Biotyping of Local Isolates Entrobacter sakazakii (Cronobacter spp) and Genetic Variability among Several Isolates based on infB Gene

i

BIOTYPING ISOLAT LOKAL Enterobacter sakazakii
(Cronobacter spp.) DAN KERAGAMAN GENETIK BEBERAPA
ISOLAT BERDASARKAN GEN infB

IZA AYU SAUFANI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

iii

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Biotyping Isolat Lokal
Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) dan Keragaman Genetik Beberapa
Isolat Berdasarkan Gen infB adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi

mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, Mei 2013
Iza Ayu Saufani
NIM F251100081

* Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak
luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait.

RINGKASAN
IZA AYU SAUFANI. Biotyping Isolat Lokal Enterobacter sakazakii
(Cronobacter spp.) dan Keragaman Genetik Beberapa Isolat Berdasarkan Gen
infB. Dibimbing oleh RATIH DEWANTI-HARIYADI dan SRI HENDRASTUTI
HIDAYAT.
E. sakazakii pada awalnya didefinisikan sebagai bakteri E. cloacae yang
memiliki pigmen kuning, yang kemudian dapat diklasifikasikan dengan

menggunakan reaksi biokimia, ketahanan terhadap antibiotik dan hibridisasi
DNA. Pada tahun 2007, E. sakazakii digolongkan ke dalam Cronobacter spp.
yang terdiri dari C. sakazakii, C. malonaticus, C. muytjensiii, C. dublinensis dan
C. turicensis berdasarkan f-AFLP serta 4 reaksi biokimia Iversen (produksi asam
dari dulsitol, produksi asam dari methyl-α-D-glucoside, produksi indol dan
pemanfaatan malonat).
Isolat lokal yang diperoleh dari susu formula bubuk, makanan bayi, pati,
tepung-tepungan dan rempah-rempah di Indonesia teridentifikasi sebagai
Cronobacter spp. dan tidak memiliki keragaman genetik yang tinggi berdasarkan
gen parsial 16S rRNA (Gitapratiwi et al 2012). Meskipun demikian, beberapa
isolat menunjukkan ketahanan panas yang lebih tinggi dibandingkan lainnya
(Seftiono 2012).
Tujuan penelitian ini adalah melakukan identifikasi dan klasifikasi
berdasarkan sifat biokimia (biotyping) dengan menggunakan perangkat cepat
RapID onE dan 4 uji biokimia Iversen (Iversen et al. 2007b), serta untuk
mengetahui keragaman isolat-isolat lokal yang telah diketahui kinetika termalnya
berdasarkan gen infB.
Dengan menggunakan RapID onE diketahui bahwa dari 19 isolat lokal yang
dipelajari, 9 teridentifikasi sebagai E. sakazakii, 9 lainnya sebagai E. cloacae dan
1 teridentifikasi sebagai E. cancerogenus. Jika hasil identifikasi menggunakan

perangkat cepat RapID onE dibandingkan dengan hasil berdasarkan perangkat
cepat API 20E (Gitapratiwi 2011; Hamdani 2012), 8 dari 19 isolat uji sama-sama
teridentifikasi sebagai E. sakazakii. Berdasarkan 4 reaksi biokimia Iversen
diketahui bahwa 15 dari 19 isolat adalah Cronobacter spp. sementara 4 lainnya
tidak bisa diklasifikasikan ke dalam Cronobacter spp. Dengan mencermati hasil
reaksi pada RapID onE dan memilih reaksi yang memberikan hasil berbeda, maka
dapat disimpulkan bahwa uji pyrohydonyl-β-naphthylamide dapat digunakan
untuk menggolongkan keempat isolat tersebut ke dalam C. sakazakii.
Sepuluh dari 19 reaksi uji yang terdapat pada RapID onE dapat digunakan
untuk mengelompokkan isolat-isolat lokal menjadi 16 biotipe. Jika hasil
biotyping dengan perangkat RapID onE dibandingkan dengan 4 uji biokimiawi
Iversen, maka biotipe I-VIII adalah spesies C. sakazakii; biotipe IX, X, XV dan
XVI adalah spesies C. malonaticus; biotype XIII dan XIV adalah spesies
C. muytjensii; serta biotipe XI, XII dan XVI adalah spesies C. turicensis.
Karakterisasi genotip terhadap gen infB antar isolat menunjukkan bahwa
isolat lokal memiliki hubungan kekerabatan yang dekat walaupun memiliki nilai
kinetika termal yang bervariasi. Berdasarkan analisis menggunakan BLAST maka
sekuen contig gen infB yang diperoleh ternyata memiliki fungsi sebagai faktor

iii

inisiasi translasi IF2. Berdasarkan gen infB, isolat lokal Cronobacter spp. yang
diuji dapat dibagi menjadi 2 kelompok yaitu isolat DES b7a, DES b10, DES c13,
YR t2a dan E6 memiliki kerabatan yang dekat dengan isolat C. sakazakii
sementara isolat YR c3a memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan isolat
C. malonaticus dan C. dublinensis.
Kata kunci:

Biotyping, E. sakazakii, infB, pyrohydonyl-β-naphthylamide,
RapID onE

SUMMARY
IZA AYU SAUFANI. Biotyping of Local Isolates Entrobacter sakazakii
(Cronobacter spp.) and Genetic Variability among Several Isolates based on infB
Gene. Supervised by RATIH DEWANTI-HARIYADI and SRI HENDRASTUTI
HIDAYAT.
E. sakazakii was initially described as E. cloacae with yellow pigment, and
later were classified based on their biochemical reactions, antibiotics
susceprability and DNA-DNA hybridization. In 2007, E. sakazakii was
reclassified into Cronobacter spp. consisting of C. sakazakii, C. malonaticus, C.

muytjensii, C. dublinensis and C. turicensis based on f-AFLP and production of
acid from dulcitol, production of indole, malonate utilization and production of
acid from methyl-α-D-glucoside.
All local isolates obtained from powder infant formula, weaning foods,
starch, flours and spices in Indonesia have been identified as Cronobacter spp.
and were reported to have close genetic relatedness based on its partial gene
sequence encoding for 16S rRNA. However, they have been reported to have
different thermal resistance (Seftiono 2012).
This study aims to identify and classify local isolates of C. sakazakii based
on their biochemical properties and genetic relatedness based on infB genes which
known thermal kinetics.
Identification of the 19 local isolates using RapID onE suggested that 9
isolates were identified as E. sakazakii, 9 others were E. cloacae and 1 was
E. cancerogenus. When the results were compared to the identification using API
20E (Gitapratiwi 2011; Hamdani 2012), 8 of the 19 isolates were identified as
E. sakazakii by both kits. Based on classification using 4 biochemical reaction,
15 isolates can be identified as Cronobacter spp. whereas 4 isolates can not be
identified. By evaluating biochemical reaction in the RapID onE test kit, it can be
conclude that reaction of pyrohydonyl-β-naphthylamide can be used as the
additional testing to classify the previously unclassified local isolates into

C. sakazakii.
Ten of the 19 biochemical tests in RapID onE were selected for the
biotyping of Cronobacter spp local isolates since they give different result for all
isolates studied. Based on the ten biochemical profiles, the 19 local isolates of
Cronobacter spp. can be classified into 16 biotypes. When the results of biotyping
with rapid kit RapID onE was compared to result with the four biochemical
reaction by Iversen, biotype I-VIII is C. sakazakii; while biotype IX, X, XV and
XVI is
C. malonaticus; biotype XIII and XIV is C. muytjensii; and biotype XI,
XII and XVI is C. turicensis.

v

Genotypic characterization of infB gene among local isolates showed that all
tested isolates where closely related. Based on the BLAST program, it was
revealed that the contig sequence of the infB genes was as a translation initiation
factor IF2. Based on the infB gene the local isolates can be classified into 2 groups.
Isolat DES b7a, DES b10, DES c13, YR t3a and E6 belong to C. sakazakii, while
isolate YR c3a is C. malonaticus and C. dublinensis.
Keywords:

RapID onE

Biotyping, E. sakazakii, infB, pyrohydonyl-β-naphthylamide,

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

i

BIOTYPING ISOLAT LOKAL Enterobacter sakazakii
(Cronobacter spp.) DAN KERAGAMAN GENETIK BEBERAPA
ISOLAT BERDASARKAN GEN infB

IZA AYU SAUFANI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Pangan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Penguji pada Ujian Tesis :

Dr. Ir. Harsi Dewantarikusumaningrum

iii

Judul Tesis : Biotyping Isolat Lokal Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)

dan Keragamana Genetik Beberapa Isolat Berdasarkan Gen infB
Nama
: Iza Ayu Saufani
NIM
: F251100081

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi, MSc
Ketua

Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, MSc
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Ilmu Pangan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi, MSc

Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc. Agr

Tanggal Ujian: 17 Mei 2013

Tanggal Lulus: 2 Juli 2013

v

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan sebagai salah
satu syarat memperoleh gelar Magister Sains. Penelitian yang dilaksanakan sejak
bulan Juli 2012 selama 6 bulan di Laboratorium SEAFAST Center dapat penulis
selesaikan dengan baik berkat bantuan dana penelitian dari SEAFAST Center IPB
dan Direktorat Jenderal Perguruan Tinggi melalui hibah kompetensi 2011.
Penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan setinggi-tingginya

kepada Ibu Dr. Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi, MSc selaku ketua komisi pembimbing
dan ibu Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, MSc selaku anggota komisi pembimbing ,
serta ibu Dr. Ir. Harsi Dewantarikusumaningrum selaku penguji luar komisi yang
telah memberikan bimbingan, kritik, saran dan motivasi yang membangun selama
penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Selain itu penulis sampaikan terima
kasih kepada seluruh staf dan laboran laboratorium SEAFAST Center IPB.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada papa, mama, kakak dan adik
atas doa, kasih sayang, motivasi dan semangat yang konstruktif selama ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada keluarga besar IPN 2010, rekanrekan sepenelitian dan teman-teman serta semua pihak yang tidak dapat penulis
sebutkan satu persatu atas kerjasama selama penulis melaksanakan perkuliahan
maupun penelitian.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Mei 2013
Iza Ayu Saufani

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

xii

DAFTAR GAMBAR

xii

DAFTAR LAMPIRAN

xii

1  PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

1 
1 
2 
2 

2  TINJAUAN PUSTAKA
Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)
Klasifikasi Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)
Peran Gen infB dan Ketahanan Panas

3
3 
4 
7 

3  METODE PENELITIAN
Lokasi Penelitian dan Waktu Penelitian
Bahan Penelitian dan Peralatan Penelitian
Prosedur Penelitian

10 
10 
10 
11

4  HASIL DAN PEMBAHASAN
Identifikasi Biokimia Isolat Lokal Cronobacter spp.
Keragaman Genotip Gen infB Cronobacter spp.

19 
19
27 

5  SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

33 
33 
34 

DAFTAR PUSTAKA

34 

LAMPIRAN

39

RIWAYAT HIDUP

50

vii

DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

Peosedur isolasi Cronobacter spp. dari susu formula
Kriteria untuk klasifikasi bakteri
Uji biokimia untuk membedakan spesies Cronobacter
Daftar isolat Cronobacter spp. yang digunakan
Hasil identifikasi takson dan tingkat kemiripan isolat lokal Cronobacter
spp. dengan program ERIC RapID onE
Perbandingan identifikasi isolat lokal Cronobacter spp. menggunakan
RapID onE dengan API 20E
Klasifikasi isolat lokal Cronobacter spp. berdasarkan 4 reaksi biokimia
Iversen
Uji biokimia untuk membedakan spesies lokal Cronobacter spp.
Biotyping isolat lokal Cronobacter spp. berdasarkan 10 reaksi biokimia
Karakteristik fenotip Cronobacter spp.
Jumlah nukleotida hasil sekuensing gen infB menggunakan primer
infBf/infBr
Hasil BLAST gen infB dengan database
Persen homologi antar isolat lokal Cronobcater spp. yang diuji
berdasarkan gen infB
Persen homologi isolat lokal Cronobacter spp. dengan isolat luar

4
5 
6 
10 
19
23
24
25
26
27
30
30
31
32

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6

Diagram Alir Penelitian
Diagram Alir Penelitian Tahapan Biotyping
Diagram Alir Penelitian Tahapan Keragaman Genetik
Penampilan Kerja Perangkat Lunak Eric (Remel)
Penanda DNA ladder 1kb
Visualisai DNA hasil amplifikasi gen infB menggunakan primer infBf/infB-r
7 Dendogram isolat lokal Cronobacter spp. dan isolat pembanding
berdasarkan gen faktor translasi inisition

12 
12 
13 
15 
18 
29 
33 

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5

 

Identifikasi Bakteri Berdasarkan Bergey’s Manual
Form Hasil Kerja RapID onE
Identifikasi Isolat Lokal Cronobacter spp. Berdasarkan RapID onE
Peta Sekuen Contig Isolat Cronobacter spp.
Sekuen Contig Isolat Lokal Cronobacter spp.

39 
42 
43 
46 
47 

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) mula-mula digolongkan ke
dalam genus Enterobacter dan dapat dibedakan dari E. cloacae karena memiliki
pigmen kuning. Bakteri ini merupakan mikroorganisme berbahaya yang dapat
menyebab beberapa kasus infeksi meningitis, septicemia dan necrotizing
enterocolitis (NEC) pada bayi kelompok tertentu melalui konsumsi susu formula
bubuk. FDA (2002a) melaporkan terjadinya kasus kematian bayi prematur akibat
meningitis di Indiana US, sehingga dilakukan penarikan susu formula bubuk yang
terkontaminasi oleh Cronobacter spp. dari pasaran.
Bakteri patogen ini bisa diisolasi dari bahan pangan seperti sayuran, buahbuahan, minuman tradisional, biji-bijian, bahan rempah dan susu formula serta
lingkungan disekitar bahan pangan. (Jaradat et al. 2009). Di Indonesia
Cronobacter spp. diisolasi dari susu formula bubuk, makanan bayi (DewantiHariyadi et al. 2010; Estuningsih et al. 2006) dan produk pangan kering lainnya
(Dewanti-Hariyadi et al. 2010; Hamdani 2012). Isolat-isolat lokal tersebut tidak
memiliki keragaman genetik yang tinggi dan teridentifikasi sebagai
Cronobacter spp. dengan polymerase chain reaction (PCR) berdasarkan gen
parsial 16S rRNA (Gitapratiwi et al. 2012). Isolat-isolat lokal ini belum diketahui
klasifikasinya berdasarkan sifat biokimiawi.
Berdasarkan beberapa literatur, klasifikasi Cronobacter spp. ada beberapa
jenis. Farmer et al. (1980) mengelompokkan Cronobacter spp. menjadi
15 biogrup berdasarkan produksi indol, motilitas pada suhu 36˚C, produksi asam
inositol, dulsitol, α-methyl-D-glukosidase, pemanfaatan malonat, ornitin, methyl
red dan Vogas-Prokauer (VP). Kemudian Iversen et al. (2006) menambahkan
biogrup 16 dari pengelompokkan yang dilakukan oleh Farmer et al. (1980)
dengan profil reaksi positif terhadap inositol dan dulsitol serta reaksi negatif untuk
indol. Nazarowec-White dan Farber (1999) mengelompokkan Cronobacter spp.
menjadi 3 biogrup berdasarkan profil biokimia menggunakan kit API 20E.
Selanjutnya, Iversen et al. (2007a) mengusulkan klasifikasi ulang bakteri patogen
ini ke dalam genus Cronobacter berdasarkan pengujian biokimia dengan API 20E,
ID32E, α-glukosidase dan produksi pigmen kuning serta berdasarkan gen dnaG
dan gluA. Iversen et al. (2007b) menggunakan 4 rekasi biokimia (produksi asam
dari dulsitol, produksi asam dari methyl-α-D-glucoside, produksi indol dan
pemanfaatan malonat) untuk mengelompokkan Cronobacter spp. menjadi
C. sakazakii, C. malonaticus, C. muytjensii, C. dublinensis dan C. turicensis.
Selain klasifikasi berdasarkan sifat biokimiawi (metoda biotyping) terdapat
metoda lain yaitu klasifikasi genetik yang bertujuan untuk melihat hubungan
kekerabatan gen antar isolat. Nazarowec-White dan Farber (1999) dan
menemukan bahwa Cronobacter spp. dibedakan atas 10 ribotipe dengan
menggunakan enzim restriksi endonuklease EcoR1. Sedangkan Iversen et al.
(2004b) mengelompokkan Cronobacter spp. menjadi klaster 1, 2, 3 dan 4
berdasarkan gen parsial 16S rDNA dan hsp60. Iversen et al. (2007b) kemudian
mengelompokkan Cronobacter spp. menjadi C. sakazakii, C. malonaticus,
C. muytjensii, C. dublinensii, C. turicensis dan Cronobacter genomospesies 1

2
berdasarkan metode Amplified Fragment Length Polymorphism dengan
fluorescent (f-AFLP). Keragaman genetik isolat-isolat lokal Cronobacter spp.
terlihat dari analisa filogeni oleh Gitapratiwi et al. (2012) melaporkan bahwa
10 isolat lokal yang diuji memiliki hubungan kekerabatan dengan C. sakazakii
ATCC 29544. Begitu juga dengan Hamdani (2012) menyatakan bahwa 7 dari 12
isolat lokal Cronobacter spp. memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan
C. sakazakii, 4 isolat mirip dengan C. malonaticus dan 1 isolat lokal mirip dengan
C. muytjensii. Hubungan kekerabatan isolat lokal tersebut dilakukan berdasarkan
sekuen gen parsial 16S rRNA.
Pada penelitian Hedegaard et al. (1999) dinyatakan bahwa gen 16S rRNA
tergolong multigenik rRNA (ditemukan beberapa kopi dalam satu genomnya).
Oleh karena itu untuk memperoleh hasil analisa metode genetik yang lebih
terpercaya, Hedegaard et al. (1999) melakukan uji terhadap gen lain yaitu
mengidentifikasi Enterobacteriaceae berdasarkan sekuen parsial gen infB.
Penelitian menggunakan gen infB tersebut dapat memisahkan spesies yang sama
ke dalam beberapa klaster serta telah mampu mengkonfirmasi hasil klasifikasi
hingga pada tingkat spesies. Selanjutnya Asakura et al. (2007) memanfaatkan
keberadaan gen infB sebagai pembeda isolat E. sakazakii yang tahan panas dengan
yang rentan terhadap panas.
Penelitian ini juga bertujuan untuk melakukan identifikasi dan klasifikasi
bakteri Cronobacter spp. baik biotyping dengan menggunakan 4 uji biokimia
Iversen dan perangkat cepat RapID onE. Disamping itu enam isolat lokal yang
telah diketahui kinetika thermalnya, diklasifikasikan berdasarkan genetik
menggunakan gen infB.

Tujuan Penelitian
Penelitian bertujuan untuk :
1. Melakukan identifikasi isolat-isolat lokal Cronobacter spp. dengan perangkat
cepat RapID onE dan membandingkan dengan perangkat cepat API 20E.
2. Mengklasifikasikan isolat-isolat lokal Cronobacter spp. berdasarkan profil
biokimia melalui uji RapID onE.
3. Melakukan klasifikasi isolat-isolat lokal Cronobacter spp. berdasarkan
produksi asam dari dulsitol, produksi asam dari methyl-α-D-glukosidase,
produksi indol dan pemanfaatan malonat.
4. Mengetahui keragaman enam isolat Cronobacter spp. berdasarkan gen infB.

Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah mengetahui klasifikasi isolat lokal ke dalam
spesies Cronobacter spp. berdasarkan uji biokimia dan menambah basis data
tentang genotyping beberapa isolat lokal Cronobacter spp.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)
Penamaan untuk E. sakazakii diberikan untuk menghormati ahli bakteriologi
Jepang yang bernama Riichi Sakazaki. Penemuan E. sakazakii sebagai E. cloacae
yang berpigmen kuning berawal dari laporan infeksi yang mengakibatkan sepsis
dan meningitis di Inggris yang dilaporkan oleh Urmenyi dan Franklin pada tahun
1961 dan kasus meningitis yang terjadi di Denmark tahun 1965. Dalam kasuskasus ini, bakteri E. cloacae berhasil diisolasi dari jaringan otak, sumsum tulang
belakang dan spesimen lainnya. Pada tahun 1972 untuk pertama kalinya keluar
bukti-bukti bahwa bakteri-bakteri yang digolongkan kedalam spesies E. cloacae
ini masih beragam, ada yang menghasilkan pigmen kuning dan ada pula yang
tidak menghasilkan pigmen kuning dan hubungan kekerabatannya hanya 50%.
Nama E. sakazakii pertama kali digunakan pada pertemuan tahunan American
Society for Microbiology pada tahun 1977, dan dideskripsikan E. sakazakii
sebagai spesies baru oleh Farmer et al. (1980).
E. sakazakii mula-mula digolongkan sebagai anggota dari famili
Enterobacteriaceae, genus Enterobacter (Nazarowec-White dan Farber 1997a).
Bakteri ini merupakan bakteri gram negatif, tidak membentuk spora, berbentuk
batang, bersifat anaerob fakultatif, sel motil dengan flagela peritrichous, serta
memiliki ukuran dengan panjang 3 μm dan lebar 1 μm (Shaker et al. 2007; Adams
dan Moss 2000; Kandhai 2010).
Sumber kontaminasi bakteri ini adalah dari klinis, lingkungan dan bahan
pangan. E. sakazakii diisolasi dari cairan otak, darah, air ludah, kerongkongan,
hidung, peralatan klinis, usus, kulit, luka, sumsum tulang belakang, mata dan
telinga (Farmer et al. 1980). Keberadaan E. sakazakii pada lingkungan seperti
tikus, serangga, air, tanah dan sampah (Iversen dan Forsythe 2003). Bakteri ini
ditemukan juga pada produk-produk olahan pangan seperti susu UHT, keju,
daging, sayuran, biji-bijian ataupun produk fermentasi (Gassem 1999, 2002;
Iversen dan Forsythe 2003, 2004; Leclercq et al. 2002; Muytjens et al., 1988;
Skaldal et al. 1993 dalam Shaker et al. 2007).
Bakteri ini dapat menginfeksi semua umur terutama bayi yang terlahir
prematur kurang dari 36 minggu, berat lahir rendah, sistem kekebalan tubuh
rendah dan bayi yang terlahir dari ibu yang terinfeksi HIV (Fiore et al. 2008).
Kontamiasi E. sakazakii dapat terjadi secara intrinsik pada susu formula maupun
secara ekstrinsik (Van Acker et al. 2001; Muytjens et al. 1983). Sifat invasif oleh
E. sakazakii dapat mengakibatkan penyakit berbahaya seperti septis, meningitis
dan necrotizing enterocolitis. Angka kematian untuk necrotizing enterocolitis
berkisar antara 10-55% dan meningitis pada rentang antara 40-80% (Fiore et al.
2008).
Kasus yang diakibatkan oleh E. sakazakii dapat diatasi dengan perlakuan
antibiotik chloramphenicol dan ampicillin (Farmer et al. 1980). Akan tetapi
Oonaka et al. (2010) menyatakan bahwa E. sakazakii tahan terhadap ampicilin
dan lincomycin, namun sensitif terhadap antimikroba cefotaxime, ceftriaxone,
cefoperazone, ceftazidime, cefpirome, cefozopran, gentamicin, meropenem,
ciprofloxacin.

4
Cronobacter spp. merupakan nama lain (sinonim) dari E. sakazakii. Bakteri
ini digolongkan ke dalam genus baru Cronobacter, yang terdiri atas spesiesspesies C. sakazakii, C. malonaticus, C. turicensis, C. muytjensii dan
C. dublinensis (Iversen et al. 2007b). Metoda deteksi dan isolasi E. sakazakii
dapat juga digunakan untuk bakteri Cronobacter. Metoda isolasi Cronobacter spp.
dari susu formula seperti pada Tabel 1.
Tabel 1 Prosedur isolasi Cronobacter spp. dari susu formula
Ukuran Sampel

FDA (2002)a
100 g, 10 g, 1 g

ISO/TS 22964 (2006)b
30 g

Pra-pengayaan

Air destilata steril (inkubasi BPW (inkubasi
suhu 36˚C, 24 jam)
37˚C, 18 jam)

Pengayaan (inkubasi 24
jam)

EE broth (suhu 36˚C)

modifikasi LST
broth+vancomycin (suhu
44˚C)

Isolasi (inkubasi 24 jam)

VRBG agar (suhu 36˚C),
koloni menggumpal
berwarana ungu bergradasi ke
orange/kuning/kecoklatan.

ESIA (suhu 44˚C), koloni
biru/hijau

Identifikasi

TSA (inkubasi 25˚C, 48-72
jam), koloni berwarna
kuning.
API 20E

TSA (inkubasi 25˚C, 4448 jam), koloni berwarna
kuning.
Uji oksidase.

Konfirmasi
a
b

suhu

FDA (2002b)
ADRIA DEVELOPPEMENT (2012)

Klasifikasi Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)
Klasifikasi merupakan pengelompokan organisme berdasarkan tingkat
kemiripannya, sehingga dapat dikelompokkan ke dalam tingkatan taksonomi
(seperti kingdom, phylum, class, order, family, genus dan spesies). Tujuan
klasifikasi ini yaitu : (1) membuat kriteria untuk identifikasi. Identifikasi
merupakan kegiatan menentukan persamaan dan perbedaan antara dua organisme,
(2) menata organisme sejenis ke dalam sebuah grup dan (3) memperoleh
informasi penting tentang bagaimana organisme tersebut berkembang. Untuk
organisme macroscopic, klasifikasi dapat dilakukan berdasarkan karakterisasi
struktural, namun untuk organisme microscopic seperti bakteri memiliki struktural
yang hampir mirip. Pengklasifikasian bakteri mengacu kepada Bergey’s manual,
yang pada awalnya dapat membedakan genus dan spesies berdasarkan deskripsi
dan bentuk sel. Karena perbedaan morfologi bakeri lebih minor dibandigkan
terjadinya rekombinasi genetik (akibat transfer gen lateral), maka perkembangan
klasifikasi berdasarkan Bergey’s manual dilakukan berdasarkan filogeni (dengan

5
analisis sekuensing 16s rDNA) (Black 2012). Secara umum kriteria klasifikasi
bakteri seperti terlihat pada Tabel 2.

Tabel 2 Kriteria untuk klasifikasi bakteri
Kriteria
Morfologi

Pewarnaan

Pertumbuhan

Nutrisi

Fisiologis

Biokimia

Genetik

Serologi
Tipe phage
Sekuensing
basa pada
rRNA
Profil protein

Contoh
ukuran dan bentuk sel; sel tersusun
berpasangan, mengelompok atau
filament; keberadaan flagella, pili,
endospora,kapsul.
gram positif, gram negative

karakterisasi pada kultur cair atau
padat,morfologi koloni,
pengembangan pigmen
autrotropik,heterotropik, fermentasi
dengan produk-produk
berbeda,sumber energi, sumber
karbon, sumber
nitrogen,membutuhkan nutrisi
khusus.
temperature (optimum dan rentang);
pH (optimum dan rentang),
memerlukan oksigen, garam, tahan
tekanan osmotic,sensitifitas dan
resisten terhadap antibiotic.
Komponen alami sel seperti dinding
sel, molekul RNA, ribosom, pigmen,
antigen, uji biokimia.
persentase basa nukleotida (rasio G +
C), hibridisasi DNA.

Kegunaan
pembeda utama antara
genus dengan
beberapa spesies.
memisahkan
eubacteria ke dalam
divisi
membedakan spesies
dengan genus
membedakan spesies,
genus dan grup yang
lebih tinggi.

membedakan spesies,
genus dan grup yang
lebih tinggi.

membedakan spesies,
genus dan grup yang
lebih tinggi.
membedakan
kekerabatan dalam
genus dan family.
penggumpalan, antibodi yang dilabel membedakan strain
dengan fluorescent.
dan beberapa spesies.
kerentanan terhadap kelompok
identifikasi dan
bagteriophage
membedakan strain.
sekuensing rRNA
menguji hubungan
dalam kehidupan

pemisahan protein dengan dua
dimensi PAGE (elektroforesis)

Sumber : Black (2012)

membedakan strain

6
Klasifikasi Biokimia Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)
Klasifikasi bakteri oleh Bergey’s manual dibedakan berdasarkan pewarnaan
dan morfologi sel. Enterobacteriaceae merupakan kelompok bakteri gram negatif
dan berbentuk batang. Famili Enterobacteriaceae dapat dibedakan dari
Aeromonas, Pseudomonas dan Vibrio melalui pengujian oksidase. Bakteri yang
tergolong ke dalam famili Enterobacteriaceae memiliki karakteristik negatif
terhadap uji oksidase. Spesies-epesies di dalam famili Enterobacteriaceae
dibedakan dengan pengujian fermentasi laktosa, produksi indol, uji MR-VP dan
lisin decarboxylase seperti yang tertera pada Lampiran 1 (Holt 2000).
Farmer et al. (1980) mengelompokkan Cronobacter spp. menjadi
15 biogrup berdasarkan produksi indol, motilitas pada suhu 36 ˚C, produksi asam
inositol, dulsitol, α-methil-D-glukosidase, pemanfaatan malonat, ornitin, methyl
red dan Vogas-Prokauer (VP). Nazarowec-White dan Farber (1999)
mengelompokkan Cronobacter spp. menjadi 3 biotipe berdasarkan profil biokimia
menggunakan perangkat cepat API 20E. Biotipe 1 memiliki karakteristik yang
sama dengan E. sakazakii ATCC 29544. Biotipe 2 memiliki perbedaan pada uji
inositol negatif dibandingkan dengan biotipe 1. Sedangkan untuk biotipe 3
memiliki karakteristik reaksi positif untuk uji VP. Iversen et al. (2006)
menambahkan biogrup 16 dari pengelompokan yang dilakukan Farmer et al.
(1980) dengan profil positif untuk reaksi inositol dan dulsitol positif tetapi
menunjukkan reaksi negatif untuk indol. Iversen et al. (2007b) menggunakan 4
reaksi biokimia (dulsitol, produksi asam dari methyl-α-D-glucoside, produksi
indol dan pemanfaatan malonat) untuk mengelompokkan Cronobacter spp.
menjadi C. sakazakii, C. malonaticus, C. muytjensii, C. dublinensii, C. turicensis
(Tabel 3).
Tabel 3 Uji biokimia untuk membedakan spesies Cronobacter
Cronobacter sakazakii
Cronobacter malonaticus
Cronobacter muytjensii
Cronobacter dublinensii
Cronobacter turicensis
Cronobacter genomospesies 1

Dulsitol
+
+
+

Indol
+
+
-

Malonat
+
+
v
+
+

AMGa
+
+
+
+
+

a

metil-α-D-glukosida
Sumber : Iversen et al. (2007b)

Klasifikasi Genetik Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)
Klasifikasi Cronobacter spp. secara genetik oleh Nazarowec-White dan
Farber (1999) dilakukan berdasarkan ribotyping, pulsed-field gel electrophoresis
(PFGE) dan randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). Klasifikasi
berdasarkan ribotyping tersebut, dapat mengelompokan E. sakazakii menjadi 10
ribotipe dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease EcoR1.
Isolat yang tidak bisa dibedakan menggunakan metoda ribotyping dapat
dibedakan berdasarkan RAPD. Cronobacter spp. terbagi atas 17 kelompok
berdasarkan RAPD menggunakan primer UBC 245 (5’-CGC GTG CCA G-3’)
dan 18 kelompok menggunakan primer UBC 282. Produk yang dihasilkan dari

7
analisis dengan RAPD yakni berukuran 0.3-2.5 kb (Nazarowec-White dan Farber
1999). Analisa RAPD oleh Kim et al. (2008) menyatakan bahwa Cronobacter spp.
menghasilkan 5 grup berdasarkan primer UBC 245 dan 6 grup berdasarkan primer
UBC 282. Produk DNA yang dihasilkan oleh kedua primer tersebut berukuran
0.2-2.0 kb.
Klasifikasi berdasarkan PFGE dilakukan menggunakan enzim endonuklease
Xba1 (5’-TCT AGA-3’) dan Spe1 (5’-ACT AGT-3’). Cronobacter spp. dapat
dikelompokkan menjadi 18 kelompok menggunakan enzim endonuklease Xba1
dan 17 kelompok menggunakan enzim endonuklease Spe1 (Nazarowec-White dan
Farber 1999). Klasifikasi oleh Kim et al. (2008) membagi Cronobacter spp.
menjadi 8 grup berdasarkan PFGE. Keragaman genetik Cronobacter spp.
menggunakan RAPD dan PFGE lebih diskriminatif dibandingkan menggunakan
metoda ribotyping.
Iversen et al. (2004b) mengelompokkan Cronobacter spp. menjadi klaster 1,
2, 3 dan 4 berdasarkan gen parsial 16S rDNA dan hsp60. Sekuensing gen hsp60
menggunakan pasangan primer GGT AGA AGA AGG CGT GGT TGC-3’ dan
5’-ATG CAT TCG GTG GTG ATC ATC AG-3’. Berdasarkan gen 16S rDNA
isolat Cronobacter spp. memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan
Citrobacter koseri (97.8%) dibandingkan dengan spesies Enterobacter lainnya.
Pengelompokan isolat-isolat Cronobacter spp. berdasarkan gen 16S rDNA,
disimpulkan bahwa klaster 1 dan 2 dapat dibedakan sebesar 1.6-1.9%. Klaster 2
memiliki hubungan yang lebih dekat dengan E. sakazakii. Klaster 3 memiliki
hubungan yang dekat dengan E. pyrinus, E. hormaechei dan Citrobacter koseri.
Klaster 4 memiliki hubungan sebesar 96.5% dengan E. sakazakii. Berdasarkan
gen hsp60 klaster 1 memiliki hubungan sebesar 97.6-99.4% dengan E. sakazakii,
klaster 2 sebesar 89.2-90.4%, klaster 3 sebesar 95.2% dan klaster 4 sebesar 88.8%.
Iversen et al. (2006) membandingkan sifat genotip dengan karakteristik
biokimia sehingga menyatakan bahwa klaster 1 terdiri atas biogrup 1-5, 7-9,11,13
dan 14. Klaster 3 dengan biogrup 15 dan klaster 4 dengan biogrup 6, 10 dan 12,
sedangkan klaster 2 terdiri atas bigrup baru 16. Iversen et al. (2007b)
mengelompokkan Cronobacter spp. menjadi C. sakazakii, C. malonaticus,
C. muytjensii, C. dublinensis, C. turicensis dan Cronobacter genomospesies 1.
Golongan C. sakazakii, C. malonaticus merupakan strain pada grup 1.
C. muytjensii merupakan strain pada grup 3. C. dublinensis merupakan strain pada
grup 4. C. turicensis merupakan strain pada grup 2. Cronobacter genomospesies 1
yaitu strain NCTC 9529 dan E680 yang tergolong kedalam grup 2, namun
memiliki perbedaan dengan C. turicensis berdasarkan Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP). AFLP merupakan teknik molekuler yang digunakan
sebagai penanda genetik terhadap hasil amplifikasi DNA dari fragmen-fragmen
DNA yang terbentuk akibat aktivitas enzim restriksi tertentu.

Peran Gen infB dan Ketahanan Panas
Gen infB merupakan penyandi protein IF2. IF1, IF2 dan IF3 dimiliki oleh
bakteri sebagai faktor inisiasi (Shazand et al. 1993). Inisiasi merupakan tahap
awal proses translasi untuk mensintesis protein (Laursen et al. 2005).

8
Proses translasi tersebut dimulai dengan pemisahan ribosom sub unit besar
(50S) dan sub unit kecil (30S). IF3 akan berikatan dengan sub unit 30S yang
mendukung pemisahan kedua sub unit tersebut. IF1 akan menstimulasi kerja IF3.
Setelah kedua sub unit ribosom terpisah, asam amino metionin akan berikatan
dengan inisiator tRNAfMet, sehingga fMet-tRNA dan mRNA akan saling berikatan
dan masuk ke ribosom sub unit 30S. Inisiator tRNA tersebut berikatan langsung
dengan kodon awal (sisi-P). Ikatan ini dipengaruhi juga oleh kerja IF1, yakni
dengan memblok sisi-A. Tahapan translasi inisiasi ini, akan membuat interaksi
antara kodon-antikodon sehingga terjadi perubahan konformasi sub unit 30S. IF1
dan IF3 bersifat relatif tidak stabil terhadap perubahan komformasi tersebut,
sehingga IF1 dan IF3 terlepas dari 30S, selanjutnya IF2 membawa triplet mRNA,
sub unit 30S dan tRNA-met secara bersamaan kemudian bergabung dengan sub
unit 50S hingga terbentuk ribosom komplek 70S (Laursen et al. 2005;
Madison et al. 2012).
Shazand et al. (1990) menyatakan gen infB pada bakteri Bacillus subtilis
mengandung 2 148 pb (716 asam amino) dengan ATG sebagai kodon awal dan
TGA sebagai kodon akhir. Pada Escherichia coli, dimana gen infBnya terletak
pada operon yang sama dengan inisiator tRNA (metY), terminasi transkripsi
(nusA) dan tiga protein open reading frame (ORF) yang fungsinya tidak diketahui.
Pada Bacillus subtilis, gen infB tidak diikuti oleh nusA tetapi diapit oleh dua ORF
(polC dan pscB). Gen infB terletak pada 145˚ kromosom Bacillus subtilis. Gen
tersebut mengkode dua protein, IF2α dan IF2β yang homolog dengan IF2 pada
Escherichia coli.
Hedegaard et al. (1999) menggunakan gen infB untuk mengkonfirmasi hasil
klasifikasi dan untuk melihat keragaman pada level spesies di dalam genus
Enterobacteriaceae. Isolat E. aerogenes diklasifikasikan sebagai isolat E. cloacae
(EclAU9604) berdasarkan gen infBnya. Isolat Hafnia alvei (HalAU9601) juga
diklasifikasikan ke dalam grup Escherichia coli berdasarkan analisis sekuen infB.
Berdasarkan pohon filogeni, gen infB dapat memisahkan Escherichia coli menjadi
dua klaster. Gen ini juga dapat memperlihatkan keragaman spesies dengan
memisahkan Citrobacter diversus dan Citrobacter freundii, Klebsiella pneumonia
dan Klebsiella oxytoca, E. cloacae dan E. aerogenes serta Erwinia herbicola dan
Morganella morganii.
Baldwin et al. (2009) menyatakan bahwa lokus gen infB beserta 6 lokus gen
lainnya (atpD, fusA, glnS, gltB, gyrB dan pps) digunakan untuk membedakan
spesies C. sakazakii dan C. malonaticus menggunakan metoda multilocus
sequence typing (MLST). C. sakazakii terdiri dari 12 kelompok sedangkan
C. malonaticus terdiri atas 3 kelompok berdasarkan profil filogeni ketujuh lokus
gen tersebut. Isolat yang tergolong C. sakazakii merupakan isolat-isolat pada
biotipe 1, 2, 2a, 3, 4, 4a, 5, 7, 13 dan 13a, adapun C. malonaticus merupakan
isolat-isolat di dalam biotipe 2a, 4a, 5, 5a, 8c, 9, 13a, 13b dan 14b. Hasil analisis
MLST menunjukkan gen infB memiliki ukuran fragmen 441 bp.
Gen infB dilaporkan memiliki hubungan dengan perilaku Cronobacter spp.
terhadap ketahanan panas. Karakterisasi genetik ketahanan panas Cronobacter spp.
berdasarkan gen groEL, hnsB dan infB telah dilakukan oleh Asakura et al. (2007)
dan menyatakan bahwa gen groEL dan hnsB tidak spesifik dalam membedakan
isolat tahan panas (kelas R) dan isolat sensitif panas (kalas S), namun gen infB
spesifik membedakan isolat kelas R dan kelas S. Berdasarkan respon ketahanan

9
panasnya, Cronobacter spp. terdiri dari 3 kelompok yaitu heat-resisten (kelas R),
heat-sensitive (kelas S) dan intermediate (kelas M). Pengelompokkan ini
dilakukan berdasarkan konsentrasi sel yang bertahan hidup setelah mendapatkan
perlakuan pemanasan. Sel yang bertahan hidup lebih dari 104 sel/ml digolongkan
ke dalam kelas R, kurang dari 102 sel/ml dikelompokkan ke dalam kelas S dan sel
yang bertahan antara 102-104 sel/ml merupakan kelas M (Asakura et al. 2007).
Analisis terhadap Cronobacter spp. baik digunakan pada saat bakteri ini
berada di fase stasioner, karena alasan kompetitif antara bakteri. Fase stasioner
Cronobacter spp. berada pada suhu media 58˚C. Nilai D untuk Cronobacter spp.
yang diperoleh pada suhu ini berada pada rentang 0.39-0.6 menit (Breewer et al.
2003). Menurut Edelson-Mammel dan Buchanan (2004) menyatakan bahwa
nilai D untuk Cronobacter spp. bervariasi yaitu antara 0.51 hingga 10.4 menit
pada suhu 58˚C. Ghassem et al. (2011) menyatakan bahwa rentang nilai D untuk
isolat C. muytjensii strain ATCC 51329 dan isolat-isolat C. sakazakii dari bahan
pangan berkisar antara 42.92 menit pada suhu 52˚C hingga 1.86 menit pada suhu
60˚C. Nazarowec-White dan Farber (1997b) menyatakan nilai D untuk
Cronobacter spp. yaitu 4.2 menit pada suhu 58˚C. Nilai ini menindikasikan bahwa
Cronobacter spp. merupakan bakteri yang tahan panas dibandingkan
Enterobactericeae lainnya pada produk susu. Iversen et al. (2004a) menyatakan
bahwa nilai D untuk Cronobacter spp. pada suhu 54˚C yaitu 10.2-16.4 menit.
Al-Holy et al. (2009) menyatakan bahwa nilai D pada suhu 55˚C memiliki rentang
yang jauh yakni 14.8 menit untuk isolat E. sakazakii ATCC 29004 hingga 1.5
menit untuk isolat E. sakazakii 55. Nilai D suhu 60˚C pada susu bubuk dilaporkan
oleh Iversen et al. (2004a) sebesar 1.1 menit, dan nilai D pada suhu 62˚C yaitu
antara 0.2-0.4 menit. Al-Holy et al. (2009) melaporkan bahwa nilai D pada suhu
63˚C yakni 0.88 menit.
Berdasarkan analisis nilai-nilai D tersebut, Iversen et al. (2004a)
memperkirakan nilai D suhu 71.2˚C yakni 0.7 detik. Dengan demikian,
Cronobacter spp. tidak mampu bertahan pada suhu pasteurisasi, karena suhu
pasteurisasi yaitu 71.7 ˚C selama 15 detik. Pasteurisasi dengan metoda HTST
(High Temperature Short Time) dapat mereduksi 6 log Cronobacter spp.,
sedangkan pemanasan selama 50 detik pada suhu 86.5˚C mampu mereduksi
seluruh Cronobacter spp. (Al-Holy et al. 2009).
Berdasarkan nilai D pada suhu 52˚C beberapa isolat lokal Cronobacter spp.
memiliki waktu reduksi yang lebih besar jika dibandingkan dengan isolat luar.
Semakin tinggi nilai D menunjukan isolat lebih tahan terhadap panas. Nilai D52˚C
untuk isolat lokal berkisar antara 17.92-114.94 menit. , sedangkan nilai D58˚C
berkisar antara 1.72-3.55 menit dan terdapat 3 dari 7 isolat yang diuji tidak
mampu bertahan hidup pada suhu ini (Seftiono 2012).

10

3 METODE PENELITIAN
Lokasi Penelitian dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium SEAFAST (South East Asia Food
and Agricultural Science and Technology) Center, kampus IPB Darmaga, Bogor,
Institut Pertanian Bogor pada bulan Juli sampai November 2012.

Bahan Penelitian dan Peralatan Penelitian
Bahan Penelitian
Isolat yang digunakan dalam penelitian ini adalah 19 isolat lokal
Cronobacter spp. koleksi SEAFAST Center IPB (Tabel 4) yang telah
terkonfirmasi berdasarkan keberadaan sekuen parsial gen penyandi 16S rRNA
dengan PCR. Untuk melihat keragaman genetik berdasarkan gen infBnya dipilih 6
isolat lokal (isolat DES b7a, DES b10, DES c13, YR t2a, YR c3a dan 6a) yang
telah dilaporkan kinetika termalnya oleh Seftiono (2012).

Tabel 4 Daftar isolat Cronobacter spp. yang digunakan
Nama Isolat
DES b7a
DES b10
DES c7
DES c13
YR c3a
YR t2a
6a
FWH b2
FWH b6
FWH b11
FWH b15
FWH c3
FWH d1
FWH d2c
FWH d2u
FWH d11
FWH d12
FWH d14
FWH d16
a
b

Asal Isolat
Makanan bayib
Makanan bayib
Maizenab
Maizenab
Susu formulac
Susu formulac
Formula lanjutan bayid
Tepung berase
Tepung terigue
Tepung beras ketane
Gula haluse
Pati singkonge
Cabai bubuke
Cabai bubuke
Cabai bubuke
Jintane
Ketumbar bubuke
Pala bubuke
Merica bubuke

No. Aksesi
JF800179.1
JF800180.1
JF800181.1
JF800183.1
JF800182.1
AY624069
-a
-a
-a
-a
-a
JX535016.1
JX535017.1
-a
-a
-a
-a
JX535018.1

Belum terdapat pada GeneBank
Dewanti-Hariyadi et al. (2010); cMeutia (2008); d Estuningsih et al. (2006); eHamdani (2012)

11
Bahan-bahan utama yang digunakan antara lain BHI broth (Oxoid Ltd., UK),
TSA (Oxoid Ltd., UK), akuabides, phenol red broth, dulsitol dan perangkat cepat
Rapid One untuk konfirmasi biokimia (Remel,USA). Bahan yang digunakan
untuk isolasi DNA antara lain media pertumbuhan LB Broth (Miller Caisson Lab.,
USA), bahan-bahan ekstraksi antara lain Tris (Amersham Bioscience, Swedan),
EDTA disodium salt (Amersham Bioscience, Swedan), 10% (w/v) Sodium
dodecyl sulphate (SDS) (Promega Corporation, USA), 10 mg/ml proteinase K
(Fermentas, US), Cethyiltrimethyl ammonium bromide (CTAB) (Merck,
Darmstadt, Germany), NaCl, Phenol, Chloroform, Isoamyl alcohol (Applichem),
sodium asetat (Merck, Darmstadt, Germany), isopropanol (Merck, Darmstadt,
Germany), etanol 70%, dan HCl untuk pengaturan pH bufer. Bahan untuk
campuran PCR yaitu akuabides steril, primer forward dan reverse (primer infB-f
5’-GCG TAA TAA ACT GTA GCA GGA A-3’ dan primer infB-r 5’-CGT TCT
CTT CAG CCA TAC GAC-3’), DNA templet dari hasil ekstraksi DNA genom
serta DreamTaq DNA polymerase (2× DreamTaq Green buffer, 0.4 mM dNTP, 4
mM MgCl2). Bahan yang digunakan untuk elektroforesis adalah medium agarosa
(Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Germany), bufer Tris-asetat-EDTA (TAE
bufer), 0.5 µg/ml etidium bromida (Amersham Biosciences, Sweden), 6× loading
dye dan penanda 1 kb DNA ladder (0.5 µg/µl #SM0311).
Peralatan Penelitian
Tabung reaksi bertutup beserta dudukannya, jarum ose, inkubator, pipet
mikro beserta tip, vortex, eppendorf beserta kedudukannya, sentrifugasi dengan
kekuatan 18 000 rpm, water bath shaker, freezer, laminar air flow (ESCO®),
perangkat PCR Applied Biosystem 2720 Thermal Cycler (Foster City, California),
timbangan analitik, erlenmeyer, gelas ukur, pipet volumetrik, labu takar, botol
Schott Duran, pengaduk magnet, hotplate stirrer, perangkat elektroforesis (BioRad), pH meter, plastik steril, bunsen, kertas parafilm, Geldoc XR (Bio-Rad),
autoklaf, termometer, perangkat dokumentasi, dan Spektrofotometer UV-Vis
(Shimadzu).
Perangkat Lunak (Software)
Beberapa software yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Eric (Remel)
untuk konfirmasi hasil uji biokimia RapID onE, program ChromasPro untuk
proses trimming dan contig sekuen DNA, program BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) dari situs NCBI (www.ncbi.nih.nlm.gov) untuk
menganalisis hasil perunutan, serta program MEGA4 (www.megasoftware.net)
untuk membentuk pohon filogeni.

Prosedur Penelitian
Pelaksanaan penelitian ini terdiri atas dua tahap, yaitu tahapan biotyping dan
keragaman genetik (Gambar 1). Pada tahapan biotyping dilakukan untuk
mengidentifikasi dan klasifikasi isolat lokal berdasarkan sifat biokimianya,
adapun pengamatan ini dilakukan menggunakan perangkat cepat RapID onE dan
4 reaksi biokimia Iversen. Tahapan keragaman genetik dilakukan melalui analisa
keragaman gen infB dengan cara melakukan amplifikasi dan perunutan gen

12
tersebut. Untuk melihat hubungan kekerabatan isolat lokal maka dilakukan
dengan analisa pohon filogeni. Tahapan amplifikasi gen diawali dengan tahapan
isolasi DNA genom. Pada gambar 2 disajikan skema penelitian tahap biotyping,
adapun tahap keragaman genetik dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 1 Diagram Alir Penelitian

Gambar 2 Diagram Alir Penelitian Tahapan Biotyping

13

Gambar 3 Diagram Alir Penelitian Tahapan Keragaman Genetik

14
Klasifikasi Isolat Lokal dengan Biotyping
Persiapan Isolat Bakteri
Bakteri uji yang digunakan pada penelitian ini yaitu sebanyak 19 isolat lokal
Cronobacter spp. koleksi SEAFAST Center. Semua isolat berasal dari susu
formula bayi, makanan bayi, tepung-tepungan dan tanaman rempah. Pembagian
isolat yang digunakan dapat terlihat pada Tabel 4. Isolat-isolat tersebut telah
dikonfirmasi sebagai Cronobacter spp. menggunakan PCR terhadap gen parsial
16S rRNA (Gitapratiwi et al. 2012; Hamdani 2012). Selanjutnya isolat lokal pada
media DFI agar dan CES agar diambil 1 atau 2 loop kemudian disegarkan pada
media BHI broth, diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam. Satu ose isolat dari
BHI broth dikultur pada media agar miring yang berisi TSA. Setelah diinkubasi
pada suhu 37˚C selama 24 jam, kultur dapat digunakan sebagai kultur kerja.
Identifikasi dan Klasifikasi Isolat Lokal Cronobacter spp. dengan RapID onE
Biotyping menggunakan RapID onE merupakan perangkat cepat yang
berguna untuk mengidentifikasi sifat biokimia bakteri Enterobacteriaceae.
Perangkat ini berupa strip yang terdiri atas 18 sumur berisi kompartemen uji yang
telah dikeringkan. Satu sumur pada RapID onE mewakili satu pengamatan uji
biokimia. Pada prinsipnya, perangkat cepat RapID onE bekerja berdasarkan
perubahan warna pada masing-masing sumur yang mengindikasikan reaksi positif
atau negatif suatu sampel. Indikator warna untuk 19 uji biokimia dapat dilihat
pada form laporan kerja RapID onE (Lampiran 2).
Masing-masing isolat dari agar miring diambil 1 hingga 2 loop untuk
disuspensikan dengan larutan Remel. Kemudian larutan dituang ke dalam ujung
strip dan diratakan. Setelah diinkubasi pada suhu 37˚C selama 4 jam maka dapat
diamati reaksi-reaksi warna pada masing-masing sumur. Untuk mengamati reaksi
indol, maka ditetesi larutan indol pada sumur yang bertuliskan ADON.
Pembacaan reaksi indol setelah 2 menit ditetesi larutan indol.
Hasil pembacaan RapID onE kemudian diinterpretasikan dengan
menggunakan perangkat lunak Eric (Remel). Perangkat lunak akan bekerja
dengan menghasilkan kombinasi angka, sehingga diperoleh hasil identifikasi
spesies berdasarkan database perangkat tersebut serta persentase kemiripannya.
Gambar 4 disajikan penampilan analisa salah satu isolat lokal Cronobacter spp.
dengan perangkat lunak Eric (Remel). Hasil identifikasi RapID onE dibandingkan
dengan hasil API 20E yang telah diperoleh pada penelitian Gitapratiwi (2011) dan
Hamdani (2012).
Selain dianalisis menggunakan perangkat lunak Eric (Remel), 19 uji
biokimia pada perangkat RapID onE diamati secara manual untuk melihat pola
spesifik hasil pengujian yang dihasilkan oleh masing-masing isolat uji. Uji
biokimia yang menghasilkan reaksi positif saja atau reaksi negatif saja untuk
semua isolat uji, tidak digunakan sebagai parameter klasifikasi. Sepuluh uji
terpilih meliputi lisin (ODC), fatty acid ester (LIP), sorbitol (SBL), pnitrophienyl-β-D-glukoside (βGLU), p-nitrophienyl-β-D-xyloside, p-nitrophienyln-acetyl-β-D-glucoamide (NAG), malonat (MAL), pyrohidonyl-β-naphtylamide
(PYR), adonitol (ADON) dan indol (IND) digunakan sebagai faktor pembeda
dalam klasifikasi isolat-isolat lokal menjadi beberapa tipe. Isolat-isolat yang

15
memiliki karakteristik biokimia yang sama akan diklasifikasikan ke dalam satu
biotipe.

Kombinasi angka

Hasil pengamatan
sifat biokimia isolat

Hasil identifikasi dan persentase kemiripan

Gambar 4 Penampilan Kerja Perangkat Lunak Eric (Remel)

Klasifikasi Isolat Lokal Cronobacter spp. dengan 4 Reaksi Biokimia Iversen
Dalam melakukan klasifikasi menggunakan 4 reaksi biokimia Iversen,
dilakukan pengujian terhadap produksi asam dari dulsitol, methyl-α-D-glukosidase,
produksi indol dan pemanfaatan malonat. Modifikasi metoda Iversen et al.
(2007b) pada penelitian ini yakni tiga reaksi diantaranya diperoleh dari hasil uji
pada RapID onE yaitu malonat, indol dan p-nitrophienyl-β-D-glukoside.
Pengujian terhadap produksi asam dari dulsitol dilakukan berdasarkan metoda
Iversen et al. (2007b) yaitu phenol red broth dilarutkan dengan larutan steril
dulsitol. Konsentrasi dulsitol yang digunakan pada medium adalah 0.5% (m/v).
Kemudian media diinokulasi pada tabung reaksi dan diamati perubahan warna
dari merah menjadi kuning untuk hasil positif setelah diinkubasi 24 jam pada suhu
37 °C.
Selanjutnya isolat-isolat lokal akan dikelompokkan ke dalam C. sakazakii,
C. malonaticus, C. muytjensii, C. dublinensis dan C. turicensis. Klasifikasi ini
dilakukan berdasarkan pengamatan reaksi positif atau negatif dari keempat uji
biokimia Iversen yang disesuaikan dengan pola Iversen et al. (2007b) seperti pada
Tabel 3.

16
Keragaman Genetik
Persiapan Bahan Pereaksi Ekstraksi DNA
Pembuatan larutan untuk isolasi DNA dan bufer yang dibutuhkan yaitu
0.5 M EDTA pH 8 (garam disodium EDTA.2H2O dilarutkan di dalam akuabides
dan ditepatkan hingga pH 8 dengan NaOH. Kemudian larutan ditambahkan
akuabides hingga tepat 50 ml dan larutan disterilisasi dengan autoclave). Larutan
1 M Tris dibuat dengan cara melarutkan garam tris dengan akuabides dan diatur
pH 8 dengan HCl. Selanjutnya ditambahkan akuabides hingga 50 ml dan
disterilisasi dengan akuabides. Untuk membuat larutan TE pH 8, maka 1 ml
EDTA 0.5 M ditambahkan dengan 5 ml Tris 1 M lalu ditambahkan akuabides
hingga 500 ml. larutan disterilisasi dengan autoclave.
Bufer CTAB yang digunakan yaitu 10% CTAB dalam 0.7 M NaCl.
Sebanyak 4.1 gram garam NaCl ditimbang dan dilarutkan dalam 80 ml akuabides.
Kemudian ditambahkan secara perlahan 10 gram CTAB. Larutan dipanaskan
sambil distirrer. Pemanasan dilakukan suhu 65˚C. Selanjutnya ditepatkan hingga
100 ml.
Larutan PCI dibuat dengan perbandingan phenol : chloroform : isoamyl
alcohol = 25 : 24 : 1, sedangkan CIA dengan perbandingan chloroform : isoamyl
alcohol = 24 : 1. Untuk larutan 3 M sodium asetat dibuat dengan melarutkan
408.1 gram sodium asetat 3H2O dalam 800 ml akuabides. Pengaturan pH
disesuaikan menjadi 5.2 dengan menambahkan asetat glasial. Selanjutnya
ditambahkan akuabides hingga volume 1 liter dan disterilisasi dengan autoclave.
Larutan-larutan lain yang diperlukan yaitu SDS 10% (w/v), proteinase K
10 mg/ml, isopropanol dan etanol 70%. Bufer 50× TAE dan EtBr diperlukan
untuk visualisasi DNA pada gel agarosa. Bufer TAE dibuat dengan 242 gram tris
dilarutkan ke dalam 700 ml akuabides, kemudian ditambahkan 57.1 ml asam
asetat dan 100 ml EDTA 0.5 M pH 8. Larutan tersebut ditepatkan hingga 1 liter
dan disterilisasi dengan autoclave.
Ekstraksi DNA
DNA genom diekstrak dari 19 isolat lokal Cronobacter spp. yang telah
diinkubasi pada media LB dengan inkubasi shaker pada suhu 37˚C kecepatan
150 rpm selama 24 jam. Metode ekstraksi fenol-kloroform yang dilakukan
berdasarkan Brown (1992) yaitu isolat yang telah ditumbuhkan kemudian
disentrifugasi pada 18 000 rpm selama 3 menit. Pelet diresuspensi dalam 200 μl
bufer TE dengan vorteks, ditambahkan 50 μl SDS 10% dan dicampur sampai
suspensi terlihat jernih. Sepuluh μl proteinase-K (10 mg/ml) ditambahkan dan
diinkubasi pada 37˚C selama 1 jam. Setelah itu ditambahkan 80 μl CTAB/NaCl
dan diinkubasi pada 65˚C selama 20 menit. Ke dalam campuran ditambahkan
campuran P:C:I (25:24:1) dengan rasio 1:1 dan divorteks selama 2 menit.
Campur