Genetic variability analysis of pineapple based on morphological and moleculer marker
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK
NENAS (Ananas comosus (L). Merr) BERDASARKAN
PENANDA MORFOLOGI DAN PENANDA RAPD
CORNALIA MEINARTI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASINYA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Analisis Keragaman Genetik
Nenas (Ananas comosus (L). Merr) Berdasarkan Penanda Morfologi dan Penanda
RAPD adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Juli 2011
Cornalia Meinarti
NIM A.253080161
ABSTRACT
CORNALIA MEINARTI. Genetic Variability Analysis of Pineapple (Ananas
comosus (L). Merr) Based on Morphological and Moleculer Marker (RAPD)
under direction of SOBIR, EDI SANTOSA and AGUS PURWITO.
In order to reveal the phylogenetic relationship among genotypes of pineapple in
PKBT collection, 32 accessions were analyzed using morphological markers with
116 distinguishing characteristics and RAPD markers with 10 primers that formed
50 profiles of DNA bands with 47 polymorphic bands and 3 bands monomorphic.
Cluster analysis results on 32 accessions using morphological markers revealed
three groups with the cut at the level of similarity of 0.63, whereas at 53
accessions formed three groups with the level of similarity of 0.50. RAPD formed
3 groups with diverse levels of 0.66 and a marker combined data formed three
groups with the cut at the level of similiarity of 0.61. The result of alignment
analysis showed that morphological markers on 32 accessions have the
appropriate r value of 0.80271 whereas at 53 accessions obtained the appropriate
value 0.81392. whereas RAPD has the appropriate value of r 0.87144 and the
combined data had a value of r less appropriate is 0.75761.
Keywords : morphological, pineapple accessions, RAPD markers.
RINGKASAN
CORNALIA MEINARTI. Analisis Keragaman Genetik Nenas (Ananas comosus
(L). Merr) Berdasarkan Penanda Morfologi dan Penanda RAPD. Dibimbing oleh
SOBIR, EDI SANTOSA dan AGUS PURWITO.
Keragaman genetik nenas pada kebun koleksi PKBT dapat diungkap
melalui analisis morfologi dan molekuler. Penanda yang dapat digunakan untuk
mengetahui keragaman genetik nenas adalah RAPD ( Random Amplified
Polymorphic DNA). RAPD merupakan teknik yang lebih cepat dan mudah
dilakukan karena tidak perlu diketahui sekuen DNA sebelumnya dan material
tanaman yang dibutuhkan lebih sedikit. Penelitian ini bertujuan menganalisis dan
mengevaluasi keragaman aksesi nenas berdasarkan penanda morfologi dan
genetik serta mengetahui keragaman genetik nenas berdasarkan penanda
morfologi dan penanda RAPD koleksi Pusat Kajian Buah-buahan Tropika
(PKBT)
Keragaman morfologi dapat diamati pada penanda morfologi sebanyak 31
karakter meliputi organ : (1) daun yaitu 15 karakter, (2) buah yaitu 16 karakter
dan diperoleh 116 karakter pembeda. Hasil analisis pengelompokan diperoleh
sebanyak 3 kelompok pada tingkat kemiripan 0.62 yaitu (1) grup A meliputi
C-KAS, SC-JPG, C-LMPG1, C-LMPG3, SC-SMDG, Q-KTM1, Q-KTM2, QOGIL, Q-RIAU, QH-BBEL, Q-BLI, QC-P18, QC-AZRI, QC-V49, C-RNIS, QCP5/12, CNN, C-SMUT2, QC-P10, SC-WNSBO, C-FLPN, QC-III, QC-P14 (2)
grup B meliputi C-SMUT, C-BNHYU, SC-NAD, C-SMDU, SC-SMUT3, SC-PRBA
dan (3) grup C meliputi C-MNDO, C-PAK, SC-DSBG.
Analisis molekuler terhadap 32 aksesi menghasilkan 50 pita yaitu 47 pita
polimorfik (98%) dan pita monomorfik sebanyak 3 pita (2%). Hasil analisis
pengelompokan skor pita DNA dengan menggunakan program NTSYS, diperoleh
3 grup pada koefisien kemiripan 0.66 yaitu (1) grup A meliputi C-KAS, C-SMUT,
C-PAK, QC-V49, Q-KTM2, C-LMPG3, C-SMUT2, C-SMDU, Q-RIAU, QC-AZRI,
C-BNHYU, C-FLPN, Q-KTM1, Q-BLI, Q-MNDO, C-LMPG1, QC-P14, (2) grup
B meliputi QC-P5/12, QC-P10, QC-III, C-DSBG, SC-SMUT3,QC-P18, Q-OGIL,
SC-NAD, SC-PRBA, C-RNIS, SC-SMDG, SC-WNSBO, SC-JPG dan (3) grup 3
meliputi CNN.
Penggabungan data penanda morfologi dan penanda molekuler
memberikan informasi secara fenotipik dan genotipik. Karakter yang digunakan
adalah penggabungan 31 karakter morfologi dan 10 primer yang menghasilkan 50
pita, sehingga total gabungan karakter adalah 81. Hasil analisis dengan
menggunakan program NTSYS pada koefisien kemiripan 0.61, diperoleh
dendrogram membentuk 3 grup, yaitu (1) grup A meliputi C-KAS, C-SMUT, CPAK, C-BNHYU, C-SMDU, C-FLPN, QC-III, C-DSBG, Q-KTM1, Q-KTM2, CLMPG3, C-SMUT2, Q-RIAU, Q-BLI, QC-V49, QC-AZRI, C-LMPG1, C-RNIS,
QH-BBEL, Q-OGIL, QC-P18, QC-P10, QC-P5/12, CNN, SC-SMDG, SC-JPG,
SC-WNSBO, QC-P14 (2) grup B meliputi Q-MNDO, SC-NAD, SC-PRBA dan (3)
grup D meliputi SC-SMUT.
Kata kunci : aksesi nenas, morfologi, penanda RAPD.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2011
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk
kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan
laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah dan pengutipan
tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK
NENAS (Ananas comosus (L). Merr) BERDASARKAN
PENANDA MORFOLOGI DAN PENANDA RAPD
CORNALIA MEINARTI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. M. Syukur, SP. MSi
Judul Tesis : Analisis Keragaman Genetik Nenas (Ananas comosus (L). Merr)
Berdasarkan Penanda Morfologi dan Penanda RAPD
Nama
: Cornalia Meinarti
NIM
: A.253080161
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Edi Santosa, SP., MSi
Anggota
Dr. Ir. Sobir, MSi
Ketua
Dr. Ir. Agus Purwito, MSc.Agr
Anggota
Diketahui
Ketua Mayor
Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman
Dr. Ir. Trikoesoemaningtyas, MSc
Tanggal Ujian : 27 Juni 2011
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc.Agr
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema
penelitian adalah Analisis Keragaman Genetik Nenas (Ananas comosus (L).
Merr ) Berdasarkan Penanda Morfologi dan Penanda RAPD yang dilaksanakan
sejak bulan April sampai dengan Oktober 2010.
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis
sampaikan kepada :
1.
Dr. Ir. Sobir, MSi, Dr. Edi Santosa, SP., MSi dan Dr. Ir Agus Purwito,
MSc.Agr selaku komisi pembimbing yang telah memberikan arahan dan
bimbingan sejak perencanaan, pelaksanaan penelitian sampai penyelesaian
penyusunan tesis.
2.
Dr. Ir. Trikoesoemaningtyas, MSc selaku Ketua Mayor Pemuliaan dan
Bioteknologi Tanaman SPs IPB dan Dr. Ir. Darda Efendi, MS selaku
Sekretaris Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman SPs IPB.
3.
Pemerintah Daerah Kabupaten Sintang yang telah memberikan bantuan
dana melalui Program Bantuan Beasiswa Tugas Belajar.
4.
Pusat Kajian Buah Tropika LPPM IPB, yang telah mendanai penelitian ini.
5.
Ayahnda Ignasius Slamet dan Ibunda Maria Magdalena Ukis untuk segala
cinta,
kasih
sayang
dan
kesabaran
yang
tidak
berujung
untuk
menyekolahkan saya, bang heru dan kak lily, mas anton, adik-adiku (Joni,
Erick, Merry) terima kasih untuk dukungannya baik moril maupun materil,
juga keponakan tercinta (evan, dek dian, arlen dan adun) yang selalu
memberi semangat.
6.
Ir. Ellina Mansyah, MP., Ir. Kasutjianingati, MSi. Ir. Arifah, MSi., Rd.
Selvy Handayani, SP, Dede Safitri, Sulaeman, Baesuni, Pak Ence dan Imas
atas dukungannya.
7.
Pa Dani, Walter, Arif, Anton, Ai, Arin, Cia, Cici, Mbak Lassih, Dian, Furi,
Nofi, Neli, Roma, Mawi, Misnen, Okti, Prima, Peni, Ria, Susi, Umi,
Karlina, Asep, Vina, Vitri, Nila, Pak Arifin atas kebersamaannya selama
perkuliahan.
8.
Teman-teman Mayor AGH dan PBT 2007, 2008, 2009 dan 2010 atas
kebersamaannya.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu
pengetahuan dan ilmu pertanian.
Bogor, Juli 2011
Cornalia Meinarti
11
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Sintang pada tanggal 18 Mei 1978 dari ayah Ignasius
Slamet dan ibu Maria Magdalena Ukis. Penulis merupakan putri ke dua dari
empat bersaudara. Tahun 1996 penulis lulus dari SMA Negeri 2 Sintang dan pada
tahun yang sama penulis melanjutkan studi pada program Strata I Ilmu Tanah
Fakultas Pertanian UPN “Veteran” Jogjakarta. Penulis bekerja sebagai staf
Tanaman Pangan pada Dinas Pertanian Kabupaten Sintang sejak tahun 2003
sampai sekarang.
Penulis berkesempatan melanjutkan pendidikan Program Magister Sains
pada Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Sekolah Pascasarjana IPB
pada tahun 2008 dengan memperoleh bantuan Beasiswa Tugas Belajar dari
Pemerintah Daerah Kabupaten Sintang Kalimantan Barat.
12
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ........................................................................................... xiv
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xvi
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xviii
PENDAHULUAN ..........................................................................................
Latar Belakang .......................................................................................
Tujuan ....................................................................................................
Kerangka Pemikiran ..............................................................................
1
1
2
3
TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................
Klasifikasi Nenas ...................................................................................
Daerah Penyebaran Nenas .....................................................................
Karakter Vegetatif .................................................................................
Karakter Generatif dan Pembungaan .....................................................
Pemuliaan Tanaman Nenas ....................................................................
Penanda Morfologi ................................................................................
Penanda Molekuler ................................................................................
4
4
6
6
8
9
10
11
METODOLOGI ..............................................................................................
Waktu dan Tempat .................................................................................
Bahan dan Alat .......................................................................................
Metode Penelitian ..................................................................................
Analisis Data .........................................................................................
13
13
14
16
19
HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................
Analisis Penanda Morfologi ..................................................................
Analisis Penanda Molekuler ..................................................................
Analisis Penanda Gabungan ..................................................................
21
21
30
33
SIMPULAN .................................................................................................... 36
Simpulan ................................................................................................ 36
Saran ...................................................................................................... 36
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 37
LAMPIRAN .................................................................................................... 40
13
DAFTAR TABEL
Halaman
1.
Jenis dan asal bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian .......... 14
2.
Nama dan susunan basa primer koleksi PKBT-IPB ............................... 19
3.
Rekapitulasi karakter polimorfik penanda morfologi nenas................... 23
4.
Pengelompokan 32 aksesi nenas berdasarkan dendrogram ................... 26
5.
Nilai analisis komponen utama pada karakter morfologi ....................... 28
6.
Pengelompokan 53 aksesi nenas berdasarkan dendrogram .................... 30
7.
Rekapitulasi jumlah amplifikasi pita DNA Ananas comosus 32
aksesi pada 10 primer ............................................................................. 31
8.
Pengelompokan 32 aksesi nenas berdasarkan dendrogram karakter
molekuler …………….. ......................................................................... 33
9.
Nilai analisis komponen utama pada karakter molekuler ....................... 33
10.
Rekapitulasi jumlah karakter dan pita hasil analisis gabungan .............. 34
11.
Pengelompokan 32 aksesi nenas berdasarkan dendrogram karakter
molekuler ............................................................................................... 35
14
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
Bagan alir penelitian studi analisis keragaman nenas koleksi PKBT
berdasarkan penanda morfologi dan penanda RAPD ............................. 3
2.
Hasil pengamatan morfologi karakter kedudukan daun (1), warna
daun tua (2), distribusi duri (3), warna buah matang (4), warna
daging buah (5), dan bentuk mahkota 6) pada C-SMDU (A), CBNHYU (B), SC-NAD (C), SC-PRBA (D), SC-SMUT3 (E), C-PAK
(F), QC-P5/12 (H), C-FLPN (I) dan C-DSBG (J).) ............................... 22
3.
Perbedaan karakter morfologi lebar daun atas, tengah dan bawah
pada aksesi Q-KTM-2 (A) dengan Q-KTM1 (B) di koefisen
kemiripan 0.95 ........................................................................................ 25
4.
Perbedaan karakter morfologi kedudukan daun, warna buah ketika
masak dan warna daging buah pada C-SMUT2( A) dengan QC-P14
(B) di koefisien kemiripan 0.57 .............................................................. 25
5.
Dendrogram karakter morfologi berdasarkan analisis (SAHN)UPGMA pada 116 karakter dengan r = 0.80271 . .................................. 26
6.
Dendrogram karakter morfologi 53 aksesi berdasarkan analisis
(SAHN)-UPGMA pada 100 karakter dengan r = 0.81392. .................... 29
7.
Karakter pola pita DNA Ananas comosus 32 asesi pada primer SBH
13. ........................................................................................................... 31
8.
Dendrogram karakter molekuler berdasarkan analisis (SAHN)UPGMA pada 10 primer dengan r = 0.87144. ....................................... 32
9.
Dendrogram
gabungan karakter morfologi dan molekuler
berdasarkan analisis (SAHN)-UPGMA pada 150 karakter dengan r =
0.75761…………………... .................................................................... 34
15
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1.
Standar pengamatan deskripsi morfologi nenas (IBPGR 1991) ............ 40
2.
Data biner dari karakter fenotipik pada 32 aksesi ................................. 44
3.
Data biner pola pita DNA dari 10 primer pada 32 aksesi ...................... 48
4.
Matriks kemiripan fenotipik (KF) antar 32 aksesi ................................ 51
5.
Matriks kemiripan genetik (KG) antar 32 aksesi ................................... 52
6.
Matriks kemiripan data gabungan antar 32 aksesi ................................. 53
7.
Bahan Tanaman 21 aksesi penelitian Apriyani (2005) .......................... 54
8.
Matriks kemiripan morfologi antar 53 aksesi ......................................... 55
16
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Nenas (Ananas comosus (L) Merr) di Indonesia merupakan salah satu
tanaman buah tropika penting ketiga setelah pisang dan jeruk (BPS 2010).
Produksi nenas di Indonesia pada tahun 2009 sebesar 1.558.196 ton (BPS 2010),
sedangkan Thailand dan Philipina masing-masing mencapai 2.705.000 ton dan
1.833.000 ton (FAOSTAT, 2007). Peningkatan produktivitas dan kualitas dapat
dilakukan melalui intensifikasi, ekstensifikasi dan pemuliaan tanaman. Nenas
memiliki nilai ekonomi yang tinggi dan merupakan komoditas hortikultura yang
mempunyai manfaat ganda, baik dikonsumsi dalam bentuk segar maupun sebagai
bahan olahan (Medina & Garcia 2005). Standar pasar untuk konsumsi buah segar
yaitu : (1) daun tidak berduri, (2) warna kulit buah/luar kuning-hijau, (3) warna
daging buah kuning, (4) total padatan terlarut 12.8-13.7 obrix dan (5) rasio
gula/asam 1.31-2.11. Standar buah untuk nenas kalengan yaitu : tangkai buah
kuat, bentuk buah silindris, mata buah datar dan dangkal, permukaan buah keras,
empulur dan serat kurang, serta mempunyai kandungan gula dan asam tertentu
dan aroma menarik serta buah tidak berbiji (Py et al. 1987; Broertjes dan Harten
1988; Verheij dan Coronel 1992; Leal dan Coppens 1996).
Kualitas buah segar Indonesia belum memenuhi standar kualitas buah
segar yang diinginkan oleh pasar. Peningkatan kualitas dan mutu buah segar dapat
diperoleh melalui proses pemuliaan tanaman. Keragaman genetik diperlukan
dalam proses pemuliaan tanaman dan dapat diperoleh melalui karakterisasi
morfologi dan molekuler.
Penggunaan karakter morfologi relatif lebih mudah dilakukan dalam
karakterisasi tetapi karakter tersebut kurang akurat karena adanya sebagian
karakter tanaman yang di pengaruhi oleh lingkungan. Selain itu, biasanya
memiliki tingkat keragaman atau polimorfisme yang rendah (Asideu et al. 1989)
karena itu diperlukan penanda selain morfologi yaitu penanda molekuler.
17
Penanda molekuler yang tepat mampu menganalisa secara pasti tingkat
keragaman genetik karena konsisten dan tidak dipengaruhi oleh lingkungan (Brar
2002). Salah satu penanda molekuler adalah RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA). Dibandingkan dengan teknik molekuler yang lain, RAPD
merupakan teknik yang lebih cepat dan mudah dilakukan karena tidak perlu
diketahui sekuen DNA sebelumnya dan material tanaman yang dibutuhkan lebih
sedikit.
Pusat Kajian Buah-buahan Tropika (PKBT) memiliki koleksi aksesi nenas
sebanyak 137 aksesi, sebagian sudah dilakukan karakterisasi. Apriyani (2005)
melakukan analisa keragaman genetik 22 aksesi, yang terdiri dari 20 koleksi
dalam negeri dan 2 aksesi dari Pantai Gading. Pemanfaatan yang lebih optimal,
dilakukan dengan karakterisasi terutama pada 32 aksesi yang potensial memiliki
sifat unggul.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk :
1. Menganalisis dan mengevaluasi keragaman aksesi nenas berdasarkan
penanda morfologi dan genetik
2. Mengetahui keragaman genetik aksesi nenas berdasarkan penanda
morfologi dan penanda RAPD Nenas koleksi Pusat Kajian Buah-buahan
Tropika (PKBT)
18
Kerangka Pemikiran
PKBT memiliki koleksi nenas yang sangat bermanfaat untuk perakitan
varietas unggul akan tetapi belum semuanya dapat dikarakterisasi, dengan
demikian manfaat dari koleksi tersebut menjadi belum maksimal, karena itu perlu
dilakukan karakterisasi bagi aksesi yang belum dikarakterisasi. Karakterisasi perlu
mencakup karakter morfologi serta molekuler, karena keduanya mempunyai
manfaat yang saling menunjang baik dari sisi aplikasi maupun cakupan
keragamannya. Alur kerangka pemikiran penelitian sebagai berikut :
Koleksi Nenas
PKBT
Pemanfaatan
belum
maksimal
Penanda
Morfologi
Penanda
Molekuler (RAPD)
Isolasi DNA
Fase Vegetatif
Daun
Anaka
n
Fase Generatif
Buah
Uji Kualitas dan
Kuantitas DNA
Gel Agarose
Analisis Data
Informasi Keragaman
Genetik bagi
Pemuliaan tanaman
Amplifikasi PCR
Analisis Data
Gambar 1. Bagan alir penelitian studi analisis keragaman nenas koleksi PKBT
berdasarkan penanda morfologi dan penanda RAPD
19
TINJAUAN PUSTAKA
Klasifikasi Nenas
Nenas (Ananas comosus (L). Merr) termasuk ke dalam kingdom Plantae,
divisi Spermatophyta, kelas Angiospermae, sub-kelas Monocotyldonae, ordo
Farinosae, family Bromeliaceace, genus Ananas dan spesies Ananas comusus.
Kerabat dekat spesies nenas cukup banyak, terutama nenas liar yang biasa
dijadikan tanaman hias, misalnya A. braceteatus (Lindl) Schultes, A. fritzmuelleri,
Aerectifolius L.B. Smith, dan A. anenassoides (Bak) L.B. Smith.
Nenas memiliki banyak kultivar dan berdasarkan warna daging buahnya
dikelompokkan menjadi tiga golongan yaitu : (1). Golongan tanaman yang daging
buahnya berwarna putih, kultivar penting yang termasuk golongan ini adalah
kultivar Red Spanish. Kultivar ini banyak diusahakan di Cuba, Puerto Rico dan
Malaysia. Bobot buah rata-rata 0.94 – 1.4 kg, umumnya untuk industri kalengan.;
(2). Golongan tanaman nenas
dengan daging buah berwarna kuning emas,
kultivar penting pada golongan ini adalah adalah kultivar Queen, termasuk
kultivar Abaka, Natal Queen, Palembang, Cabezona dan Eleuthera. Bobot buah
kultivar Natal Queen rata-rata 0.4 – 0.9 kg dan sampai 1.6 kg. Kultivar Cabezona
bobot buah rata-rata 7 kg, sebagian besar kultivar tersebut dikonsumsi dalam
bentuk buah segar dan sebagian lagi dikalengkan.; ( 3 ) Golongan tanaman nenas
dengan daging buah berwarna berwarna kuning muda, kultivar penting yang
termasuk golongan ini adalah Smooth Cayenne, merupakan kultivar nenas paling
penting di dunia, banyak diusahakan di Hawai. Bobot buah rata-rata 2.3-3.6 kg
(Dinas Pertanian Tanaman Pangan Bengkulu 1994).
Berdasarkan karakteristik daun dan buahnya nenas (Ananas comosus (L).
Merr) dapat dibedakan menjadi lima group yaitu: (1) Spanish (daun pendek
berduri tajam, buah lonjong mirip kerucut), (2) Queen (daun pendek berduri
tajam, buah lonjong mirip kerucut), (3) Abacci (daun panjang berduri kasar, buah
silindris atau seperti piramida), (4) Cayene (daun halus, tidak berduri, buah besar),
dan (5) Maipure (Nakasone dan Paull 1990), dan yang paling banyak ditanam
adalah Cayenne. Kultivar nenas yang banyak ditanam di Indonesia adalah
20
golongan Cayenne yang dikenal dengan nama lokal nanas
(Subang), nanas
minyak (Bogor) sedangkan untuk kultivar Queen dikenal dengan nama lokal
seperti nanas Bogor, Palembang, Pemalang dan Blitar. Golongan Spanish
dikembangkan di kepulauan India Barat, Puerte Rico, Mexico dan Malaysia.
Golongan Abacaxi banyak ditanam di Brazilia.
Spanish bobot buah 0.9 – 1.8 kg, bentuk buah membulat, mata buah
menonjol, warna kulit buah orange atau merah, warna daging buah kuning pucat
sampai putih, hati (core) besar, berserat dan asam. Kultivar yang termasuk dalam
Spanish yaitu : Red Spanish, Singapore Spanish, Green Selangor, Castilla, PRI67 dan Cabezona. Red Spanish banyak di budidayakan di Amerika Tanah dan
Amerika Selatan dan Singapore Spanish hanya dibudidayakan di Malaysia (Wee
dan Thongtham 1992).
Nenas kelompok Queen mempunyai ukuran tanaman, daun dan buahnya
lebih kecil daripada Cayenne. Pinggir daun berduri, bobot buah sekitar 0.5 – 1.1
kg, bentuk buah konikal, mata buah menonjol, warna kulit buah kuning, warna
daging buah kuning tua, hati (core) kecil, rasanya manis, kandungan asam rendah.
Kultivar yang yang termasuk jenis ini adalah Queen, Mac Gregor, Natal, Ripley
dan Alexandria. Collins (1960) menyatakan bahwa warna kulit dan daging buah
ketika matang berwarna kuning keemasan. Panjang tangkai buah sekitar 7 – 12
cm, ukuran mata buah lebih kecil, renyah dan memiliki aroma yang lebih baik.
Abacaxi banyak ditanam di Brazilia untuk keperluan lokal. Tanamannya
berdiri tegak. Panjang daun berkisar antara 60 – 65 cm pada bagian daun berduri.
Tangkai buah kaku dengan panjang sekitar 40 cm. Buah berbentuk seperti
piramida, berat kurang lebih 1.5 kg. Kultivar yang termasuk jenis ini yaitu
Abacaxi, Abaka, Sugar Loaf, Venezolara, Amarella, dan Papelon (Collins 1968).
Cayenne mempunyai pinggir daun yang tidak berduri, bobot buahnya
berkisar antara 2.3 – 2.5 kg, bentuk buah silinder, mata buah datar, warna kulit
buah orange, warna daging buah kuning pucat sampai kuning hati (core) sedang,
rasa manis, kandungan serat sedikit, juicy. Kultivar yang termasuk Cayenne
yaitu Smoth Cayenne, Cayenne Lisse, Smooth Guatemalan Typhone, St Michael
dan Esmeralda. Nenas jenis Cayenne ini paling banyak ditanam di Filipina,
Thailand, Hawaii, Kenya, Meksiko dan Taiwan (Wee dan Thongtham, 1992).
21
Varietas nenas yang banyak ditanam di Indonesia adalah golongan Cayenne dan
Queen. Dewasa ini ragam kultivar nenas yang dikategorikan unggul adalah nenas
Bogor, Subang dan Palembang.
Maipure mempunyai bobot buah sekitar 0.8 – 2.5 kg, berbentuk silinder,
warna daging buah putih atau kuning tua, hati kecil sampai medium, rasanya lebih
manis daripada Cayene, berserat, sangat juicy, kurang cocok untuk pengalengan.
Maipure, Rondon, Perolera, Monte Lirio dan Lebrija termasuk kultivar jenis ini.
Jenis ini banyak dibudidayakan di Amerika Selatan dan Tengah sebagai buah
segar untuk pasaran lokal (Prosea 1997).
Daerah Penyebaran Nenas
Nenas berasal dari Brasilia (Amerika Selatan) yang telah di domestikasi
disana sebelum kedatangan Colombus. Pada abad ke-16 orang Spanyol membawa
nenas ini ke Filipina dan Semenanjung Malaysia, masuk ke Indonesia pada abad
ke-15 (1599). Di Indonesia pada mulanya hanya sebagai tanaman pekarangan, dan
meluas dikebunkan di lahan kering (tegalan) di seluruh wilayah nusantara. Nenas
tersebar hampir di seluruh provinsi dan dibudidayakan terutama di daerah dataran
rendah. Sentra produksi nenas di Indonesia meliputi: Sumatera Utara, Riau,
Sumatera Selatan, Lampung, Jawa Barat, Jawa Tengah, Jawa Timur, Kalimantan
Barat, Kalimantan Tengah dan Kalimantan Timur.
Karakter Vegetatif
Nenas termasuk tanaman herbaceous dari kelas monokotil yang bersifat
perennial. Nenas dewasa dapat mencapai ketinggian ketinggian 100 - 200 cm,
dengan diameter tajuk 100 - 200 cm tergantung dari varietas tanamannya. Struktur
utama morfologi dibedakan menjadi batang, daun, tangkai buah, buah majemuk
atau sinkarp, mahkota, tunas dan akar (Coppens dan Leal 2001).
Batang nenas memiliki panjang antara 20 – 25 cm dengan diameter
bagian bawahnya 2 – 3.5 cm dan semakin ke atas diameter batang semakin besar
yaitu 5.5 – 6.5 cm serta bagian puncaknya mengalami mengecil. Batang nenas
terdiri dari ruas – ruas yang panjangnya bervariasi dari 1 – 10 cm (Collins 1960).
Buku nenas dapat dilihat melalui daun yang dekat batang, menghasilkan tunas
22
ketiak setiap buku. Tunas ketiak ini dapat menghasilkan tunas dasar buah atau
tunas anakan (Verheij dan Coronel 1997; Nakasone dan Paull 1998).
Daun merupakan bagian yang melekat pada bagian batang yang berada di
bagian atas permukaan tanah, pada tangkai dan pada batang mahkota. Rata-rata
jumlah daun yang berfungsi dan aktif berkisar antara 70-80 helai dan berbentuk
pedang, panjangnya dapat mencapai 1 m atau lebih, lebarnya 5-8 cm,
pinggirannya berduri atau hampir rata dan berujung lancip. Daun di bagian bawah
merupakan daun tua dan ukurannya pendek, di bagian tengah tanaman ukuran
daun paling panjang dan daun bagian atas umumnya muda dan ukurannya pendek,
sehingga tanaman seakan-akan berbetuk hati. Warna daun nenas sebelah atas ada
hijau mengkilap, hijau tua, merah tua bergaris coklat kemerahan, tergantung dari
varietasnya, sedang permukaan daun bagian bawah berwarna putih seperti perak.
Berdasarkan pengamatan anatomi terdapat jaringan penyimpanan air
(water storage tissue) yang terdiri dari sel-sel yang tidak berwarna, berbentuk
tiang dan terletak di bawah jaringan hypodermal bagian atas dan meluas ke bawah
sampai mesofil. Jaringan penyimpanan air dapat mencapai setengah dari tebalnya
daun. Pada musim kering, tanaman nenas akan menggunakan air dalam jaringan
tersebut (Collins 1968). Stomata terdapat pada permukaan daun bagian bawah.
Jumlah stomata lebih kurang 70-85/mm2. Stomata ini tertutup sepanjang siang
untuk menghemat penggunaan air. Mekanisme menutupnya stomata pada nenas
ini disebabkan nenas termasuk mempunyai jalur fotosintesis tipe CAM
(Crassulacean Acid Metabolism). Karbondioksida diserap pada malam hari dan
diubah menjadi asam yang digunakan dalam sintesis karbohidrat pada siang hari.
Jalur fotosintesis memungkinkan stomata tertutup sepanjang siang untuk
menghemat menghemat penggunaan air.
Nenas berdasarkan keberadaan duri pada daun dibagi tiga kelompok
yaitu : (1) berduri di ujung daun, (2) berduri pada seluruh tepi daun dan (3) tidak
berduri sama sekali, daunnya menggulung seperti pipa (“pipping”) (Collins 1968;
Verheij dan Coronel 1997; Samson 1980).
Nenas
mempunyai tangkai buah yang berkembang dari perpanjangan
meristem apikal yang kemudian berdiferensiasi dan membentuk buah. Pada saat
terbentuk buah, beberapa tunas ketiak pada batang tumbuh menjadi tunas batang.
23
Tunas batang yang telah mencapai panjang 30-35 cm dapat dipotong dan
digunakan untuk bibit. Tangkai buah yang merupakan perpanangan dari batang
adalah tempat melekatnya bunga atau buah. Pada tangkai buah, di bawah buah,
terdapat sejumlah daun yang pendek dan sempit. Jumlah dan besarnya tunas dasar
buah tergantung pada sifat keturunan tanaman nenas dan kesuburan tanah.
Panjangnya dapat mencapai 26 cm dengan bobot antara 285-425 gram (Coppens
dan Leal 2001; Verheij dan Coronel 1997; Nakasone dan Paull 1998).
Mahkota
merupakan kelanjutan dari sel – sel meristem pada batang.
Pertumbuhannya sejalan dengan perkembangan buah dan ketika buah matang
mahkota menjadi dorman. Rangkaian bunga dan buah tanaman nenas terdapat
pada meristem apikal batang. Pertumbuhan mahkota berlangsung selama buah
berkembang menjadi besar. Setelah buah masak, mahkota dapat ditanam sebagai
bibit tanaman. Pada ujung mahkota terdapat meristem pembentuk daun.
Peningkatan pertumbuhan mahkota kira-kira 30-45 hari setelah pertumbuhan buah
dimulai (Collins 1968; Nakasone dan Paull 1998).
Nenas mempunyai perakaran yang dangkal dan terbatas walaupun ditanam
pada media yang paling baik. Kedalaman perakarannya tidak lebih dari 50 cm
(Samson 1980). Berdasarkan cara terbentuknya perakaran nenas dikelompokkan
menjadi akar primer, akar sekunder dan akar adventif. Akar prmer berasal dari biji
sebagai akar tunggang. Pada pertumbuhan bibit selanjutnya akar ini hilang dan
berganti dengan akar adventif. Pada akar adventif selanjutnya bercabang menjadi
akar sekunder yang dapat berupa rambut akar, epidermis, exodermis, korteks
bagian luar dan dalam, endodermis, perisikel, floem, xylem dan sel-sel empulur.
Tanaman nenas hanya mempunyai sistem perakaran serabut yang sebarannya kea
rah horizontal dan vertikal mencapai radius 50 cm (Collins 1968; Samson 1980;
Nakasone dan Paull 1998).
Karakter Generatif dan Pembungaan
Karakter generatif yaitu dari meristem ujung terbentuk tangkai buah dan
bunga. Bunga nenas muncul sebanyak 50-200 bunga pada setiap individu ditandai
dengan berubahnya dasar pangkal buah menjadi merah (Okimoto 1984; Leal dan
Coppens 1996). Bunga nenas termasuk bunga majemuk, mekar sebanyak 5
24
sampai 10 bunga setiap hari (Samson 1980). Masing-masing bunga memiliki satu
daun pelindung (braktea) yang lancip, mempunyai 3 helai daun kelopak, pendek
dan berdaging terdapat 3 helai daun mahkota, membentuk tabung yang
mengelilingi 6 lembar benangsari dan satu lembar tangkai putik yang sempit
berisi kepala putik yang bercabang tiga (Verheij dan Cronel 1997). Masa reseptif
dan anthesis hampir bersamaan, bervariasi pada setiap kultivar mulai satu minggu
sampai dua bulan setelah inisiasi bunga, akan tetapi persilangan sendiri tidak
terjadi karena adanya self-incompatibilitas karena terhambatnya pertumbuhan
tabung polen pada stilus (Kerns et al. 1932; Leal dan Coppens 1996).
Buah nenas termasuk buah senokarp (cenocarfium) yang terbentuk dari
penebalan yang luar biasa dari poros pembungaan dan dari peleburan masingmasing bunga yang kecil, kulit buahnya yang keras terbentuk dari kelopakkelopak dan braktea yang tidak rontok. Berat buah meningkat sekitar 20 kali lipat
dari pembungaan sampai maksimum. Studi perkembangan buah menunjukkan
bahwa berat buah dan komponen-komponen buah lainnya meningkat berupa
sigmoid. Buah normal berisi buah kecil yang tersusun dalam deretan ke kiri dan
ke kanan secara teratur. Dalam deretan yang memutar ke kiri terdapat 8 deretan
dan deretan ke kanan terdapat 13 deretan. Sejak munculnya bunga sampai saat
buah masak diperlukan waktu kurang lebih lima sampai enam bulan (Coppens dan
Leal 2003; Collins 1968; Verheij dan Coronel 1997; Nakasone dan Paull 1998).
Pemuliaan Tanaman Nenas
Tujuan pemuliaan seleksi tanaman nenas berbeda-beda di setiap tempat,
tetapi biasanya menekankan pada reisistensi terhadap hama dan penyakit
(Coppens dan d’eeckenbrugge 1996). Saat ini, pengembangan kultivar untuk
konsumsi buah segar telah menjadi perhatian utama. Populasi yang diperoleh dari
persilangan untuk memungkinkan diseleksi tipe-tipe yang lebih baik.
Dalam
seleksi ini melibatkan sifat-sifat yang jelek dan mutasi dan yang diseleksi tipe
superior. Mutasi tetap terjadi pada klon-klon terpilih, pengaruh seleksi tidak
permanen dan tanpa seleksi lebih lanjut, klon-klon komersil di lapang dapat
kembali ke kondisi seperti populasi yang sebelum diseleksi (Nakasone dan Paull
1998).
25
Kegiatan hibridisasi nenas pertama kali dikerjakan dan mengambil tempat
di Florida sebagai usaha untuk menghasilkan kultivar yang adaptif pada kondisi
lokal sehingga bisa bersaing dengan nenas impor dari India Barat untuk pasar
nenas segar. Pemuliaan nenas dalam skala besar diselenggarakan dari tahun 1914
sampai tahun 1972 oleh Pineapple Growers Association of Hawaii (PGAH) di
kebun percobaan Pineapple Research Institute (PRI) dibawah pimpinan K. Kern
dan J.L Collins. Program ini sangat lengkap dan meliputi studi biologi bunga
(sitologi, sitogenetik, self incompatibility), pengembangan uji resistensi hama dan
penyakit, pewarisan karakter yang diseleksi, prospek plasma nutfah dan evaluasi.
Hasilnya menjadi dasar yang diwajibkan dalam pengetahuan genetika nenas saat
ini (Leal dan Coppens 1996).
Penanda Morfologi
Secara tradisional, identifikasi tanaman dan analisis hubungan keragaman
antar tanaman dilakukan secara kombinasi menggunakan penanda morfologi, sifat
agronomi atau analisis biokimia (Hadiati et al. 2002). Identifikasi tanaman dan
analisis hubungan kekerabatan antar tanaman dilakukan secara kombinasi
mengunakan penanda morfologi, sifat agronomi atau analisis biokimia seperti
isozim (Waugh 1997). Analisis keragaman morfologi dilakukan dengan
menggunakan data hasil pengamatan atau pengukuran karakter morfologi tertentu
(Falconer 1970). Kelemahan analisis keragaman genetik menggunakan penanda
morfologi adalah sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan, memperlihatkan
penurunan sifat dominan – resesif, dan memiliki tingkat keragaman atau
polimorfisme yang rendah (Asiedu et al. 1989; Tanksley dan Bernatsky 1989).
Penanda morfologi adalah suatu penanda yang berdasarkan bentuk –
bentuk organ tanaman yang mudah diamati. Penanda morfologi yang digunakan
adalah deskripsi taksonomi karena lebih mudah, lebih cepat, sederhana dan lebih
murah.
Penanda
morfologi
dipergunakan
sebagai
cara
cepat
untuk
mengidentifikasi varietas dan diharapkan dapat digunakan untuk menilai
kekerabatan.
26
Penanda Molekuler
Beberapa metode analisis DNA untuk studi keragaman genetik antara
lain : 1) Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), 2)
Amplified Polymorphic DNA
(RAPD), 3) Amplified Fragment
Random
Length
Polymorpism (AFLP) dan 4) Simple Sequence Repeat (SSR).
Teknik analisis RAPD
mempunyai banyak kelebihan dibandingkan
dengan penanda DNA lainnya yaitu antara lain: 1) penanda RAPD lebih murah, 2)
regenerasi cepat, 3) membutuhkan DNA lebih sedikit, 4) tidak menggunakan
radio isotop. Selain itu penanda RAPD dapat dihasilkan tanpa perlu diketahui
latar belakang genomnya. Disamping itu, pada analisis RAPD dapat diperoleh
hasil yang cepat, tidak membutuhkan informasi urutan primer serta primer yang
acak yang dipakai dan dapat digunakan untuk analisis genom semua jenis
organisme (Williams et al. 1991).
Metode RAPD ini menggunakan satu primer acak. Primer tersebut akan
berpasangan dengan utas tunggal DNA genom yang satu dan pada utas DNA
pasangannya dengan orientasi yang berlawanan. Selama situs penempelan primer
masih berada dalam jarak yang masih dapat diamplifikasi, maka akan diperoleh
produk DNA amplifikasi. Semakin pendek fragmen yang akan diamplifikasi
semakin efisien amplifikasinya (Tingey et al. 1992; Darmono 1996; Weising et al.
1995).
Analisis keragaman genetik menggunakan RAPD telah digunakan pada
tanaman nenas. Hasil analisis keragaman genetik 22 aksesi nenas koleksi PKBT
IPB menunjukkan bahwa dari 4 primer yang digunakan diperoleh total pita
polimorfik sebanyak 23 dari 29 total pita secara keseluruhan dan menghasilkan
dendrogram dengan koefisien kemiripan berkisar antara 0.62-1.00 (Apriyani
2005). Selanjutnya Nasution (2008) dengan menggunakan analisis RAPD telah
berhasil mengevaluasi jarak genetik dan pola hubungan 30 genotipe nenas hasil
persilangan antara tetua ”Smooth Cayenne” dan “Queen” dimana hasil uji
koefisien kemiripan menunjukkan rentang 0.38-0.81. Berdasarkan hasil analisis
gerombol berhasil memisahkan menjadi dua kelompok utama pada koefisien
kemiripan 0.61. Hadiati dan Sukmajaya (2002) memperoleh empat kelompok
kekerabatan dari 30 aksesi nenas yang dianalisis berdasarkan penanda isozim pada
27
derajat kemiripan 0.63. Duval et al. (2001) dengan menggunakan RFLP berhasil
membuktikan bahwa Ananas comosus dengan spesies lainnya, seperti
Pseudananas sagenarius mempunyai polimorfisme yang tinggi yaitu 58.7%,
sedangkan Ananas lucidus, Ananas ananassoides
dan Ananas parguazensis
relative homogen. Popluechai et al. (2007) berhasil
mengelompokkan tiga
kelompok kultivar nenas di Thailand melalui penanda RAPD dengan koefisien
kemiripan 0.64 hingga 0.96. Metode RAPD merupakan salah satu metode yang
akhir-akhir ini banyak digunakan dalam analisis keragaman genetik tanaman,
karena relatif lebih cepat dan lebih mudah.
28
METODOLOGI
Tempat dan Waktu
Percobaan ini terdiri dari dua tahapan, tahap pertama adalah penelitian
analisis keragaman karakter fenotipik tanaman
yang telah ditanam di kebun
koleksi IPB Pasir Kuda Ciomas. Tahapan kedua, yaitu pelaksanaan analisis
molekuler yang dilakukan di Laboratorium Molekuler Pusat Kajian Buah Tropika
(PKBT) Kampus IPB Baranangsiang. Penelitian dilaksanakan pada bulan April
sampai dengan Oktober 2010.
Bahan dan Alat
Karakterisasi tanaman pada penelitian ini dilakukan pada 32 asesi nenas
hasil koleksi Kebun Percobaan Institut Pertanian Bogor Pasir Kuda Ciomas,
merupkan hasil eksplorasi beberapa daerah di Indonesia seperti Kalimatan
Selatan, Kalimantan Timur, Manado, Lampung, Papua (Pak-Pak Barat),
Lampung, Jawa Barat, Sumatera Utara, Riau, Nangroe Aceh Darussalam, Filipina,
Jepang, Wonosobo dan koleksi PKBT (Tabel 1).
Bahan kimia yang digunakan antara lain : CTAB, NaCl, Mercaptoetanol,
Tris HCl, air bebas ion, pasir kuarsa, polyvynylpyrolidone (PVP), Chloroform
isoamylalkohol (CIAA 24:1), isopropanol, alkohol absolut 70%, loading dye,
agarose, buffer TAE 1x, primer RAPD (10 primer), PCR mix, tube 1.5 ml, tube
0.2 ul, tip putih, tip kuning, tip biru, ethidium bromide. Peralatan yang digunakan
adalah water bath, mortar, gunting, mikropipet, tube rak, vortex, sentrifuge, UV
spektrofotometer, Polymerase Chain Reaction (PCR) merk Applied Biosystem
2720, elektroforesis (Mupid), UV transiluminator dan kamera digital.
29
Tabel 1. Jenis dan Asal bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian
No.
KODE
KELOMPOK
LOKASI
LAPANGAN
AKSESI
ASAL
KODE
1
SC-KAS
KSPMSC
SMOOTH CAYENNE
KALIMANTAN SELATAN
2
C-SMUT
SUPMSC
SMOOTH CAYENNE
SUMATERA UTARA
3
Q-MNDO
QUEEN
MANADO
4
C-PAK
MANADO
PAK-PAK
BARAT
CAYENNE
PAPUA
5
Q-KTM1
Q-KAL-TIM 1
QUEEN
KALIMANTAN TIMUR
6
Q-KTM2
Q-KALTIM 2
QUEEN
KALIMANTAN TIMUR
7
C-LMPG1
SLLLC-1
CAYENNE
LAMPUNG
8
C-LMPG3
SLLLC-3
CAYENNE
LAMPUNG
9
Q-BLI
Q-BALI
QUEEN
BALI
10
QC-V49
V.49
QUEEN X CAYENNE
KOLEKSI PKBT
11
C-BNHYU
BUNIHAYU
CAYENNE
SUBANG
12
C-SMUT2
NBSI
CAYENNE
SUMATERA UTARA
13
C-SMDU
SIMADU
CAYENNE
SUBANG
14
C-FLPN
LNFSC
SMOOTH CAYENNE
FILIPINA
15
Q-RIAU
SRPLQH
QUEEN
RIAU
16
QC-AZRI
AZURI
QUEEN X CAYENNE
KOLEKSI PKBT
17
SC-NAD
SNADLS
SMOOTH CAYENNE
NANGROE ACEH DARUSSALAM
18
SC-PRBA
JBPHSC
SMOOTH CAYENNE
PURBALINGGA
19
C-RNIS
ARNIS
CAYENNE
MEKARSARI
20
QC-P14
P.14
QUENN X CAYENNE
KOLEKSI PKBT
21
QC-P5/12
P.5/12
QUEEN X CAYENNE
KOLEKSI PKBT
22
QC-P18
P.18
QUEEN X CAYENNE
KOLEKSI PKBT
23
QC-P10
P.10
QUEEN X CAYENNE
KOLEKSI PKBT
24
SC-SMDG
SMDGSC
SMOOTH CAYENNE
SUMEDANG
25
QH-BBEL
BBBMQH
QUEEN HIJAU
BANGKA BELITUNG
26
SC-JPG
LNJSC
SMOOTH CAYENNE
JEPANG
27
SC-SMUT3
SSUBSC
SMOOTH CAYENNE
SUMATERA UTARA
28
Q.OGIL
Q.OG-IL
QUEEN
OGAN KOMERING ILIR
29
QC-III
III/1/31
QUEEN X CAYENNE
KOLEKSI PKBT
30
SC-WNSBO
JTWHSC
SMOOTH CAYENNE
WONOSOBO
31
CNN
CNN
CAYENNE
KOLEKSI PKBT
32
C-DSBG
D.SUBANG
CAYENNE
SUBANG
Metode Penelitian
Penanda Morfologi Tanaman
Penelitian terdiri atas dua bagian, yaitu pengamatan fenotipik di lapang dan
pengamatan genotipik di laboratorium. Pengamatan fenotipik dilakukan dengan
mengamati penampilan morfologi tanaman dan pengamatan genotipik melalui
analisis pola pita DNA dengan menggunakan teknik RAPD.
30
Standar
pengamatan
deskripsi
morfologi
nenas
yang
digunakan
berdasarkan IBPGR (1991). Adapun peubah yang diamati adalah:
a) Pengamatan fase vegetatif tanaman meliputi :
1. Tinggi tanaman (cm), diukur dari pangkal batang terbawah/bagian
permukaan tanah sampai pucuk daun teratas setelah semua daun
ditelungkupkan dan diukur pada saat panen
2. Total jumlah daun (helai), diukur total keseluruhan daun yang ada
(termasuk yang layu). Total jumlah daun diukur/dihitung pada saat panen.
3. Panjang daun (cm), diukur mulai dari batang, tempat daun keluar sampai
ujung daun dari daun terpanjang atau daun nomer 7, diukur pada saat
panen.
4. Lebar daun (cm), diukur pada bagian permukaan daun terlebar dari daun
terpanjang atau daun nomor 7 dan diukur pada saat panen.
5. Diameter tajuk, diukur panjang bukaan daun, diukur pada saat panen.
6. Jumlah duri per 10 cm, dihitung jumlah duri yang ada pada daun nenas
setiap 10 cm pada sisi kanan dan kiri. Kemudian jumlah duri dari kedua
sisi daun tersebut diratakan. Jumlah duri diukur pada saat panen.
7. Warna daun, menentukan warna daun bagian atas dan bagian bawah pada
daun yang masih muda, daun yang tua/layu dan menjelang panen dengan
menggunakan colour chart.
8. Letak duri, dilihat letak duri yang ada pada daun nenas dimana
digolongkan menjadi 3 bagian yaitu ujung, tengah dan pangkal, diukur
pada saat panen.
9. Jumlah anakan (suckers), menghitung jumlah anakan yang muncul dari
permukaan tanah, diukur pada saat panen.
10. Jumlah tunas dasar buah (slips), menghitung jumlah tunas yang muncul
dari dasar buah dan diukur pada saat panen.
31
b) Pengamatan fase generatif buah yang dilakukan pada saat panen / masak
fisiologis meliputi :
1. Warna buah, diamati dalam dua tahap yaitu saat buah muda (sebelum
panen) dan saat buah matang (setelah panen). Pengukuran dilakukan
dengan menggunakan colour chart
2. Bobot mahkota (g), diukur dengan menimbang mahkota yang terdapat
pada ujung buah.
3. Bobot buah (g), diukur dengan menimbang buah tanpa mahkota dan tanpa
batang buah
4. Bobot total / bobot buah dengan mahkota (g), diukur dengan menimbang
buah tanpa membuang mahkotanya.
5. Jumlah daun mahkota (helai), menghitung semua jumlah daun yang ada di
mahkota
6. Panjang buah (cm), mengukur panjang buah dari pangkal sampai ujung
dengan menggunakan jangka sorong atau penggaris
7. Tinggi mahkota (cm), mengukur tinggi mahkota dari pangkal mahkota
sampai ujung setelah daun mahkota ditelungkupkan.
8. Diameter buah (cm), diukur dengan cara membelah buah secara vertical
kemudian diukur diameternya dari sisi yang telah dibelah. Pengukuran
diameter di lakukan dibagian ujung, tengah dan pangkal. Pengukuran
dengan menggunakan jangka sorong atau penggaris.
9. Diameter hati/core (cm), mengukur dengan cara membelah buah secara
vertikal, kemudian diukur poros tengah diantara daging buah. Pengukuran
dengan menggunakan jangka sorong atau penggaris.
10. Diameter kedalaman mata (cm), mengukur kedalaman mata dari buah
nenas dengan membelah buah secara horizontal, kemudian pengukuran
dilakukan di tiga mata tunas. Pengukuran dengan menggunakan jangka
sorong.
11. Panjang pedunkel (cm), diukur dari pangkal buah bertumpu
12. Total padatan terlarut (0Brix), mengukur dengan cara mengambil dan
menghaluskan bagian buah, kemudian mengukur cairan buah setelah
menyaringnya dengan kertas saring menggunakan hand refractometer
32
13. pH buah nenas,
14. Lingkar mahkota (cm), diukur lingkaran mahkota buah
15. Jumlah mata buah, diukur dengan cara menghitung berapa banyak jumlah
mata buah yang ada
16. Total asam (%), diukur dengan menggunakan daging buah yang telah
dihancurkan sebanyak 20 g dan memasukkannya ke dalam labu takar 200
ml dan menambahkan air destilata sampai tanda tera kemudian melakukan
penyaringan. Filtrat hasil penyaringan selanjutnya diambil sebanyak 25 ml
(fp = 200/25) dan selanjutnya menambahkan indikator Phenolphetalein
(PP) sebanyak 3 tetes lalu menitrasinya dengan larutan NaOH 0.1 N
sampai membentuk warna merah muda yang stabil.
17. Panjang empulur (cm) diukur dengan cara membelah buah secara vertikal
dan mengukur panjang empulur/hati buah dari bagian atas sampai bagian
bawah buah.
Penanda Molekuler RAPD
Isolasi DNA
Metode yang digunakan untuk CTAB Doyle dan Doyle (1987) yang
sudah dimodifikasi (Drabkoba et al. 2002). Sampel daun dari masing-masing
bahan tanaman dihancurkan dengan menggunakan mortar yang di dalamnya
ditambahkan buffer ekstrak, kemudian diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65
0
C selama 20 menit. Setelah inkubasi, ditambahkan larutan kloroform isoamyl
alkohol/CIAA (24:1) sebanyak 1 kali volume kemudian divortex selama 1 menit
hingga larutan tercampur.
Sampel disentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit
dengan tujuan untuk memisahkan bagian DNA dan bahan-bahan lainnya.
Supernatan dimasukan ke dalam tabung baru dan ditambahkan CIAA kembali
sebanyak 1x volume dan disentrifuse kembali. Supernatan ditambahkan
isopropanol sebanyak 1x volume. Larutan DNA tersebut disentrifuse kembali dan
larutan di buang hingga pelet DNA tertinggal diujung tube, kemudian
ditambahkan akohol 70% sebanyak 100 µl dan disentrifuse kembali. Alkohol
dibuang dan pelet DNA dikeringkan dengan cara tube dibalik disimpan dalam
33
desikator sampai pelet DNA mengering. Pelet DNA yang kering ditambahkan air
bebas ion sebanyak 10 µl dan dijadikan sebagai stok DNA.
Uji kualitas dan kuantitas DNA dengan gel agarose
Uji kualitas DNA total dilakukan dengan menggunakan larutan agarose
0.8% dan dielektroforesis dalam larutan buffer TAE 1x yang dialirkan arus listrik
dari muatan negatif menuju muatan positif selama selama 50 menit pada 50 volt.
Konsentrasi DNA total dapat diperkirakan berdasarkan hasil elektroforesis yaitu
dengan cara membandingkan DNA total dengan lamda DNA. Lamda DNA yang
digunakan produk merk promega. Lamda yang digunakan untuk mengecek
konsentrasi DNA total dibutuhkan sebanyak 1µl dan diisikan pada lubang sumur
pertama pada agarose. Konsentrasi Lamda DNA dalam 1 ul adalah 457 µg/ml.
Volume DNA total untuk tes kualitas DNA digunakan sebanyak 5 µl, sehingga
untuk setiap 1 µl DNA setara dengan 91.4 ng/µl. Kebutuhan DNA untuk tahapan
PCR sebanyak 10 ng, maka DNA total diencerkan konsentrasinya menjadi 5x.
Pewarnaan dengan cara perendaman gel agarose di dalam larutan pewarna DNA
EtBr 1% selama 10 menit, kemudian didokumentasikan dengan menggunakan
kamera digital pada penyinaran uv transilluminator. Elektroforesis ditujukan
untuk pengecekan kualitas DNA total dan produk PCR.
Amplifikasi DNA dengan PCR
Amplifikasi DNA nenas dilakukan menurut metode Williams et al. (1990).
Reaksi amplifikasi dilakukan dengan microtube volume 0.5 nl yang berisi 25 µl
campuran larutan yang terdiri atas : 12.5 µl Go tag mix, 10.5 µl air bebas ion (ion
free) , 1 µl primer acak dan 1 µl DNA. Volume akhir campuran reaksi amplifikasi
adalah 26 µl. Selanjutnya tube tersebut dimasukkan ke dalam blok mesin PCR
(Applied Biosystem Thermal Cycler version 2.00), yang diprogramkan dengan
tahapan sebagai berikut :
Tahap I Pre-PCR
: 940C selama 4 menit sebanyak 1 siklus
Tahap II PCR
: Denaturasi 940C selama 30 detik, annealing (penempelan
primer) pada suhu 360C selama 1 menit; dan extention
(perpanjangan) pada suhu 720C selama 1 menit sebanyak
40 siklus
34
Tahap III Post PCR
: Perpanjangan akhir pada suhu 720C selama 5 menit
sebanyak satu siklus
Hasil dari amplifikasi ini dapat dilihat dengan elektroforesis. Primer yang
digunakan untuk amplifikasi DNA adalah primer yang sudah diuji melalui tahap
optimasi suhu di Laboratorium Pusat Kajian Buah Tropika (Tabel 2).
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tabel 2. Nama dan susunan basa primer koleksi PKBT-IPB
Nama
Susunan Basa
Suhu
Primer
Annealing
SBH 06
AC GC AT CG CA
360C
SBH 07
CT GC AT CG TG
360C
SBH 08
GA AA CA CG CC
360C
SBH 12
AC GC GC AT GT
360C
SBH 13
GA CG CC AC AC
360C
SBH 18
GA AT CG GC CA
360C
SBH 19
CT GA CC AG CC
360C
SBN 03
GG TA CT CC CC
360C
SBN 13
AG CG TC AC TC
360C
OPE 07
AG AT GC AG CC
360C
Analisis Data
Data hasil pengamatan morfologi dan molekular dianalisis dengan
menggunakan program NTSYSpc (Numerical Taxonomy and Multivariate
Analysis) versi 2.0 (Rohlf 1998). Hasil pengamatan morfologi, diberi nilai skor 0
apabila karakter morfologi tidak dimiliki oleh individu dan nilai skor 1 apabila
individu memiliki karakter sesuai pengamatan. Pengamatan pola pita hasil
elektroforesis ditujukan pada tingkat migrasi yang sama yaitu bernilai skor 0
apabila tidak terbentuk pita dan skor 1 apabila terdapat pita.
Koefisien kemiripan berdasarkan penanda morfologi, molekular dan data
gabungan dianalisis berdasarkan metode Simple Matching Coeficient (SM)
melalui SIMQUAL (Similarity for Qualitative Data) pada program NTSYSpc
versi 2.0. Tingkat keselarasan koefisien kesamaan ant
NENAS (Ananas comosus (L). Merr) BERDASARKAN
PENANDA MORFOLOGI DAN PENANDA RAPD
CORNALIA MEINARTI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASINYA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Analisis Keragaman Genetik
Nenas (Ananas comosus (L). Merr) Berdasarkan Penanda Morfologi dan Penanda
RAPD adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Juli 2011
Cornalia Meinarti
NIM A.253080161
ABSTRACT
CORNALIA MEINARTI. Genetic Variability Analysis of Pineapple (Ananas
comosus (L). Merr) Based on Morphological and Moleculer Marker (RAPD)
under direction of SOBIR, EDI SANTOSA and AGUS PURWITO.
In order to reveal the phylogenetic relationship among genotypes of pineapple in
PKBT collection, 32 accessions were analyzed using morphological markers with
116 distinguishing characteristics and RAPD markers with 10 primers that formed
50 profiles of DNA bands with 47 polymorphic bands and 3 bands monomorphic.
Cluster analysis results on 32 accessions using morphological markers revealed
three groups with the cut at the level of similarity of 0.63, whereas at 53
accessions formed three groups with the level of similarity of 0.50. RAPD formed
3 groups with diverse levels of 0.66 and a marker combined data formed three
groups with the cut at the level of similiarity of 0.61. The result of alignment
analysis showed that morphological markers on 32 accessions have the
appropriate r value of 0.80271 whereas at 53 accessions obtained the appropriate
value 0.81392. whereas RAPD has the appropriate value of r 0.87144 and the
combined data had a value of r less appropriate is 0.75761.
Keywords : morphological, pineapple accessions, RAPD markers.
RINGKASAN
CORNALIA MEINARTI. Analisis Keragaman Genetik Nenas (Ananas comosus
(L). Merr) Berdasarkan Penanda Morfologi dan Penanda RAPD. Dibimbing oleh
SOBIR, EDI SANTOSA dan AGUS PURWITO.
Keragaman genetik nenas pada kebun koleksi PKBT dapat diungkap
melalui analisis morfologi dan molekuler. Penanda yang dapat digunakan untuk
mengetahui keragaman genetik nenas adalah RAPD ( Random Amplified
Polymorphic DNA). RAPD merupakan teknik yang lebih cepat dan mudah
dilakukan karena tidak perlu diketahui sekuen DNA sebelumnya dan material
tanaman yang dibutuhkan lebih sedikit. Penelitian ini bertujuan menganalisis dan
mengevaluasi keragaman aksesi nenas berdasarkan penanda morfologi dan
genetik serta mengetahui keragaman genetik nenas berdasarkan penanda
morfologi dan penanda RAPD koleksi Pusat Kajian Buah-buahan Tropika
(PKBT)
Keragaman morfologi dapat diamati pada penanda morfologi sebanyak 31
karakter meliputi organ : (1) daun yaitu 15 karakter, (2) buah yaitu 16 karakter
dan diperoleh 116 karakter pembeda. Hasil analisis pengelompokan diperoleh
sebanyak 3 kelompok pada tingkat kemiripan 0.62 yaitu (1) grup A meliputi
C-KAS, SC-JPG, C-LMPG1, C-LMPG3, SC-SMDG, Q-KTM1, Q-KTM2, QOGIL, Q-RIAU, QH-BBEL, Q-BLI, QC-P18, QC-AZRI, QC-V49, C-RNIS, QCP5/12, CNN, C-SMUT2, QC-P10, SC-WNSBO, C-FLPN, QC-III, QC-P14 (2)
grup B meliputi C-SMUT, C-BNHYU, SC-NAD, C-SMDU, SC-SMUT3, SC-PRBA
dan (3) grup C meliputi C-MNDO, C-PAK, SC-DSBG.
Analisis molekuler terhadap 32 aksesi menghasilkan 50 pita yaitu 47 pita
polimorfik (98%) dan pita monomorfik sebanyak 3 pita (2%). Hasil analisis
pengelompokan skor pita DNA dengan menggunakan program NTSYS, diperoleh
3 grup pada koefisien kemiripan 0.66 yaitu (1) grup A meliputi C-KAS, C-SMUT,
C-PAK, QC-V49, Q-KTM2, C-LMPG3, C-SMUT2, C-SMDU, Q-RIAU, QC-AZRI,
C-BNHYU, C-FLPN, Q-KTM1, Q-BLI, Q-MNDO, C-LMPG1, QC-P14, (2) grup
B meliputi QC-P5/12, QC-P10, QC-III, C-DSBG, SC-SMUT3,QC-P18, Q-OGIL,
SC-NAD, SC-PRBA, C-RNIS, SC-SMDG, SC-WNSBO, SC-JPG dan (3) grup 3
meliputi CNN.
Penggabungan data penanda morfologi dan penanda molekuler
memberikan informasi secara fenotipik dan genotipik. Karakter yang digunakan
adalah penggabungan 31 karakter morfologi dan 10 primer yang menghasilkan 50
pita, sehingga total gabungan karakter adalah 81. Hasil analisis dengan
menggunakan program NTSYS pada koefisien kemiripan 0.61, diperoleh
dendrogram membentuk 3 grup, yaitu (1) grup A meliputi C-KAS, C-SMUT, CPAK, C-BNHYU, C-SMDU, C-FLPN, QC-III, C-DSBG, Q-KTM1, Q-KTM2, CLMPG3, C-SMUT2, Q-RIAU, Q-BLI, QC-V49, QC-AZRI, C-LMPG1, C-RNIS,
QH-BBEL, Q-OGIL, QC-P18, QC-P10, QC-P5/12, CNN, SC-SMDG, SC-JPG,
SC-WNSBO, QC-P14 (2) grup B meliputi Q-MNDO, SC-NAD, SC-PRBA dan (3)
grup D meliputi SC-SMUT.
Kata kunci : aksesi nenas, morfologi, penanda RAPD.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2011
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk
kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan
laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah dan pengutipan
tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK
NENAS (Ananas comosus (L). Merr) BERDASARKAN
PENANDA MORFOLOGI DAN PENANDA RAPD
CORNALIA MEINARTI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. M. Syukur, SP. MSi
Judul Tesis : Analisis Keragaman Genetik Nenas (Ananas comosus (L). Merr)
Berdasarkan Penanda Morfologi dan Penanda RAPD
Nama
: Cornalia Meinarti
NIM
: A.253080161
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Edi Santosa, SP., MSi
Anggota
Dr. Ir. Sobir, MSi
Ketua
Dr. Ir. Agus Purwito, MSc.Agr
Anggota
Diketahui
Ketua Mayor
Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman
Dr. Ir. Trikoesoemaningtyas, MSc
Tanggal Ujian : 27 Juni 2011
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc.Agr
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema
penelitian adalah Analisis Keragaman Genetik Nenas (Ananas comosus (L).
Merr ) Berdasarkan Penanda Morfologi dan Penanda RAPD yang dilaksanakan
sejak bulan April sampai dengan Oktober 2010.
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis
sampaikan kepada :
1.
Dr. Ir. Sobir, MSi, Dr. Edi Santosa, SP., MSi dan Dr. Ir Agus Purwito,
MSc.Agr selaku komisi pembimbing yang telah memberikan arahan dan
bimbingan sejak perencanaan, pelaksanaan penelitian sampai penyelesaian
penyusunan tesis.
2.
Dr. Ir. Trikoesoemaningtyas, MSc selaku Ketua Mayor Pemuliaan dan
Bioteknologi Tanaman SPs IPB dan Dr. Ir. Darda Efendi, MS selaku
Sekretaris Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman SPs IPB.
3.
Pemerintah Daerah Kabupaten Sintang yang telah memberikan bantuan
dana melalui Program Bantuan Beasiswa Tugas Belajar.
4.
Pusat Kajian Buah Tropika LPPM IPB, yang telah mendanai penelitian ini.
5.
Ayahnda Ignasius Slamet dan Ibunda Maria Magdalena Ukis untuk segala
cinta,
kasih
sayang
dan
kesabaran
yang
tidak
berujung
untuk
menyekolahkan saya, bang heru dan kak lily, mas anton, adik-adiku (Joni,
Erick, Merry) terima kasih untuk dukungannya baik moril maupun materil,
juga keponakan tercinta (evan, dek dian, arlen dan adun) yang selalu
memberi semangat.
6.
Ir. Ellina Mansyah, MP., Ir. Kasutjianingati, MSi. Ir. Arifah, MSi., Rd.
Selvy Handayani, SP, Dede Safitri, Sulaeman, Baesuni, Pak Ence dan Imas
atas dukungannya.
7.
Pa Dani, Walter, Arif, Anton, Ai, Arin, Cia, Cici, Mbak Lassih, Dian, Furi,
Nofi, Neli, Roma, Mawi, Misnen, Okti, Prima, Peni, Ria, Susi, Umi,
Karlina, Asep, Vina, Vitri, Nila, Pak Arifin atas kebersamaannya selama
perkuliahan.
8.
Teman-teman Mayor AGH dan PBT 2007, 2008, 2009 dan 2010 atas
kebersamaannya.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu
pengetahuan dan ilmu pertanian.
Bogor, Juli 2011
Cornalia Meinarti
11
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Sintang pada tanggal 18 Mei 1978 dari ayah Ignasius
Slamet dan ibu Maria Magdalena Ukis. Penulis merupakan putri ke dua dari
empat bersaudara. Tahun 1996 penulis lulus dari SMA Negeri 2 Sintang dan pada
tahun yang sama penulis melanjutkan studi pada program Strata I Ilmu Tanah
Fakultas Pertanian UPN “Veteran” Jogjakarta. Penulis bekerja sebagai staf
Tanaman Pangan pada Dinas Pertanian Kabupaten Sintang sejak tahun 2003
sampai sekarang.
Penulis berkesempatan melanjutkan pendidikan Program Magister Sains
pada Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Sekolah Pascasarjana IPB
pada tahun 2008 dengan memperoleh bantuan Beasiswa Tugas Belajar dari
Pemerintah Daerah Kabupaten Sintang Kalimantan Barat.
12
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ........................................................................................... xiv
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xvi
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xviii
PENDAHULUAN ..........................................................................................
Latar Belakang .......................................................................................
Tujuan ....................................................................................................
Kerangka Pemikiran ..............................................................................
1
1
2
3
TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................
Klasifikasi Nenas ...................................................................................
Daerah Penyebaran Nenas .....................................................................
Karakter Vegetatif .................................................................................
Karakter Generatif dan Pembungaan .....................................................
Pemuliaan Tanaman Nenas ....................................................................
Penanda Morfologi ................................................................................
Penanda Molekuler ................................................................................
4
4
6
6
8
9
10
11
METODOLOGI ..............................................................................................
Waktu dan Tempat .................................................................................
Bahan dan Alat .......................................................................................
Metode Penelitian ..................................................................................
Analisis Data .........................................................................................
13
13
14
16
19
HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................
Analisis Penanda Morfologi ..................................................................
Analisis Penanda Molekuler ..................................................................
Analisis Penanda Gabungan ..................................................................
21
21
30
33
SIMPULAN .................................................................................................... 36
Simpulan ................................................................................................ 36
Saran ...................................................................................................... 36
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 37
LAMPIRAN .................................................................................................... 40
13
DAFTAR TABEL
Halaman
1.
Jenis dan asal bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian .......... 14
2.
Nama dan susunan basa primer koleksi PKBT-IPB ............................... 19
3.
Rekapitulasi karakter polimorfik penanda morfologi nenas................... 23
4.
Pengelompokan 32 aksesi nenas berdasarkan dendrogram ................... 26
5.
Nilai analisis komponen utama pada karakter morfologi ....................... 28
6.
Pengelompokan 53 aksesi nenas berdasarkan dendrogram .................... 30
7.
Rekapitulasi jumlah amplifikasi pita DNA Ananas comosus 32
aksesi pada 10 primer ............................................................................. 31
8.
Pengelompokan 32 aksesi nenas berdasarkan dendrogram karakter
molekuler …………….. ......................................................................... 33
9.
Nilai analisis komponen utama pada karakter molekuler ....................... 33
10.
Rekapitulasi jumlah karakter dan pita hasil analisis gabungan .............. 34
11.
Pengelompokan 32 aksesi nenas berdasarkan dendrogram karakter
molekuler ............................................................................................... 35
14
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
Bagan alir penelitian studi analisis keragaman nenas koleksi PKBT
berdasarkan penanda morfologi dan penanda RAPD ............................. 3
2.
Hasil pengamatan morfologi karakter kedudukan daun (1), warna
daun tua (2), distribusi duri (3), warna buah matang (4), warna
daging buah (5), dan bentuk mahkota 6) pada C-SMDU (A), CBNHYU (B), SC-NAD (C), SC-PRBA (D), SC-SMUT3 (E), C-PAK
(F), QC-P5/12 (H), C-FLPN (I) dan C-DSBG (J).) ............................... 22
3.
Perbedaan karakter morfologi lebar daun atas, tengah dan bawah
pada aksesi Q-KTM-2 (A) dengan Q-KTM1 (B) di koefisen
kemiripan 0.95 ........................................................................................ 25
4.
Perbedaan karakter morfologi kedudukan daun, warna buah ketika
masak dan warna daging buah pada C-SMUT2( A) dengan QC-P14
(B) di koefisien kemiripan 0.57 .............................................................. 25
5.
Dendrogram karakter morfologi berdasarkan analisis (SAHN)UPGMA pada 116 karakter dengan r = 0.80271 . .................................. 26
6.
Dendrogram karakter morfologi 53 aksesi berdasarkan analisis
(SAHN)-UPGMA pada 100 karakter dengan r = 0.81392. .................... 29
7.
Karakter pola pita DNA Ananas comosus 32 asesi pada primer SBH
13. ........................................................................................................... 31
8.
Dendrogram karakter molekuler berdasarkan analisis (SAHN)UPGMA pada 10 primer dengan r = 0.87144. ....................................... 32
9.
Dendrogram
gabungan karakter morfologi dan molekuler
berdasarkan analisis (SAHN)-UPGMA pada 150 karakter dengan r =
0.75761…………………... .................................................................... 34
15
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1.
Standar pengamatan deskripsi morfologi nenas (IBPGR 1991) ............ 40
2.
Data biner dari karakter fenotipik pada 32 aksesi ................................. 44
3.
Data biner pola pita DNA dari 10 primer pada 32 aksesi ...................... 48
4.
Matriks kemiripan fenotipik (KF) antar 32 aksesi ................................ 51
5.
Matriks kemiripan genetik (KG) antar 32 aksesi ................................... 52
6.
Matriks kemiripan data gabungan antar 32 aksesi ................................. 53
7.
Bahan Tanaman 21 aksesi penelitian Apriyani (2005) .......................... 54
8.
Matriks kemiripan morfologi antar 53 aksesi ......................................... 55
16
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Nenas (Ananas comosus (L) Merr) di Indonesia merupakan salah satu
tanaman buah tropika penting ketiga setelah pisang dan jeruk (BPS 2010).
Produksi nenas di Indonesia pada tahun 2009 sebesar 1.558.196 ton (BPS 2010),
sedangkan Thailand dan Philipina masing-masing mencapai 2.705.000 ton dan
1.833.000 ton (FAOSTAT, 2007). Peningkatan produktivitas dan kualitas dapat
dilakukan melalui intensifikasi, ekstensifikasi dan pemuliaan tanaman. Nenas
memiliki nilai ekonomi yang tinggi dan merupakan komoditas hortikultura yang
mempunyai manfaat ganda, baik dikonsumsi dalam bentuk segar maupun sebagai
bahan olahan (Medina & Garcia 2005). Standar pasar untuk konsumsi buah segar
yaitu : (1) daun tidak berduri, (2) warna kulit buah/luar kuning-hijau, (3) warna
daging buah kuning, (4) total padatan terlarut 12.8-13.7 obrix dan (5) rasio
gula/asam 1.31-2.11. Standar buah untuk nenas kalengan yaitu : tangkai buah
kuat, bentuk buah silindris, mata buah datar dan dangkal, permukaan buah keras,
empulur dan serat kurang, serta mempunyai kandungan gula dan asam tertentu
dan aroma menarik serta buah tidak berbiji (Py et al. 1987; Broertjes dan Harten
1988; Verheij dan Coronel 1992; Leal dan Coppens 1996).
Kualitas buah segar Indonesia belum memenuhi standar kualitas buah
segar yang diinginkan oleh pasar. Peningkatan kualitas dan mutu buah segar dapat
diperoleh melalui proses pemuliaan tanaman. Keragaman genetik diperlukan
dalam proses pemuliaan tanaman dan dapat diperoleh melalui karakterisasi
morfologi dan molekuler.
Penggunaan karakter morfologi relatif lebih mudah dilakukan dalam
karakterisasi tetapi karakter tersebut kurang akurat karena adanya sebagian
karakter tanaman yang di pengaruhi oleh lingkungan. Selain itu, biasanya
memiliki tingkat keragaman atau polimorfisme yang rendah (Asideu et al. 1989)
karena itu diperlukan penanda selain morfologi yaitu penanda molekuler.
17
Penanda molekuler yang tepat mampu menganalisa secara pasti tingkat
keragaman genetik karena konsisten dan tidak dipengaruhi oleh lingkungan (Brar
2002). Salah satu penanda molekuler adalah RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA). Dibandingkan dengan teknik molekuler yang lain, RAPD
merupakan teknik yang lebih cepat dan mudah dilakukan karena tidak perlu
diketahui sekuen DNA sebelumnya dan material tanaman yang dibutuhkan lebih
sedikit.
Pusat Kajian Buah-buahan Tropika (PKBT) memiliki koleksi aksesi nenas
sebanyak 137 aksesi, sebagian sudah dilakukan karakterisasi. Apriyani (2005)
melakukan analisa keragaman genetik 22 aksesi, yang terdiri dari 20 koleksi
dalam negeri dan 2 aksesi dari Pantai Gading. Pemanfaatan yang lebih optimal,
dilakukan dengan karakterisasi terutama pada 32 aksesi yang potensial memiliki
sifat unggul.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk :
1. Menganalisis dan mengevaluasi keragaman aksesi nenas berdasarkan
penanda morfologi dan genetik
2. Mengetahui keragaman genetik aksesi nenas berdasarkan penanda
morfologi dan penanda RAPD Nenas koleksi Pusat Kajian Buah-buahan
Tropika (PKBT)
18
Kerangka Pemikiran
PKBT memiliki koleksi nenas yang sangat bermanfaat untuk perakitan
varietas unggul akan tetapi belum semuanya dapat dikarakterisasi, dengan
demikian manfaat dari koleksi tersebut menjadi belum maksimal, karena itu perlu
dilakukan karakterisasi bagi aksesi yang belum dikarakterisasi. Karakterisasi perlu
mencakup karakter morfologi serta molekuler, karena keduanya mempunyai
manfaat yang saling menunjang baik dari sisi aplikasi maupun cakupan
keragamannya. Alur kerangka pemikiran penelitian sebagai berikut :
Koleksi Nenas
PKBT
Pemanfaatan
belum
maksimal
Penanda
Morfologi
Penanda
Molekuler (RAPD)
Isolasi DNA
Fase Vegetatif
Daun
Anaka
n
Fase Generatif
Buah
Uji Kualitas dan
Kuantitas DNA
Gel Agarose
Analisis Data
Informasi Keragaman
Genetik bagi
Pemuliaan tanaman
Amplifikasi PCR
Analisis Data
Gambar 1. Bagan alir penelitian studi analisis keragaman nenas koleksi PKBT
berdasarkan penanda morfologi dan penanda RAPD
19
TINJAUAN PUSTAKA
Klasifikasi Nenas
Nenas (Ananas comosus (L). Merr) termasuk ke dalam kingdom Plantae,
divisi Spermatophyta, kelas Angiospermae, sub-kelas Monocotyldonae, ordo
Farinosae, family Bromeliaceace, genus Ananas dan spesies Ananas comusus.
Kerabat dekat spesies nenas cukup banyak, terutama nenas liar yang biasa
dijadikan tanaman hias, misalnya A. braceteatus (Lindl) Schultes, A. fritzmuelleri,
Aerectifolius L.B. Smith, dan A. anenassoides (Bak) L.B. Smith.
Nenas memiliki banyak kultivar dan berdasarkan warna daging buahnya
dikelompokkan menjadi tiga golongan yaitu : (1). Golongan tanaman yang daging
buahnya berwarna putih, kultivar penting yang termasuk golongan ini adalah
kultivar Red Spanish. Kultivar ini banyak diusahakan di Cuba, Puerto Rico dan
Malaysia. Bobot buah rata-rata 0.94 – 1.4 kg, umumnya untuk industri kalengan.;
(2). Golongan tanaman nenas
dengan daging buah berwarna kuning emas,
kultivar penting pada golongan ini adalah adalah kultivar Queen, termasuk
kultivar Abaka, Natal Queen, Palembang, Cabezona dan Eleuthera. Bobot buah
kultivar Natal Queen rata-rata 0.4 – 0.9 kg dan sampai 1.6 kg. Kultivar Cabezona
bobot buah rata-rata 7 kg, sebagian besar kultivar tersebut dikonsumsi dalam
bentuk buah segar dan sebagian lagi dikalengkan.; ( 3 ) Golongan tanaman nenas
dengan daging buah berwarna berwarna kuning muda, kultivar penting yang
termasuk golongan ini adalah Smooth Cayenne, merupakan kultivar nenas paling
penting di dunia, banyak diusahakan di Hawai. Bobot buah rata-rata 2.3-3.6 kg
(Dinas Pertanian Tanaman Pangan Bengkulu 1994).
Berdasarkan karakteristik daun dan buahnya nenas (Ananas comosus (L).
Merr) dapat dibedakan menjadi lima group yaitu: (1) Spanish (daun pendek
berduri tajam, buah lonjong mirip kerucut), (2) Queen (daun pendek berduri
tajam, buah lonjong mirip kerucut), (3) Abacci (daun panjang berduri kasar, buah
silindris atau seperti piramida), (4) Cayene (daun halus, tidak berduri, buah besar),
dan (5) Maipure (Nakasone dan Paull 1990), dan yang paling banyak ditanam
adalah Cayenne. Kultivar nenas yang banyak ditanam di Indonesia adalah
20
golongan Cayenne yang dikenal dengan nama lokal nanas
(Subang), nanas
minyak (Bogor) sedangkan untuk kultivar Queen dikenal dengan nama lokal
seperti nanas Bogor, Palembang, Pemalang dan Blitar. Golongan Spanish
dikembangkan di kepulauan India Barat, Puerte Rico, Mexico dan Malaysia.
Golongan Abacaxi banyak ditanam di Brazilia.
Spanish bobot buah 0.9 – 1.8 kg, bentuk buah membulat, mata buah
menonjol, warna kulit buah orange atau merah, warna daging buah kuning pucat
sampai putih, hati (core) besar, berserat dan asam. Kultivar yang termasuk dalam
Spanish yaitu : Red Spanish, Singapore Spanish, Green Selangor, Castilla, PRI67 dan Cabezona. Red Spanish banyak di budidayakan di Amerika Tanah dan
Amerika Selatan dan Singapore Spanish hanya dibudidayakan di Malaysia (Wee
dan Thongtham 1992).
Nenas kelompok Queen mempunyai ukuran tanaman, daun dan buahnya
lebih kecil daripada Cayenne. Pinggir daun berduri, bobot buah sekitar 0.5 – 1.1
kg, bentuk buah konikal, mata buah menonjol, warna kulit buah kuning, warna
daging buah kuning tua, hati (core) kecil, rasanya manis, kandungan asam rendah.
Kultivar yang yang termasuk jenis ini adalah Queen, Mac Gregor, Natal, Ripley
dan Alexandria. Collins (1960) menyatakan bahwa warna kulit dan daging buah
ketika matang berwarna kuning keemasan. Panjang tangkai buah sekitar 7 – 12
cm, ukuran mata buah lebih kecil, renyah dan memiliki aroma yang lebih baik.
Abacaxi banyak ditanam di Brazilia untuk keperluan lokal. Tanamannya
berdiri tegak. Panjang daun berkisar antara 60 – 65 cm pada bagian daun berduri.
Tangkai buah kaku dengan panjang sekitar 40 cm. Buah berbentuk seperti
piramida, berat kurang lebih 1.5 kg. Kultivar yang termasuk jenis ini yaitu
Abacaxi, Abaka, Sugar Loaf, Venezolara, Amarella, dan Papelon (Collins 1968).
Cayenne mempunyai pinggir daun yang tidak berduri, bobot buahnya
berkisar antara 2.3 – 2.5 kg, bentuk buah silinder, mata buah datar, warna kulit
buah orange, warna daging buah kuning pucat sampai kuning hati (core) sedang,
rasa manis, kandungan serat sedikit, juicy. Kultivar yang termasuk Cayenne
yaitu Smoth Cayenne, Cayenne Lisse, Smooth Guatemalan Typhone, St Michael
dan Esmeralda. Nenas jenis Cayenne ini paling banyak ditanam di Filipina,
Thailand, Hawaii, Kenya, Meksiko dan Taiwan (Wee dan Thongtham, 1992).
21
Varietas nenas yang banyak ditanam di Indonesia adalah golongan Cayenne dan
Queen. Dewasa ini ragam kultivar nenas yang dikategorikan unggul adalah nenas
Bogor, Subang dan Palembang.
Maipure mempunyai bobot buah sekitar 0.8 – 2.5 kg, berbentuk silinder,
warna daging buah putih atau kuning tua, hati kecil sampai medium, rasanya lebih
manis daripada Cayene, berserat, sangat juicy, kurang cocok untuk pengalengan.
Maipure, Rondon, Perolera, Monte Lirio dan Lebrija termasuk kultivar jenis ini.
Jenis ini banyak dibudidayakan di Amerika Selatan dan Tengah sebagai buah
segar untuk pasaran lokal (Prosea 1997).
Daerah Penyebaran Nenas
Nenas berasal dari Brasilia (Amerika Selatan) yang telah di domestikasi
disana sebelum kedatangan Colombus. Pada abad ke-16 orang Spanyol membawa
nenas ini ke Filipina dan Semenanjung Malaysia, masuk ke Indonesia pada abad
ke-15 (1599). Di Indonesia pada mulanya hanya sebagai tanaman pekarangan, dan
meluas dikebunkan di lahan kering (tegalan) di seluruh wilayah nusantara. Nenas
tersebar hampir di seluruh provinsi dan dibudidayakan terutama di daerah dataran
rendah. Sentra produksi nenas di Indonesia meliputi: Sumatera Utara, Riau,
Sumatera Selatan, Lampung, Jawa Barat, Jawa Tengah, Jawa Timur, Kalimantan
Barat, Kalimantan Tengah dan Kalimantan Timur.
Karakter Vegetatif
Nenas termasuk tanaman herbaceous dari kelas monokotil yang bersifat
perennial. Nenas dewasa dapat mencapai ketinggian ketinggian 100 - 200 cm,
dengan diameter tajuk 100 - 200 cm tergantung dari varietas tanamannya. Struktur
utama morfologi dibedakan menjadi batang, daun, tangkai buah, buah majemuk
atau sinkarp, mahkota, tunas dan akar (Coppens dan Leal 2001).
Batang nenas memiliki panjang antara 20 – 25 cm dengan diameter
bagian bawahnya 2 – 3.5 cm dan semakin ke atas diameter batang semakin besar
yaitu 5.5 – 6.5 cm serta bagian puncaknya mengalami mengecil. Batang nenas
terdiri dari ruas – ruas yang panjangnya bervariasi dari 1 – 10 cm (Collins 1960).
Buku nenas dapat dilihat melalui daun yang dekat batang, menghasilkan tunas
22
ketiak setiap buku. Tunas ketiak ini dapat menghasilkan tunas dasar buah atau
tunas anakan (Verheij dan Coronel 1997; Nakasone dan Paull 1998).
Daun merupakan bagian yang melekat pada bagian batang yang berada di
bagian atas permukaan tanah, pada tangkai dan pada batang mahkota. Rata-rata
jumlah daun yang berfungsi dan aktif berkisar antara 70-80 helai dan berbentuk
pedang, panjangnya dapat mencapai 1 m atau lebih, lebarnya 5-8 cm,
pinggirannya berduri atau hampir rata dan berujung lancip. Daun di bagian bawah
merupakan daun tua dan ukurannya pendek, di bagian tengah tanaman ukuran
daun paling panjang dan daun bagian atas umumnya muda dan ukurannya pendek,
sehingga tanaman seakan-akan berbetuk hati. Warna daun nenas sebelah atas ada
hijau mengkilap, hijau tua, merah tua bergaris coklat kemerahan, tergantung dari
varietasnya, sedang permukaan daun bagian bawah berwarna putih seperti perak.
Berdasarkan pengamatan anatomi terdapat jaringan penyimpanan air
(water storage tissue) yang terdiri dari sel-sel yang tidak berwarna, berbentuk
tiang dan terletak di bawah jaringan hypodermal bagian atas dan meluas ke bawah
sampai mesofil. Jaringan penyimpanan air dapat mencapai setengah dari tebalnya
daun. Pada musim kering, tanaman nenas akan menggunakan air dalam jaringan
tersebut (Collins 1968). Stomata terdapat pada permukaan daun bagian bawah.
Jumlah stomata lebih kurang 70-85/mm2. Stomata ini tertutup sepanjang siang
untuk menghemat penggunaan air. Mekanisme menutupnya stomata pada nenas
ini disebabkan nenas termasuk mempunyai jalur fotosintesis tipe CAM
(Crassulacean Acid Metabolism). Karbondioksida diserap pada malam hari dan
diubah menjadi asam yang digunakan dalam sintesis karbohidrat pada siang hari.
Jalur fotosintesis memungkinkan stomata tertutup sepanjang siang untuk
menghemat menghemat penggunaan air.
Nenas berdasarkan keberadaan duri pada daun dibagi tiga kelompok
yaitu : (1) berduri di ujung daun, (2) berduri pada seluruh tepi daun dan (3) tidak
berduri sama sekali, daunnya menggulung seperti pipa (“pipping”) (Collins 1968;
Verheij dan Coronel 1997; Samson 1980).
Nenas
mempunyai tangkai buah yang berkembang dari perpanjangan
meristem apikal yang kemudian berdiferensiasi dan membentuk buah. Pada saat
terbentuk buah, beberapa tunas ketiak pada batang tumbuh menjadi tunas batang.
23
Tunas batang yang telah mencapai panjang 30-35 cm dapat dipotong dan
digunakan untuk bibit. Tangkai buah yang merupakan perpanangan dari batang
adalah tempat melekatnya bunga atau buah. Pada tangkai buah, di bawah buah,
terdapat sejumlah daun yang pendek dan sempit. Jumlah dan besarnya tunas dasar
buah tergantung pada sifat keturunan tanaman nenas dan kesuburan tanah.
Panjangnya dapat mencapai 26 cm dengan bobot antara 285-425 gram (Coppens
dan Leal 2001; Verheij dan Coronel 1997; Nakasone dan Paull 1998).
Mahkota
merupakan kelanjutan dari sel – sel meristem pada batang.
Pertumbuhannya sejalan dengan perkembangan buah dan ketika buah matang
mahkota menjadi dorman. Rangkaian bunga dan buah tanaman nenas terdapat
pada meristem apikal batang. Pertumbuhan mahkota berlangsung selama buah
berkembang menjadi besar. Setelah buah masak, mahkota dapat ditanam sebagai
bibit tanaman. Pada ujung mahkota terdapat meristem pembentuk daun.
Peningkatan pertumbuhan mahkota kira-kira 30-45 hari setelah pertumbuhan buah
dimulai (Collins 1968; Nakasone dan Paull 1998).
Nenas mempunyai perakaran yang dangkal dan terbatas walaupun ditanam
pada media yang paling baik. Kedalaman perakarannya tidak lebih dari 50 cm
(Samson 1980). Berdasarkan cara terbentuknya perakaran nenas dikelompokkan
menjadi akar primer, akar sekunder dan akar adventif. Akar prmer berasal dari biji
sebagai akar tunggang. Pada pertumbuhan bibit selanjutnya akar ini hilang dan
berganti dengan akar adventif. Pada akar adventif selanjutnya bercabang menjadi
akar sekunder yang dapat berupa rambut akar, epidermis, exodermis, korteks
bagian luar dan dalam, endodermis, perisikel, floem, xylem dan sel-sel empulur.
Tanaman nenas hanya mempunyai sistem perakaran serabut yang sebarannya kea
rah horizontal dan vertikal mencapai radius 50 cm (Collins 1968; Samson 1980;
Nakasone dan Paull 1998).
Karakter Generatif dan Pembungaan
Karakter generatif yaitu dari meristem ujung terbentuk tangkai buah dan
bunga. Bunga nenas muncul sebanyak 50-200 bunga pada setiap individu ditandai
dengan berubahnya dasar pangkal buah menjadi merah (Okimoto 1984; Leal dan
Coppens 1996). Bunga nenas termasuk bunga majemuk, mekar sebanyak 5
24
sampai 10 bunga setiap hari (Samson 1980). Masing-masing bunga memiliki satu
daun pelindung (braktea) yang lancip, mempunyai 3 helai daun kelopak, pendek
dan berdaging terdapat 3 helai daun mahkota, membentuk tabung yang
mengelilingi 6 lembar benangsari dan satu lembar tangkai putik yang sempit
berisi kepala putik yang bercabang tiga (Verheij dan Cronel 1997). Masa reseptif
dan anthesis hampir bersamaan, bervariasi pada setiap kultivar mulai satu minggu
sampai dua bulan setelah inisiasi bunga, akan tetapi persilangan sendiri tidak
terjadi karena adanya self-incompatibilitas karena terhambatnya pertumbuhan
tabung polen pada stilus (Kerns et al. 1932; Leal dan Coppens 1996).
Buah nenas termasuk buah senokarp (cenocarfium) yang terbentuk dari
penebalan yang luar biasa dari poros pembungaan dan dari peleburan masingmasing bunga yang kecil, kulit buahnya yang keras terbentuk dari kelopakkelopak dan braktea yang tidak rontok. Berat buah meningkat sekitar 20 kali lipat
dari pembungaan sampai maksimum. Studi perkembangan buah menunjukkan
bahwa berat buah dan komponen-komponen buah lainnya meningkat berupa
sigmoid. Buah normal berisi buah kecil yang tersusun dalam deretan ke kiri dan
ke kanan secara teratur. Dalam deretan yang memutar ke kiri terdapat 8 deretan
dan deretan ke kanan terdapat 13 deretan. Sejak munculnya bunga sampai saat
buah masak diperlukan waktu kurang lebih lima sampai enam bulan (Coppens dan
Leal 2003; Collins 1968; Verheij dan Coronel 1997; Nakasone dan Paull 1998).
Pemuliaan Tanaman Nenas
Tujuan pemuliaan seleksi tanaman nenas berbeda-beda di setiap tempat,
tetapi biasanya menekankan pada reisistensi terhadap hama dan penyakit
(Coppens dan d’eeckenbrugge 1996). Saat ini, pengembangan kultivar untuk
konsumsi buah segar telah menjadi perhatian utama. Populasi yang diperoleh dari
persilangan untuk memungkinkan diseleksi tipe-tipe yang lebih baik.
Dalam
seleksi ini melibatkan sifat-sifat yang jelek dan mutasi dan yang diseleksi tipe
superior. Mutasi tetap terjadi pada klon-klon terpilih, pengaruh seleksi tidak
permanen dan tanpa seleksi lebih lanjut, klon-klon komersil di lapang dapat
kembali ke kondisi seperti populasi yang sebelum diseleksi (Nakasone dan Paull
1998).
25
Kegiatan hibridisasi nenas pertama kali dikerjakan dan mengambil tempat
di Florida sebagai usaha untuk menghasilkan kultivar yang adaptif pada kondisi
lokal sehingga bisa bersaing dengan nenas impor dari India Barat untuk pasar
nenas segar. Pemuliaan nenas dalam skala besar diselenggarakan dari tahun 1914
sampai tahun 1972 oleh Pineapple Growers Association of Hawaii (PGAH) di
kebun percobaan Pineapple Research Institute (PRI) dibawah pimpinan K. Kern
dan J.L Collins. Program ini sangat lengkap dan meliputi studi biologi bunga
(sitologi, sitogenetik, self incompatibility), pengembangan uji resistensi hama dan
penyakit, pewarisan karakter yang diseleksi, prospek plasma nutfah dan evaluasi.
Hasilnya menjadi dasar yang diwajibkan dalam pengetahuan genetika nenas saat
ini (Leal dan Coppens 1996).
Penanda Morfologi
Secara tradisional, identifikasi tanaman dan analisis hubungan keragaman
antar tanaman dilakukan secara kombinasi menggunakan penanda morfologi, sifat
agronomi atau analisis biokimia (Hadiati et al. 2002). Identifikasi tanaman dan
analisis hubungan kekerabatan antar tanaman dilakukan secara kombinasi
mengunakan penanda morfologi, sifat agronomi atau analisis biokimia seperti
isozim (Waugh 1997). Analisis keragaman morfologi dilakukan dengan
menggunakan data hasil pengamatan atau pengukuran karakter morfologi tertentu
(Falconer 1970). Kelemahan analisis keragaman genetik menggunakan penanda
morfologi adalah sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan, memperlihatkan
penurunan sifat dominan – resesif, dan memiliki tingkat keragaman atau
polimorfisme yang rendah (Asiedu et al. 1989; Tanksley dan Bernatsky 1989).
Penanda morfologi adalah suatu penanda yang berdasarkan bentuk –
bentuk organ tanaman yang mudah diamati. Penanda morfologi yang digunakan
adalah deskripsi taksonomi karena lebih mudah, lebih cepat, sederhana dan lebih
murah.
Penanda
morfologi
dipergunakan
sebagai
cara
cepat
untuk
mengidentifikasi varietas dan diharapkan dapat digunakan untuk menilai
kekerabatan.
26
Penanda Molekuler
Beberapa metode analisis DNA untuk studi keragaman genetik antara
lain : 1) Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), 2)
Amplified Polymorphic DNA
(RAPD), 3) Amplified Fragment
Random
Length
Polymorpism (AFLP) dan 4) Simple Sequence Repeat (SSR).
Teknik analisis RAPD
mempunyai banyak kelebihan dibandingkan
dengan penanda DNA lainnya yaitu antara lain: 1) penanda RAPD lebih murah, 2)
regenerasi cepat, 3) membutuhkan DNA lebih sedikit, 4) tidak menggunakan
radio isotop. Selain itu penanda RAPD dapat dihasilkan tanpa perlu diketahui
latar belakang genomnya. Disamping itu, pada analisis RAPD dapat diperoleh
hasil yang cepat, tidak membutuhkan informasi urutan primer serta primer yang
acak yang dipakai dan dapat digunakan untuk analisis genom semua jenis
organisme (Williams et al. 1991).
Metode RAPD ini menggunakan satu primer acak. Primer tersebut akan
berpasangan dengan utas tunggal DNA genom yang satu dan pada utas DNA
pasangannya dengan orientasi yang berlawanan. Selama situs penempelan primer
masih berada dalam jarak yang masih dapat diamplifikasi, maka akan diperoleh
produk DNA amplifikasi. Semakin pendek fragmen yang akan diamplifikasi
semakin efisien amplifikasinya (Tingey et al. 1992; Darmono 1996; Weising et al.
1995).
Analisis keragaman genetik menggunakan RAPD telah digunakan pada
tanaman nenas. Hasil analisis keragaman genetik 22 aksesi nenas koleksi PKBT
IPB menunjukkan bahwa dari 4 primer yang digunakan diperoleh total pita
polimorfik sebanyak 23 dari 29 total pita secara keseluruhan dan menghasilkan
dendrogram dengan koefisien kemiripan berkisar antara 0.62-1.00 (Apriyani
2005). Selanjutnya Nasution (2008) dengan menggunakan analisis RAPD telah
berhasil mengevaluasi jarak genetik dan pola hubungan 30 genotipe nenas hasil
persilangan antara tetua ”Smooth Cayenne” dan “Queen” dimana hasil uji
koefisien kemiripan menunjukkan rentang 0.38-0.81. Berdasarkan hasil analisis
gerombol berhasil memisahkan menjadi dua kelompok utama pada koefisien
kemiripan 0.61. Hadiati dan Sukmajaya (2002) memperoleh empat kelompok
kekerabatan dari 30 aksesi nenas yang dianalisis berdasarkan penanda isozim pada
27
derajat kemiripan 0.63. Duval et al. (2001) dengan menggunakan RFLP berhasil
membuktikan bahwa Ananas comosus dengan spesies lainnya, seperti
Pseudananas sagenarius mempunyai polimorfisme yang tinggi yaitu 58.7%,
sedangkan Ananas lucidus, Ananas ananassoides
dan Ananas parguazensis
relative homogen. Popluechai et al. (2007) berhasil
mengelompokkan tiga
kelompok kultivar nenas di Thailand melalui penanda RAPD dengan koefisien
kemiripan 0.64 hingga 0.96. Metode RAPD merupakan salah satu metode yang
akhir-akhir ini banyak digunakan dalam analisis keragaman genetik tanaman,
karena relatif lebih cepat dan lebih mudah.
28
METODOLOGI
Tempat dan Waktu
Percobaan ini terdiri dari dua tahapan, tahap pertama adalah penelitian
analisis keragaman karakter fenotipik tanaman
yang telah ditanam di kebun
koleksi IPB Pasir Kuda Ciomas. Tahapan kedua, yaitu pelaksanaan analisis
molekuler yang dilakukan di Laboratorium Molekuler Pusat Kajian Buah Tropika
(PKBT) Kampus IPB Baranangsiang. Penelitian dilaksanakan pada bulan April
sampai dengan Oktober 2010.
Bahan dan Alat
Karakterisasi tanaman pada penelitian ini dilakukan pada 32 asesi nenas
hasil koleksi Kebun Percobaan Institut Pertanian Bogor Pasir Kuda Ciomas,
merupkan hasil eksplorasi beberapa daerah di Indonesia seperti Kalimatan
Selatan, Kalimantan Timur, Manado, Lampung, Papua (Pak-Pak Barat),
Lampung, Jawa Barat, Sumatera Utara, Riau, Nangroe Aceh Darussalam, Filipina,
Jepang, Wonosobo dan koleksi PKBT (Tabel 1).
Bahan kimia yang digunakan antara lain : CTAB, NaCl, Mercaptoetanol,
Tris HCl, air bebas ion, pasir kuarsa, polyvynylpyrolidone (PVP), Chloroform
isoamylalkohol (CIAA 24:1), isopropanol, alkohol absolut 70%, loading dye,
agarose, buffer TAE 1x, primer RAPD (10 primer), PCR mix, tube 1.5 ml, tube
0.2 ul, tip putih, tip kuning, tip biru, ethidium bromide. Peralatan yang digunakan
adalah water bath, mortar, gunting, mikropipet, tube rak, vortex, sentrifuge, UV
spektrofotometer, Polymerase Chain Reaction (PCR) merk Applied Biosystem
2720, elektroforesis (Mupid), UV transiluminator dan kamera digital.
29
Tabel 1. Jenis dan Asal bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian
No.
KODE
KELOMPOK
LOKASI
LAPANGAN
AKSESI
ASAL
KODE
1
SC-KAS
KSPMSC
SMOOTH CAYENNE
KALIMANTAN SELATAN
2
C-SMUT
SUPMSC
SMOOTH CAYENNE
SUMATERA UTARA
3
Q-MNDO
QUEEN
MANADO
4
C-PAK
MANADO
PAK-PAK
BARAT
CAYENNE
PAPUA
5
Q-KTM1
Q-KAL-TIM 1
QUEEN
KALIMANTAN TIMUR
6
Q-KTM2
Q-KALTIM 2
QUEEN
KALIMANTAN TIMUR
7
C-LMPG1
SLLLC-1
CAYENNE
LAMPUNG
8
C-LMPG3
SLLLC-3
CAYENNE
LAMPUNG
9
Q-BLI
Q-BALI
QUEEN
BALI
10
QC-V49
V.49
QUEEN X CAYENNE
KOLEKSI PKBT
11
C-BNHYU
BUNIHAYU
CAYENNE
SUBANG
12
C-SMUT2
NBSI
CAYENNE
SUMATERA UTARA
13
C-SMDU
SIMADU
CAYENNE
SUBANG
14
C-FLPN
LNFSC
SMOOTH CAYENNE
FILIPINA
15
Q-RIAU
SRPLQH
QUEEN
RIAU
16
QC-AZRI
AZURI
QUEEN X CAYENNE
KOLEKSI PKBT
17
SC-NAD
SNADLS
SMOOTH CAYENNE
NANGROE ACEH DARUSSALAM
18
SC-PRBA
JBPHSC
SMOOTH CAYENNE
PURBALINGGA
19
C-RNIS
ARNIS
CAYENNE
MEKARSARI
20
QC-P14
P.14
QUENN X CAYENNE
KOLEKSI PKBT
21
QC-P5/12
P.5/12
QUEEN X CAYENNE
KOLEKSI PKBT
22
QC-P18
P.18
QUEEN X CAYENNE
KOLEKSI PKBT
23
QC-P10
P.10
QUEEN X CAYENNE
KOLEKSI PKBT
24
SC-SMDG
SMDGSC
SMOOTH CAYENNE
SUMEDANG
25
QH-BBEL
BBBMQH
QUEEN HIJAU
BANGKA BELITUNG
26
SC-JPG
LNJSC
SMOOTH CAYENNE
JEPANG
27
SC-SMUT3
SSUBSC
SMOOTH CAYENNE
SUMATERA UTARA
28
Q.OGIL
Q.OG-IL
QUEEN
OGAN KOMERING ILIR
29
QC-III
III/1/31
QUEEN X CAYENNE
KOLEKSI PKBT
30
SC-WNSBO
JTWHSC
SMOOTH CAYENNE
WONOSOBO
31
CNN
CNN
CAYENNE
KOLEKSI PKBT
32
C-DSBG
D.SUBANG
CAYENNE
SUBANG
Metode Penelitian
Penanda Morfologi Tanaman
Penelitian terdiri atas dua bagian, yaitu pengamatan fenotipik di lapang dan
pengamatan genotipik di laboratorium. Pengamatan fenotipik dilakukan dengan
mengamati penampilan morfologi tanaman dan pengamatan genotipik melalui
analisis pola pita DNA dengan menggunakan teknik RAPD.
30
Standar
pengamatan
deskripsi
morfologi
nenas
yang
digunakan
berdasarkan IBPGR (1991). Adapun peubah yang diamati adalah:
a) Pengamatan fase vegetatif tanaman meliputi :
1. Tinggi tanaman (cm), diukur dari pangkal batang terbawah/bagian
permukaan tanah sampai pucuk daun teratas setelah semua daun
ditelungkupkan dan diukur pada saat panen
2. Total jumlah daun (helai), diukur total keseluruhan daun yang ada
(termasuk yang layu). Total jumlah daun diukur/dihitung pada saat panen.
3. Panjang daun (cm), diukur mulai dari batang, tempat daun keluar sampai
ujung daun dari daun terpanjang atau daun nomer 7, diukur pada saat
panen.
4. Lebar daun (cm), diukur pada bagian permukaan daun terlebar dari daun
terpanjang atau daun nomor 7 dan diukur pada saat panen.
5. Diameter tajuk, diukur panjang bukaan daun, diukur pada saat panen.
6. Jumlah duri per 10 cm, dihitung jumlah duri yang ada pada daun nenas
setiap 10 cm pada sisi kanan dan kiri. Kemudian jumlah duri dari kedua
sisi daun tersebut diratakan. Jumlah duri diukur pada saat panen.
7. Warna daun, menentukan warna daun bagian atas dan bagian bawah pada
daun yang masih muda, daun yang tua/layu dan menjelang panen dengan
menggunakan colour chart.
8. Letak duri, dilihat letak duri yang ada pada daun nenas dimana
digolongkan menjadi 3 bagian yaitu ujung, tengah dan pangkal, diukur
pada saat panen.
9. Jumlah anakan (suckers), menghitung jumlah anakan yang muncul dari
permukaan tanah, diukur pada saat panen.
10. Jumlah tunas dasar buah (slips), menghitung jumlah tunas yang muncul
dari dasar buah dan diukur pada saat panen.
31
b) Pengamatan fase generatif buah yang dilakukan pada saat panen / masak
fisiologis meliputi :
1. Warna buah, diamati dalam dua tahap yaitu saat buah muda (sebelum
panen) dan saat buah matang (setelah panen). Pengukuran dilakukan
dengan menggunakan colour chart
2. Bobot mahkota (g), diukur dengan menimbang mahkota yang terdapat
pada ujung buah.
3. Bobot buah (g), diukur dengan menimbang buah tanpa mahkota dan tanpa
batang buah
4. Bobot total / bobot buah dengan mahkota (g), diukur dengan menimbang
buah tanpa membuang mahkotanya.
5. Jumlah daun mahkota (helai), menghitung semua jumlah daun yang ada di
mahkota
6. Panjang buah (cm), mengukur panjang buah dari pangkal sampai ujung
dengan menggunakan jangka sorong atau penggaris
7. Tinggi mahkota (cm), mengukur tinggi mahkota dari pangkal mahkota
sampai ujung setelah daun mahkota ditelungkupkan.
8. Diameter buah (cm), diukur dengan cara membelah buah secara vertical
kemudian diukur diameternya dari sisi yang telah dibelah. Pengukuran
diameter di lakukan dibagian ujung, tengah dan pangkal. Pengukuran
dengan menggunakan jangka sorong atau penggaris.
9. Diameter hati/core (cm), mengukur dengan cara membelah buah secara
vertikal, kemudian diukur poros tengah diantara daging buah. Pengukuran
dengan menggunakan jangka sorong atau penggaris.
10. Diameter kedalaman mata (cm), mengukur kedalaman mata dari buah
nenas dengan membelah buah secara horizontal, kemudian pengukuran
dilakukan di tiga mata tunas. Pengukuran dengan menggunakan jangka
sorong.
11. Panjang pedunkel (cm), diukur dari pangkal buah bertumpu
12. Total padatan terlarut (0Brix), mengukur dengan cara mengambil dan
menghaluskan bagian buah, kemudian mengukur cairan buah setelah
menyaringnya dengan kertas saring menggunakan hand refractometer
32
13. pH buah nenas,
14. Lingkar mahkota (cm), diukur lingkaran mahkota buah
15. Jumlah mata buah, diukur dengan cara menghitung berapa banyak jumlah
mata buah yang ada
16. Total asam (%), diukur dengan menggunakan daging buah yang telah
dihancurkan sebanyak 20 g dan memasukkannya ke dalam labu takar 200
ml dan menambahkan air destilata sampai tanda tera kemudian melakukan
penyaringan. Filtrat hasil penyaringan selanjutnya diambil sebanyak 25 ml
(fp = 200/25) dan selanjutnya menambahkan indikator Phenolphetalein
(PP) sebanyak 3 tetes lalu menitrasinya dengan larutan NaOH 0.1 N
sampai membentuk warna merah muda yang stabil.
17. Panjang empulur (cm) diukur dengan cara membelah buah secara vertikal
dan mengukur panjang empulur/hati buah dari bagian atas sampai bagian
bawah buah.
Penanda Molekuler RAPD
Isolasi DNA
Metode yang digunakan untuk CTAB Doyle dan Doyle (1987) yang
sudah dimodifikasi (Drabkoba et al. 2002). Sampel daun dari masing-masing
bahan tanaman dihancurkan dengan menggunakan mortar yang di dalamnya
ditambahkan buffer ekstrak, kemudian diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65
0
C selama 20 menit. Setelah inkubasi, ditambahkan larutan kloroform isoamyl
alkohol/CIAA (24:1) sebanyak 1 kali volume kemudian divortex selama 1 menit
hingga larutan tercampur.
Sampel disentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit
dengan tujuan untuk memisahkan bagian DNA dan bahan-bahan lainnya.
Supernatan dimasukan ke dalam tabung baru dan ditambahkan CIAA kembali
sebanyak 1x volume dan disentrifuse kembali. Supernatan ditambahkan
isopropanol sebanyak 1x volume. Larutan DNA tersebut disentrifuse kembali dan
larutan di buang hingga pelet DNA tertinggal diujung tube, kemudian
ditambahkan akohol 70% sebanyak 100 µl dan disentrifuse kembali. Alkohol
dibuang dan pelet DNA dikeringkan dengan cara tube dibalik disimpan dalam
33
desikator sampai pelet DNA mengering. Pelet DNA yang kering ditambahkan air
bebas ion sebanyak 10 µl dan dijadikan sebagai stok DNA.
Uji kualitas dan kuantitas DNA dengan gel agarose
Uji kualitas DNA total dilakukan dengan menggunakan larutan agarose
0.8% dan dielektroforesis dalam larutan buffer TAE 1x yang dialirkan arus listrik
dari muatan negatif menuju muatan positif selama selama 50 menit pada 50 volt.
Konsentrasi DNA total dapat diperkirakan berdasarkan hasil elektroforesis yaitu
dengan cara membandingkan DNA total dengan lamda DNA. Lamda DNA yang
digunakan produk merk promega. Lamda yang digunakan untuk mengecek
konsentrasi DNA total dibutuhkan sebanyak 1µl dan diisikan pada lubang sumur
pertama pada agarose. Konsentrasi Lamda DNA dalam 1 ul adalah 457 µg/ml.
Volume DNA total untuk tes kualitas DNA digunakan sebanyak 5 µl, sehingga
untuk setiap 1 µl DNA setara dengan 91.4 ng/µl. Kebutuhan DNA untuk tahapan
PCR sebanyak 10 ng, maka DNA total diencerkan konsentrasinya menjadi 5x.
Pewarnaan dengan cara perendaman gel agarose di dalam larutan pewarna DNA
EtBr 1% selama 10 menit, kemudian didokumentasikan dengan menggunakan
kamera digital pada penyinaran uv transilluminator. Elektroforesis ditujukan
untuk pengecekan kualitas DNA total dan produk PCR.
Amplifikasi DNA dengan PCR
Amplifikasi DNA nenas dilakukan menurut metode Williams et al. (1990).
Reaksi amplifikasi dilakukan dengan microtube volume 0.5 nl yang berisi 25 µl
campuran larutan yang terdiri atas : 12.5 µl Go tag mix, 10.5 µl air bebas ion (ion
free) , 1 µl primer acak dan 1 µl DNA. Volume akhir campuran reaksi amplifikasi
adalah 26 µl. Selanjutnya tube tersebut dimasukkan ke dalam blok mesin PCR
(Applied Biosystem Thermal Cycler version 2.00), yang diprogramkan dengan
tahapan sebagai berikut :
Tahap I Pre-PCR
: 940C selama 4 menit sebanyak 1 siklus
Tahap II PCR
: Denaturasi 940C selama 30 detik, annealing (penempelan
primer) pada suhu 360C selama 1 menit; dan extention
(perpanjangan) pada suhu 720C selama 1 menit sebanyak
40 siklus
34
Tahap III Post PCR
: Perpanjangan akhir pada suhu 720C selama 5 menit
sebanyak satu siklus
Hasil dari amplifikasi ini dapat dilihat dengan elektroforesis. Primer yang
digunakan untuk amplifikasi DNA adalah primer yang sudah diuji melalui tahap
optimasi suhu di Laboratorium Pusat Kajian Buah Tropika (Tabel 2).
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tabel 2. Nama dan susunan basa primer koleksi PKBT-IPB
Nama
Susunan Basa
Suhu
Primer
Annealing
SBH 06
AC GC AT CG CA
360C
SBH 07
CT GC AT CG TG
360C
SBH 08
GA AA CA CG CC
360C
SBH 12
AC GC GC AT GT
360C
SBH 13
GA CG CC AC AC
360C
SBH 18
GA AT CG GC CA
360C
SBH 19
CT GA CC AG CC
360C
SBN 03
GG TA CT CC CC
360C
SBN 13
AG CG TC AC TC
360C
OPE 07
AG AT GC AG CC
360C
Analisis Data
Data hasil pengamatan morfologi dan molekular dianalisis dengan
menggunakan program NTSYSpc (Numerical Taxonomy and Multivariate
Analysis) versi 2.0 (Rohlf 1998). Hasil pengamatan morfologi, diberi nilai skor 0
apabila karakter morfologi tidak dimiliki oleh individu dan nilai skor 1 apabila
individu memiliki karakter sesuai pengamatan. Pengamatan pola pita hasil
elektroforesis ditujukan pada tingkat migrasi yang sama yaitu bernilai skor 0
apabila tidak terbentuk pita dan skor 1 apabila terdapat pita.
Koefisien kemiripan berdasarkan penanda morfologi, molekular dan data
gabungan dianalisis berdasarkan metode Simple Matching Coeficient (SM)
melalui SIMQUAL (Similarity for Qualitative Data) pada program NTSYSpc
versi 2.0. Tingkat keselarasan koefisien kesamaan ant