Isolation and Genetic Diversity Identification of Cronobacter spp (Enterobacter sakazakii) from Dried Foods

i

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI KERAGAMAN GENETIKA
Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) YANG DIPEROLEH
DARI PRODUK PANGAN KERING

FRANSISCA WANNY HAMDANI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
i

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Isolasi dan Identifikasi
Keragaman Genetika Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) yang Diperoleh
dari Produk Pangan Kering adalah karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan

maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Juni 2012
Fransisca Wanny Hamdani
NIM F251090181

ii

ABSTRACT
FRANSISCA WANNY HAMDANI. Isolation and Genetic Diversity
Identification of Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) from Dried Foods.
Under the direction of RATIH DEWANTI HARIYADI and SRI HENDRASTUTI
HIDAYAT.
Cronobacter spp. (formerly Enterobacter sakazakii) is a group of emerging
pathogen that has been implicated as the causative agent of meningitis and
necrotizing enterocolitis in certain groups of infants. In Indonesia several isolates
have been obtained mostly from powder infant formula and weaning foods. This
research aimed to obtain Cronobacter spp. isolates from other dried foods i.e.
weaning foods, flours, starches and spices and evaluated the biochemical and

genotypic characteristics of the isolates. Isolation was conducted according to
FDA method (2002) modified with Iversen and Forsythe (2004), biochemical was
conducted by API 20E test and genotypic characterization was conducted by PCR
amplification of their 16S rRNA gene using 3 primer pairs respectively, 16 SUNIL/Saka 2b (Segment 1), ESA1/16 SUNI-R (Segment 2) and 16SUNI-L/16SUNI-R
(Universal segment). Results of the DNA amplification were sequenced and then
analyzed for their relatedness to reference isolates of C.sakazakii from GenBank
using BLAST program. In this study 62 samples of weaning foods, flours, starches
and spices were screened for the presence of Cronobacter spp. Twelve typical
colonies on DFI were obtained from sample of flours, starches and spices
samples. Biochemical test using API 20E suggested that 11 of the 12
presumptives isolates were E. sakazakii while one was identified as E. cloacae.
Genotypic analysis revealed that eleven isolates including the one identified as
E.cloacae by API test were confirmed as C.sakazakii while one isolates was
C.muytjensii. Relationships between strains based on segment 1 was depicted in a
dendrogram using the neighbor-joining method showed that the twelve isolates
can be differentiated into two groups, meanwhile when universal segment was
used, the isolates can be differentiated into three groups.

Keyword: Cronobacter spp., E. sakazakii, dried foods, isolation, genetic diversity

iii

RINGKASAN
FRANSISCA WANNY HAMDANI. Isolasi dan Identifikasi Keragaman Genetika
Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) yang Diperoleh dari Produk Pangan
Kering. Dibimbing oleh RATIH DEWANTI HARIYADI dan SRI
HENDRASTUTI HIDAYAT.
Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) adalah bakteri oportunistik yang
banyak ditemukan di lingkungan kemudian dilaporkan sebagai emerging
foodborne pathogen. Bakteri ini memiliki ciri-ciri umum seperti: Gram negatif,
vegetatif, anaerob fakultatif, berbentuk batang pendek (0,5-1,0 x 1,0-3,0 μm)
dengan pigmen warna kuning, peritrichous, dan tidak membentuk spora serta
memiliki kapsul yang menyelimuti tubuhnya sebagai mekanisme pertahanan diri.
Bakteri ini termasuk dalam famili Enterobacteriaceae dan genus Enterobacter,
namun kemudian berdasarkan hasil analisis pendekatan polyphasic taxonomy
diklasifikasi ulang sebagai genus baru yaitu ‘Cronobacter’ (Iversen et al. 2007).
Hal tersebut didasarkan pada enzim α-glukosidase, yang terekspresi pada sebagian
besar Cronobacter dan hanya sedikit pada Enterobacteriaceae lain.
C. sakazakii merupakan patogen penting yang mengancam kesehatan
utamanya pada bayi kelompok tertentu yaitu: memiliki berat badan rendah, bayi

lahir prematur maupun bayi yang dilahirkan oleh ibu penderita AIDS (acquired
immune deficiency syndrome), sehingga mengakibatkan septicaemia, meningitis
(radang otak) dan necrotizing enterocolitis (peradangan usus). Selain itu
C.sakazakii juga dapat menyerang orang dewasa utamanya yang tergolong
memiliki daya tahan tubuh rendah.
Meskipun belum ada laporan kasus infeksi oleh Cronobacter spp.
(E. sakazakii) di Indonesia, namun Estuningsih et al. (2006a) dan Meutia (2008)
melaporkan keberadaan bakteri ini di dalam makanan bayi dan susu formula.
Gitapratiwi et al. (2012), melaporkan adanya E. sakazakii pada makanan bayi dan
beberapa produk makanan kering seperti tepung maizena dan bubuk coklat. Selain
itu Senzani (2011), menemukan adanya C. sakazakii pada sayuran segar yaitu kol
yang berasal dari pasar lokal kota Bogor.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi Cronobacter spp. (Enterobacter
sakazakii) dari berbagai jenis pangan kering seperti: makanan bayi, tepung, pati
dan rempah-rempah kering. Isolat yang diperoleh kemudian diuji secara biokimia
lalu dievaluasi keragaman genetikanya dengan metode PCR menggunakan tiga
pasang primer penyandi gen 16S rRNA C. sakazakii. Hasil tersebut kemudian
diidentifikasi keragaman genetikanya dengan cara mengevaluasi hubungan
kekerabatan antara isolat yang diperoleh dengan isolat-isolat lokal yang diperoleh
dari beberapa penelitian sebelumnya dan juga isolat-isolat dari luar Indonesia

yang terdapat pada GenBank berdasarkan gen 16S rRNA.
Manfaat penelitian ini adalah menambah basis data isolat lokal C. sakazakii
di Indonesia mengenai sifat biokimia dan genotipiknya. Selain itu, penelitian ini
dapat menambah informasi mengenai keragaman genetika C. sakazakii sehingga
dapat menjadi rujukan dalam pengendalian bakteri ini di lingkungan pengolahan
pangan.

iv

Isolasi C.sakazakii dari berbagai sampel menghasilkan dua belas isolat
yaitu satu isolat dari sampel tepung beras, satu isolat dari sampel tepung terigu,
satu isolat dari tepung beras ketan, satu isolat dari gula halus, satu isolat pati
singkong (tapioka), tiga isolat dari cabai bubuk, satu isolat dari jintan, satu isolat
dari ketumbar bubuk, satu isolat dari pala bubuk dan satu isolat dari merica bubuk.
Hasil analisis reaksi biokimiawi isolat-isolat yang diduga C. sakazakii dengan
menggunakan program apiwebTM menunjukkan bahwa isolat FWH d2c, FWh d2u,
FWH d11 dan FWH d12 terindikasi sebagai C. sakazakii dengan kemiripan masingmasing 99.9%; FWH d1 terindikasi sebagai C. sakazakii dengan kemiripan 99.1%;
FWH b2, FWH b11, FWH b15 dan FWH d16 terindikasi sebagai C. sakazakii
dengan kemiripan masing-masing 98.4%; FWH b6 dan FWH b14 terindikasi
sebagai C. sakazakii dengan kemiripan masing-masing 51.9% dan hanya isolat FWH

c3 yang terindikasi sebagai E. cloacae dengan kemiripan 69,1%.
Karakterisasi genotipik berdasarkan gen 16S rRNA menyimpulkan bahwa
kedua belas isolat adalah Cronobacter spp. dan menghasilkan produk PCR
(amplikon) baik segmen 1 (1000 bp), segmen 2 (408 bp) dan segmen universal
(1402 bp) yang sama dengan isolat ATCC 51329 sebagai kontrol positif yang
tampak pada pola elektroforesisnya.
Pohon filogenetik dari isolat-isolat Cronobacter spp. berdasarkan sekuen
parsial gen 16S rRNA segmen 1 menggambarkan terbentuknya 2 kelompok.
Kelompok pertama menempatkan isolat-isolat lokal yaitu E. sakazakii galur 6a,
10a, 39a dan 39d, C. sakazakii galur YRw3, YRw1, YRc3a, YRt2a, YRk2a dan
YRk1b, C. sakazakii galur DESb10, DESc13 dan DESc7, FWH c3, FWH d1,
FWH d16, FWH d12, FWH b11, FWH b15, FWH d2c, FWH d2u, FWH b2, FWH
b6 dan FWH d14 bersama dengan C. sakazakii ATCC 29544, C. sakazakii
05CHPL88 dan C. malonaticus galur E825. Kelompok kedua menempatkan
isolat lokal FWH d11 bersama dengan C. muytjensii ATCC 51329.
Pohon filogenetik dari isolat-isolat Cronobacter spp. berdasarkan sekuen
parsial gen 16S rRNA dengan primer universal menggambarkan terbentuknya 3
kelompok. Kelompok pertama menempatkan isolat-isolat lokal yaitu E. sakazakii
galur 6a dan 10a, C. sakazakii galur YRw3 dan YRw1 FWH b6, FWH d2c, FWH
d16, FWH d11, FWH b2 dan FWH d14 bersama dengan C. sakazakii ATCC

29544 dan C. malonaticus galur E825. Kelompok kedua menempatkan isolatisolat lokal yaitu YRc3a, YRt2a, YRk2a dan YRk1b, C. sakazakii galur DES c13,
DES b10 dan DES c7, E. sakazakii galur 39a dan 39d bersama dengan
C. sakazakii galur 05CHPL88. Kelompok ketiga menempatkan isolat lokal FWH
d1 bersama dengan C. muytjensii ATCC 51329.

Kata kunci : Cronobacter sakazakii, produk pangan kering, isolasi, keragaman
genetika.

v

© Hak cipta milik IPB, tahun 2012
Hak cipta dilindungi undang-undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

vi

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI KERAGAMAN GENETIKA
Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) YANG DIPEROLEH
DARI PRODUK PANGAN KERING

FRANSISCA WANNY HAMDANI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Ilmu Pangan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

vii

Penguji Luar Komsisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr

viii

Judul Tesis

Nama
NIM

: Isolasi
dan
Identifikasi
Keragaman
Genetika
Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) yang
Diperoleh dari Produk Pangan Kering
: Fransisca Wanny Hamdani
: F251090181

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi,M.Sc
Ketua

Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, M.Sc
Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Ilmu Pangan

Dekan Sekolah Pascasarjana IPB

Dr. Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi, M.Sc

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr

Tanggal Ujian : 15 Mei 2012

Tanggal Lulus : 11 Juni 2012

ix

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yesus Kristus atas segala
tuntunan dan penyertaan-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat penulis selesaikan.
Rangkaian kegiatan penelitian dan penulisan tesis ini merupakan salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Pangan,
Sekolah Pascasarjana IPB.
Penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan setinggi-tingginya
kepada Dr. Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi, M.Sc. selaku ketua komisi pembimbing
dan Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, M.Sc. selaku anggota komisi pembimbing
yang telah memberikan semangat, arahan, masukan dan saran selama pelaksanaan
penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga disampaikan
kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementrian Pendidikan Republik
Indonesia yang telah mendanai penelitian ini melalui skema Hibah Penelitian
Pascasarjana.
Ungkapan terima kasih pula kepada Ayahanda Johanis Irwan Hamdani dan
ibunda dr. Sheny Sumalgo atas motivasi, semangat, doa dan kasih sayang yang
selalu diberikan kepada penulis dalam suka dan duka; keluargaku khususnya:
Akbar, Ika, Alky, Jasmin, Elke, Ris, Lani, Harry, Ita dan seluruh keluarga besar
atas doa dan semangat yang diberikan.
Terima kasih penulis ucapakan kepada: (1) staf laboratorium SEAFAST
Center IPB: Mbak Ari, Mas Yerris, Mas Taufik, Mbak Ria, Mbak Lira, (Almh)
Bu Entin, Bu Sari, Pak Abah, Bu Eva atas bantuannya selama pelaksanaan
penelitian, (2) Desty Gitapratiwi atas bimbingan, nasihat, motivasi dan perhatian
yang diberikan selama penulis melakukan penelitian (3) sahabat-sahabatku :Indra,
Meily, Pik Wie, Since, Yuni, Laura, Felix, Grace, Hong Hong; teman-teman THP
UNHAS; teman-teman UOB Buana Makassar; teman-teman pelayan Pelkat PA
dan Pelkat GP GPIB Bethania Makassar, yang tetap setia dalam memberikan
dukungan, semangat dan doa, (4) teman-teman seperjuangan di IPN: Tina,
Riyanti, Melina, Hermawan, Fenny, Mbak Wida, Rani, Rangga, Dede,Vanessa,
Dian, Kiki, Mbak Lina, Mbak Tanti, Bu Indah Pak Supriyadi, Melinda, Nandi,
Pak Ikhsan, Bu Tita, Bu Zita, Bu Meilan, Bu Siti, Bu Aswita, Winnie, Cicoy,
Zulia, Ria, Rion dan Iza (5) keluarga besar wisma Flora: Ka Teti, Agnes, Devi,
Widi, Ika, Nie, Uthe, Septi, Dimas, Angel, Halimah, Indy, Diah, Kiki,
Yuyun,Vina, Abrar, Efan, Mba Fitri, Reza, Bang Rudi, Mas Yuli, (6) temanteman lab Viro: Aceu, Mba Dwi, Herma, Pak Santoso, Mba Tuti, (7) keluarga
besar Prima Copy Center dan (8) semua pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu
persatu atas dukungan dan doanya selama ini.
Semoga Tuhan Yang Maha Esa membalas budi baik Bapak/Ibu/Saudara/i
semuanya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Juni 2012

Fransisca Wanny Hamdani

x

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Ujung Pandang pada tanggal 14 Juni 1983 sebagai
anak tunggal dari ayah Johanis Irwan Hamdani dan ibu dr. Sheny Sumalgo.
Penulis lulus dari SMU Katolik Rajawali pada tahun 2001 dan melanjutkan
pendidikan sarjana di Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Pertanian dan
Kehutanan, Universitas Hasanuddin Makassar, dan lulus pada tahun 2006. Pada
tahun 2009, penulis mendapatkan kesempatan untuk melanjutkan pendidikan
magister sains di Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pascasarjana, Institut
Pertanian Bogor.
Selama mengikuti program S2, penulis ditunjuk sebagai salah satu anggota
dalam Forum Mahasiswa Ilmu Pangan (Formasip) periode 2009-2010. Selain itu,
penulis beberapa kali mengikuti berbagai kegiatan ilmiah seminar maupun
pelatihan yang berkaitan dengan studi penulis. Sebagai salah satu syarat untuk
memperoleh gelar Master Sains, penulis melakukan penelitian yang berjudul
“Isolasi dan Identifikasi Keragaman Genetika Cronobacter spp. (Enterobacter
sakazakii) yang Diperoleh dari Produk Pangan Kering” dibawah bimbingan
Dr. Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi, M.Sc dan Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, M.Sc.

xi

DAFTAR ISI

Halaman
DAFTAR TABEL ............................................................................................. xiii
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xiv
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xvi
PENDAHULUAN
Latar Belakang ....................................................................................

1

Tujuan Penelitian ..................................................................................

3

Manfaat Penelitian ................................................................................

3

TINJAUAN PUSTAKA
Karakteristik Cronobacter spp. (E. sakazakii) ......................................

4

Sumber Cronobacter sakazakii ...........................................................

5

Cronobacter spp. (E. sakazakii) pada Produk Pangan .........................

6

Perilaku Cronobacter spp. (E.sakazakii) dalam Lingkungan Pangan ...

8

Penyakit Akibat Cronobacter sakazakii ...............................................

9

Metode Deteksi Cronobacter spp. (E. sakazakii) ..............................

10

Keragaman Genetika Cronobacter sakazakii ......................................

16

Analisis Neighbor-Joining ..................................................................

20

BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu ..............................................................................

22

Bakteri Uji ...........................................................................................

22

Bahan dan Media .................................................................................

22

Alat ......................................................................................................

24

Perangkat Lunak (Software) ................................................................

24

Pelaksanaan Penelitian ........................................................................

25

Isolasi Bakteri C. sakazakii (Metode Modifikasi FDA) ..................

25

Identifikasi Isolat Secara Biokimia .................................................

26

Analisis Keragaman Genetika Cronobacter spp. (E. sakazakii) .....

28

Isolasi DNA Genom Bakteri .................................................
Elektroforesis Gel Agarosa ...................................................
Amplifikasi Gen 16S rRNA ..................................................
Sekuensing DNA ..................................................................

28
29
30
31

xii

HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Identifikasi Isolat-Isolat Presumtif Cronobacter spp.
(E. sakazakii) dari Bahan Pangan Kering .............................................

32

Karakteristik Biokimia Cronobacter spp. (E. sakazakii) ......................

37

Identifikasi dan Karakterisasi Genotipik Cronobacter spp.
(E. sakazakii) ........................................................................................
Isolasi DNA Genom Bakteri .......................................................
Amplifikasi Gen 16S rRNA ........................................................
Analisis Sekuen Parsial Gen 16S rRNA .....................................

39
39
40
43

Analisis Keragaman Genetika Cronobacter spp. (E. sakazakii) ..........
Analisis Filogeni .........................................................................
Keterkaitan Antara Kekerabatan Isolat-Isolat Lokal C. sakazakii
Dengan Resiko Kontaminasi pada Pangan Lokal .......................

49
49

SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................

53

DAFTAR PUSTAKA .....................................................................................

55

52

xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

1

Sifat biokimia galur-galur Cronobacter spp. ………………….....

5

2

Pasangan primer oligonukleotida yang digunakan untuk
amplifikasi gen penyandi 16S rRNA C. sakazakii …………….....

23

3

Sifat biokimia spesies Enterobacter ……………………………..

28

4

Hasil isolasi Cronobacter spp. (E. sakazakii) dari berbagai
sumber berdasarkan pertumbuhan koloni pada media VRBG dan
DFI ……………………………………………………………….

34

Isolat presumtif Cronobacter spp. (E. sakazakii) dan asal sampel
yang diperoleh ..………………………………………………......

36

Hasil identifikasi takson dan tingkat kemiripan isolat presumtif
Cronobacter spp. (E. sakazakii) dengan program apiwebTM ……

38

Sumber dan nomor akses galur acuan Cronobacter spp. yang
digunakan ………………………………………………………...

44

Homologi (%) antar isolat lokal yang dianalisis dengan galurgalur isolat lokal (dari Indonesia) Cronobacter spp. dari
GenBank berdasarkan sekuen parsial gen 16S rRNA segmen 1…

46

Homologi (%) antar isolat lokal yang dianalisis dengan galurgalur isolat Cronobacter spp. luar Indonesia dari GenBank
berdasarkan sekuen parsial gen 16S rRNA segmen 1…………...

47

Homologi (%) antar isolat lokal Cronobacter spp. hasil isolasi
yang dianalisis berdasarkan sekuen parsial gen 16S rRNA
segmen 1 …………........................................................................

47

Homologi (%) antar isolat lokal yang dianalisis dengan galurgalur isolat Cronobacter spp. luar Indonesia dari GenBank
berdasarkan sekuen parsial gen 16S rRNA segmen universal …..

48

Homologi (%) antar isolat lokal Cronobacter spp. yang dianalisis
berdasarkan sekuen parsial gen 16S rRNA segmen universal …...

48

5

6

7

8

9

10

11

12

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1

Dendogram keragaman sekuen Neighbor-Joining berdasarkan
sekuen parsial 16S rRNA segmen 1 yang menggunakan primer 16
SUNI-L dan Saka-2b berukuran 977 bp isolat C. sakazakii yang
diisolasi dari makanan bayi ……………………………..................

21

Peta amplifikasi fragmen gen 16S rRNA Cronobacter spp.
(Enterobacter sakazakii) dengan menggunakan pasangan primer
16 SUNI-L dan Saka-2b, ESA-1 dan 16 SUNI-R, 16 SUNI-L dan
16 SUNI-R ……………………………………................................

24

3

Diagram alir kegiatan penelitian keragaman genetika C. sakazakii..

25

4

Pertumbuhan isolat presumtif Cronobacter spp. (E. sakazakii)
pada beberapa media : (a dan b) VRBG, (c) DFI, (d) TSA ………

32

Sel bakteri C.sakazakii yang diamati di bawah mikroskop dengan
perbesaran 1000x …………………………………………………..

37

Visualisasi DNA hasil amplifikasi fragmen 16S rRNA segmen 1,
menggunakan pasangan primer 16 SUNI-L/Saka-2b bakteri
C.sakazakii pada gel agarosa 1.5% (TAE). Lajur M merupakan
marker DNA ladder 1 kb. K merupakan kontrol positif yaitu
ATCC 51329 dan kn merupakan kontrol negatif. Sampel terdiri
dari: FWH b2 (1), FWH b6 (2),FWH b11(3), FWH c3 (4), FWH
b15 (5), FWH d1 (6), FWH d2c (7), FWH d2u (8), FWH d11 (9),
FWH d12 (10), FWH d14 (11), FWh d16 (12) ……………………

40

Visualisasi DNA hasil amplifikasi fragmen 16S rRNA segmen 1,
menggunakan pasangan primer ESA-1/16 SUNI-R bakteri
C.sakazakii pada gel agarosa 1.5% (TAE). Lajur M merupakan
marker DNA ladder 1 kb. K merupakan kontrol positif yaitu
ATCC 51329 dan kn merupakan kontrol negatif. Sampel terdiri
dari: FWH b2 (1), FWH b6 (2),FWH b11(3), FWH c3 (4), FWH
b15 (5), FWH d1 (6), FWH d2c (7), FWH d2u (8), FWH d11 (9),
FWH d12 (10), FWH d14 (11), FWh d16 (12) ……………………

41

Visualisasi DNA hasil amplifikasi fragmen 16S rRNA segmen
universal, menggunakan pasangan primer 16 SUNI-L/16 SUNI-R
bakteri C.sakazakii pada gel agarosa 1.5% (TAE). Lajur M
merupakan marker DNA ladder 1 kb. K merupakan kontrol positif
yaitu ATCC 51329 dan kn merupakan kontrol negatif. Sampel
terdiri dari: FWH b2 (1), FWH b6 (2),FWH b11(3), FWH c3 (4),
FWH b15 (5), FWH d1 (6), FWH d2c (7), FWH d2u (8)FWH d11
(9), FWH d12 (10), FWH d14 (11), FWh d16 (12) ……………….

41

2

5

6

7

8

xv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

9

10

Dendogram dari galur-galur Cronobacter spp. berdasarkan gen
16S rRNA segmen 1. Metode analisis menggunakan Neighbor
joining dengan koreksi Felsenstein (1000 replikat Bootstrap).
Skala menunjukkan estimasi keragaman sekuen sebesar 5% ……..

50

Dendogram dari galur-galur Cronobacter spp. berdasarkan gen
16S rRNA segmen universal. Metode analisis menggunakan
Neighbor joining dengan koreksi Felsenstein (1000 replikat
Bootstrap). Skala menunjukkan estimasi keragaman sekuen
sebesar 5% …………………………………………………………

51

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Hasil isolasi bakteri Cronobacter spp. (E. sakazakii) dari beberapa
produk pangan kering ……………………………………………...

63

Hasil identifikasi isolat diduga C. sakazakii dengan API 20E yang
dianalisis dengan apiwebTM………………………………………...

69

Hasil uji reaksi biokimiawi isolat bakteri diduga Cronobacter spp.
(E. sakazakii) dengan perangkat API 20E ……………………….

75

Konsentrasi dan kemurnian DNA genom bakteri Cronobacter spp.
(E. sakazakii) ………………………………………………………

77

Jumlah nukleotida isolat lokal Cronobacter spp. (E. sakazakii)
yang berhasil disekuensing dengan primer segmen 1 ……………..

78

Hasil identifikasi isolat hasil isolasi berdasarkan sekuen parsial
gen 16S rRNA segmen 1 …………………………………………..

79

Homologi (%) antar isolat Cronobacter spp. dari luar Indonesia
pada GenBank ……………………………………………………..

80

Urutan basa (nukleotida) gen 16S rRNA segmen 1 isolat-isolat
lokal C. sakazakii yang dianalisis setelah contig ………………….

81

Jumlah nukleotida isolat lokal Cronobacter spp. (E. sakazakii)
yang berhasil disekuensing menggunakan primer universal ……..

87

Hasil identifikasi isolat hasil isolasi berdasarkan sekuen parsial
gen 16S rRNA segmen universal ………………………………….

88

Urutan basa (nukleotida) gen 16S rRNA segmen universal isolatisolat lokal C. sakazakii yang dianalisis setelah contig ……………

89

xvii

1
 

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Enterobacter sakazakii adalah mikroba patogen emerging yang dapat
mencemari pangan. Bakteri ini merupakan mikroorganisme vegetatif, fakultatif
anaerob, berbentuk batang dan tidak membentuk spora. Pada mulanya bakteri ini
termasuk dalam famili Enterobacteriaceae dan genus Enterobacter. Kemudian
berdasarkan

hasil

analisis

taksonomo

polifase

dan

keberadaan

enzim

α-glukosidase, yang dimiliki sebagian besar Cronobacter dan hanya sedikit pada
Enterobacteriaceae lainnya disusunlah reklasifikasi E. Sakazakii ke dalam genus
baru ‘Cronobacter’ yang terbagi atas enam spesies (Iversen et al. 2007).
Beberapa penelitian menyatakan bahwa Cronobacter spp. bisa diisolasi dari
spektrum

yang

luas

dan

kemungkinan

besar

berasal

dari

tumbuhan

karena disinyalir bahwa lingkungan (tanah, air, tikus dan lalat) serta makanan
(sayuran) merupakan sumber infeksi. Schmid et al. (2009), menyelidiki
kemampuan Cronobacter spp. untuk berkolonisasi pada akar tanaman.
Selanjutnya Walsh et al. (2010), menemukan Cronobacter spp. tumbuh lebih baik
dan bertahan pada jangka waktu yang lama dalam ingridien susu formula kering
terutama yang berasal dari tanaman sehingga dapat menjadi sumber kontaminasi
bagi alat-alat pengolahan dalam pabrik. Jaradat et al. (2009), menemukan
C. sakazakii lebih banyak pada produk herbal dan rempah-rempah sehingga dapat
disimpulkan bahwa sumber bakteri patogen khususnya C. sakazakii adalah
tanaman.
Infeksi akibat C. sakazakii menyebabkan gangguan kesehatan khususnya
pada bayi dengan berat badan rendah, bayi lahir prematur maupun bayi yang
dilahirkan oleh ibu yang menderita AIDS (acquired immune deficiency syndrome)
karena sistem imun dari golongan bayi-bayi tersebut tidak dapat bekerja secara
sempurna. Meskipun demikian, C. sakazakii juga pernah menyerang orang
dewasa utamanya yang tergolong memiliki daya tahan tubuh rendah
(immunocompromised).

2 
 

Kasus infeksi Cronobacter spp. (E. sakazakii) Indonesia belum pernah
dilaporkan tetapi Estuningsih et al. (2006a; 2006b) melaporkan keberadaan
bakteri ini dari susu formula lanjutan (22.73%, n=22) dan makanan bayi (46.7%,
n=15); Meutia et al. (2008) melaporkan keberadaan bakteri ini pada susu formula
(18.75%, n=16) dan makanan bayi (55.5%, n=9). Gitapratiwi et al. (2012), juga
melaporkan keberadaan C. sakazakii pada makanan bayi (20%, n=15), pati-patian
(pati jagung/maizena) (11.8%, n=17) dan produk pangan kering lainnya yaitu
bubuk coklat (6.3%, n=16). Senzani (2011), mengisolasi satu isolat C.sakazakii
dari sayur kubis diantara sembilan belas sampel sayur (5.26%) yang berasal dari
daerah Bogor.
Gitapratiwi et al. (2012), selanjutnya melakukan analisis keragaman
genetika berdasarkan sekuen parsial gen 16S rRNA dan menyimpulkan adanya
tingkat kemiripan yang bervariasi antara isolat-isolat lokal yang diperoleh dengan
isolat Estuningsih et al. (2006a) dan Meutia et al. (2008), dan dengan galur-galur
C. sakazakii dari luar Indonesia berdasarkan data dari GenBank.

Selain itu,

disimpulkan pula bahwa isolat-isolat lokal memiliki kedekatan kekerabatan secara
genetika meskipun berasal dari sumber yang berbeda (Gitapratiwi 2011).
Penelitian lebih lanjut mengenai keberadaan C. sakazakii perlu dilakukan
pada beberapa produk pangan kering, kemudian dilakukan analisis secara
biokimia maupun

keragaman genetika antara isolat-isolat Cronobacter spp.

(E. sakazakii) yang diperoleh dengan isolat-isolat lokal dan isolat-isolat dari luar
negeri berdasarkan data dari GenBank. Informasi mengenai keragaman genetika
Cronobacter spp. yang ada di Indonesia dapat berkontribusi pada reklasifikasi
spesies Cronobacter spp. (E. sakazakii).
Pengetahuan mengenai keragaman genetika bakteri patogen ini diharapkan
dapat dihubungkan dengan perilakunya selama pengolahan maupun penanganan
bahan pangan. Selain itu juga dapat diketahui sejauh mana bakteri Cronobacter
spp. (E. sakazakii) dapat melakukan kontaminasi silang utamanya pada
lingkungan pabrik ataupun tempat yang sering digunakan untuk preparasi
susu formula dan makanan bayi di lingkungan rumah tangga karena
kemampuan hidup bakteri ini dalam berbagai sumber bahan pangan kering.

3
 

Dengan

demikian

diharapkan

dapat

diidentifikasi

karakteristik

penting

Cronobacter spp. (E. sakazakii) yang memberikan risiko lebih besar utamanya
terhadap bayi maupun masyarakat di Indonesia serta cara pengendaliannya.
Tujuan Penelitian
1. Mendapatkan isolat Cronobacter spp. (E. sakazakii) dari beberapa bahan
pangan kering di Indonesia.
2. Melakukan identifikasi secara biokimia dan genotipik isolat Cronobacter
spp. (E. sakazakii) yang diperoleh
3. Melakukan analisis keragaman genetika melalui perbandingan isolat yang
diperoleh dengan isolat-isolat lokal dari beberapa penelitian sebelumnya
dan juga isolat-isolat dari luar Indonesia dari data GenBank berdasarkan
gen 16S rRNA.
Manfaat Penelitian
1. Mempelajari karakteristik biokimia dan genetik isolat lokal Cronobacter
spp. (E. sakazakii) di Indonesia.
2. Meningkatkan informasi mengenai keragaman genetika Cronobacter spp.
(E. sakazakii) agar dapat menjadi rujukan dalam pengendalian lingkungan.

4 
 

5
 

TINJAUAN PUSTAKA

Karakteristik Cronobacter spp. (E. sakazakii)
Enterobacter sakazakii merupakan bakteri Gram negatif, anaerob fakultatif
berbentuk batang pendek (0,5-1,0 x 1,0-3,0 μm), peritrichous, memiliki pigmen
warna kuning, tidak membentuk spora dan memiliki kapsul yang menyelimuti
tubuhnya sebagai mekanisme pertahanan diri. Pada media pembiakan, koloninya
nampak licin berlendir namun juga terkadang kering. Karena memiliki
karakteristik biokimia yang sama, bakteri ini pertama kali dikenal dengan nama
E. cloacae berpigmen kuning. Pada tahun 1980, berdasarkan perbedaan dengan
E. cloacae dalam hal kekerabatan DNA, reaksi-reaksi biokimiawi, produksi
pigmen dan ketahanannya terhadap antibiotik bakteri ini dimasukkan dalam genus
Enterobacter sebagai suatu spesies baru yang diberi nama E. sakazakii sebagai
penghormatan seorang bakteriolog Jepang bernama Riichi Sakazakii (Farmer
et al. 1980).
Berdasarkan profil biokimiawinya, E. sakazakii sangat menyerupai
E. cloacae, tetapi E. sakazakii selalu bersifat D-sorbitol negatif, DNase
ekstraselular positif dan membentuk koloni berpigmen kuning sedangkan
E. cloacae bersifat D-sorbitol positif, DNAse ekstraselular negatif dan tidak
membentuk koloni berpigmen kuning.

E. sakazakii terbagi atas 15 biogrup

dengan karakteristik biokimia dulcitol positif dan α-metil-glukosida negatif yang
tidak ditemukan pada karakterisiktik biokimia galur-galur Enterobacteriaceae
yang lain. Untuk biogrup 15 memiliki karakteristik yaitu indol positif dan malonat
positif, dimana kombinasi karakteristik tersebut tidak ditemukan di galur-galur
yang lain (Farmer et al. 1980). Pembentukan pigmen kuning lebih kuat pada suhu
25 °C dibandingkan pada suhu 36 °C. Semua galur dapat tumbuh dengan cepat
pada media TSA dan membentuk koloni 1.5-3 mm setelah 1-2 hari (NazarowecWhite et al. 2003).
Pada tahun 2007, berdasarkan metode polyphasic taxonomy, sekuen gen 16S
rRNA, ribotyping, f-AFLP (fluorescent-amplified fragment length polymorphism)
dan hibridisasi DNA-DNA, patogen Enterobacter sakazakii diklasifikasikan
dalam genus baru ‘Cronobacter’ yang terdiri dari enam spesies dan terbagi

6 
 

menjadi 16 biogrup. Spesies-spesies tersebut adalah : Cronobacter sakazakii
(biogrup 1-4, 7, 8 , 11 dan 13), Cronobacter malonaticus (biogrup 5, 9, 14),
Cronobacter dublinensis (biogrup 6, 10, 12), Cronobacter muytjensii (biogrup
15), Cronobacter turicensis (biogrup 16) dan Cronobacter genomospecies I.
(Iversen et al. 2007). Cronobacter dublinensis terbagi atas beberapa subspesies
yaitu : Cronobacter dublinensis subsp. dublinensis subsp. nov. (biogrup 12),
Cronobacter dublinensis subsp.

lausanensis subsp. nov. (biogrup 10)

dan

Cronobacter dublinensis subsp. lactaridi subsp. nov. (biogrup 6) (Iversen et al.
2008a). Karakteristik biokimia galur Cronobacter spp. (E. sakazakii) secara
biokimia antara lain menunjukkan reaksi positif terhadap produksi asam dari
metil-α-D-glukosida dan menunjukkan reaksi negatif terhadap produksi asam dari
dulcitol, produksi indol dan pemanfaatan malonat, untuk galur-galur Cronobacter
spp. yang lain secara keseluruhan dapat terlihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Sifat biokimia galur-galur Cronobacter spp.
Galur Cronobacter spp.
Cronobacter sakazakii subsp. sakazakii*
Cronobacter sakazakii subsp. malonaticus*
Cronobacter muytjensii*
Cronobacter dublinensis subs. dublinensis*
Cronobacter dublinensis subs. lausanensis**
Cronobacter dublinensis subs. lactaridi**
Cronobacter turicensis*
Cronobacter genomospecies I*

Dul
+
+
+

Ind
+
+
V
+
-

Malo
+
+
V
+
+

AMG
+
+
+
+
+
+
+

Dul : produksi asam dari dulcitol; Ind : produksi indol; Malo : pemanfaatan malonat;
AMG : produksi asam dari metil-α-D-glukosida; untuk * + : 85-100% positif, - : kurang
dari 15% positif, V: variable; untuk ** + : lebih besar dari 90% positif, - : kurang dari
10% positif, V : 20-80% positif.

*Iversen et al. (2007); **Iversen et al. (2008).
Sumber Cronobacter sakazakii
Cronobacter spp. merupakan bakteri patogen yang terdapat dimana-mana
(Cawthorn et al. 2008). Patogen ini telah diisolasi dari berbagai sumber antara lain
lingkungan, klinis, makanan maupun minuman. Salah satu sumber Cronobacter
spp. yang terkait dengan wabah penyakit adalah susu formula (FAO/WHO 2004),
sehingga beberapa penelitian dilakukan secara khusus untuk mengetahui
keberadaan galur Cronobacter pada fasilitas-fasilitas pengolahan susu formula
(Mullane et al. 2008), bahan baku (El-Sharoud et al. 2009) dan produk akhir

7
 

(Mullane et al. 2008). Kontaminasi secara intrinsik pada susu formula dapat
terjadi melalui penambahan bahan baku yang telah terkontaminasi atau melalui
lingkungan pengolahan pada proses pengemasan. Kontaminasi ekstrinsik dapat
terjadi pada saat rekonstitusi susu formula dengan peralatan yang telah
terkontaminasi (Mullane et al. 2008).
Habitat alami dan cara penularan C. sakazakii hingga saat ini masih terus
diselidiki. Bakteri ini biasanya dapat ditemukan di lingkungan ataupun dalam
makanan. Kemampuan bakteri ini menghasilkan polisakarida ekstraseluler (gum
like) dan bertahan dalam keadaan kering menunjukkan bahwa sumber utama dari
lingkungan berhubungan erat dengan tanaman. Hal tersebut dibuktikan oleh
penelitian Schmid et al. (2009) yang mengamati galur-galur Cronobacter spp.
yang dipakai untuk melihat proses kolonisasinya pada akar tanaman tomat dan
jagung, menunjukkan adanya solubilitas dari fosfat mineral dan produksi asam
asetat indol. Karakteristik tersebut biasanya ditemukan pada tanaman yang terkait
bakteri dan mikroorganisme rhizosfer, sehingga dapat disimpulkan bahwa habitat
alami Cronobacter spp. kemungkinan berasal dari tumbuhan
Penularan C. sakazakii dapat terjadi secara eksogen, misalnya melalui
kotoran manusia, dari orang ke orang, dari ibu dan bayi yang dikandung, melalui
makanan, peralatan rumah sakit, dan secara endogen seperti dari usus manusia
sendiri. Penularan secara pasif yang berasal dari tangan tenaga medis juga dapat
menjadi modus utama penularan bakteri ini. C. sakazakii juga dapat diisolasi dari
keran dan air kemasan dan dapat bertahan hidup dan berkembang biak pada atau
dalam peralatan rumah sakit seperti alat hemodialisis dan maupun alat bantu
pernafasan (Farmer 1999).
Cronobacter spp. (E. sakazakii) pada Produk Pangan
Bakteri C. sakazakii merupakan kontaminan utama pada susu formula yang
diakibatkan oleh kontaminasi pada saat penambahan ingridien setelah proses
pasteurisasi, proses pengemasan atau proses rekonstitusi susu di rumah tangga
atau di rumah sakit (Cawthorn et al. 2008; Cordier 2008; Mullane et al. 2007).
Kontaminasi pada ingridien susu formula diakibatkan adanya kontaminasi silang

8 
 

dari lingkungan melalui air, udara yang mengandung kotoran atau debu atau
akibat kurang higienisnya personal yang terlibat dalam proses produksi (Den
Aantrekker et al. 2003).
Cronobacter spp. juga dapat diisolasi dari produk pangan siap saji antara
lain vanilla cream bars, produk salad, seledri, basil, lentil sprouts, onion sprouts,
mung bean sprouts, sproud mixture, merica dan salad dengan campuran herbs
kering (Baumgartner et al. 2009); produk pangan segar antara lain kacang hijau
(Boehme et al. 2004), produk sayuran dan produk sosis (Leclercq et al. (2002);
produk pangan non kering antara lain domiatti cheese (El Sharoud et al. 2009) dan
white cheese yang diproduksi di Konya (Gökmen et al. 2010).
Cronobacter

spp.

dalam

produk

pangan

siap

saji

dapat

Keberadaan
berpeluang

mengkontaminasi peralatan rumah tangga sehingga meningkatkan potensi risiko
bakteri ini untuk menginfeksi orang dewasa khususnya yang memiliki daya tahan
tubuh rendah (immunocompromised) (Baumgartner et al. 2009).
Keberadaan Cronobacter spp. dalam produk pangan kering telah dilaporkan
oleh beberapa penelitian. Jaradat et al. (2009) mengisolasi C. sakazakii dengan
total persentase tinggi dari produk rempah seperti liquorice, thyme, anise,
chamomile, fennel dan sage dan

campuran rempah-rempah (89.6%, n=67).

Lee et al. (2010) mengisolasi C. sakazakii dan C. dublenisis dari ‘saengsik’, yaitu
pangan yang terdiri atas biji-bijian, buah-buahan dan sayuran yang menjadi bubuk
melalu proses pengeringan beku (freeze drying) dengan frekuensi isolasi 45%
(n=41). Sementara itu Restaino et al. (2006) mengisolasi C. sakazakii dari produk
tepung-tepungan, sayuran dan rempah-rempah kering dengan frekuensi isolasi
37.9% (n=83) dan Baumgartner et al. (2009) mengisolasi dari rempah-rempah dan
bumbu kering dengan frekuensi isolasi 26.9% (n=26).
Di Indonesia, bakteri C. sakazakii diisolasi dari produk susu formula
lanjutan dan makanan bayi seperti yang dilaporkan oleh Estuningsih et al. (2006a)
dan Meutia et al. (2008). Sementara itu Gitapratiwi et al. (2012) melaporkan
adanya C. sakazakii dalam produk makanan bayi dan produk pangan kering
seperti pati jagung (maizena) dan bubuk coklat; sedangkan Senzani (2011)
melaporkan adanya C.sakazakii dari sayur kubis yang merupakan jenis sayur dan
buah komoditas lokal kota Bogor.

9
 

Berdasarkan hasil penelitian Jaradat et al. (2009), tumbuh-tumbuhan
merupakan sumber utama dari bakteri patogen khususnya C. sakazakii. Tingginya
persentase hasil isolasi C. sakazakii pada produk pangan kering, produk herbal
dan rempah-rempah kering menunjukkan perlunya pengawasan ketat selama
pengolahan, pengeringan atau pengemasan produk pangan utamanya pada susu
formula dan makanan bayi. Selain itu, pada saat penyajian susu formula maupun
makanan bayi perlu diperhatikan untuk menghindari terjadinya kontaminasi silang
(Erkekoğlu et al. 2009)
Perilaku Cronobacter spp. (E. sakazakii) dalam Lingkungan Pangan
C. sakazakii memiliki beberapa karakteristik fisiologis khusus seperti
pembentukan biofilm, resistensi terhadap antibiotik, tahan terhadap pengeringan
dan tekanan osmotik (Gurtler et al. 2005; Wu et al. 2006). Bakteri C. sakazakii
tumbuh pada rentang suhu yang luas yakni 6 °C - 47 °C dengan suhu optimum
pertumbuhannya 39 °C (Iversen dan Forsythe 2003). Bakteri ini memiliki
kemampuan bertahan hidup dalam kondisi kering dan aw rendah sehingga
walaupun tidak tumbuh tetapi dapat bertahan dalam produk kering hingga
beberapa bulan bahkan sampai dua tahun (Edelson-Mammel et al. (2005); Barron
dan Forsythe 2007). Kemampuan bertahan dari Cronobacter spp dalam jangka
waktu yang lama diduga karena kemampuannya mengakumulasi trehalosa dan
membentuk kapsul (ekstraseluler polisakarida). Trehalosa tersebut merupakan
bentuk disakarida dari glukosa mudah larut yang dapat menstabilkan protein dan
membran fosfolipid sehingga melindungi bakteri dari kekeringan (Breeuwer et al.
2003). Meskipun demikian, C. sakazakii tidak dapat membentuk spora sehingga
mudah diinaktivasi oleh panas.
Pasteurisasi sangat efektif dalam menghancurkan C. sakazakii (Iversen et al.
2004c). Pengasaman juga dapat mengurangi konsentrasi C. sakazakii dalam
berbagai jenis susu formula dan produk makanan berbasis nabati. Dalam jus
sayuran, penurunan pH setelah 48 jam berkorelasi dengan pengurangan jumlah
C. sakazakii (Kim dan Beuchat 2005).
C. sakazakii dapat hidup dalam keadaan aw rendah seperti pada produk
bubur bayi (aw 0.3-0.69) dan produk susu formula (aw 0.25-0.5). Pertumbuhan
bakteri C. sakazakii pada biji-bijian (cereal) menunjukkan peningkatan paling

10 
 

signifikan pada suhu rendah yaitu 4 °C dengan aw 0.63-0.83 dibandingkan
penyimpanan pada suhu tinggi yaitu 21 °C dan 30 °C pada kondisi aw 0.40-0.50
dan (Gurtler dan Beuchat 2007).
C. sakazakii biasanya terdapat dalam lingkungan yang tidak bersih sehingga
dapat mengkontaminasi berbagai peralatan utamanya yang digunakan dalam
proses produksi (Lai 2001). Susu bubuk formula merupakan sumber infeksi yang
utama bagi C. sakazakii (Drudi et al. 2006; Gurtler et al. 2005). Bakteri ini tahan
terhadap pengeringan dan pH asam, panas, dan membentuk biofilm pada
permukaannya.
Beberapa penelitian melaporkan bahwa spesies-spesies dari genus
Cronobacter spp.

dapat membentuk biofilm dan kapsul pada berbagai jenis

permukaan seperti silikon, kaca, stainless steel, lateks, polycarbonate dan
polyvinyl chloride sehingga memungkinkan bakteri ini dapat bertahan pada
beberapa kondisi seperti tekanan osmotik yang tinggi, terpapar sinar UV, kondisi
kering, kekurangan nutrisi, terpapar sanitisers dan antibiotik, fagosit, antibodi
dan bacteriophage (Iversen et al. 2004c; Lehner et al. 2005). Produksi biofilm
dipengaruhi oleh ketersediaan nutrisi dan suhu medium pertumbuhan (Kim et al.
2006).
Penyakit Akibat Cronobacter sakazakii
Penyakit akibat C. sakazakii pertama kali ditemukan pada tahun 1958
dengan 78 kasus bayi yang terkena infeksi meningitis. Beberapa publikasi
menyebutkan kasus-kasus bayi baru lahir yang mengalami septicaemia,
meningitis (radang otak) dan necroitizing enterocolitis (peradangan usus) akibat
Cronobacter spp. (E. sakazakii) berkaitan dengan susu bubuk formula. Laporan
mengenai infeksi akibat C. sakazakii menurut Iversen dan Forsythe (2003) dan
Drudy et al. (2006) dari tahun 1958-2004 terdapat 72 kasus pada bayi dan anakanak dimana 24 kasus diantaranya mengakibatkan kematian.
Beberapa galur C. sakazakii ternyata membentuk kapsul, sehingga
berkontribusi dalam menghindar dari makrofag dalam tubuh manusia. Selain itu,
kapsul juga dapat memberikan perlindungan bagi organisme, sehingga
memfasilitasi kelangsungan hidup terutama di lingkungan kering (Iversen et al.
2004c).

11
 

C. sakazakii dapat menginfeksi segala usia tetapi risiko terbesar adalah pada
bayi usia 0-1 tahun. Pada tahun 1994 terjadi KLB (Kejadian Luar Biasa) infeksi
C. sakazakii pada bayi baru lahir di rumah bersalin di Perancis yang melibatkan
13 bayi baru lahir dan tiga diantaranya meninggal dunia (Caubilla-Barron et al.
2007). Di New Mexico pada tahun 2008, satu bayi perempuan berusia 7 minggu
dikabarkan mengalami cedera otak parah dan hydrocephalus, dan bayi laki-laki
berusia 7 bulan meninggal dunia akibat akibat terinfeksi oleh Cronobacter. Kasus
yang melibatkan orang dewasa terjadi pada tahun 2006 berupa bacteremia yang
terjadi pada seorang wanita usia 75 tahun dengan pembengkakan limpa (See et al.
2007). Pada tahun 2008 dilaporkan kasus infeksi saluran kemih akibat C.
sakazakii pada seorang wanita 63 tahun dengan gagal ginjal kronis (Bhat et al.
2009).
Metode Deteksi Cronobacter spp. (E. sakazakii)
Pengujian patogen secara konvensional biasanya memerlukan 4 tahap yakni
(1) preenrichment untuk memperkaya atau mengkondisikan bakteri patogen
terutama bila bakteri dalam keadaan injured atau jumlahnya sangat rendah,
(2) selective enrichment, dimana diberikan senyawa tertentu atau suatu kondisi
yang menghambat bakteri patogen lain selain yang diinginkan , (3) isolasi yakni
pemupukan pada medium tertentu untuk mendapatkan koloni tipikal atau benarbenar murni bakteri yang diinginkan, dan (4) identifikasi yang dilanjutkan dengan
konfirmasi yakni dengan uji-uji biokimia, serologi, immunoassay ataupun DNA
untuk memastikan jenis patogen tersebut (BAM 2001).
Berbagai metode isolasi dan identifikasi Cronobacter telah dikembangkan
sebagai respon atas berbagai kasus kontaminasi dan infeksi akibat bakteri ini.
FDA (2002) dalam publikasinya telah mengembangkan media serta pereaksi yang
digunakan dalam isolasi C. sakazakii pada susu formula. Metode ini terdiri atas
beberapa tahapan yaitu :
™ Rekonstitusi susu formula bubuk dengan air destilata steril selama 24 jam
pada 36ºC untuk meresusitasi sel-sel yang mengalami stress dilanjutkan
pengayaan pada media Enterobacteriaceae enrichment (EE) broth selama 24
jam pada 36 °C untuk menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif karena

12 
 

adanya kombinasi Brilliant Green dan bile salts. EE broth terdiri atas glukosa
yang mampu meningkatkan pertumbuhan bakteri Enterobacteriaceae. Isolat
yang ditumbuhkan pada EE broth dapat mengubah warna media dari hijau
bening menjadi keruh.
™ Tahapan selanjutnya adalah plating dengan cara penggoresan pada Violet Red
Bile Glucose (VRBG) Agar kemudian diinkubasi selama 24 jam pada 36 ºC
untuk menghambat bakteri Gram positif seperti Lactobacillus karena adanya
kombinasi kristal violet dan bile salts. Pertumbuhan yang terjadi pada VRBG
dapat dilihat dari pembentukan koloni yang menggumpal yang berwarna
ungu bergradasi ke oranye atau kuning atau kecoklatan. Koloni yang
menggumpal menandakan terjadinya presipitasi garam empedu yang
merupakan bahan selektif yang ditambahkan di dalam VRBG.
™ Koloni positif yang tumbuh pada VRBG kemudian diseleksi kembali pada
media Tryptone Soy Agar (TSA) dan diinkubasi selama 48 hingga 72 jam
pada 25 ºC. Koloni positif E. sakazakii pada TSA yang berpigmen kuning
kemudian dikonfirmasi dengan menggunakan sistem identifikasi biokimia,
API 20E, yang memerlukan tambahan waktu selama 18 hingga 24 jam.
Media-media yang dikemukakan oleh FDA menurut Oh dan Kang (2004),
memerlukan beberapa pengembangan karena kelemahan-kelemahan pada VRBG
dan TSA. Media VRBG dinyatakan kurang selektif karena mikroba lain dapat
juga tumbuh dan menghasilkan koloni berwarna ungu yang dikelilingi dengan
halo berwarna ungu akibat presipitasi garam empedu sehingga agak sulit untuk
membedakan E.sakazakii dari bakteri lainnya. Media TSA memiliki beberapa
kekurangan karena memerlukan inkubasi yang lama yaitu 72 jam, selain itu
spesies Enterobacteriaceae yang lain yaitu E. hermanii dan E. vulneris juga
berpigmen

kuning

pendeteksiannya.

sehingga

Oleh

karena

mengembangkan media selektif
glukosidase yaitu OK agar.

dapat
itu,

menimbulkan
Oh

dan

Kang

kerancuan
(2004)

dalam

kemudian

untuk E. sakazakii berdasarkan aktivitas α-

Media ini terdiri dari 4-Methylumbelliferyl-α-D-

glukosida yang merupakan substrat bagi α-glukosida dan bersifat fluorogenik
pada saat terpapar sinar UV. Sodium tiosulfat dan ferric citrate pada media ini

13
 

berfungsi sebagai penanda selektif dalam membedakan Enterobacteriaceae
(Citrobacter, Salmonella, Edwardsiella dan Proteus) penghasil H2S.
Media kromogenik selektif untuk mendeteksi keberadaan C. sakazakii pada
susu

formula

yaitu

Druggan-Forsythe-Iversen

(DFI)

agar

kemudian

dikembangkan oleh Iversen et al. (2004b). Bahan selektif yang terdapat pada
media tersebut adalah suatu senyawa chromogen 4-chloro-3-indolyl-α,Dglucopyranoside (XαGlc). Senyawa tersebut akan berikatan dengan enzim αglukosidase pada C.sakazakii dan membentuk koloni berwarna hijau-biru. Selain
itu di media ini terdapat sodium desoxycholate yang bersama-sama dengan sodium
thiosulphate dan ferric ammonium citrate yang bertindak sebagai senyawa
selektif. Iversen dan Forsythe (2004b) menyatakan bahwa media chromogenic
yang ditemukannya memiliki beberapa keunggulan dibandingkan metode
konvensional yang dikemukakan oleh FDA antara lain dengan menggunakan
media DFI maka hasil isolasi dapat diperoleh dua hari lebih awal dibandingkan
dengan metode konvensional; selain itu, media DFI lebih selektif dan sensitif
dalam mendeteksi keberadaan C. sakazakii dibandingkan dengan metode
konvensional (metode FDA).
Media kromogenik R&F Enterobacter sakazakii Chromogenic Plating
Medium (ESPM) untuk isolasi koloni presumtif C. sakazakii dari makanan
maupun lingkungan dikembangkan oleh Restaino et al. (2006). Media ini terdiri
dari

dua

substrat

kromogenik

yaitu

5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-

glucopyranoside dan 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-cellobioside. Penggunaan
medium ESPM menghasilkan empat reaksi yaitu: (1) organisme yang
menghidrolisis satu atau dua substrat kromogenik (indoxyl) membentuk waterinsoluble halogenated indole membentuk koloni berwarna biru-hitam atau birukeabu-abuan (seperti C. sakazakii), (2) organisme yang menghidrolisis satu atau
dua substrat kromogenik ditambah satu atau dua karbohidrat membentuk koloni
berwarna hijau (seperti Klabsiella dan galur-galur E. coli), (3) organisme yang
tidak menghidrolisis substrat kromogenik tetapi mampu memfermentasi satu atau
lebih karbohidrat membentuk koloni berwarna putih kekuningan (seperti
Pseudomonas) dan (4) organisme yang sama sekali tidak menghidrolisis ataupun
memfermentasi membentuk koloni berwarna bening (seperti Pseudomonas).

14 
 

Media ESPM juga terdiri dari tiga gula (sorbitol, D-arabitol dan adonitol),
indikator pH dan beberapa penghambat (bile salt, vancomycin dan cefsulodin).
Restaino et al. (2006) menggunakan metode ESPM dan ESSM (Enterobacter
sakazakii

Chromogenic

screening

medium)

secara

bersama-sama

untuk

meningkatkan sensitifitas dan lebih spesifik.
Perbandingan dua media kromogenik yaitu DFI agar dan Enterobacter
sakazakii Isolation Agar (ESIA) untuk mendeteksi C. sakazakii di lingkungan
dilakukan oleh Lehner et al. (2006). Berdasarka