Potensi Bakteri Endofit Asal Tanaman Kopi Untuk Pengendalian Nematoda Luka Akar Pratylenchus Coffeae (Zimmermann) Filipjev & Schuurmans Stekhoven Dan Pemacu Pertumbuhan Tanaman

POTENSI BAKTERI ENDOFIT ASAL TANAMAN KOPI UNTUK
PENGENDALIAN NEMATODA LUKA AKAR Pratylenchus coffeae
(Zimmermann) Filipjev & Schuurmans Stekhoven DAN PEMACU
PERTUMBUHAN TANAMAN

DWI HALIMAH

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Potensi Bakteri Endofit
Asal Tanaman Kopi untuk Pengendalian Nematoda Luka Akar Pratylenchus
coffeae (Zimmermann) Filipjev & Schuurmans Stekhoven dan Pemacu
Pertumbuhan Tanaman adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan

dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2016
Dwi Halimah
NIM A352120211

RINGKASAN
DWI HALIMAH. Potensi Bakteri Endofit Asal Tanaman Kopi untuk
Pengendalian Nematoda Luka Akar Pratylenchus coffeae (Zimmermann) Filipjev
& Schuurmans Stekhoven dan Pemacu Pertumbuhan Tanaman. Dibimbing oleh
ABDUL MUNIF dan GIYANTO.
Kopi merupakan tanaman perkebunan yang memiliki potensi ekspor yang
cukup tinggi. Sebelum abad 19, Indonesia merupakan negara penghasil kopi
terbesar di dunia setelah Brazil, namun saat ini produksi terus menurun dan telah
tergeser oleh negara lain. Salah satu faktor penyebabnya adalah serangan
nematoda luka akar Pratylenchus coffeae. Penurunan produksi akibat nematoda
tersebut mencapai 28.7-78.4% pada kopi Robusta dan pada kopi Arabika, tanaman
hanya dapat bertahan selama dua tahun. Upaya pengendalian terhadap P. coffeae
telah dilakukan di antaranya secara kultur teknis, penggunaan bahan tanam tahan,

kimiawi dan pengendalian biologis. Salah satu teknik pengendalian biologi adalah
dengan pemanfaatan bakteri endofit. Penelitian mengenai eksplorasi dan
penggunaan bakteri endofit pada tanaman kopi sebagai agens pengendali
nematoda P. coffeae belum banyak dilakukan. Penelitian bertujuan memperoleh
isolat tunggal maupun konsorsium bakteri endofit asal tanaman kopi yang efektif
untuk mengendalikan nematoda luka akar P. coffeae dan memacu pertumbuhan
tanaman.
Ruang lingkup penelitian meliputi: 1) isolasi bakteri endofit dari bagian akar,
batang dan daun sehat tanaman kopi untuk memperoleh isolat tunggal dan
konsorsium; 2) penapisan bakteri endofit melalui uji hipersensitif dan hemolisis;
3) pengelompokan isolat tunggal bakteri endofit menurut golongan pseudomonad
fluoresen, Bacillus, Aktinomiset dan bukan ketiganya; 4) penyiapan inokulum P.
coffeae; 5) uji in vitro bakteri endofit terhadap mortalitas P. coffeae dan pemacuan
pertumbuhan tanaman; 6) karakterisasi bakteri endofit mencakup pengujian
aktivitas hidrolisis (kitinolitik, proteolitik, dan lipolitik), produksi HCN,
kemampuan pelarutan fosfat (P), penambatan nitrogen (N2); 7) uji potensi bakteri
endofit dalam menekan populasi P. coffeae dan memacu pertumbuhan tanaman di
rumah kaca; dan 8) identifikasi secara molekuler dengan sekuensing gen 16S
rRNA terhadap 2 isolat tunggal terbaik di rumah kaca.
Hasil isolasi diperoleh 264 isolat tunggal dan 27 konsorsium bakteri endofit.

Hasil seleksi melalui uji hipersensitif dan hemolisis, diperoleh 78 isolat tunggal
dan 9 konsorsium bakteri endofit yang tidak bersifat patogen terhadap tumbuhan
dan mammalia. Pengujian in vitro menunjukkan bahwa sebanyak 77 dari 78 isolat
tunggal dan 9 konsorsium dapat menekan nematoda P. coffeae dengan persentase
mortalitas nematoda antara 6.7-100%, dan 16.7-65.8%. Hasil uji pemacuan
pertumbuhan diperoleh sebanyak 16 isolat tunggal (19.5%) yang memacu
pertumbuhan batang dan 13 isolat tunggal (16.9%) mampu memacu pertumbuhan
akar. Konsorsium bakteri endofit yang dapat memacu pertumbuhan batang
sebanyak 6 konsorsium (60%) dan memacu pertumbuhan akar sebanyak satu
konsorsium (10%). Berdasarkan seleksi awal tersebut dipilih 23 isolat tunggal dan
4 konsorsium bakteri endofit untuk karakterisasi fisiologis. Dua puluh tiga isolat
tersebut terdiri atas 9 isolat yang mampu menekan P. coffeae saja, 10 isolat

memacu pertumbuhan batang dan/atau akar, dan 4 isolat dapat menekan P. coffeae
serta memacu pertumbuhan tanaman. Bakteri endofit konsorsium terseleksi
sebanyak 4 konsorsium, terdiri atas satu konsorsium yang mampu menekan
populasi P. coffeae saja, satu konsorsium dapat memacu pertumbuhan saja, serta 2
konsorsium yang mampu menekan P. coffeae dan memacu pertumbuhan tanaman.
Berdasarkan karakterisasi fisiologis, diperoleh: 1) isolat tunggal bakteri
endofit C939A31 memiliki kemampuan aktivitas proteolitik, kitinolitik, lipolitik,

dan fiksasi N2, serta kemampuan menekan P. coffeae 66.7%; C939A32 memiliki
kemampuan aktivitas lipolitik, pelarutan P dan fiksasi N2, serta kemampuan
menekan P. coffeae 100%; I308A32 memiliki kemampuan aktivitas proteolitik,
lipolitik, pelarutan P dan fiksasi N2, serta kemampuan menekan P. coffeae 77.9%;
2) konsorsium bakteri endofit K6 memiliki kemampuan aktivitas proteolitik,
kitinolitik, lipolitik, produksi HCN dan fiksasi N2, serta kemampuan menekan P.
coffeae 65.8%; K8 memiliki kemampuan aktivitas proteolitik, kitinolitik, lipolitik,
produksi HCN dan fiksasi N2, serta kemampuan menekan P. coffeae 43.1%; K15
memiliki kemampuan aktivitas proteolitik, kitinolitik, lipolitik, produksi HCN,
pelarutan P dan fiksasi N2, serta kemampuan menekan P. coffeae 43.3%.
Hasil pengujian di rumah kaca menunjukkan bahwa isolat tunggal terbaik
yang dapat memacu pertumbuhan dan menekan populasi P. coffeae sebesar 62
dan 69.1% adalah isolat C939A31 dan C939A32, sedangkan konsorsium bakteri
endofit terbaik yang mampu memacu pertumbuhan kopi dan menekan populasi P.
coffeae sebesar 83 dan 92.4% adalah konsorsium K8 dan K15. Identifikasi gen
16S rRNA menunjukkan bahwa isolat C939A31 memiliki kemiripan dengan
Ochrobactrum intermedium DSQ5 dan C939A32 dengan Klebsiella oxytoca
NGB-FR 50.
Kata kunci: isolat tunggal, konsorsium, karakterisasi fisiologis, mortalitas

SUMMARY
DWI HALIMAH. Potency of Endophytic Bacteria from Coffee Plant for
Controlling Root Lesion Nematode Pratylenchus coffeae (Zimmermann) Filipjev
& Schuurmans Stekhoven and Plant Growth Promoting. Supervised by ABDUL
MUNIF and GIYANTO.
Coffee is one of the products of plantation crops that have high export
potential. Before the 19th century, Indonesia was the world’s largest coffee
producer after Brazil, but the production being decreased and this position now
was replaced by other countries. One factor that influenced this conditions were
attacking of root lesion nematode Pratylenchus coffeae. Decreasing of production
caused by this nematode was 28.7-78.4 % on Robusta coffee and on Arabica
coffee, the plants can survived only 2 years. The efforts to control this nematode
have been made by various techniques, such as technical culture, the use of
resistant planting material, chemical and biological control. One technique of
biological control is application of endophytic bacteria. Research on the
exploration and use of endophytic bacteria on coffee plants as an controlling
agenst of P. coffeae nematode has not been widely implemented. This study aims
to obtain either single isolates or consortia of endophytic bacteria origin from
coffee plant which effectively controlling P. coffeae nematode and promote the
growth of plants.

The scopes of research includes: 1) the isolation of endophytic bacteria from
roots, stems, and leaves of healthy coffee plants to obtain single isolates and
consortia of endophytic bacteria; 2) selection of endophytic bacteria through
hypersensitivity and hemolysis test; 3) grouping single isolates of endophytic
bacteria by fluorescent pseudomonads, Bacillus, actinomycetes and out of those
three groups; 4) preparation of P. coffeae inoculum; 5) in vitro assays of
endophytic bacteria to P. coffeae mortality and promoting plant growth; 6)
characterization of endophytic bacteria include hydrolytic activity test
(chitinolytic, proteolytic and lipolytic), HCN production, dissolving of phosphate,
and nitrogen fixation; 7) in vivo assays of endophytic bacteria potential to
suppress P. coffeae population and promote plant growth in greenhouse; and 8)
molecular identification by 16S rRNA gene sequencing of the 2 best single
isolates in greenhouse.
The isolation resulted 264 single isolates and 27 consortia of endophytic
bacteria. Selection through hypersensitive and hemolysis test, produces 78 single
isolates and 9 consortia that are not pathogenic to plants and mammals. In vitro
assays showed 77 single isolates and 9 consortia of endophytic bacteria that could
kill P. coffeae nematodes. Percentage of nematodes mortality was 6.7-100% on
single isolates and 16.7-65.8% on consortia endophytic bacteria. Single isolates
were able to stimulate stem growth indicated on 16 (19.7%) isolates, and able to

stimulate root growth on 13 (16.9%) isolates. Consortia endophytic bacteria were
able to stimulate stem growth showed on 100% consortia, and able to stimulate
root growth on 10% isolates. Based on those assays, we choice 23 single isolates
and 4 consortia endophytic bacteria for the next assays. Those 23 single isolates
were 9 isolates which could only kill P. coffeae, 10 isolates which could only
stimulate plant growth, either shoot growth or root growth, and 4 isolates which

could kill P. coffeae and stimulate plant growth. The four selected consortia of
endophytic bacteria were one consortia which could only kill P. coffeae, one
consortia which could only stimulate plant growth, and two consortia which could
kill P. coffeae and stimulate plant growth.
Based on physiologyst characteristics on in vitro assays, we obtained: 1)
C939A31 single isolate which indicated on proteolytic, chitinolytic, lipolytic, and
N2-fixing activities, and suppressed P. coffeae at 66.7%; C939A32 isolate which
have ability on lipolytic, solubilization of phosphate and N2-fixing activities, and
ability to suppressed P. coffeae at 100%; I308A32 isolate which showed on
proteolytic, lipolytic, solubilization of phosphate and N2-fixing activities, and
ability to suppressed P. coffeae at 77.9%; 2) K6 consortia which indicated on
proteolytic, chitinolytic, lipolytic, HCN production and N2-fixing activities, and
suppressed P. coffeae at 65.8%; K8 consortia which have ability on proteolytic,

chitinolytic, lipolytic, HCN production and N2-fixing activities, and ability to
suppressed P. coffeae at 43.1%; K15 consortia which showed on proteolytic,
chitinolytic, lipolytic, HCN production, solubilization of phosphate and N2-fixing
activities, and ability to suppressed P. coffeae at 43.3%.
The in vivo assays in greenhouse showed that single isolates which gave
highest coffee growth promotion and highly suppressed P. coffeae population on
62 and 69.1% were C939A31 and C939A32 isolates; while consortia endophytic
bacteria which gave highest coffee growth promotion and highly suppressed P.
coffeae population on 83 and 92.4% were K8 and K15 consortia. Identification of
16S rRNA gene showed that C939A31 isolate was identical to Ochrobactrum
intermedium DSQ5, and C939A32 isolate was identical to Klebsiella oxytoca
NGB-FR 50.
Keywords: single isolate, consortia, physiologist characterization, mortality

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan

IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

POTENSI BAKTERI ENDOFIT ASAL TANAMAN KOPI UNTUK
PENGENDALIAN NEMATODA LUKA AKAR Pratylenchus coffeae
(Zimmerman) Filipjev & Schuurmans Stekhoven DAN PEMACU
PERTUMBUHAN TANAMAN

DWI HALIMAH

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Fitopatologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR

2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian tesis: Dr Ir Rita Harni, M. Si
(Balai Penelitian Tanaman Industri dan
Penyegar,
Badan
Penelitian
dan
Pengembangan Pertanian, Kementerian
Pertanian)

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan Januari 2014 – Juni 2015 ini ialah
pengendalian biologi, dengan judul Potensi Bakteri Endofit Asal Tanaman Kopi
untuk Pengendalian Nematoda Luka Akar Pratylenchus coffeae (Zimmermann)
Schuurmans & Stekhoven dan Pemacu Pertumbuhan Tanaman.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Ir Abdul Munif, M Sc Agr
dan Bapak Dr Ir Giyanto, M Si selaku pembimbing, serta Ibu Dr Rita Harni, M Si

selaku penguji luar komisi. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan
kepada Bapak Dr Yudi Sastro, SP, MP dan Ibu Ana Feronika Cindra Irawati, SP,
MP dari Badan Pengkajian Teknologi Pertanian Jakarta; serta Bapak Dr Misnawi,
Bapak Ir Nurkholis, Bapak Imam Ghozali dan Ibu Khodidjah dari Pusat Penelitian
Kopi dan Kakao Jember, yang telah membantu selama penelitian. Ungkapan
terima kasih penulis sampaikan kepada suami tercinta Tri Budi Bowo Laksono,
anak-anakku tersayang Jyotis Andra Arya Pratama dan Lituhayu Puspa Arya
Nirwasita yang telah merelakan waktu kebersamaan kita untuk penyelesaian
penelitian. Penghormatan dan terimakasih tak terhingga penulis sampaikan kepada
suami tercinta; Ibu Sugi Harini dan Bapak Admo Sugito tercinta; juga mertua
tersayang Ibu Soemiyem dan Bapak Soerachman; serta seluruh keluarga, atas
segala doa, kasih sayang dan motivasi yang tak henti-hentinya di setiap detik dan
menit masa penelitian. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada rekanrekan Laboratorium Bakteriologi dan Nematologi Departemen Proteksi Tanaman
IPB, serta rekan S2 Fitopatologi IPB angkatan 2012 yang telah menemani dalam
suka duka selama perkuliahan dan penelitian.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Februari 2016
Dwi Halimah

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
1
2
2
2
3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Pertanaman Kopi Di Indonesia
Nematoda Luka Akar Pratylenchus coffeae
Kerugian Akibat Serangan P. coffeae
Pengendalian Nematoda P. coffeae
Pengendalian Nematoda Parasit dengan Bakteri Endofit

4
4
4
7
7
7

3 METODE
Waktu dan Tempat
Ekstraksi dan Perbanyakan Nematoda P. coffeae
Isolasi dan Pengelompokan Bakteri Endofit
Seleksi Bakteri Endofit sebagai Agens Hayati Secara In Vitro
Karakterisasi Fisiologis Bakteri Endofit
Seleksi Bakteri Endofit sebagai Agens Hayati di Rumah Kaca
Identifikasi Bakteri Endofit Berdasarkan Sekuen Gen 16S rRNA
Analisis Data

10
10
10
10
12
13
14
15
15

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi dan Perbanyakan Nematoda P. coffeae
Isolasi, Seleksi, dan Karakterisasi Bakteri Endofit Asal Tanaman Kopi
Pengaruh Bakteri Endofit terhadap Pertumbuhan Tanaman Kopi di
Rumah Kaca
Pengaruh Perlakuan Bakteri Endofit terhadap Populasi Nematoda P.
coffeae di Rumah Kaca
Identifikasi Isolat Tunggal Bakteri Endofit Potensial Berdasarkan
Sekuen Gen 16S rRNA
Pembahasan Umum

16
16
17
30
33
34
35

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

39
39
39

DAFTAR PUSTAKA

40

LAMPIRAN

49

RIWAYAT HIDUP

51

DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

Kelimpahan populasi bakteri endofit hasil isolasi dari tanaman kopi
Klon BP939 dan BP308
Penggolongan bakteri endofit isolat tunggal asal tanaman kopi klon
BP939 dan BP308 dari Jawa Timur dan Jawa Barat
Indeks keragaman (H') bakteri endofit isolat tunggal asal tanaman kopi
klon BP939 dan BP308 dari Jawa Timur dan Jawa Barat
Pengaruh kultur filtrat bakteri endofit isolat tunggal terhadap tingkat
mortalitas nematoda P. coffeae
Pengaruh kultur filtrat konsorsium bakteri endofit terhadap tingkat
mortalitas nematoda P. coffeae
Pengaruh bakteri endofit isolat tunggal asal tanaman kopi terhadap
pertumbuhan benih tomat
Pengaruh konsorsium bakteri endofit asal tanaman kopi terhadap
pertumbuhan benih tomat
Karakter fisiologis bakteri endofit isolat tunggal dan konsorsium asal
tanaman kopi yang terseleksi
Pengaruh bakteri endofit isolat tunggal terhadap tinggi tanaman kopi di
rumah kaca
Pengaruh bakteri endofit isolat tunggal terhadap biomassa tanaman
kopi
Pengaruh konsorsium bakteri endofit terhadap tinggi tanaman kopi di
rumah kaca
Pengaruh konsorsium bakteri endofit terhadap biomassa tanaman kopi
Pengaruh isolat tunggal dan konsorsium bakteri endofit terhadap P.
coffeae dan tanaman kopi pada percobaan di rumah kaca
Hasil analisis runutan gen 16S rRNA isolat bakteri endofit dengan
runutan gen 16S rRNA di pusat data GeneBank

18
18
19
21
22
23
24
26
31
31
32
32
33
35

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
7
8

Diagram alir penelitian potensi bakteri endofit asal tanaman kopi untuk
pengendalian nematoda luka akar Pratylenchus coffeae dan pemacu
pertumbuhan tanaman
Gejala serangan nematoda P. coffeae pada akar kopi
Inokulum nematoda P. coffeae yang digunakan untuk pengujian
Hasil uji reaksi hipersensitif bakteri endofit asal tanaman kopi
Uji hemolisis pada isolat bakteri endofit asal tanama kopi
Karakter fisiologis pada bakteri endofit asal tanaman kopi
Hasil elektroforesis DNA isolat uji

3
16
17
20
20
28
34

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4

Homologi runutan pita DNA isolat terseleksi dengan spesies lain di
GeneBank
Urutan basa nukleotida isolat C939A31
Urutan basa nukleotida isolat C939A32
Urutan basa nukleotida isolat I308A32

49
50
50
50

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kopi merupakan salah satu komoditas perkebunan unggulan di Indonesia,
namun produksinya terus menurun. Salah satu penyebabnya adalah adanya
serangan nematoda, di antaranya Meloidogyne incognita, Pratylenchus coffeae
dan Radhopolus similis. Penurunan produksi akibat serangan nematoda tersebut
berkisar 28.7%-78.4% pada kopi Robusta (Wiryadiputra dan Atmawinata 1998).
Nursol et al. (2006) menyebutkan serangan nematoda parasit pada kopi robusta
menyebabkan tanaman hanya dapat bertahan hidup hingga 5 tahun, tetapi pada
kopi Arabika hanya dapat bertahan selama 2 tahun (Wiryadiputra dan Atmawinata
1998).
Serangan P. coffeae dapat menyebabkan akar tanaman kopi berwarna
kuning, kemudian berubah menjadi coklat, sedangkan akar lateralnya busuk. Luka
pada akar tersebut merusak seluruh sistem perakaran kopi sehingga menghambat
penyerapan hara dari tanah. Daun menunjukkan gejala klorosis (menguning)
dimulai dari daun terdekat dari batang, kemudian cabang-cabang utama tumbuh
sedikit, dan batang pohon menjadi mudah digoyang karena akarnya habis,
akhirnya tanaman mati (Campos et al. 1990). Pada bibit dan tanaman muda
pertumbuhan lambat, tanaman kurus dan kerdil, daun mengecil serta klorosis.
Pada daun timbul bercak nekrosis berwarna coklat tua seperti terbakar, dimulai
dari ujung daun. Tanaman muda kopi Arabika varietas Kartika 1 dan Kartika 2
yang terserang berat mati sebelum dewasa, atau paling lama setelah berbuah
pertama, diawali dengan gejala menguningnya daun. Hal ini berkaitan dengan
sebaran populasi nematoda tersebut mulai permukaan tanah hingga kedalaman 30
cm, dimana akar kopi muda sebagian besar berada pada zona kedalaman yang
sama. Dalam hamparan pertanaman kopi dewasa, gejala menguning tampak dalam
blok-blok tertentu mengikuti jalannya aliran air. Gejala kerusakan diperparah jika
tidak ada tanaman penaung dan kurang pemupukan (Hulupi 2008).
Upaya pengendalian nematoda pada tanaman kopi dapat dilakukan dengan
kultur teknis, kimiawi, varietas tahan, dan pengendalian secara biologis.
Pengendalian kultur teknis dapat dilaksanakan dengan sanitasi kebun, penanaman
tanaman perangkap, pergiliran/rotasi tanaman (Wiryadiputra, 1997). Pengendalian
secara kimiawi dapat dilakukan dengan sterilisasi media bibit dengan fungisida
dan sterilisasi pertanaman dengan nematisida sistemik dan kontak (Mustika 2005).
Pengendalian dengan varietas tahan dapat dilakukan dengan penanaman klon
BP308 yang telah direkomendasikan sebagai klon yang tahan terhadap nematoda
parasit (Surat Keputusan Menteri Pertanian No. 65/Kpts/SR.120/1/2004).
Pengendalian secara biologis dapat dilakukan dengan aplikasi agens hayati, salah
satunya menggunakan bakteri endofit.
Pengendalian biologi menggunakan bakteri endofit merupakan salah satu
komponen pengendalian nematoda Pratylenchus yang cukup menjanjikan karena
sebagai agens biokontrol, penginduksi ketahanan tanaman dan pemacu
pertumbuhan tanaman (Harni 2014). Sebagai agens biokontrol, bakteri endofit
dapat memproduksi enzim, senyawa-senyawa volatil, zat pelisis dan substansi
racun lainnya yang merupakan antagonis patogen (Baker dan Cook 1974). Induksi

2
ketahanan tanaman oleh bakteri endofit dapat terjadi melalui induksi ketahanan
sistemik (induced systemic resistance/ISR) dan ketahanan perolehan (systemis
acquire resistance/SAR) (Van Loon dan Bakker 2006). ISR oleh bakteri endofit
dapat terjadi dengan pembentukan senyawa lipopolysacharida (LPS) yang
menurunkan penetrasi nematoda pada akar, mencegah terbentuknya feeding site
dan reproduksi nematoda (Sikora et al. 2007). Mekete et al. (2009) telah
menggunakan bakteri endofit Bacillus pumilus dan B. mycoides untuk menekan
populasi dan jumlah puru nematoda Meloidogyne incognita pada tanaman kopi.
Eksplorasi bakteri endofit dari komoditas kopi di Indonesia telah dilaksanakan
oleh (Harni dan Khaerati 2013) dari beberapa lokasi pertanaman kopi di Jawa
Barat dan Lampung. Dari 422 isolat hasil eksplorasi, 50 isolat (12.3%) bersifat
antagonis terhadap P. coffeae dan 60 isolat (14.21%) dapat meningkatkan
pertumbuhan.
Perumusan Masalah
Serangan nematoda luka akar P. coffeae pada tanaman kopi telah
menimbulkan kerugian yang tinggi. Berbagai teknologi pengendalian telah
dikembangkan, di antaranya pengendalian secara biologi. Hal tersebut menjadi
landasan dilaksanakannya penelitian ini. Penelitian ini mencakup kegiatan
eksplorasi, seleksi dan pengujian keefektifan bakteri endofit asal tanaman kopi
untuk pengendalian nematoda luka akar P. coffeae dan memacu pertumbuhan
tanaman.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mendapatkan isolat bakteri endofit asal tanaman
kopi, baik isolat tunggal maupun konsorsium yang efektif untuk mengendalikan
nematoda luka akar P. coffeae dan memacu pertumbuhan tanaman.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan bermanfaat untuk pengembangan pengendalian
nematoda yang berbasis pengendalian secara biologi, melalui pemanfaatan isolat
tunggal dan konsorsium bakteri endofit dari tanaman kopi yang efektif untuk
pengendalian nematoda parasit P. coffeae dan memacu pertumbuhan tanaman.

3
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian meliputi kegiatan isolasi, seleksi secara in vitro di
laboratorium dan pengujian di rumah kaca (Gambar 1).
Pengambilan sampel
Isolasi bakteri endofit dari tanaman kopi (akar, batang, daun)
Pengelompokan isolat tunggal
(Bacillus, fluoresen, aktinomiset)

Isolat Konsorsium

Uji Reaksi Hipersensitif

Penyediaan
nematoda
P. coffeae

Uji Hemolisis

Uji
pertumbuhan
secara in vitro

Karakterisasi Fisiologis
(Kitinolitik, Proteolitik, Lipolitik,
HCN, Pelarut P, Fiksasi N)

Antibiosis bakteri
endofit terhadap P.
coffeae secara in vitro

Uji potensi bakteri endofit di rumah kaca

Identifikasi molekuler gen 16S rRNA isolat tunggal potensial

Gambar 1 Diagram alir penelitian potensi bakteri endofit asal tanaman kopi untuk
pengendalian nematoda luka akar Pratylenchus coffeae dan pemacu
pertumbuhan tanaman

4

2 TINJAUAN PUSTAKA
Pertanaman Kopi Di Indonesia
Kopi merupakan salah satu komoditas perkebunan di Indonesia. Kopi
Arabika varietas Typica merupakan jenis kopi yang pertama kali dibudidayakan di
Indonesia. Pada tahun 1959, penyakit karat daun mulai menyerang pertanaman
kopi di Indonesia, sehingga varietas tersebut hanya mampu bertahan jika ditanam
pada ketinggian > 1250 m dpl. Kopi Liberika (Coffea liberica) dan Ekselsa
(Coffea dewevrei var. excelsa) diintroduksi untuk penanaman di lahan rendah.
Kedua jenis kopi tersebut memiliki produktivitas yang rendah dan citarasa kopi
yang asam, sehingga kurang disukai (Yahmadi, 1972). Pada saat ini jenis kopi
tersebut hanya dijumpai di lahan gambut (Sumatera dan Kalimantan) sebagai
konsumsi lokal. Selanjutnya jenis kopi Robusta (Coffea canephora var. robusta)
(kopi Robusta) diintroduksi untuk mengatasi kelemahan kedua jenis kopi
sebelumnya.
Hasil pengamatan lapangan menunjukkan bahwa sebagian besar klon
anjuran maupun varietas lokal kopi Robusta di Indonesia rentan serangan
nematoda parasit. Klon-klon kopi Robusta anjuran, BP 42, BP 358, BP 409, BP
436, BP 534, BP 936 dan BP 939 rentan nematoda P. coffeae (Wiryadiputra dan
Hulupi 1997), dan sampai saat ini baru ditemukan satu genotipe yang
menunjukkan reaksi tahan, yaitu klon BP 308 (Mawardi et al. 2003). Hal serupa
juga terjadi pada kopi Arabika, semua varietas anjuran kopi Arabika tidak tahan
serangan nematoda parasit, dengan tingkat kerentanan berbeda-beda. Varietas S
795 merupakan varietas yang mampu beradaptasi pada kondisi lahan marginal
namun ternyata rentan terhadap nematoda parasit (Hulupi 2006).

Nematoda Luka Akar Pratylenchus coffeae
Nematoda luka akar dari genus Pratylenchus Filipjev 1936 mengakibatkan
kerugian ekonomi ranking kedua setelah nematoda puru akar dan sista pada
pertanaman (Sasser dan Freckman 1987). Hal tersebut tidak hanya disebabkan
luasnya kisaran inang, namun juga sebarannya yang cukup luas baik di daerah
dingin, subtropis maupun tropis. Spesies Pratylenchus merupakan patogen
biotroph obligat, soil-inhabiting parasites dan dapat ditemukan hampir di seluruh
daerah pertanian di dunia. Meskipun spesies Pratylenchus bersifat polifag, namun
kisaran inang masing-masing spesies cukup jelas. Nematoda tersebut dikenal di
dunia sebagai patogen utama pada pertanaman dengan nilai ekonomi tinggi seperti
pisang, sereal, kopi, jagung, leguminoceae, kacang tanah, kentang, buah-buahan
dan sayuran. Sebagai migratory-endoparasite, Pratylenchus spp. menyebabkan
beberapa kerusakan pada tanaman terutama pada jaringan parenkim dan korteks.
Baik penetrasi pada tanaman maupun migrasi mungkin difasilitasi kombinasi
antara pengrusakan oleh stilet dan enzim pendegradasi sel yang dihasilkan.
Nematoda Pratylenchus dapat makan inangnya secara ektoparasit, namun
kerusakan pada inang lebih disebabkan karena aktivitas endoparasit. Nama

5
nematoda luka akar (root-lesion nematodes) diturunkan dari luka nekrotik yang
mudah terlihat pada akar inangnya. Genus Praylenchus terdiri atas 68 spesies
yang tersebar di seluruh dunia dengan berbagai jenis tanaman inang, di antaranya
Pratylenchus brachyurus yang menyerang tanaman herba dan buah-buahan,
Pratylenchus coffeae (Zimmermann 1898) Filipjev & Schuurmans Stekhoven
yang menyerang kopi, jeruk, tebu dan teh, Pratylenchus loosi Loof 1960 yang
menyerang teh, Pratylenchus penetrans Cobb 1917 yang memarasit tanaman buah,
rumput dan strawberi, serta 64 spesies lainnya (Castillo dan Vovlas 2007).
Nematoda P. coffeae dilaporkan sebagai tipe lokal yang pertama kali
ditemukan pada perakaran kopi (Coffeae sp.) di Bogor Jawa Barat, Indonesia.
Pratylenchus coffeae memarasit tanaman kopi di beberapa negara di dunia, dan
beberapa jenis tanaman lain seperti kakao, tomat, karet, albisia, apel, mahoni,
pisang, krisan, kapas, dahlia, jeruk, ketela rambat, kelapa sawit, jahe, kelapa,
tanaman obat dan rempah, kacang tanah, mawar, palm, strawberi dan padi yang
tersebar luas di Asia (India, Thailand, Vietnam, Taiwan, Jepang), Eropa dan USA
(Zhang et al. 2002; Giribabu dan Saha 2003; Lee et al. 2006; Van den Berg et al.
2006; Inserra et al. 2001; Adiko dan N’Guessan 2001; Urek et al. 2003); dan di
Spanyol memarasit pisang (Castillo dan Vovlas 2007).
Pratylenchus coffeae (Zimmermann) Filipjev & Schuurmans Stekhoven
termasuk ke dalam kingdom Animalia, filum Nematoda, kelas Secernentea,
subkelas Tylenchia, ordo Tylenchida, subordo Tylenchina, superfamili
Tylenchoidea, famili Pratylenchidae, subfamili Pratylenchinae, genus
Pratylenchus (Goodey 1973). P. coffeae dicirikan oleh tubuh nematoda betina
agak silinder saat masih muda dan menjadi agak datar saat sudah tua/dewasa,
kutikula memiliki anulasi yang jelas. Bagian lateral memiliki 4 atau kadangkadang 5/6 garis. Daerah bibir datar/agak offset dari tubuhnya, dengan dua/tiga
anul yang jelas pada satu sisi bibir. Bagian bawah dicirikan oleh fusi antara
subdorsal, subventral dan bibir lateral dengan mulut yang datar (Corbett dan Clark
1983; Hernández et al. 2000). Pangkal knob dari stiletnya melingkar hingga
lonjong. Kantong post-vulva uterine berukuran 1-1.5 kali diameter tubuh, panjang
mencapai 90 μm, ovarium tidak berkembang dan terkadang memiliki oocyte.
Spermateka besar, berbentuk oval atau hampir bulat, biasanya dengan sperma.
Telur pada intra-uterin terdiri atas embrio-embrio. Ekor berukuran 2-2.5 kali
diameter bagian tubuh anal pada betina muda, dan 1.5-2 kali diameter bagian
tubuh anal pada betina dewasa; bagian terminal kadang-kadang tampak melingkar
lembut, truncate atau crenate tidak beraturan (Castillo dan Vovlas 2007).
Nematoda betina memiliki ukuran panjang tubuh 0.45-0.70 mm, anulus 25-35 μm,
vulva 76-83, dan stilet 15-18 μm. Jumlah nematoda jantan biasanya berlimpah.
spikula ramping, dengan manubria yang terbentuk baik dan poros bagian ventral
melengkung, panjang tubuh 16-20 μm, panjang gubernaculum 4-7 μm,
hypoptygma menonjol (Castillo dan Vovlas 2007). Nematoda jantan tersebut
memiliki ukuran 0.45-0.70 mm, anulus 26-40 μm, stilet 15-17 μm (Sher dan Allen,
1953).
Untuk analisis kekerabatan dan diagnosis, dilaporkan bahwa P. coffeae
dicirikan oleh daerah bibir yang sedikit tereduksi dengan dua annulus yang jelas,
bagian ujung ekor betina agak datar atau truncate atau hemispherical dan
jumlahnya berlimpah. Spesies ini dapat dibedakan secara jelas dengan spesies
terdekatnya yaitu P. loosi dengan annulasi tubuhnya, posisi vulva, bentuk ekor

6
betina, dan ujung ekor P. coffeae yang agak datar atau truncate atau hemispherical
dibandingkan meruncing secara jelas/lembut pada P. loosi. Siddiqi (2000)
meneliti paratipe dari R. allius dan R. brassicae, dan menemukan bahwa keduanya
termasuk dalam genus Pratylenchus. Setelah studi paratipe tersebut, Siddiqi
(2000) memutuskan bahwa P. brassicae (Shahina dan Maqbool, 1996) merupakan
sinonim dari P.coffeae.
Luc et al. (1995) menyebutkan bahwa nematoda P. coffeae dicirikan oleh
dua anul pada daerah bibir, bagian kepala tampak rendah dan datar. Panjang tubuh
berkisar antara 0.37 – 0.83 mm. Bagian anterior agak cembung dan tidak ada
tanda-tanda seksual dimorfisme. Bentuk tubuhnya sedikit bengkok pada bagian
ventralnya saat fase istirahat/mati. Nematoda jantan mempunyai ciri-ciri yaitu
ekornya pendek, bagian dorsalnya seperti kerucut dan melengkung, spikulanya
silindris memanjang dan melengkung. Bentuk spermateka nematoda jantan
melingkar dan dipenuhi oleh sperma. Nematoda betina mempunyai vulva di
bagian posterior. Pos-vulva bervariasi namun tidak berfungsi (mono-prodelfik). P.
coffeae mempunyai stilet yang panjang (14-18 µm) dan mengalami sklerotinisasi
sedang, basal knob berbentuk bulat serta bagian anteriornya berbentuk cekung.
P. coffeae bersifat semimigratori endoparasitik dan bereproduksi secara
seksual/amfimiktik. Semua stadium hidupnya terdapat di dalam jaringan korteks
inangnya. Nematoda ini mempunyai 4 stadium juvenil dan dewasa.
Perkembangbiakan P. coffeae mencapai optimum pada suhu tanah relatif tinggi
yaitu 26-30 0C. Pada suhu tersebut populasi nematoda dapat menyelesaikan daur
hidupnya kurang dari satu bulan dan dapat mencapai tingkat populasi sebanyak 10
000 ekor/g akar. Nematoda dapat bertahan hidup tanpa tumbuhan inang selama
beberapa bulan atau paling sedikit 4 bulan. Perpindahan nematoda ini melalui
tanah berjalan sangat lambat yaitu sekitar satu meter tiap tahun. Nematoda bersifat
patogenik pada tanah pasiran sampai tanah debuan pasiran (Luc et al. 1995). Pada
umumnya, populasi P. coffeae meningkat pada musim hujan dan mencapai
puncaknya ketika 7-8 bulan setelah masa tanam. Populasi P. coffeae menurun
pada kondisi tanah yang mempunyai pH 3.85 - 6 (Castillo dan Vovlas 2007).
Serangan P. coffeae dapat menyebabkan akar tanaman kopi berwarna
kuning, kemudian berubah menjadi coklat, sedangkan akar lateralnya busuk. Luka
akar tersebut merusak seluruh sistem perakaran kopi sehingga menghambat
penyerapan hara dari tanah. Daun menunjukkan gejala klorosis (menguning)
dimulai dari daun yang terdekat batang, kemudian cabang-cabang utama tumbuh
sedikit, dan batang pohon menjadi mudah digoyang karena akarnya habis,
akhirnya tanaman mati (Campos et al. 1990). Gejala kerusakan berupa luka hitam
dalam akar yang berkembang menjadi nekrosis ke seluruh permukaan akar. Luka
tersebut dikelilingi oleh sel-sel epidermis yang mati dan berwarna pucat. Luka
dapat meluas ke seluruh jaringan parenkim. Pada infeksi stadium akhir, jaringan
parenkim hancur dan jaringan korteks terpisah dari silinder pusat. Infeksi oleh
nematoda dapat mengurangi tingkat pertumbuhan tanaman, munculnya daun
tertunda, berat daun berkurang antara 30-45%, daun tanaman berubah berwarna
kuning, kemudian menjadi merah, kehilangan turgiditas dan kemudian menjadi
layu (Luc et al. 1995). Pada bibit dan tanaman muda pertumbuhan lambat,
tanaman kurus dan kerdil, daun mengecil serta klorosis. Pada daun timbul bercak
nekrosis berwarna coklat tua seperti terbakar, dimulai dari ujung daun. Tanaman
muda kopi Arabika varietas Kartika 1 dan Kartika 2 yang terserang berat mati

7
sebelum dewasa, atau paling lama setelah berbuah pertama, diawali dengan gejala
klorosis. Hal ini berkaitan dengan sebaran populasi nematoda tersebut mulai
permukaan tanah hingga kedalaman 30 cm, dimana akar kopi muda sebagian
besar berada pada zona kedalaman yang sama. Dalam hamparan pertanaman kopi
dewasa, gejala menguning tampak dalam blok-blok tertentu mengikuti jalannya
aliran air. Gejala kerusakan diperparah jika tidak ada tanaman penaung dan
kurang pemupukan (Hulupi 2008).
Kerugian Akibat Serangan P. coffeae
Serangan P. coffeae pada kopi robusta dapat menyebabkan penurunan
produksi sampai 57% atau berkisar 28.7-78.4 % (Wiryadiputra dan Atmawinata
1998), dan tanaman hanya dapat bertahan sampai umur 5 tahun, dengan tingkat
kematian mencapai 30% (Nursol et al. 2006). Serangan pada kopi Arabika
menyebabkan tanaman hanya dapat bertahan selama 2 tahun. Serangan
Radhopolus similis bersama-sama dengan P. coffeae pada kopi Arabika dapat
mengakibatkan kerusakan lebih parah yaitu 80% dan tanaman akan mati pada
umur kurang dari 3 tahun (Wiryadiputra dan Atmawinata 1998). Di daerah
grassland ekosistem subtropis utara, kejadian penyakit akibat Pratylenchus adalah
84% lebih sering terjadi dibanding nematoda sista (21% kejadian penyakit) atau
puru akar (19% kejadian penyakit) (De Goede dan Bongers 1998).
Pengendalian Nematoda P. coffeae
Pengendalian nematoda pada tanaman kopi selama ini dilakukan dengan
kultur teknis, mekanis, kimiawi, bahan tanam tahan, dan secara biologi (CABI
2014; Wiryadiputra 1997; Wiryadiputra dan Hulupi 1997). Pengendalian kultur
teknis dapat dilaksanakan dengan sanitasi kebun, penanaman tanaman perangkap,
pergiliran/rotasi tanaman (rumput guatemala/Trypsacum laxum, Tagetes patula,
Crotalaria anagyroides, C. striata dan C. usaramuensis, tebu, kakao terutama
kakao Lindak (Bulk cocoa), dan karo benguk (Mucuna sp.) (Wiryadiputra 1997).
Pengendalian secara mekanis dapat dilakukan dengan solarisasi/pemberaan tanah
dan hot water treatment pada benih. Pengendalian secara kimiawi dapat dilakukan
dengan sterilisasi media bibit dan pertanaman digunakan nematisida sistemik dan
kontak (oksamil, karbofuran, etoprofos dan kadusafos) (Mustika 2005).
Penggunaan bahan tanam tahan dapat dilaksanakan dengan menanam jenis kopi
Ekselsa (Coffea exelsa), yaitu Bgn. 121.09, dan Robusta (C. canephora var.
robusta), yaitu BP 961 dan BP 308 (Wiryadiputra 1997; Wiryadiputra dan Hulupi
1997).

Pengendalian Nematoda Parasit dengan Bakteri Endofit
Sejak 25 tahun lalu pengendalian hayati dalam pengendalian penyakit telah
menjadi fenomena yang menarik (Cook 1990). Pengendalian hayati merupakan

8
salah satu komponen dari konsep pengendalian penyakit secara terpadu untuk
mengurangi kepadatan inokulum dan aktivitas patogen, dengan memanipulasi
lingkungan dan inang menggunakan satu atau lebih agens antagonis. Agens
pengendali hayati mempunyai kemampuan mempengaruhi pertumbuhan dan
aktivitas patogen karena diduga adanya senyawa metabolit yang dikeluarkan serta
adanya kompetisi ruang dan nutrisi (Baker dan Cook 1974). Agens antagonis
terbukti tidak menimbulkan efek negatif bagi lingkungan maupun organisme lain
(Graham dan Mitchell 1999). Agens antagonis baik dari golongan bakteri maupun
cendawan, hidup pada habitat yang sama dengan patogen (Thomas et al. 1999).
Pengendalian secara biologi menggunakan bakteri endofit menjadi pilihan yang
cukup menjanjikan karena P. coffeae termasuk patogen yang sulit dikendalikan.
Castillo dan Vovlas (2007) menyebutkan bahwa kemampuan beberapa spesies
Pratylenchus untuk bertahan dalam kondisi anhydrobiosis merupakan salah satu
penyebab mengapa nematoda tersebut sulit dieradikasi dari lahan yang telah
terinfeksi. Beberapa studi menyebutkan bahwa P. coffeae dapat bertahan lama
dalam kondisi kering di tanah. Tsai (2008) melaporkan bahwa P. coffeae
merespon pengeringan yang lambat dengan membungkukkan tubuhnya dalam
bentuk coil yang ketat. Dalam kondisi tersebut individu P. coffeae dapat direaring
hingga 9 bulan dengan tingkat survival mencapai 36.1%.
Bakteri endofit didefinisikan sebagai bakteri yang hidup dalam jaringan
tanaman, tanpa menyebabkan kerugian bagi tanaman inang (Hallmann et al. 1999).
Hubungan antara tanaman dan bakteri endofit merupakan interaksi secara tertutup,
dengan tanaman menyediakan nutrisi bagi bakteri endofit dan bakteri endofit
meningkatkan pertumbuhan dan kesehatan tanaman. Penambatan nitrogen (N2)
secara biologis oleh sejumlah spesies bakteri endofit memiliki keunggulan
dibandingkan bakteri rizosfer, karena keberadaannya di dalam jaringan
interseluler tanaman yang tidak mudah hilang, sedangkan nitrogen yang berada
bebas di alam sangat bersifat labil, mudah tercuci air hujan dan erosi, dan mudah
menguap ke udara (Susilowati et al. 2007).
Chandrashekhara et al. (2007), menyatakan bahwa bakteri endofit dari
beberapa genera seperti Pseudomonas, Bacillus dan Azospirillum, dilaporkan
mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman, menguraikan dinding sel patogen,
dan menghambat pertumbuhan patogen dengan menghasilkan senyawa
antimikroba. Aktinomiset/actinobacteria merupakan satu grup bakteri gram
positif yang banyak dilaporkan memproduksi antibiotik (Chantongcome et al.
2009).
Pengendalian biologi menggunakan bakteri endofit merupakan salah satu
komponen pengendalian nematoda Pratylenchus yang cukup menjanjikan karena
sebagai agens biokontrol, penginduksi ketahanan tanaman dan pemacu
pertumbuhan tanaman (Harni 2014). Sebagai agens biokontrol, bakteri endofit
dapat menjadi antagonis patogen melalui produksi enzim, senyawa-senyawa
volatil, zat pelisis dan substansi racun lainnya (Baker dan Cook 1974). Induksi
ketahanan tanaman oleh bakteri endofit dapat terjadi melalui induksi ketahanan
sistemik (induced systemic resistance/ISR) dan ketahanan perolehan (systemis
acquire resistance/SAR) (Van Loon dan Bakker 2006). ISR oleh bakteri endofit
dapat terjadi dengan pembentukan senyawa lipopolysacharida (LPS) yang
menurunkan penetrasi nematoda pada akar, mencegah terbentuknya feeding site
dan reproduksi nematoda (Sikora et al. 2007). Harni et al. (2012) menyebutkan

9
mekanisme kerja bakteri endofit dalam mengendalikan P. brachyurus pada
tanaman nilam adalah dengan menginduksi ketahanan tanaman melalui
peningkatan produksi asam salisilat, peroksidase dan fenol oleh bakteri endofit A.
xylosoxidans TT2, A. faecalis NJ16 dan P. putida EH11. Di samping itu, bakteri
endofit juga dapat memicu pertumbuhan tanaman melalui peningkatan indole
acetic acid terutama pada perlakuan dengan Bacillus cereus MSK.
Penelitian mengenai eksplorasi bakteri endofit pada kopi telah dilakukan
oleh beberapa peneliti. Vega et al. (2005) telah mengisolasi bakteri endofit dari
daun dan batang buah kopi. Bakteri endofit tersebut diidentifikasi sebagai Bacillus,
Burkholderia, Clavibacter, Curtobacterium, Eschericia, Micrococcus, Pantoea,
Stenotrophomonas. Isolasi bakteri endofit asal
Pseudomonas, Serratia,
tanaman kopi juga telah dilaksanakan untuk pengendalian Hemileia vastatrix
penyebab karat daun (Shiomi et al. 2006); Alternaria alternata, Fusarium
verticillioides, Rhizoctonia solani (Milan et al. 2006); dan nematoda P. coffeae
(Harni dan Khaerati 2013; Senthilkumar et al. 2013). Mekete et al. (2009) telah
menggunakan bakteri endofit Bacillus pumilus dan B. mycoides untuk menekan
populasi dan jumlah puru nematoda Meloidogyne incognita pada tanaman kopi.
Eksplorasi bakteri endofit asal komoditas kopi di Indonesia oleh Harni dan
Khaerati (2013) dari beberapa lokasi pertanaman kopi di Jawa Barat dan Lampung
menghasilkan 422 isolat hasil eksplorasi, 50 isolat (12.3%) bersifat antagonis
terhadap P. coffeae dan 60 isolat (14.21%) dapat meningkatkan pertumbuhan.

10

3 METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan dari bulan Januari 2014 hingga Agustus 2015, di
Laboratorium Nematologi dan Laboratorium Bakteriologi Departemen Proteksi
Tanaman IPB, Laboratorium Mikrobiologi BPTP Jakarta, dan rumah kaca
University Farm Cikabayan IPB.
Ekstraksi dan Perbanyakan Nematoda P. coffeae
Nematoda P. coffeae diperoleh dari koleksi Laboratorium Pusat Penelitian
Kopi dan Kakao Jember. P. coffeae diperbanyak pada bibit kopi umur +2 bulan.
Nematoda diinokulasikan sebanyak 50 ekor/tanaman dan digunakan sebagai
sumber inokulum. Setelah inkubasi selama 2-6 bulan, nematoda P. coffeae
diekstraksi dari contoh akar tanaman kopi yang terinfeksi nematoda dengan
metode mist chamber (Viglierchio dan Schmitt 1983). Akar dipotong-potong +1-2
cm dan diletakkan di atas corong yang telah dialasi dengan kain saring. Corong
yang telah terisi akar diletakkan di dalam ruang mist chamber. Pemanenan
nematoda dilakukan setelah 2-3 hari dengan mengambil air dalam wadah
penampung dan disaring dengan saringan berukuran 500 mesh.
Nematoda yang diperoleh diidentifikasi secara morfologi dengan
pengamatan preparat semipermanen. Pembuatan preparat semipermanen
mengikuti metode Goodey (1973) yang telah dimodifikasi. Lingkaran parafin
dibuat di atas gelas objek dengan menggunakan bor gabus (cork borer) dengan
ketebalan yang sama, kemudian diteteskan laktofenol pada tengah lingkaran
parafin. Sebanyak 3-5 ekor nematoda diletakkan pada larutan laktofenol dengan
posisi sejajar dan ditutup cover glass. Preparat kemudian dipanaskan di atas
lampu bunsen. Pinggir cover glass direkatkan dengan kuteks transparan.
Pengamatan morfologi dilakukan menggunakan mikroskop dan didokumentasikan
menggunakan kamera. Identifikasi dilakukan mengacu pada buku identifikasi
nematoda yaitu: buku Plant Parasitic Nematodes : a Pictorial Key to Genera
(May et al. 1996). Nematoda telah diidentifikasi sebagai nematoda P. coffeae,
digunakan untuk pengujian in vitro dan di rumah kaca.
Isolasi dan Pengelompokan Bakteri Endofit
Isolasi Isolat Tunggal Bakteri Endofit dari Tanaman Kopi
Isolasi bakteri endofit mengikuti metode Hallmann (2001) yang
dimodifikasi. Akar, batang dan daun kopi dicuci dengan air mengalir dan
ditimbang sebanyak 1 g berat basah. Sterilisasi permukaan jaringan daun
dilakukan dengan merendam daun dalam alkohol 70% selama 1 menit, dilanjutkan
NaOCL 3% + 0.05% Tween 20 selama 3 menit. Sedangkan sterilisasi permukaan
jaringan akar dan batang dilakukan dengan merendam dalam alkohol 70% selama

11
2 menit, dilanjutkan perendaman dalam NaOCl 3% + 0.05% Tween 20 selama 4
menit. Pembilasan terakhir dilakukan dengan aquadest steril sebanyak tiga kali.
Sampel selanjutnya digerus menggunakan mortar steril sampai halus dan
dilakukan pengenceran berseri hingga 10-3. Suspensi pada tingkat pengenceran 102
dan 10-3 ditumbuhkan pada media Trypsic Soybean Agar (TSA) 20% lalu
diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Sebagai pembanding atau kontrol,
akar, batang dan daun yang sudah disterilisasi permukaan (sebelum dihancurkan)
digoreskan pada media TSA 20%. Jika pada kontrol tidak tumbuh bakteri maka
koloni bakteri hasil isolasi dapat diasumsikan sebagai endofit.
Koloni bakteri endofit yang tumbuh dimurnikan pada media TSA 100%.
Jumlah total bakteri merupakan perkalian jumlah koloni dengan faktor
pengencerannya. Penyimpanan isolat bakteri endofit menggunakan media TSB
100% + 20% gliserol pada suhu -20 ˚C.
Isolasi Konsorsium Bakteri Endofit dari Tanaman Kopi
Isolasi konsorsium bakteri endofit yang dilakukan sama dengan metode
isolasi endofit koloni tunggal. Seluruh koloni bakteri endofit dari isolasi yang
tumbuh dipanen dengan diluruhkan. Pemanenan dilakukan dengan menuangkan 2
mL media Trypsic Soybean Broth (TSB )100% + gliserol 20% pada biakan koloni
di cawan petri. Suspensi konsorsium bakteri endofit tersebut kemudian disimpan
dalam tabung eppendorf 1.5 mL pada suhu -20 oC.
Uji Hipersensitivitas
Uji hipersensitif mengikuti metode Klement dan Goodman (1967). Isolat
tunggal dan konsorsium bakteri endofit dikulturkan pada media TSB 100% dan
dishaker dengan kecepatan 100 rpm selama 24 jam. Suspensi bakteri endofit
disuntikkan pada lamina daun tembakau sehat bagian bawah, menggunakan jarum
suntik, masing-masing sebanyak 2 mL dengan tiga kali ulangan untuk setiap isolat.
Tanaman tembakau diinkubasi selama 48 jam. Pengamatan dilakukan terhadap
terjadinya klorosis/nekrosis pada daun tembakau. Isolat yang tidak menunjukkan
terjadinya nekrosis pada daun digunakan untuk pengujian selanjutnya.
Uji Hemolisis
Uji hemolisis bakteri endofit dilakukan mengikuti metode Beutin (1991).
Isolat tunggal dan konsorsium bakteri endofit yang menunjukkan reaksi negatif
pada uji hipersensitif diuji kemampuannya dalam menghidrolisis butir darah
merah. Biakan bakteri umur 24 jam ditumbuhkan pada media Blood Agar,
kemudian diinkubasi selama 24 jam dan diamati terbentuknya zona hemolisis.
Zona hemolisis berupa zona terang yang jelas batasnya di sekitar koloni
merupakan α-hemolisis, tetapi zona agak gelap di sekitar koloni(perubahan warna
media menjadi kehijauan agak gelap) merupakan β-hemolisis, zona terang diikuti
agak gelap merupakan αβ-hemolisis. Bila bakteri endofit menunjukkan ketiga
aktivitas hemolisis tersebut maka tidak digunakan karena berbahaya bagi manusia.
Bakteri endofit yang tidak menunjukkan pembentukan zona hemolisis/perubahan

12
warna media ( -hemolisis) akan digunakan untuk pengujian lebih lanjut (Khusnan
et al. 2008).
Pengelompokan Isolat Tunggal Bakteri Endofit
Bakteri endofit hasil isolasi dikelompokkan ke dalam kelompok Fluoresen,
Aktinomiset dan Bacillus, dengan menggunakan media selektif. Pengelompokan
ini bertujuan untuk mempermudah identifikasi lebih lanjut.
Bakteri endofit kelompok Fluoresen. Satu ose isolat bakteri endofit dibiakkan
pada media King’s B 100% (20 g protease pepton, 1.5 g K2HPO4, 1.5 g MgSO4,
15 mL gliserol, 15 g agar, dan 1 000 mL akuades, (Schaad et al. 2001)) dan
diinkubasikan 24-48 jam. Biakan diamati di bawah sinar UV dengan panjang 360
nm. Biakan bakteri yang berpendar di bawah sinar UV merupakan kelompok
Fluoresen.
Bakteri endofit kelompok Aktinomiset. Satu ose isolat bakteri endofit dibiakkan
pada media Water Yeast Extract Agar (WYE) (Schaad et al. 2001). Inkubasi
dilakukan selama 1-2 minggu. Biakan yang dapat membentuk spora merupakan
kelompok Aktinomiset.
Bakteri endofit kelompok Bacillus. Satu ose isolat bakteri disuspensikan dalam
20 mL aquadest steril, divortex hingga homogen, dan diinkubasi pada suhu +8090 oC selama 20 menit. Sebanyak 100 µL suspensi disebar dan diratakan pada
media TSA 100% dan diinkubasi selama 24-48 jam. Isolat bakteri yang dapat
tumbuh setelah perlakuan suhu 80-90 oC merupakan bakteri dari kelompok
Bacillus.
Seleksi Bakteri Endofit sebagai Agens Hayati Secara In Vitro
Pengaruh bakteri endofit terhadap mortalitas nematoda P. coffeae secara in
vitro
Isolat tunggal dan konsorsium bakteri endofit dibiakkan dalam 100 mL
media TSB dan digoyang dengan kecepatan 100 rpm selama 24 jam. Selanjutnya
disentrifugasi pada kecepatan 6 500 rpm, supernatannya disaring dengan milipore
Ø 0.25 mm dan ukuran pori 0.2 µm. Supernatan yang telah disaring digunakan
untuk menguji kemampuan isolat tunggal dan konsorsium bakteri endofit terhadap
mortalitas nematoda. Sebanyak +50 ekor nematoda P. coffeae dimasukkan dalam
5 mL metabolit sekunder dalam cawan petri, disimpan dalam suhu ruang dan
diamati persentase mortalitas setelah 24 jam. Pengujian dilaksanakan dengan
rancangan acak lengkap, setiap perlakuan diulang sebanyak 3 kali.

13
Kemampuan bakteri endofit sebagai pemacu pertumbuhan tanaman secara
in vitro
Seleksi isolat tunggal dan konsorsium bakteri endofit sebagai pemacu
pertumbuhan tanaman dilakukan mengikuti metode Harni dan Khaerati (2013)
yang dimodifikasi. Benih tomat varietas Ratna digunakan sebagai benih uji.
Pemilihan benih tomat sebagai benih uji disebabkan pertumbuhannya yang lebih
cepat dibanding benih kopi, yang memerlukan waktu hingga dua bulan sampai
menghasilkan akar. Sterilisasi permukaan benih tomat dilakukan dengan hot water
treatment. Benih tomat direndam dalam aquadest steril pada suhu +55 oC selama
20 menit, dilanjutkan dalam suspensi isolat tunggal atau konsorsium bakteri
endofit selama +1 jam. Benih yang telah direndam ditiriskan pada kertas tisu steril
dan ditanam pada kertas saring steril yang dilembabkan. Benih tomat yang
direndam dengan air steril dan ditanam pada media yang sama digunakan sebagai
kontrol. Pengamatan terhadap panjang batang dan aka