
24
25
26
26
28
29
29

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penyakit pada bayi dan balita merupakan masalah yang berhubungan
dengan status kesehatan bayi di Indonesia. Penyakit yang umumnya terjadi pada
bayi dan balita yaitu gastroenteritis (Bartrick and Reindhold 2010). Penyakit ini
terjadi sebagai akibat dari aktivitas mikroorganisme patogen yang menyebabkan
sistem imun di dalam usus bayi terganggu. Penurunan populasi bakteri baik seperti
bifidobakteri yang melindungi sistem pencernaan di dalam tubuh merupakan
manifestasi dari gejala infeksi tersebut yang diakibatkan oleh ketersediaan sumber
karbon dan nitrogen yang terbatas di dalam usus yang notabene dijadikan sebagai
nutrien bagi bifidobakteri. Sebenarnya, penyakit tersebut dapat dicegah dengan
pemberian ASI secara intensif. ASI mengandung senyawa oligosakarida yang
berfungsi sebagai prebiotik dan merupakan komponen terpenting dari ASI selain
protein dan lemak (Picciano 2001; Vandenplas 2003). Diketahui lebih dari 130 jenis
oligosakarida yang terdapat pada ASI (Coppa et al. 2006a).
Human Milk Oligosaccharides (HMO) adalah campuran oligosakarida yang
terkandung di dalam ASI dan merupakan salah satu komponen penyusun utama
selain laktosa dan lemak (Morrow et al. 2005). Oligosakarida yang terlarut pada
ASI (HMO) memiliki jumlah yang lebih banyak serta memiliki struktur yang
kompleks (Tao et al. 2011), dimana tersusun lebih dari 200 struktur molekul yang
bervariasi (Coppa et al. 2006b; Bode 2006; Ninonuevo et al. 2006) yang secara
signifikan berbeda dengan oligosakarida prebiotik lain seperti fruktooligosakarida
(FOS) dan galaktooligosakarida (GOS) (Fanaro et al. 2005). Struktur inti dari HMO
itu sendiri yaitu unit lacto-N-biose I dan N-acetyllactosamine dengan ikatan β1-3
dan β1-6 (Totten et al. 2012). Dikarenakan kompleksitas strukturnya, komposisi
HMO di dalam ASI tidak dapat ditiru pada susu formula (Stahl et al. 1994; Sarney
et al. 2000; Manning dan Gibson 2004; German et al. 2008; Guarner 2009; Taylor
et al. 2009).
HMO diyakini dapat merangsang pertumbuhan bifidobakteri pada saluran
pencernaan sekaligus melindungi dari mikroorganisme patogen (Daddaoua et al.
2006). HMO diduga berperan penting dalam perkembangan bayi dan memiliki
fungsi prebiotik serta memiliki efek positif dalam mengurangi aktivitas bakteri
patogen pada usus (Lane et al. 2010). Selain itu, HMO memiliki efek modulasi pada
aktivitas imunologi yang berkaitan dengan jaringan limfoid (Guarner 2009) dan
dapat menurunkan permeabilitas usus pada bayi prematur pada post-natal pertama
(Taylor et al. 2009). HMO lebih dari sekedar substrat yang menstimulasi
pertumbuhan mikroorganisme yang diinginkan dalam usus bayi (Oliveira et al.
2015).
Prebiotik adalah ingredien pangan yang tidak dapat dicerna, yang dikonsumsi
untuk memberikan manfaat bagi tubuh melalui pertumbuhan dan/atau aktivitas
mikroorganisme usus sehingga memberikan efek kesehatan bagi tubuh
(Vandenplas et al. 2011). Istilah prebiotik ini mulai banyak digunakan sejak tahun
1995 (Gibson dan Roberfroid 1995). Antarini (2011) menjelaskan bahwa prebiotik
secara selektif meningkatkan komposisi mikroorganisme yang menguntungkan
sehingga mampu mengurangi mikroorganisme yang merugikan di dalam tubuh

2

melalui beberapa mekanisme seperti diantaranya: memproduksi bakteriosin
senyawa metabolit lain, berkompetisi untuk mendapatkan nutrien dan reduksi
kolonisasi bakteri patogen serta memberikan sinyal imun dengan mengaktifkan
sitokinin. Pada penggunaan dosis yang tepat, konsumsi prebiotik dapat mengobati
dan mendukung pengendalian penyakit seperti kanker, kanker usus, sembelit,
diabetes melitus dan liver. Selain itu, Venema dan Carmo (2015) melaporkan
bahwa prebiotik dapat meregulasi pertumbuhan mikroorganisme usus, mencegah
timbulnya infeksi saluran pencernaan, memodulasi sistem kekebalan tubuh,
meningkatkan bioavailabilitas mineral, mengatur gangguan metabolisme terkait
dengan obesitas dan diabetes, serta menurunkan risiko kanker.
Pada umumnya prebiotik tersedia dalam bentuk oligosakarida yang mungkin
terjadi secara alami seperti oligosakarida pada ASI, tetapi dapat juga disintesis
untuk ditambahkan sebagai suplemen diet untuk makanan, minuman maupun susu
formula (Quan and Barness 1990). Beberapa oligosakarida lain yang digunakan
sebagai prebiotik di antaranya: rafinosa (Dinoto et al. 2006), fructo-oligosaccharide
(FOS) (Rossi et al. 2005; Bouhnik et al. 2006), galacto-oligosaccharide (GOS)
(Boehm et al. 2002; Bouhnik et al. 2004; Knol et al. 2005), inulin (Gibson 2004),
trans-galactooligosaccharide (TOS) (Roberfroid (2007), chito-oligosaccharide
(COS) (Harti et al. 2015) dan lacto-N-biose I (LNB) (Kiyohara et al. 2009; Balogh
2015) yang merupakan core structure oligosakarida pada ASI, yang secara spesifik
disebut sebagai bifidus (bifidogenic) factor.
Salah satu permasalahan yang terjadi yang berkaitan dengan penggunaan
senyawa oligosakarida di dalam ASI sebagai sumber prebiotik adalah
ketersediaannya yang sangat terbatas, sementara kebutuhan bayi dan balita akan
senyawa tersebut sangat besar untuk menjaga kesehatan saluran pencernaan di
dalam tubuh. Hal ini mendorong peneliti untuk mengkaji sintesis senyawa HMO
yang memiliki aktivitas prebiotik tersebut, sehingga dapat dijadikan alternatif
sebagai bahan tambahan pangan untuk makanan pendamping ASI. Dengan adanya
pangan pendamping ASI seperti susu formula dan bubur prebiotik bagi bayi,
kebutuhan sumber prebiotik dapat terpenuhi.
Lacto-N-biose I (LNB) merupakan salah satu jenis prebiotik yang saat ini
telah banyak dikaji khususnya terkait aktivitasnya sebagai bifidus factor. Beberapa
penelitian melaporkan bahwa LNB secara signifkan dapat meningkatkan aktivitas
mikroflora yang hidup di dalam usus bayi dan balita (Kiyohara et al. 2009). Satoh
et al. (2013), yang mengkaji perbandingan efek prebiotik dari LNB dengan
laktulosa, rafinosa, GOS, MOS membuktikan bahwa baik LNB maupun senyawa
prebiotik lain mampu meningkatkan populasi bifidobakteri secara umum, akan
tetapi untuk strain tertentu seperti Bifidobacterium bifidum subsp infantis dan
Bifidobacterium longum subsp infantis yang dominan di usus bayi, LNB memiliki
aktivitas prebiotik yang paling tinggi dibandingkan yang lain. Hal ini juga
dibuktikan oleh Xiao et al. (2010) yang mengkaji LNB terhadap sebanyak 208
strain bifidobakteri, dimana seluruh strain tersebut dapat tumbuh dengan baik
dengan adanya LNB. Fungsi prebiotik dari LNB bukan hanya sebagai sumber
karbon, akan tetapi juga sumber nitrogen bagi bifidobakteri. Hal tersebut yang
membedakan LNB dengan senyawa prebiotik lain.
Untuk dapat digunakan sebagai sumber nutrien, LNB dipecah oleh enzim
lacto-N-biose I phosphorylase yang hanya dimiliki bifidobakteri, sementara bakteri
patogen tidak memiliki kemampuan untuk melakukan sekresi enzim tersebut. Hal

3

ini menyebabkan bakteri patogen tidak mendapatkan nutrisi yang cukup, yang
mengakibatkan laju pertumbuhannya menurun. Dengan kata lain, bakteri patogen
tidak dapat menginfeksi saluran pencernaan akibat berkompetisi dengan
bifidobakteri yang populasinya meningkat seiring dengan ketersediaan LNB di
dalam usus.
LNB secara alami terdapat di dalam HMO. Akan tetapi, seiring dengan
perkembangan teknologi, senyawa ini dapat disintesis secara enzimatis (Sano et al.
1992; Nishimoto dan Kitaoka 2007a; D’Almeida et al. 2009). Sintesis LNB
dilakukan dengan tujuan untuk menghasilkan senyawa prebiotik yang berpotensi
untuk digunakan sebagai ingredien pada produk pangan seperti susu formula
(Kiyohara 2009; Satoh et al. 2013).
Metode sintesis LNB secara enzimatis telah banyak dikembangkan (Hedbys
1989; Fujimoto 1997; Derensy-Dron et al. 1999; Vetere et al. 2000; Nishimoto dan
Kitaoka 2007a; D’Almeida et al. 2009). Akan tetapi, masih memiliki keterbatasan,
di antaranya: rendemen yang dihasilkan masih rendah, penggunaan substrat yang
mahal, tahap sintesis yang kompleks serta membutuhkan waktu sintesis yang cukup
lama. Oleh karena itu, diperlukan metode yang efisien yang dapat menghasilkan
rendemen yang tinggi dan dapat dilakukan dengan waktu yang lebih singkat.
Enzim, substrat dan fosfat pada sintesis LNB diyakini dapat mempengaruhi
rendemen yang dihasilkan. Seperti yang telah dilaporkan oleh Nishimoto dan
Kitaoka (2007a), peningkatan jumlah enzim sucrose phosphorylase (SP), UDPglucose-hexose-1-phosphate uridylyltransferase (GalT), UDP-glucose 4epimerase (GalE) dan lacto-N-biose I phosphorylase (LNBP) pada sintesis LNB
dapat mempercepat reaksi yang berimplikasi pada rendemen yang diperoleh.
D’Almeida (2009) melaporkan bahwa substrat yang baik untuk enzim dengan
konsentrasi yang tinggi dapat menghasilkan LNB dengan rendemen yang tinggi.
Selain itu, sumber fosfat yang diperoleh dari Gal1P dan Glc1P, dapat digunakan
untuk reaksi fosforolisis substrat yang dikatalisis oleh enzim SP dan LNBP dalam
sintesis LNB (Nishimoto dan Kitaoka 2007a). Sejalan dengan Nihira et al. (2011),
peningkatan aktivitas enzim LNBP berhubungan dengan konversi Gal1P yang
terjadi pada fosforolisis LNB.
Pada penelitian ini dilakukan sintesis LNB secara enzimatis dari laktosa dan
GlcNAc dengan menggunakan enzim lactose phosphorylase (LP) dan lacto-Nbiose I phosphorylase (LNBP) sebagai katalis. Purifikasi dan karakterisasi enzim
LP dan LNBP dilakukan untuk menjelaskan karakteristik dan aktivitas enzim yang
digunakan untuk sintesis LNB. Selain itu, untuk mengetahui pengaruh penambahan
enzim, substrat dan fosfat terhadap rendemen, dilakukan pengukuran konsentrasi
LNB yang dihasilkan.

Perumusan Masalah
Sintesis LNB secara enzimatis dari laktosa dan GlcNAc dengan
menggunakan enzim LP dan LNBP merupakan teknik yang dapat digunakan dalam
menghasilkan LNB dengan rendemen yang tinggi dan dilakukan dengan waktu
yang singkat. Karakteristik enzim yang digunakan pada sintesis LNB akan
berpengaruh pada rendemen yang dihasilkan. Selain itu, konsentrasi substrat, fosfat

4

dan enzim yang digunakan akan mempengaruhi juga konsentrasi LNB yang
dihasilkan.

Tujuan Penelitian
Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan, maka tujuan dari
penelitian ini yaitu:
1. Mendapatkan karakteristik dari enzim rekombinan LP dan LNBP sebagai
agen enzimatis untuk sintesis LNB dari laktosa dan GlcNAc.
2. Menganalisis pengaruh penggunaan substrat laktosa dan GlcNAc terhadap
rendemen LNB yang dihasilkan.
3. Menganalisis pengaruh penambahan fosfat dan enzim LP terhadap rendemen
LNB yang dihasilkan.

Hipotesis
Secara teoritis, skema reaksi kimia yang terjadi pada sintesis LNB dari laktosa
dan GlcNAc dengan bantuan enzim LP dan LNBP sebagai katalis disajikan pada
Gambar 1. Adapun hipotesis yang dapat diambil dari penelitian ini adalah:

Gambar 1 Skema reaksi kimia sintesis lacto-N-biose I
1. Penggunaan substrat laktosa dan GlcNAc dapat menghasilkan rendemen
LNB yang tinggi melalui pemecahan laktosa menjadi Gal1P oleh enzim LP
yang kemudian dengan adanya GlcNAc dihasilkan LNB sebagai produk.
2. Penambahan fosfat mampu membantu sintesis LNB yang dihasilkan melalui
aktivitas enzim LNBP dengan adanya laktosa dan Gal1P.
3. Penggunaan enzim LP dapat menghasilkan rendemen LNB yang yang tinggi.

Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat dimanfaatkan oleh produsen susu
formula sebagai salah satu alternatif ingredien dalam hal ini prebiotik dalam
meningkatkan pertumbuhan dan aktivitas mikroflora pada usus bayi untuk
meningkatkan kesehatan bayi.

5

2 TINJAUAN PUSTAKA
Prebiotik bagi Kesehatan Bayi
Prebiotik didefinisikan sebagai senyawa karbohidrat yang dapat
menghasilkan efek peningkatan jumlah bakteri pada usus, seperti bifidobakteri
(Palframan et al. 2003). Menurut Macfarlane et al. (2006), prebiotik merupakan
rantai pendek karbohidrat yang memiliki efek yang tidak biasa di dalam usus yaitu
mengubah kompososi serta mengatur keseimbangan jumlah mikroorganisme.
Selain itu, prebiotik juga berperan sebagai karbon dan sumber energi bagi
pertumbuhan bakteri. Disebabkan besarnya manfaat yang dapat dihasilkan, saat ini
prebiotik banyak digunakan untuk banyak tujuan, terutama sebagai makanan bagi
bayi. Douglas dan Sanders (2008) juga menjelaskan bahwa prebiotik adalah bahan
pangan yang dapat menstimulasi aktivitas dan pertumbuhan sejumlah bakteri yang
menguntungkan bagi kesehatan tubuh sebagai host. Secara umum, prebiotik adalah
makanan spesifik bakteri yang dianggap bermanfaat bagi kesehatan.
Menurut Newburg (1997), bayi yang mengkonsumsi ASI lebih tahan terhadap
berbagai infeksi daripada bayi yang diberi susu formula. Beberepa hasil penelitian
menyarankan susu formula seharusnya diperkaya dengan oligosakarida seperti pada
ASI (McVeagh dan Miller 1997; Motil 2000). Mengingat keterbatasan ASI yang
tidak dapat diproduksi dalam jumlah yang besar, sumber alternatif pengganti ASI
dibutuhkan baik sebagai sumber prebiotik maupun sumber nutrisi. Seperti misalnya
oligosakarida dari susu sapi yang memiliki sifat fungsional yang berpotensi untuk
digunakan sebagai pelengkap ASI karena bioaktivitasnya bagi kesehatan bayi
(Gopal dan Gill 2000).
Penggunaan prebiotik dalam diet bayi memiliki tujuan untuk memodifikasi
mikroorganisme usus yaitu menstimulasi pertumbuhan bakteri yang
menguntungkan serta menekan jumlah bakteri yang merugikan. Selain itu,
pemanfaatan prebiotik pada susu formula dilakukan untuk meniru komposisi
sumber prebiotik yang terdapat pada ASI sehingga mampu menyerupai ASI yang
notabene memiliki aktivitas prebiotik yang tinggi bagi bakteri usus bayi
(Simmering dan Blaut 2001). Adapun beberapa oligosakarida food grade yang telah
dievaluasi untuk digunakan sebagai prebiotik pada bayi di antaranya: galactooligosaccharides (GOS), polydextrose (PDX), laktulosa (LOS), inulin, dan fructooligosaccharide (FOS). Oligosakarida tersebut secara komersial diproduksi baik
melalui sintesis oleh mikroorganisme, secara enzimatis maupun ekstraksi dari
bahan alam (Van Loo et al. 1999).

Aktivitas Prebiotik HMO (Human Milk Oligosaccharide)
HMO merupakan salah satu komponen penyusun utama ASI selain laktosa
dan lemak (Morrow et al. 2005). Secara struktural, HMO terdiri atas kombinasi dari
5 grup monoskarida penyusun yaitu: D-glukosa, N-asetilglukosamin, L-fukosa, Dgalaktosa dan asam sialat. Beberapa monosakarida tersebut juga ditemukan pada
air susu mamalia yang lain (Bode 2006). HMO tidak dapat dihidrolisis oleh enzim
yang ada di dalam perut dan usus kecil, sehingga secara utuh HMO melewati
saluran pencernaan bagian bawah (Stahl et al. 1994).

6

Secara signifikan, bagian dari HMO yang tidak dapat dicerna melewati
saluran pencernaan yang lebih rendah (Chaturvedi et al. 2001), dimana secara
selektif digunakan untuk metabolisme mikroflora usus yang menguntungkan bagi
tubuh seperti bifidobakteri (Gibson and Ruberfoid 1995; Ward et al. 2006).
Aktivitas bifidogenik dari HMO yang merupakan bifidus factor murni dapat
meningkatkan pertumbuhan mikroorganisme pada usus bayi lebih baik
dibandingkan dengan susu formula (Harmsen et al. 2000). Menurut Donovan
(2006), HMO memiliki beberapa efek menguntungkan pada perkembangan usus
neonatal, di antaranya: 1) mempromosikan pertumbuhan mikroorganisme yang
menguntungkan; 2) melindungi usus terhadap infeksi; 3) membantu perkembangan
usus; dan 4) membantu adaptasi usus terhadap kondisi lingkungan.
HMO merupakan komponen bawaan dari sistem imun pada ASI yang
memberikan proteksi pada bayi dari patogen. Secara signifikan, proteksi yang
dihasilkan dari ASI disebabkan adanya ikatan α(1-2)-oligosakarida yang
terfukosilasi (Morrow et al. 2005). Hal ini dibuktikan oleh hasil pengamatan
Newburg et al. (2005) bahwa oligosakarida yang terfukosilasi mampu mencegah
penyakit diare melalui mekanisme yang beragam seperti penghambatan aktivitas
toksin Eschericia coli yang stabil dengan mengikat dan memblokir akses untuk
menargetkan reseptor, pencegahan pelekatan Camplylobacter ke sel-sel usus dan
penghambatan kompetitif norovirus ke jaringan epitel usus. HMO dapat
mengurangi infeksi patogen dengan berfungsi sebagai antimikroba (Knol et al.
2005).

Lacto-N-Biose I sebagai Prebiotik
Lacto-N-biose I [LNB; Gal(β1-3)GlcNAc] adalah senyawa disakarida yang
berperan penting dalam struktur karbohidrat pada beberapa glycoconjugate.
Senyawa ini terdapat pada oligosakarida di dalam ASI (human milk
oligosaccharide; HMO), akan tetapi LNB tidak tersedia dalam bentuk disakarida
bebas dan aktif sebagai unit pembangun dari oligosakarida tipe 1 yang mengandung
lacto-N-tetraose sebagai struktur intinya. LNB pertama kali diisolasi melalui
hidrolisis parsial dari lacto-N-tetraose (Kuhn 1954). Selain itu, LNB ditemukan
pada domain glycan dari glycolipid dan glycoprotein pada beberapa tipe sel
termasuk sel epitel dalam usus dan grup antigen di dalam darah (Hakomori 2008).
Adapun struktur kimia dari LNB dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2 Struktur kimia lacto-N-biose I (sigmaaldrich.com)

7

Secara struktural, LNB terikat pada 4 jenis oligosakarida yang ada pada
HMO yaitu LNFP I [Lacto-N-fucopentaose I; Fuc(α1-2)Gal(β1-3) GlcNAc(β13)Gal(β1-4)Glc], LNFP 2 [Lacto-N-fucopentaose II; Gal(β1-3)|Fuc (α1-4)|GlcNAc
(β1-3)Gal(β1-4)Glc]; LNT [Lacto-N-tetraose; Gal(β1-3)GlcNAc (β1-3)Gal(β14)Glc] dan LNDFH I (Lacto-N-difucohexaose 1; Fuc(α1-2)Gal(β1-3)|Fuc(α1-4)|
GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)GlcGal(β1-3)GlcNAc yang terdapat dalam jumlah paling
banyak (Urashima et al. 2012). LNB terdapat pada non-reducing end dari
oligosakarida tipe I dalam HMO (Kobata et al. 2010; Urashima et al. 2011).
Melalui jalur metabolisme spesifik yang terjadi pada bifidobakteri, LNB
mampu berperan sebagai faktor pemicu pertumbuhan mikroorganisme di dalam
usus bayi (Kitaoka et al. 2005; Nishimoto dan Kitaoka 2007b; Fushinobu 2010).
Administrasi LNB secara oral diduga dapat membantu pertumbuhan bifidobakteri
khususnya pada susu formula (Kiyohara et al. 2009; Xiao et al. 2010). Aktivitas
prebiotik dari LNB ditemukan pada bifidobakteri, terutama B. bifidum, B. breve,
dan B. longum. Akan tetapi, LNB tidak menunjukkan efek prebiotik pada bakteri
asam laktat dan jenis bakteri lain (Bacteroides, Clostridium, Enterococcus,
Eubacterium, Lactobacillus, Lactococcus, dan Ruminococcus) (Kiyohara et al.
2009). Penelitian terkait efektivitas LNB sebagai prebiotik cukup banyak dilakukan.
Secara ringkas, hasil penelitian tersebut dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel

1

Penelitian aktivitas
mikroorganisme

Mikroorganisme
Target
Bifidobacterium
longum subsp.
infantis
ATCC15697
208 strain yang
terdiri dari 10
spesies dan 4
subspesies
bifidobakteri

18 strain
bifidobakteri, 5
clostridium, 13
enterobacter dan

prebiotik

lacto-N-biose

I

pada

berbagai

Keterangan

Hasil

Referensi

Spesivitas substrat
LNB dibandingkan
dengan pNP-β-Gal,
pNP-β-Fuc, laktosa,
LacNAc, LNnT dan
LNT
LNB digunakan
sebagai sumber
karbon dan dilakukan
penambahan gen lnpA
(LNBP)

 Nilai Kcat/Km lebih
tinggi, kecuali dengan
LNT
 Nilai Kcat/Km lebih
tinggi kecuali dengan
Laktosa dan LacNAc.
 Seluruh strain
bifidobakteri dapat
tumbuh.
 B.
pseudocatenulatum,
B. animalis subsp.
animalis, B.
pseudolongum
mampu
menggunakan LNB
kecuali B.
pseudocatelatum.
 B. bifidum JCM1254
dan JCM7004, B
longum subsp.
infantis JCM1210
dan JCM1222, B.

Yoshida
et al.
(2012)

Bakteri diinokulasi ke
dalam media yang
mengandung LNB
dan absorbansi diukur
pada OD600

Xiao
et al.
(2010)

Kiyohara
et al.
(2009)

8

8 bakteri asam
laktat

Bifidobakteri

Lactobacillus
casei

longum subsp.
longum JCM1217
dan JACM7054, B.
breve JCM1192 dan
B. scardovii
JCM12489 tumbuh
2x > kontrol.
Membandingkan efek  Populasi
prebiotik LNB dengan
bifidobakteri dengan
senyawa lain:
LNB signifikan
laktulosa, rafinosa,
tumbuh sama besar
galaktooligosakarida
dengan senyawa lain.
dan
 Aktivitas B. bifidum
mannanoolgiosakarida
lebih tinggi
dibandingkan
senyawa lain.
 Senyawa residu hasil
perlakuan LNB
seperti asam laktat
lebih rendah dan
asam asetat lebih
tinggi dari senyawa
lain.
Klaster gen
 LNB hanya dapat
gnbREFGBCDA diuji
dihidroilisis pada
aktivitasnya pada
GnbG yaitu enzim
berbagai jenis substrat
phospho-βtermasuk LNB
galactosidase dari L.
casei.

Satoh
et al.
(2013)

Bidart et
al. 2014

Sintesis Lacto-N-Biose I
Sintesis LNB secara enzimatik pertama kali diperkenalkan oleh Flowers dan
Jeanloz (1963) yang menghasilkan derivatif dari asam muramat dan kristalinnya
yaitu N-acetylmuramic acid. Sintesis LNB dilakukan untuk menghasilkan produk
dengan yield dan tingkat kemurnian yang tinggi. Hal ini disebabkan LNB hasil
sintesis dapat digunakan sebagai ingredien pangan yaitu dapat memberikan efek
prebiotik pada susu formula. Selain itu, waktu yang dibutuhkan untuk memproduksi
LNB lebih singkat sehingga dapat menghasilkan produktivitas yang tinggi.
Laporan terakhir dari D’Almeida (2009) mengungkapkan bahwa LNB dapat
disintesis menggunakan enzim glycosinthase yang diisolasi dari Thermus
thermophilus melalui mekanisme transglikolitik. Pada tahun sebelumnya,
Nishimoto dan Kitaoka (2007a) telah melakukan sintesis LNB secara scale-up yaitu
memproduksi LNB sebanyak 1,4 kg dari sukrosa dan GlcNAc dengan penambahan
UDP-Glc dan fosfat, serta menggunakan 4 enzim: sucrose phosphorylase (SP),
UDP-glucose-hexose-1-phosphate uridylyltransferase (GalT), UDP-glucose 4-

9

epimerase (GalE) dan lacto-N-biose I phosphorylase (LNBP) sebagai katalis
selama 700 jam. Metode tersebut diduga dapat digunakan pada skala industri
menggunakan sistem bioreaktor dengan enzim yang telah diimobilisasi. Selain itu,
penemuan ini memperkuat hipotesis bahwa LNB dapat digunakan sebagai bahan
tambahan pangan untuk susu formula yang menyerupai komposisi LNB pada ASI.
Secara sederhana, metode sintesis LNB menurut (Nishimoto dan Kitaoka
2007a) diawali dengan fosforolisis sukrosa menjadi α-glucose 1-posphate (Glc1P)
dengan bantuan SP sebagai katalis. Glc1P kemudian dikonversi menjadi UDP-Glc
secara bersamaan dengan konversi UDP-Gal menjadi Gal1P oleh GalT. UDP-Glc
diubah menjadi UDP-Gal sebagai hasil dari aktivitas GalE, dimana UDP-Gal dapat
digunakan oleh GalT. LNB kemudian dapat disintesis dari Gal1P dan GlcNAc
menggunakan LNBP. Fosfat dan UDP-Gal didaur-ulang selama reaksi, sehingga
keseluruhan reaksi dapat digambarkan seperti berikut:
Sukrosa + GlcNAc => LNB + Fruktosa
Penelitian terkait sintesis lacto-N-biose I telah banyak dikembangkan. Secara
ringkas beberapa penelitian terakhir yang berkaitan dengan sintesis LNB dapat
dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Penelitian sintesis lacto-N-biose I
Bakteri
Eschericia
coli
Xanthomonas
manihotis

Enzim
β-Dgalactosidase
β-Dgalactosidase

B. bifidum

Lacto-N-biose I
(LNBP)

Xanthomonas
manihotis

β-Dgalactosidase

B. bifidum

SP, GalE, GalT
dan LNBP

Thermus
thermophilus

Transglycosidase

Substrat
Laktosa dan
GalNAc
p-nitophenyl β-Dgalactopyranoside
dan 2-acetoamido2-deoxy-Dglucopyranose
Gal1P dan GlcNAc

Yield
21%

p-nitophenyl β-Dgalactopyranoside
dan 2-acetoamido2-deoxy-Dglucopyranose
GlcNAc dan Gal1P

55%

GlcNAc

80%

22%

76%

83%

Referensi
Hedbys et
al. (1989)
Fujimoto
(1997)

DerensyDron et al.
(1999)
Vetere et al.
(2000)

Nishimoto
dan Kitaoka
(2007a)
D’Almeida
et al. (2009)

10

Laktosa
Pada umumnya, prebiotik merupakan karbohidrat yang tidak dapat dicerna,
khususnya oligosakarida, baik diperoleh melalui ekstraksi dari tanaman ataupun
sintesis dari monosakarida atau disakarida seperti sukrosa (Nishimoto dan Kitaoka
2007a) dan laktosa (Oliveira 2015). Laktosa merupakan karbohidrat yang
terkandung dalam jumlah yang besar pada susu dan memiliki banyak kegunaan
pada produk pangan dan obat-obatan (Schaafsma 2008). Konsentrasi laktosa di
dalam susu pada setiap spesies berbeda-beda, misalnya pada susu caprine 41 g/l,
susu ovin 49 g/l, susu sapi 47 g/l dan pada ASI sekitar 69 g/l (Park et al. 2007).
Laktosa adalah disakarida yang terdiri dari galaktosa dan glukosa, yang biasanya
tersedia dalam bentuk α dan β, dimana merupakan komponen nutrisi yang penting
bagi tubuh. Hal ini disebabkan selain dapat menghasilkan energi, laktosa juga baik
untuk penyerapan kalsium di dalam usus, magnesium, fosfor serta pemanfaatan
vitamin C (Ganzle et al. 2008).
Laktosa ditemukan di dalam hampir seluruh susu mamalia, baik tersedia
dalam bentuk bebas ataupun terikat. Di dalam tubuh, laktosa disintesis di dalam
kelenjar susu dari uridine diphosphate galactose (UDP-Gal) sebagai donor dan
glukosa sebagai aseptor melalui mekanisme reaksi transgalaktosilasi yang
dikatalisis oleh lactose synthase (Urashima et al. 2011). ASI mengandung laktosa
bebas sebagai sakarida yang dominan. Pada saat bayi mengonsumsi ASI, laktosa
dipecah menjadi galaktosa dan glukosa oleh enzim laktase usus (neutral βgalactosidase) yang kemudian kedua monosakarida tersebut diangkut ke dalam
enterosit melalui mekanisme tertentu. Glukosa selanjutnya digunakan sebagai
sumber energi bagi tubuh, sedangkan sebagian besar galaktosa diubah menjadi
glukosa di dalam hati. HMO resisten terhadap hidrolisis enzimatik dari laktase usus
(Engfer et al. 2000) dan sebagian besar melewati usus kecil dan usus besar dimana
kemudian difermentesi oleh bakteri usus (Brand-Miller et al. 1998).

GlcNAc (2-Acetomido-2-Deoxy-D-Glucose)
GlcNAc merupakan monosakarida yang secara umum terdapat pada rantai
kabohidrat. Secara industrial, GlcNAc dapat diproduksi dari sumber gula alami
yang tersedia dalam jumlah yang banyak. GlcNAc dapat dihasilkan melalui
hidrolisis struktur homopolimernya yaitu kitin (Inoue et al. 2011). Berdasarkan
hasil penelitian Nishimoto dan Kitaoka (2007a), GlcNAc dapat digunakan sebagai
bahan dasar untuk produksi lacto-N-biose I (LNB) melalui reaksi enzimatis yang
menggunakan 4 enzim sebagai katalis. Senyawa produk tersebut diduga dapat
digunakan sebagai bahan komoditas, seperti digunakan untuk ingredien pangan
atau prekursor obat-obatan (Chiku et al. 2010). Selain itu, dengan adanya Gal1P,
GlcNAc dapat diubah menjadi LNB melalui reaksi fosforolisis oleh enzim LNBP
(Nakajima dan Kitaoka 2008).
Gal1P (α-D-Galactose 1-Phosphate)
Gal1P merupakan komponen kunci pada metabolisme D-galaktosa melalui
Leloir pathway (Nihira et al. 2011). Jalur metabolisme tersebut dikarakterisasi

11

melalui aktivitas dari beberapa enzim: aldose 1-epimerase (GalM), galactokinase
(GalK), UDP-glucose hexose-1-phosphate uridylyltransferase (GalT) dan UDPglucose 4-epimerase (GalE) yang semuanya berkaitan dengan konversi galaktosa
menjadi Glc1P (de Vos dan Vaughan 1994). Kitaoka et al. (2005) melaporkan jalur
metabolisme yang baru dari galaktosa di dalam Bifidobacterium longum, yang
dikatalisis oleh LNBP. Pada jalur tersebut, LNBP secara reversible memfosforilasi
1,3-β-D-galactosyl N-acetylhexosamine menjadi Gal1P dan N-acetylhexosamine
(Derensy-Dronn et al. 1999). Jalur tersebut tidak membutuhkan enzim
galaktokinase, tidak seperti Leloir pathway, karena LNBP secara langsung
memproduksi Gal1P dari 1,3-β-D-galactosyl N-acetylhexosamine (Kunz et al.
2000). Selain itu, menurut Nishimoto dan Kitaoka (2007a), Gal1P dapat
dimanfaatkan dalam sintesis LNB dengan adanya GlcNAc. Adapun enzim yang
berperan dalam mekanismenya yaitu LNBP melalui reaksi fosforolisis.

Enzim Lactose Phosphorylase (LP)
Lactose phosphorylase (LP) merupakan enzim mutan dari cellobiose
phosphorylase (CBP) (EC. 2.4.1.20) (O’Neill dan Field 2014). Enzim ini terbentuk
melalui mutagenesis donor binding site T508I/N667A enzim CBP. Selain itu,
enzim LP dapat mengkatalisis sintesis Gal1P dari laktosa dengan adanya fosfat
anorganik. Adanya LP sebagai agen enzimatis pada produksi Gal1P secara
sederhana dapat dilakukan dengan menggunakan teknik straight-forward seperti
kromatografi pertukaran anion dan presipitasi etanol, dimana dapat menghasilkan
Gal1P dengan tingkat kemurnian yang tinggi. Melalui teknik yang dilakukan De
Groeve et al. (2009a) tersebut, Gal1P yang notabene secara komersial memiliki
harga yang mahal dapat disintesis dari substrat yang murah dan sederhana seperti
laktosa dan fosfat.

Enzim Lactose-N-Biose I Phosphorylase (LNBP)
Enzim 1,3-β-Galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase (LNBP) (EC.
2.4.1.211) aktif dalam melakukan fosforolisis LNB dari Gal1P dengan adanya
GlcNAc (Nakajima dan Kitaoka 2008). Pada CAZy database, LNBP
diklasifikasikan pada famili glycoside hydrolase (GH) 112 (Nakajima et al. 2010)
berdasarkan kemiripan strukturnya dengan β-galactosidase GH42 (Hidaka et al.
2002). Enzim fosforilase pada umumnya dapat menghidrolisis substrat gula yang
berperan penting sebagai sumber energi khususnya bagi bakteri anaerob (Kitaoka
dan Hayashi 2002). Hal ini disebabkan reaksi fosforolisis yang dilakukan oleh
enzim fosforilase secara langsung menghasilkan gula yang terfosforilasi tanpa
membutuhkan ATP. Energi tersebut dapat diperoleh dari gula substrat yang
memiliki energi yang lebih besar daripada gula lain, khususnya pada kondisi
anaerob yang hanya memiliki 3 molekul ATP yang tersedia melalui jalur glikolitik
dari glucose 6-phosphate (Kitaoka 2012b). Lacto-N-biose 1 phosphorylase (LNBP)
ditemukan pada mikroorganisme seperti bifidobakteri yang diisolasi dari usus bayi
(Derensy-Dron et al. 1999).

12

3 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan selama 6 bulan, dari September 2015 sampai
Februari 2016 di Laboratorium Biokimia, Fakultas Pertanian, Universitas Hokkaido,
Jepang.

Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bahan kimia untuk sintesis
lacto-N-biose I (LNB) seperti laktosa, GlcNAc, natrium fosfat, enzim rekombinan
lacto-N-biose I phosphorylase (LNBP) dari Bifidobacterium longum yang
diekspresikan oleh Eschericia coli sebagai vektor ekspresi (Nishimoto dan Kitaoka
2007b), dan enzim rekombinan lactose phosphorylase (LP) yang merupakan enzim
mutan dari cellobiose phosphorylase (CBP) dari Ruminococcus albus NE1 yang
diekspresikan oleh E. coli sebagai vektor ekspresi (Hamura et al. 2012) yang
merupakan koleksi Laboratorium Biokimia, Universitas Hokkaido. Bahan untuk
transformasi plasmid yaitu: plasmid pET23, sel kompeten E. coli BL21, media SOC
dan ampicilin. Bahan kimia untuk pre-kultur dan kulturisasi di antaranya: tripton,
ekstrak yeast, NaCl dan isopropil thiogalaktosida (IPTG). Bahan untuk pembuatan
standar glukosa seperti: glukosa, tris-HCl dan glucostat reagent. Bahan untuk
pembuatan standar fosfat yaitu: ammonium molibdat, zinc asetat, asam askorbat,
potasium fosfat, HCl dan NaOH. Bahan kimia untuk analisis aktivitas enzim LP
seperti laktosa, natrium fosfat (NAP), MES hidrat, ammonium sulfat. Bahan untuk
purifikasi enzim di antaranya: imidazole, NaCl, HCl, larutan Nikel, Ni chelating
sepharose 20% etanol, kapas, PNP-β-gal, NAP, Na2CO3, MES NaOH. Bahan untuk
penentuan aktivitas enzim LNBP di antaranya: Gal1P, GlcNAc, HEPES-Na, BSA,
asam askorbat dan ammonium molibdat.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: sonikator, magnetic
stirer, mikrometer, neraca analitik, spektrofotometer, shaker, centrifuge, fraction
collector, thermostat, waterbath, tabung membran ultrafiltrasi dan unit HPLC-IR
(high performance liquid chromatography) dengan detektor indeks refraksi, alat
gelas serta alat penunjang lainnya.

Tahapan Penelitian
Penelitian ini meliputi beberapa tahapan yaitu tahap preparasi kultur bakteri
yang mencakup transformasi plasmid, pre-kulturisasi dan kulturisasi bakteri.
Kemudian dilanjutkan dengan purifikasi enzim dengan menggunakan kromatografi
filtrasi gel yang meliputi: preparasi kolom, pemurnian enzim dan konsentrasi enzim.
Setelah itu, dilakukan karakterisasi enzim untuk menentukan aktivitas enzim pada
berbagai suhu inkubasi, pH dan konsentrasi substrat. Tahap selanjutnya adalah
sintesis LNB menggunakan enzim LP dan LNBP sebagai katalis kemudian
konsentrasi LNB dianalisis secara kuantitatif menggunakan HPLC. Secara umum,
tahapan dari penelitian disajikan pada Gambar 3.

13

Preparasi Kultur Bakteri
Purifikasi Enzim

Karakterisasi Enzim

Sintesis Lacto-N-Biose I

Uji aktivitas LNBP dan LP pada berbagai:
 Suhu inkubasi
 pH
 Konsentrasi substrat

Analisis LNB
secara kuantitatif
menggunakan
HPLC

Gambar 3 Diagram alir tahapan penelitian

Prosedur Penelitian
Preparasi Kultur Bakteri
1)
Transformasi Plasmid
Sel kompeten E. coli BL21 dalam mini tube dicampurkan dengan 2 µl plasmid
pET23 kemudian didinginkan dalam serbuk es selama 30 menit dan dilanjutkan
dengan inkubasi pada suhu 42oC selama 1 menit. Sel kompeten dalam mini tube
kembali dimasukkan ke dalam serbuk es selama 2 menit dan ditambahkan dengan
1 ml medium SOC. Diinkubasikan kembali pada suhu 37oC selama 30 menit
kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri yang mengandung 50µg/ml ampicillin,
setelah itu dilakukan shaking dengan menambahkan glass blend dan diinkubasi
semalam pada suhu 37oC.
2)

Pre-Kulturisasi Bakteri
Koloni E. coli yang tumbuh dari hasil transformasi kemudian diambil
sebanyak 1 koloni untuk dicampurkan ke dalam tabung reaksi yang mengandung
30 ml medium (tripton 1%; ekstrak yeast 0,5% dan NaCl 0,5%), kemudian
ditambahkan 15 µl larutan ampicillin (200 mg/ml). Setelah itu, untuk
menumbuhkan E. coli, campuran diinkubasikan ke dalam shaker 150 rpm pada
suhu 37oC selama semalam.
3)

Kulturisasi Bakteri
Hasil pre-kulturisasi dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang mengandung 1
L larutan medium (trypton 0,1%; yeast ekstrak 0,05% dan NaCl 0,05%) dan
ditambahkan dengan larutan ampicillin 0,1 mg/ml. Media kemudian dikultivasi
untuk menumbuhkan kultur bakteri dengan memasukkannya ke dalam shaker pada
suhu 37oC, 150 rpm. Setelah jumlah bakteri mencukupi, dimana nilai absorbansi
kultur pada OD600 yaitu 0,5, kemudian kultur ditambahkan dengan 0,1 M IPTG
sebanyak 1 ml dan dikultivasi kembali di dalam shaker 120 rpm pada suhu 18oC
selama semalam. Sentrifugasi pada suhu 4oC, 8000 rpm selama 10 menit dilakukan

14

untuk memisahkan pellet dan supernatan dari kultur tersebut. Bagian pellet
kemudian dilarutkan menggunakan aquades hingga volume 30-40 ml. Setelah itu
disonikasi selama 1 menit sebanyak 5 kali. Hasil sonikasi kemudian disentrifugasi
12000 rpm pada suhu 5oC selama 10 menit untuk memisahkan bagian supernatan
yang mengandung enzim dengan bagian solid (pellet).
Purifikasi Enzim dengan Kromatografi Afinitas Ion Logam Imoblisisasi
Prosedur purifikasi enzim yang dilakukan, mengikuti standar prosedur yang
terdapat di laboratorium tempat penelitian. Adapun beberapa tahapan dari prosedur
ini mencakup: preparasi kolom, pemurnian enzim, dan konsentrasi enzim. Prosedur
tersebut dilakukan dengan mengkombinasikan beberapa referensi yang umum
dilakukan pada tempat penelitian.
1)

Preparasi Kolom
Kapas dimasukkan ke dalam kolom berdiameter 2 cm dengan tinggi 15 cm
sebagai filter, larutan Nikel Chelating Sepharose 20% etanol sebagai fase diam
ditambahkan sebanyak 15 ml. Kolom kemudian ditambahkan aquades hingga
tinggi permukaan 1 cm di atas permukaan dari fase diam. Kolom selanjutnya
dialirkan dengan larutan Ni hingga seluruh larutan dalam kolom berubah warna
menjadi hijau kemudian dialirkan dengan aquades. Setelah itu, buffer A (30 mM
imidazole; 0,5 M NaCl; pH 7) dialirkan hingga larutan dari hasil kromatografi
mencapai pH 7. Supernatan hasil sentrifugasi pada tahap kulturisasi bakteri
kemudian dialirkan ke dalam kolom dimana hasil akhir aliran tersebut ditempatkan
ke dalam fraction collector untuk memisahkan beberapa fraksi larutan yang
mengandung enzim. Kemudian dialirkan kembali buffer A ke dalam kolom
(Hamura et al. 2012).
2)

Pemurnian enzim
Fraksi yang diperoleh dari hasil fraksinasi kemudian diuji untuk menentukan
keberadaan enzim β-galactosidase. Enzim tersebut dapat mengkontaminasi proses
pemurnian enzim LP sehingga diperlukan pengujian pada 10 µl hasil fraksinasi
yaitu dengan mencampurkan 100 mM NaP pH 7 sebanyak 20 µl dan 5 mM PNPβ-galactosidase sebanyak 20 µl. Kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu
37oC selama 10 menit serta ditambahkan dengan 100 µl 1 M Na2CO3. Hasil
pengujian tersebut kemudian dibandingkan dengan blanko. Blanko diperoleh
dengan melakukan prosedur yang sama dan mengganti 10 µl hasil fraksinasi dengan
10 µl aquades. Blanko memiliki kenampakan jernih, sehingga jika pengecekan hasil
fraksinasi menghasilkan kenampakan yang tidak sama (cenderung kuning) dengan
blanko maka fraksi tersebut masih terkontaminasi oleh enzim β-galactosidase.
Pengecekan hasil fraksinasi dilakukan hingga fraksi bebas dari kontaminasi.
Setelah diperoleh fraksi tersebut, kemudian dilakukan elusi dengan menambahkan
buffer B (500 mM imidazole; 0,5 M NaCl; pH 7) dan kemudian dilakukan
pengecekan absorbansi dari masing-masing fraksi pada OD280. 3 (tiga) fraksi yang
memiliki absorbansi tertinggi kemudian dicampur dan dilarutkan hingga absorbansi
mencapai