Sintesis Enzimatis Flavonoid-glikosida dari Gambir (Uncaria gambir) menggunakan Enzim CGT-ase dari Bacillus Licheniformis

  

Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013

  Gambir Uncaria gambir (Hunter) Roxb merupakan komoditi unggulan Sumatera Barat yang potensial karena memiliki nilai ekonomi tinggi dan multi guna. Gambir mengandung flavonoid yang merupakan bahan baku untuk pembuatan obat-obatan anti-hepatitis B, anti-diare (Dharma 1985), penghambat pembentukan plak gigi (Kozai

  Walaupun demikian, senyawa flavonoid mempunyai kelemahan. Flavonoid umumnya memiliki kelarutan yang rendah serta tidak stabil terhadap pengaruh cahaya, oksidasi dan perubahan kimia. Karena itu, apabila teroksidasi, strukturnya akan berubah dan fungsinya sebagai bahan aktif akan berkurang dan bahkan hilang (Kitao dan Sekine, 1994).

  Kondisi ini tidak dapat dibiarkan berlangsung terus menerus. Maka dari itu diversifikasi produk gambir dan pemanfaatannya mutlak dilakukan. Salah satu upaya adalah membuat sediaan senyawa flavonoid dari gambir untuk dimanfaatkan sebagai antioksidan dan antimikroba.

  Walaupun gambir sudah lama diperdagangkan, akan tetapi teknologi pengolahannya masih sederhana, gambir masih dijual dalam bentuk "gambir mentah". Posisi tawar menawar (bargaining power) petani kita masih rendah. Menurut Linkenheil (1998) harga gambir yang dinikmati petani jauh lebih rendah dibandingkan harga yang berlaku di pasaran international.

  Menurut Nazir (2000), Indonesia merupakan satu-satunya eksportir gambir utama dunia dimana hampir 80% gambir yang dihasilkan Indonesia diekspor ke luar negeri, terutama India. Kondisi saat ini menunjukkan kecenderungan bahwa harga komoditas gambir ini masih ditentukan oleh pasar luar negeri dengan fluktuasi harga gambir mencapai 400% (Linkeinheil, 1998).

  antinematoda (Alen, Bakhtiar, Noviantri 2004) dan manfaat lainnya dalam mendukung berbagai industri farmasi, kosmetik, dan pertanian (Nazir, 2000).

  et al. 1995. cit. Nazir 2000), antimikroba,

  Key words:

Uncaria gambir, Bacillus Licheniformis, , flavonoid--glicoside.

PENDAHULUAN

  Semirata 2013 FMIPA Unila

  

The pretest of CGT-ase transfer activity was carried out using pyrocatechol and resorcinol as

an acceptor and iso-malto and commercial starch solution as the glucosyl donor.

Subsequently, acceptor was replaced by flavonoid (Etyl acetate and butanol fraction)

extracted from four types of gambir from West Sumatra.

  3 ₁ Faculty of Mathematics and Sciences, University of Andalas Padang, Indonesia ₂ Indonesian Institute of Science. Research Centre of Biology. Cibinong, Indonesia ₃ Faculty of Mathematics and Natural Sciences, University of Andalas Padang, Indonesia

Abstract. Laboratory scale-up of Flavonoid-- glycoside was synthesized using enzyme of

CGT-ase which was isolated from cultivated of Bacillus Licheniformis. CGT-ase enzyme

has optimum capability at the temperature of 45C, pH 6.5. yielded 7.864 unit/minute/mL.

  2 , Novizar Nazir

  1

, Joko Sulistyo

  Norman Ferdinal

  |185

Sintesis Enzimatis Flavonoid-glikosida dari Gambir (Uncaria

gambir) menggunakan Enzim CGT-ase dari Bacillus

Licheniformis

  Salah satu cara meningkatkan kelarutan dan kestabilan senyawa flavonoid ialah dengan mengubah senyawa tersebut menjadi bentuk glikosida yaitu flavonoid- glikosida (flavonoid dengan gula terikat)

  

Norman Ferdinal, dkk: Sintesis Enzimatis Flavonoid-glikosida dari Gambir (Uncaria

gambir) menggunakan Enzim CGT-ase dari Bacillus Licheniformis

  melalui reaksi transglikosilasi, baik secara kimiawi maupun secara enzimatis dengan bantuan enzim transferase (CG-Tase) (Kometani et al 1996). Akan tetapi dibandingkan dengan sintesis enzimatis, sintesis senyawa flavonoid-glikosida secara kimiawi selain tidak ekonomis, juga tidak mudah karena akan menghasilkan produk campuran dengan konfigurasi α- dan β-glikosida (Funayama et.a, 1994, Sulistyo et al 2000 dan Handayani et al

  2002 ). Oleh karena itu, sintesis flavonoid-

  - glikosida melalui reaksi transfer enzimatik menjadi pilihan untuk memperoleh senyawa yang relatif stabil dan memiliki kelarutan tinggi, Sulistyo et al. (1998) melaporkan bahwa enzim CGT-ase dapat dimanfaatkan dalam reaksi transglikosilasi dengan memakai senyawa flavonoid sebagai akseptor

BAHAN DAN METODE

  Ada empat tipe gambir yang ada di Sumatera Barat. Keempat jenis gambir tersebut adalah tipe udang, tipe riau mancik, riau gadang dan tipe cubadak (Nazir 2000) yang secara anatomis (Nazir dan Yurnawati 2002) dan secara genetik memiliki variasi (Fauza 2007). Ekstrak tanaman gambir kaya akan flavonoid yang bisa dimanfaatkan sebagai antioksidan dan antimikroba (Nazir 2000). Dalam upaya pengembangan dan pemberdayaan tanaman lokal yang potensial tersebut maka perlu dilakukan suatu penelitian yang bisa mendapatkan senyawa flavonoid-glikosida dan diuji bioaktivitasnya sebagai antioksidan dan antimikroba.

  Penelitian ini penting untuk menjawab beberapa pertanyaan yang belum diketahui selama ini: (a) apakah ada variasi fitokimia dari 4 tipe gambir yang ada di Sumatera Barat; (b) apakah ada variasi komponen flavonoid dari 4 jenis gambir yang ada di Sumatera Barat; (c) mikroba apa yang menghasilkan enzim CG-tase terbaik untuk mensintesis flavonoid-glikosida dari gambir; (d) bagaimana kondisi bioproses terbaik untuk melakukan sintesis flavonoid- glikosida dari gambir.

  Untuk jangka panjang hasil penelitian ini diharapkan dapat diaplikasikan dalam pengembangan obat tradisional, farmasi, industri pangan dan kosmetik yang berbasis bahan alam terutama tanaman gambir (Uncaria gambir Roxb.). Dengan adanya diversifikasi produk gambir dan pemanfaatannya diharapkan dapat meningkatkan nilai tambah komoditas gambir Sumatera Barat dan mengurangi ketergantungan untuk hanya menjual gambir dalam bentuk gambir mentah ke luar negeri sehingga posisi tawar kita menjadi kuat.

  Biakan yang digunakan. Bacillus licheniformis, isolat dari koleksi Bidang

  Mikrobiologi, Puslit Biologi-LIPI, Cibinong-Bogor. Gambir yang digunakan berasal dari empat jenis gambir yang ditanam di daerah Siguntur, Pesisir Selatan, Sumatera Barat.

  a. Esktraksi Gambir

  Daun gambir diambil dari sentra gambir di Sumatera Barat yaitu Pesisir Selatan yaitu tipe udang (U), tipe riau gadang (RG), riau mancik (RM) dan tipe cubadak (C). 100 gram daun gambir direbus selama 1 jam (sampai daun berwarna coklat), diekstrak menggunakan blender, disaring, filtratnya dibekukan 12 jam, diendapkan dan dikeringkan.

  b. Penapisan Fitokimia (Harborne 1988)

  Penapisan fitokimia adalah untuk melihat apakah ada perbedaan komponen kimia diantara ketiga tipe gambir ini. Penapisan fitokimia meliputi Uji alkoloid, Uji steroid-triterpenoid, uji flavonoid, saponin, tanin dan kuinon.

  Sampel 10 gram dirajang tambahkan 20 – 30 ml methanol dan didihkan± 5 menit. Ekstrak methanol dipisahkan, kemudian

• Bagian 1 dilakukan uji steroid dan triterpenoid

  Fraksi eter dipindahkan ke dalam lempeng tetes lalu ditambahkan 3 tetes anhdrida asam asetat sambil diaduk perlahan-lahan dan dibiarkan sampai kering, kemudian tambahkan 1-2 tetes H

  Tanin

  Keberadaan kuinon dalam contoh tumbuhan biasanya ditandai dengan pewarnaan kuning, orange,atau merah. Pemeriksaan kuinon dapat dilakukan dengan cara mengekstraksi contoh tumbuhan segar (telah diracik) dengan eter. Jika warna contoh yang diuji terekstrak ke dalam eter, maka boleh jadi zat warnha yang ada adalah kuinon. Selanjutnya jika ekstrak eter ini diekstrak kembali dengan larutan NaOH 5% ternyata warnanya hilang dan jika ditambahkan asam klorida encer sampai bereaksi asam ternyata warna semula kembali timbul, maka zat warna dimaksud termasuk ke dalam kelompok kuinon.

   Kuinon

  2 M dan kemudian lapisan asamnya dipisahkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini diteteskan pada lempeng tetes dan ditambahkan pereaksi Mayer, dan Dragendrof yang akan menimbulkan endapan dengan warna berturut-turut putih dan merah jingga

  4

  2 SO

  0H. Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi dikocok dengan 10 tetes H

  4

  Fraksi eter dipindahkan kedalam tabung reaksi bertutup, kemudian tambahkan beberapa tetes NH

  Alkaloid.

• Bagian 2 ditambahkan amoniak pekat 1 tetes dan selanjutnya asam sulfat pekat. Campuran dikocok dan fraksi air dipisahkan, kemudian terhadap fraksi air dilakukan uji alkaloid dengan pereaksi Mayer dan Dragendroff.

  1 %. Jika ekstrak mengandung senyawa tanin akan menghasilkan warna hijau kehitaman atau biru tua.

  Steroid dan triterpenoid

  3

  Dilakukan dengan pengocokan 10 ml fraksi air dalam tabung reaksi tertutup selama 10 menit. Adanya saponin ditunjukan dengan terbentuknya buih stabil (± 15menit) dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes HCl pekat.

  Saponin

  Sebagian fraksi air dipipet kedalam tabung reaksi, lalu tambahkan HCl pekat (± 0,5 volume air) dan beberapa butir serbuk magnesium. Pewarnaan orange sampai merah memberikan uji positif flavonoid.

  Flavonoid

  Pewarnaan biru atau biru ungu memberikan uji positif fenolik.

  Fraksi air dipindahkan kedalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan beberapa tetes FeCl 3.

  Fenolik

  Residu ditambahkan kloroform sambil diaduk, fraksi kloroform dibagi dua :

  Residunya didihkan dengan air beberapa menit, kemudian disaring dalam keadaan panas. Terhadap fraksi air dilakukan uji fenolik, flavonoid ,saponin dan tanin.

  pelarutnya diuapkan sampai kering dengan penangas air, sehingga didapat residu.

  c. Ekstraksi dan fraksinasi Flavonoid (Markham 1988)

  Gambir sebanyak masing-masing 20 gram (tipe udang (U), tipe riau gadang (RG), riau mancik (RM) dan tipe cubadak (C) ditambahkan MeOH : H

  

Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013

  Fraksi air dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 3 mL, kemudian ditambahkan dengan 3 tetes larutan FeCl

2 SO

  4 pekat (uji Lieberman-Burchard).

  |187

  Semirata 2013 FMIPA Unila

  2 O (140 ml : 60

  ml), kemudian difraksinasi dengan berturut- turut dengan : Heksana = 3 x 75 ml

  Warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau atau biru menunjukkan adanya steroid.

  

Norman Ferdinal, dkk: Sintesis Enzimatis Flavonoid-glikosida dari Gambir (Uncaria

gambir) menggunakan Enzim CGT-ase dari Bacillus Licheniformis

  Flavonoid--glikosida disintesis dalam campuran yang mengandung 5% iso-malto atau pati terlarut komersial, 0.25% flavonoid yang diekstrak dari gambir (fraksi butanol dan etil asetat), 1 mL buffer fosfat atau buffer asetat 0.05 M pH 6.5 dan 0.5 mL enzim CGT-ase, serta 0.50 mL butanol/etil asetat dan diinkubasi pada suhu 40 C selama 24 jam.

  Steroid - - - - Alkaloid + ++ + + Tannin + + + + Flavonoid + + + +

  Gadan g Quinon + + + + Terpenoid + + + +

  Riau Manci k Riau

  Cubada k Udan g

  Tabel 1. Identifikasi Kualitatif Fitokimia Ekstrak Gambir Group of Chemical compoun ds Type of Gambir

  Dari hasil analisis kualitatif menujukkan bahwa gambir mengandung quinon, terpenoid, alkaloid, tannin, flavonoid dan saponin (Thorpe dan Whiteley 1921, Bakhtiar 1991 dan Nazir 2000). Sementara itu steroid tidak terdeteksi pada keseluruhan tipe gambir (Tabel 1). Alkaloid yang terbesar terdapat pada gambir tipe udang.

  HASIL DAN PEMBAHASAN Identifikasi Kualitatif Fitokimia Ekstrak Gambir

  Kandungan gula total pada produk dianalisis menurut metode Dubois et al. (1956).

  Analisis Produk transfer

  Sintesis flavonoid- -glikosida oleh enzim CGT-ase.

  CHCl

  tersebut dipanaskan pada suhu 150° C selama 5-10 menit.

  2 S0 4 dalam metanol), selanjutnya plat

  Pengujian aktivitas enzim CGT-ase dilakukan menurut metode Funayama et al. (1993). Masing-masing contoh diukur aktivitasnya dengan spektrofotometer Perkin Elmer pada serapan  660 nm. Pengujian aktivitas transglikosilasi dilakukan menurut metode Sulistyo et al. (1998) menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan larutan pengembang propanol 85%. Setelah plat KLT dikeringkan selama satu jam, kemudian disemprot dengan larutan pembangkit (20% H

  Pengujian aktivitas enzim CGT-ase dan aktivitas transglikosilasi.

  Ekstraksi enzim CGT-ase dari biakan diperbanyak pada media agar (PDA) dan diinkubasi pada suhu 27C selama 5 hari. Setelah itu biakan disuspensikan dengan 5 mL aquades steril. Selanjutnya suspensi biakan diinokulasikan menurut metode Mori et al. (1994).

   Sintesis Flavonoid-glikosida melalui reaksi transglikosilasi enzimatik menggunakan enzim CGTase Ekstraksi enzim CGT-ase

  BuOH = 3 x 75 ml Masing-masing fraksi dilakukan uji flavonoidnya. Fraksi-fraksi yang mengandung flavonoid dijadikan bahan baku untuk sintesis flavonoid glikosida. Pengukuran rendemen diperlukan untuk mengetahui dan membandingkan jumlah senyawa yang dapat terambil oleh pelarut. Banyaknya rendemen hasil ekstraksi dihitung berdasarkan(%) = bobot ekstrak /bobot sampel x 100% d.

  3 x 75 ml EtOAc = 3x 75 ml

  3 ==

  Saponin + + + + Ekstraksi Flavonoid

  

Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013

  Semirata 2013 FMIPA Unila

  |189 Gambar 2. Variabilitas Kandungan flavonoid 4 tipe gambir Sumatera Barat berdasarkan pelarutnya

  Ada 3 pelarut yang digunakan dalam ekstraksi gambir: kloroform, etil asetat dan butanol. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat variasi kandungan flavonoid dari gambir berdasar jenis pelarutnya dan berdasarkan tipe gambirnya (Gambar 2). Kandungan flavonoid yang paling tinggi ada pada gambir tipe Riau Gadang. Variasi tersebut terjadi diduga karena adanya variasi genetik dari gambir (Fauza 2007) dan adanya variasi anatomis (Nazir dan Yusniwati 2002).

  Dalam penelitian ini, yang digunakan sebagai bahan untuk flavonoid glikosida adalah fraksi etil asetat dan butanol.

  Aktivitas transglikosilasi CGT-ase dari berbagai sumber biakan

  Gambar 3 menunjukkan pengaruh suhu terhadap aktivitas transglikosilasi CGT-ase dari biakan B. Licheniformis. Suhu berpengaruh terhadap aktivitas enzim CGT- ase, dimana suhu optimum yang memperlihatkan potensi paling aktif sebagai enzim transferase adalah pada suhu

  45

  o C.

  Pengujian aktivitas enzim CGT-ase dilakukan dengan menggunakan pati sebagai substrat. Kemampuan menghidrolisis pati diuji dengan menambahkan KI dalam I

  2 sehingga terbentuk larutan yang berwarna biru.

  Intensitas warna biru sebanding dengan konsentrasi pati yang tidak terhidrolisis, sehingga semakin banyak pati yang terhidrolisis, warna biru akan memudar.

  Hasil uji pengaruh suhu dan pH terhadap aktivitas enzim menunjukkan bahwa CGT- ase dari B. lichenifirmis mempunyai kemampuan optimum pada suhu 45C (7.89 unit/mL) dan pH 6,5 (7,88 unit/mL ), dapat dilihat pada Gambar 3 dan 4.

  Aktivitas enzim CGT-ase sangat dipengaruhi oleh pH dan suhu agar aktivitasnya optimal, tetapi enzim ini akan kehilangan aktivitasnya akibat panas. Berdasarkan uji yang dilakukan diperoleh bahwa aktivitasnya akan menurun dengan meningkatnya suhu dan pH. Aktivitas tidak akan meningkat lagi setelah pH >9 (Sulistyo et al 1998, Handayani et al 2002 dan 2005)

  Gambar 3. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim CGT-ase Gambar 4. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim CGT-ase Sintesis flavonoid-

  -glikosida

  

Norman Ferdinal, dkk: Sintesis Enzimatis Flavonoid-glikosida dari Gambir (Uncaria

gambir) menggunakan Enzim CGT-ase dari Bacillus Licheniformis

  Terimakasih disampaikan kepada DP2M Direktorat Jendral Pergururuan Tinggi Depdiknas RI atas bantuan biaya penelitian Hibah Bersaing. Terimasih juga disampaikan kepada Puslit Biologi LIPI Cibinong atas segala fasilitas yang digunakan dalam penelitian ini. Kepada Lembaga Penelitian Unand, atas bantuan dan kerjasamanya juga dihaturkan terimakasih.

  Padang. 23 hal.

  dan Pedagang Pengumpul Gambir di Kec. Pangkalan 50 Kota. 29-30 Nopember 1991. FMIPA Unand.

  Gambir . Makalah Penataran Petani

  Bakhtiar, A. 1991. Manfaat Tanaman

  , Makalah Poster Seminar Nasional TOI XXVI, 7-8 September 2004.

  Antinematoda Bursaphelenchus xylophilus dari Ekstrak Gambir

  2004. Isolasi Senyawa Bioaktif

  DAFTAR PUSTAKA Alen Y., Elvi Rahmayuni dan A. Bakhtiar.

  Kandungan gula produk transfer berkisar adalah 1998 ppm untuk flavonoid dari gambir fraksi etil asetat dan 1389 ppm untuk gambir fraksi butanol.

  Gambar 5. Kandungan gula produk transfer

  Hasil uji pengaruh suhu dan pH terhadap aktivitas enzim menunjukkan bahwa CGT- ase dari B. lichenifirmis mempunyai kemampuan optimum pada suhu 45C dan pH 6,5.

  Enzim CGT-ase dari B. Lichineformis (buffer fosfat) berpotensi aktif sebagai enzim transferase.

  Kandungan flavonoid terbanyak pada fraksi EtOAc dan fraksi BuOH dan yang paling tinggi ada pada gambir tipe Riau Gadang. Variasi tersebut terjadi diduga karena adanya variasi genetik dari gambir dan adanya variasi anatomis

  Dari hasil analisis kualitatif menujukkan bahwa gambir mengandung quinon, terpenoid, alkaloid, tannin, flavonoid dan saponin. Sementara itu steroid tidak terdeteksi pada keseluruhan tipe gambir . Alkaloid yang terbesar terdapat pada gambir tipe udang.

  dari gambir fraksi etil asetat dan butanol KESIMPULAN

  dari isomalto dan pati terlarut komersial dan akseptor ekstrak flvonoid (fraksi atil asetat dan butanol) pada sistem reaksi dua lapisan mempunyai aktivitas transfer gugus glukosil yang tinggi (Gambar 5). Penentuan konsentrasi produk transfer yang diperoleh dilakukan dengan metode Dubois dengan standar arbutin. Kandungan gula produk transfer berkisar adalah 1998 ppm untuk flavonoid dari gambir fraksi etil asetat dan 1389 ppm untuk gambir fraksi butanol. Dari Gambar 5 terlihat bahwa flavonoid dari semua fraksi (fraksi etil asetat dan butanol) bisa dijadikan produk transfer, dilihat dari kandungan gulanya. Hasil penelitian menunjukkan donor glikosil isomalto terlihat lebih baik daripada pati terlarut komersial.

  Licheniformis dengan donor glikosil berasal

  Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim CGT-ase dari biakan B.

UCAPAN TERIMAKASIH

  

Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013

  dan Prospek Diversifikasinya,

  Bacillus species and Synthesis of

  Glycosyl Rhamnose., Bioscience,

  Biotechnology, and Biochemistry 60 (7): 1176-1178.

  Linkenheil, K. 1998. Gambir Processing

  Industry in West Sumatra . ATIAMI and

  Departemen Perindustrian dan Perdagangan Sumatera Barat Mori, S., S. Hirose, T. Oya.and S. Kitahata.

  1994. Purification and Properties of

  Cyclodextrin Glucanotrasferase from Brevibuctrium sp. No. 9605., Bio.sci.

  Biotech. Biochem. 58(11), 1968-1972. N., 2000. Gambir; Budidaya, Pengolahan

  Penerbit Hutanku. Nazir, N. dan Yurnawati. 2002. Studi

  58(1): 38-42 Kometami, T., Y. Terada, T. Nishimura, T.

  Awal mengenai Sifat Anatomis 3 Jenis Gambir Sumatera Barat. Makalah poster

  pada peresmian Gambir Development Center, Payakumbuh 8 Agustus 2002. Sulistyo, J. Y.S. Soeka. Dan R. Handayani.

  2000. Enzymatic Synthesis of

  Polyphenol Galactoside and its Antimelanogenesis and Antioxidative Activities. Makalah pada Kongres Biologi XII.

  Sulistyo, J., Y.S. Soeka and A.K. Karim.

  1998. Sintesis Polifenol- α-glukosida

  oleh CG-Tase Secara Reaksi Transglikolisasi., Biol. Indo. 2(3)y150- 161 .

  Thorpe, J.F dan Whiteley, MA, 1921.

  Thorpe’s Dictionary of Applied Chemistry.

  Nakae, H. Takii and Okada. 1996. Acceptor Specificity of Cyclodextrin Glucanotransferase from an Alkalophilic

  transfer to phenolic compounds by sucrose phosphorylase from leuconostoc mesenteroides and production of α- arbutin. Biosci. Biotech. Biochem.

  Semirata 2013 FMIPA Unila

  Murao, S. Takenishi and H. Nakao. 1993- Enzymatic synthesis of (+)

  |191

  Dharma, A.P. 2005. Tanaman Obat

  Tradisional Indonesia. PN Balai Pustaka. Jakarta.

  Dubois, M., K. Giles and J.K. Hamilton.

  1956. Colorimetric Method for

  Determination of sugar . Anal Chem 28, 356-359.

  Fauza, A. 2007. Variasi Genetik beberapa

  Jenis Gambir Sumatera Barat (riset S-3 Faperta Unpad) . Komunikasi Pribadi.

  Funayama, M. T. Nishino, A. Hirota, S.

  catechin- α-glukosida and its effects on tyronase activity. Biosci Biotech.

  Kitao, S. and H. Sekine. 1994, α-D-glukosyl

  Biochem. 57(10): 1666-1669. Funayama, M., H. Arakawa, R.

  Yamamoto. T. Nishino, T. Shin and S. Murao. 1994. A new microorganism producing a glucosyl transfer enzyme to polyphenols. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 58 (5): 817-821.

  Handayani, R and J. Sulistyo. 2005.

  Transesterification of Fatty Acid by Application of Lipase Technology. J.

  Biodiversitas. 6 (5) Hal. 164-167. Handayani, R., M. Hawab & J. Sulistyo.

  2002. Antioxidation Activity of

  Polyphenol Glycosides Synthesized by Enzymatic Transglycosylation Reaction of Bacillus macerans . J. BioSMART. 4 (2) Hal. 18-22.

  Harborne, J.B. 1988. Metode Fitokimia:

  Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Terbitan ke-2. Terjemahan

  Kosasih, P dan S. Iwang. Penerbit ITB. Bandung.

  Fourth Edition,Vol II. Longman, Green and Co. London 434- 438.