Profil Protein, Aktivitas Antioksidan, Dan Inhibitor Ace Dari Susu Kuda Dan Hidrolisatnya
PROFIL PROTEIN, AKTIVITAS ANTIOKSIDAN, DAN
INHIBITOR ACE DARI SUSU KUDA
DAN HIDROLISATNYA
MUHAMMAD NOVIANTO BAYU SAPUTRO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Profil Protein, Aktivitas
Antioksidan, dan Inhibitor ACE dari Susu Kuda dan Hidrolisatnya adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2016
Muhammad Novianto Bayu Saputro
NIM F251120021
RINGKASAN
MUHAMMAD NOVIANTO BAYU SAPUTRO. Profil Protein, Aktivitas
Antioksidan, dan Inhibitor ACE dari Susu Kuda dan Hidrolisatnya. Dibimbing
oleh MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO dan NURHENI SRI PALUPI.
Tingginya prevalensi dan mortalitas penyakit kardiovaskular seperti jantung
koroner dan stroke telah mendorong eksplorasi komponen peptida bioaktif asal
protein pangan. Susu kuda telah sejak lama dikonsumsi sebagai sumber nutrisi
bagi bayi ataupun pangan fungsional bagi orang dewasa. Ditinjau dari segi
komposisinya (protein dan laktosa), susu kuda lebih menyerupai susu ASI
dibandingkan susu sapi. Susu kuda secara spesifik telah digunakan sebagai
sumber nutrisi pengganti susu sapi bagi anak-anak dan bayi penderita alergi. Hal
ini disebabkan oleh karakter digestibilitas dan tolerabilitas yang lebih baik dari
susu sapi.
Peningkatan minat konsumen terhadap susu kuda disebabkan oleh efek
pencegahan dan pengobatan terhadap beberapa penyakit, termasuk penyakitpenyakit kardiovaskular. Susu kuda secara empiris telah digunakan sebagai obat
terapi untuk mengatasi penyakit-penyakit metabolik, gastrointestinal, dan hati.
Selain itu, susu kuda juga telah digunakan sebagai obat untuk mengobati atau
mencegah arteriosklerosis, artritis, bahkan kanker. Sifat fungsional susu kuda
diduga berkaitan erat dengan pelepasan peptida-peptida bioaktif. Peptida-peptida
tersebut bersifat non-aktif pada protein asalnya dan menjadi aktif ketika
dilepaskan melalui proses hidrolisis. Pelepasan peptida-peptida tersebut sangat
ditentukan oleh cara hidrolisisnya. Hal tersebut menjadi aspek utama dari
penelitian ini.
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis profil protein, aktivitas
antioksidan dan penghambat ACE dari kasein, whey susu kuda, dan hidrolisatnya.
Protease Bacillus licheniformis F11.4 diproduksi pada media kaldu Luria Bertani
dengan modifikasi (5 g L-1 tripton, 2.5 g L-1 ekstrak khamir, NaCl 5 g L-1) dan 1%
(b/v) susu skim bubuk sebagai penginduksi. Bromelin diekstrak dari buah nanas
segar jenis Queen tanpa kulit (Ananas comosus L.) dengan tingkat kematangan
buah 50–75%. Protease F11.4 dan bromelin ekstrak kasar lalu dipresipitasi dengan
amonium sulfat hingga mencapai tingkat kejenuhan 60% (b/v). Setelah
disentrifugasi, presipitat –yaitu protease F11.4 dan bromelin semimurni digunakan
untuk menghidrolisis protein kasein dan whey susu kuda.
Kasein susu kuda dipisahkan dari whey pada pH isoelektrik 4.2. Sebanyak
10 unit mL-1 bromelin atau protease Bacillus licheniformis galur F11.4 semimurni
digunakan untuk menghidrolisis 100 mg mL-1 kasein dan whey susu kuda.
Hidrolisis dilakukan pada suhu 45 oC, pH 7, selama 30, 60, 90, dan 120 menit.
Analisis SDS-PAGE dilakukan untuk mengetahui pola hidrolisis masing-masing
perlakuan. Komposisi gel poliakrilamida yang digunakan ialah 15 dan 18%.
Elektroforesis dilakukan pada tegangan konstan 70 volt dan arus 50 mA. Gel
diwarnai dengan CBB R-250 dan perak nitrat. Setelah itu, hidrolisat diuji
bioaktivitasnya untuk mengetahui pengaruh hidrolisis terhadap aktivitas DPPH∙
radical scavenging, Fe reducing power, dan ACE inhibitor.
Hasil SDS-PAGE menunjukkan bahwa profil protein susu kuda asal
Indonesia mirip dengan susu kuda asal Eropa. Kasein susu kuda dihidrolisis
sangat efektif oleh enzim bromelin dan protease F11.4, bila dibandingkan dengan
whey. Bromelin efektif menghidrolisis semua jenis kasein, protein no. 10, dan
protein no. 9 (tipikal laktoferin). Di sisi lain, protease F11.4 efektif menghidrolisis
-kasein, -laktoglobulin I, lisozim, protein no. 10, dan 9 (tipikal laktoferin). Dua
pita protein baru dihasilkan dari hidrolisis kasein dan whey oleh bromelin.
Sebaliknya, hidrolisis kasein ataupun whey oleh protease F11.4 tidak
menunjukkan pembentukan pita protein baru. Hal ini mengindikasikan
terbentuknya peptida-peptida yang berukuran kecil.
Proses hidrolisis meningkatkan bioaktivitas kasein susu kuda. Aktivitas
DPPH∙ radical scavenging dan Fe reducing power tertinggi diperoleh dari kasein
susu kuda yang dihidrolisis oleh bromelin dan F11.4 pada kisaran menit ke-60 dan
90. Aktivitas spesifik DPPH∙ radical scavenging nya setara dengan 124–150 ppm
asam askorbat per 25 mg protein terlarut, sedangkan pada Fe reducing power-nya
3–4 kali lebih tinggi dari asam askorbat standar 100 M per 10 mg protein terlarut.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa susu kuda menunjukkan aktivitas
penghambatan ACE yang tinggi, hampir setara dengan 1 mg mL-1 Captopril.
Kasein ialah bagian yang paling kaya dengan ACE inhibitor. Ketika dihidrolisis,
terjadi peningkatan signifikan aktivitas spesifik penghambatan ACE dari hidrolisat
kasein. Aktivitas penghambatan tertinggi ditemukan pada hidrolisat kaseinbromelin, yaitu 84.75±0.71% per 50 µg protein. Hasil penelitian ini menunjukkan
bahwa hidrolisis kasein kuda oleh bromelin dan protease F11.4 telah
menghasilkan peptida-peptida antioksidan dan inhibitor ACE.
Kata kunci: susu kuda, antioksidan, antihipertensi, SDS-PAGE, kasein, whey
SUMMARY
MUHAMMAD NOVIANTO BAYU SAPUTRO. Protein Profile, Antioxidant,
and ACE-Inhibitory Activity of Equine Milk and Its Hydrolysates. Supervised by
MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO dan NURHENI SRI PALUPI.
High prevalent and mortality of Cardiovascular Disease (CVD‘s) such as
coronary heart disease and stroke activate exploration of bioactive peptides from
many food protein sources. Equine‘s milk has been used not only as nutritious
food for the infant but also as functional foods for adults. From the compositional
point of view, equine milk is more similar to human milk than bovine milk. It has
been used as a substitute for bovine milk, especially for children and the young
infant who severe from the alergenic reaction. There have been increasing
interests on equine‘s milk consumption due to their good effect on human health
and disease therapy, including CDV‘s. Equine milk has been used as a curative
agent for some disease, e.g. for treating metabolic, gastrointestinal, and liver
problems, for curing or preventing atherosclerosis, arthritis, and cancer. In
addition, in Indonesia, fermented equine milk has been marketed and claimed for
its functional properties. The functional properties of equine milk may relate to
the release of bioactive peptides which non-active at their parent protein and
become active after hydrolysis. The release of these peptides mainly depends on
the hydrolysis step, which becomes the main aspects of this research.
The aim of this research was to study the protein profiles and to explore the
antioxidant and ACE inhibitory potentials of equine casein, whey, and its
hydrolysates, hydrolyzed by bromelain and Bacillus licheniformis F11.4 protease.
Bacillus licheniformis F11.4 protease was produced using modified Luria-Bertani
Broth (5 g L-1 tryptone, 2.5 g L-1 yeast extract, NaCl 5 g L-1) and 1% (b/v)
skimmed milk powder as an inducer. The bromelain was extracted from fleshy
ripe Queen pineapple fruits (Ananas comosus L.) which have 50–75% maturation
point. Both crude F11.4 protease and bromelain was precipitated using
ammonium sulfate until it reaches 60% (b/v) saturation point. After centrifuging,
the precipitate i.e. semipurified protease was used to hydrolyze equine milk
protein. The equine casein was separated at its isoelectric point (pH 4.2). As much
as 10 Unit mL-1 of semipurified bromelain and Bacillus licheniformis F11.4
protease were used to hydrolyze 100 mg mL-1 both casein and whey at 45 oC, pH
7, during 30–120 minutes. The SDS-PAGE analysis was performed by using 15
and 18% polyacrylamide gel. The electrophoresis was conducted under constant
voltage 70 volts and 50 mA electrical currents. The gels were stained using
Coomassie Blue and silver staining technique. After electrophoresis, the
bioactivity tests including DPPH∙ radical scavenging, Fe reducing power, and
ACE-inhibitory activity were conducted in order to know the influence of
hydrolysis to the antioxidant and antihypertensive activity.
The SDS-PAGE shows high similarity of equine milk protein profile from
Indonesia with European breeding equine milk. The SDS-PAGE also shows that
equine casein is more susceptible to both enzymes than the whey. Bromelain was
effective in hydrolyzing all type of casein, protein no. 10, and lactoferrin-like
proteins, while the F11.4 protease was effective to hydrolyze -like casein, lactoglobulin I, lysozyme, protein no. 10 and lactoferrin-like protein. Two new
protein band with rather high molecular weight (MW) were produced by
bromelain. Meanwhile, F11.4 proteases did not generate new protein/peptide
bands, which indicated a much smaller peptides product.
Hydrolysis enhanced the bioactivity of equine casein. The highest radical
scavenging and reducing power activity were obtained using bromelain and F11.4
protease after 60–90 min incubation times. The highest radical scavenging activity
was equal to 124–150 ppm ascorbic acid‘s activity at β5 mg solubilized protein.
Meanwhile, the highest reducing power was 3–4 times higher than 100 M
ascorbic acid‘s activity, at 10 mg solubilized protein. The highest ACE inhibitory
specific activity was obtained using bromelain on casein after 90 min incubation
times. The ACE inhibitory activity was 84.75±0.71% at 50 µg protein content,
which is close to the 1 mg mL-1 Captopril‘s activity (λ7.γκ%). The enhanced
bioactivities might be related to the release of small peptides from equine casein
by both bromelain and F11.4 protease activity.
Keywords: equine milk, antioxidant, antihypertensive, SDS-PAGE, casein, whey
©Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PROFIL PROTEIN, AKTIVITAS ANTIOKSIDAN, DAN
INHIBITOR ACE DARI SUSU KUDA
DAN HIDROLISATNYA
MUHAMMAD NOVIANTO BAYU SAPUTRO
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof Dr Ir Sedarnawati Yasni, MAgr
Judul Tesis : Profil Protein, Aktivitas Antioksidan, dan Inhibitor ACE dari Susu
Kuda dan Hidrolisatnya
Nama
: Muhammad Novianto Bayu Saputro
NIM
: F251120021
Komisi Pembimbing
Prof Dr Ir Maggy T. Suhartono
Ketua
Dr Ir Nurheni Sri Palupi, MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Pangan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Harsi D. Kusumaningrum
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
27 Juli 2016
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala ridho dan karunia-Nya sehingga Tesis yang berjudul ―Profil Protein,
Aktivitas Antioksidan, dan Inhibitor ACE dari Susu Kuda dan Hidrolisatnya‖
berhasil diselesaikan. Penulis mengucapkan terima kasih kepada proyek Penelitian
Unggulan, DIPA IPB (kode MAK 2013.089.521219) yang telah mendanai
penelitian ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih dan memberikan penghargaan yang
tak terhingga kepada:
1 Ibu Prof Dr Ir Maggy Thenawidjaja Suhartono dan Ibu Dr Ir Nurheni Sri
Palupi, MSi selaku komisi pembimbing atas semua waktu, ilmu, bimbingan,
arahan, dan motivasi selama masa studi, perencanan dan pelaksanaan
penelitian, penulisan laporan, penulisan jurnal, dan laporan akhir sehingga
tesis ini dapat terselesaikan dengan baik.
2 Ibu Prof Dr Ir Sedarnawati Yasni, MAgr selaku Penguji di luar komisi atas
semua waktu, saran dan kritik demi kesempurnaan karya tulis ini.
3 Ibu Dr Ir Endang Prangdimurti, MSi selaku perwakilan departemen Ilmu
Pangan dan juga para dosen atas semua ilmu yang telah diberikan selama
masa perkuliahan.
4 Bapak Prof Dr Ir Sony Suharsono, DEA selaku Kepala Pusat Penelitian
Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB atas ijin penggunaan
fasilitas laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia di gedung Pusat Antar
Universitas IPB.
5 Ibu Ika Malikah dan teknisi lainnya atas semua ilmu, teknik, dan semangat
kerja sehingga kegiatan penelitian ini dapat berjalan dengan lancar.
6 Bapak, Ibu, dan adinda Awalia Indahsaputri atas semua doa, dukungan moral
dan finansial sehingga penulis dapat menyelesaikan studinya dengan baik.
7 Rekan-rekan seperjuangan peptida bioaktif, antara lain: Diana, Mba Ino,
Silvie atas kebersamaannya selama masa pelaksanaan penelitian.
8 Para sahabat, yaitu Fajri, Kamil, Danang, Edo, Reno atas semua doa,
semangat, dukungan, dan bantuan sehingga tesis ini dapat terselesaikan
dengan baik.
9 Rekan-rekan Ilmu Pangan atas semua kebersamaan dan kerjasamanya selama
menempuh studi di program studi Ilmu Pangan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2016
Muhammad Novianto Bayu Saputro
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
xiv
DAFTAR GAMBAR
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
xv
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Hipotesis Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
2
3
3
3
3
2 TINJAUAN PUSTAKA
Karakter Komponen Nutrisi Susu Kuda
Sifat Fungsional Beberapa Protein Susu Kuda
Protease
Aplikasi Protease dalam Pembuatan Peptida Bioaktif
Bromelin
Bacillus licheniformis Galur F11.4 Sebagai Bakteri Proteolitik
Peptida Bioaktif
Peptida Antioksidan
Peptida Inhibitor Angiotensin-I-Converting Enzyme (ACE)
3
3
5
5
7
8
9
9
10
12
3 METODE
Waktu dan Lokasi Penelitian
Bahan Penelitian
Peralatan Penelitian
Metode Penelitian
14
14
14
15
15
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Profil Protein Susu Kuda
Profil Hidrolisat Kasein dan Whey Susu Kuda
Aktivitas Antioksidan Susu Kuda dan Hidrolisatnya
Aktivitas Penghambatan ACE oleh Susu Kuda dan Hidrolisatnya
22
22
24
27
30
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
34
34
34
DAFTAR PUSTAKA
34
LAMPIRAN
40
RIWAYAT HIDUP
52
DAFTAR TABEL
1 Komposisi total zat gizi pada berbagai jenis susu
2 Konsentrasi kasein dan whey protein (g kg-1) pada susu kuda, ASI,
dan susu sapi
3 Kondisi hidrolisis dan protease yang digunakan untuk menghasilkan
berbagai peptida bioaktif
4 Sumber, jenis, cara hidrolisis, dan sifat fungsional beberapa contoh
peptida bioaktif
5 Metode Bergmeyer dan Grassel (1983) dengan modifikasi.
6 Perbandingan jumlah pereaksi yang digunakan untuk membuat gel
pemisah dan penahan
7 Prosedur uji Fe reducing power
8 Prosedur uji penghambatan ACE
6
7
8
11
18
19
20
21
DAFTAR GAMBAR
1 Peptida bioaktif asal susu dan sifat fungsionalnya. Sumber: Korhonen
(2009).
2 Mekanisme peptida bioaktif sebagai antioksidan, antara lain: (1)
pengkelat logam, (2) radical scavenging, dan (3) sebagai pelindung.
Sumber: Yoshinori et al. 2010).
3 Peran ACE di dalam pengaturan tekanan pembuluh darah. Sumber:
Li et al. 2004.
4 Kecenderungan beberapa asam amino untuk berikatan dengan sisi
aktif ACE pada ujung 3 C terminal. Sumber: Wilson et al. (2011).
5 Tiga tahap utama rancangan penelitian.
6 Perbandingan antara profil SDS-PAGE susu kuda dari Indonesia dan
beberapa studi terdahulu, serta susu sapi dan ASI. Gambar A, protein
susu skim dari kuda poni pada gel 12% (Miranda et al. 2004); B, susu
kuda skim pada gel 15% (Inglingstad et al. 2010); S, K, dan W = susu
skim, kasein 10% (b/v), dan konsentrat whey; C dan D, susu sapi dan
ASI pada gel 15% (Inglingstad et al. 2010).
7 Pengaruh hidrolisis terhadap profil protein kasein susu kuda oleh
enzim bromelin (A) dan protease F11.4 (B). Pita protein yang
terhidrolisis ditunjukkan oleh tanda panah. Pita protein baru
ditunjukkan oleh tanda panah dan abjad. M1 dan M2 ialah penanda
protein ber-BM tinggi dan rendah. Gel diwarnai dengan perak nitrat.
8 Hidrolisis kasein oleh kimosin pada gel poliakrilamida 15%.
Keterangan: eCN, kasein kuda; bGMP, glikomakropeptida sapi.
Fragmen a, b dan e ialah hasil hidrolisis kasein kuda. Sumber: Egito
et al. 2001.
9 Pengaruh hidrolisis terhadap profil protein whey susu kuda oleh
enzim bromelin (A) dan protease F11.4 (B). Pita protein yang
terhidrolisis ditunjukkan oleh tanda panah. Pita protein baru
ditunjukkan oleh tanda panah dan abjad. M1 dan M2 ialah penanda
protein ber-BM tinggi dan rendah. Gel diwarnai dengan CBB R-250.
12
13
13
14
16
23
25
25
26
10 Supramolekul kasein distabilkan oleh -kasein dan nanokluster CaP. Gambar A, model McMahon dan Oommen (2008) berdasarkan
hasil TEM; dan B, model Walstra (1999) di dalam Phadungath (2005)
11 Aktivitas antioksidan DPPH∙ radical scavenging (A) dan Fe reducing
power (B) dari kasein dan whey susu kuda.
12 Pengaruh hidrolisis terhadap aktivitas spesifik DPPH∙ radical
scavenging (A) dan Fe reducing power (B) dari kasein dan whey susu
kuda. Keterangan: CB, kasein + bromelin; CF, kasein + protease
F11.4; WB, whey + bromelin; dan WF, whey + protease F11.4.
13 Aktivitas penghambatan ACE dari kasein dan whey susu kuda.
14 Pengaruh hidrolisis terhadap aktivitas spesifik penghambatan ACE
dari kasein dan whey susu kuda. Keterangan: CB, kasein + bromelin;
CF, kasein + protease F11.4; WB, whey + bromelin; dan WF, whey +
protease F11.4.
15 Mekanisme absorbsi peptida bioaktif. Sumber: Wada dan Lönnerdal
(2014).
27
29
30
31
32
33
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Prosedur pembuatan pereaksi metode Bradford
Kurva standar protein
Prosedur pembuatan pereaksi metode Bergmeyer dan Grassel (1983)
Prosedur pembuatan pereaksi metode SDS-PAGE
Pereaksi untuk prosedur pewarnaan Coomassie Blue
Pereaksi untuk prosedur pewarnaan Silver Staining
Prosedur pewarnaan Silver Staining
Korelasi antara konsentrasi asam askorbat dan aktivitas DPPH∙
radical scavenging
Prosedur pembuatan pereaksi metode Fe reducing power
Prosedur pembuatan pereaksi metode inhibitor ACE
Kadar protein terlarut susu kuda dan hidrolisatnya
Uji statistika aktivitas DPPH∙ radical scavenging spesifik dari
hidrolisat kasein- bromelin (CB)
Uji statistika aktivitas DPPH∙ radical scavenging spesifik dari
hidrolisat kasein-F11.4 (CF)
Uji statistika aktivitas reducing power spesifik dari hidrolisat kasein
Uji statistika aktivitas penghambatan ACE spesifik dari hidrolisat
kasein
41
41
42
43
44
44
44
45
45
46
47
48
49
50
51
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Susu kuda (Equus caballus) telah dikonsumsi secara tradisional pada
masyarakat di beberapa wilayah dunia, khususnya Asia Tengah, Mongolia, dan
Rusia, seperti Kazakhstan, Kyrgyzstan, and Tajikistan. Selain memberikan nutrisi
yang baik, susu kuda dipercaya dan telah digunakan untuk mencegah dan
mengobati berbagai macam penyakit, seperti: kelainan metabolik, gastrointestinal,
liver, arteriosklerosis, artritis, bahkan kanker (Claeys et al. 2014). Di Indonesia,
minuman fermentasi susu kuda telah dipasarkan dan diklaim sifat fungsionalnya.
Meskipun demikian studi mekanisme fungsionalnya masih sangat terbatas.
Beberapa sifat fungsional yang telah diteliti antara lain: karakter antimikroba susu
kuda autofermentasi asal Sumba dan Sumbawa, Indonesia Timur (Hermawati
2005; Detha, et al. 2013); dan inhibitor angiotensin-I-converting enzyme (ACE)
dari Koumiss, yaitu minuman fermentasi susu kuda yang terkenal di Mongolia dan
Rusia (Chen et al. 2010). Sebagai jenis susu yang memiliki rasio kasein/whey
yang rendah, susu kuda lebih mudah dicerna dan lebih tidak berpotensi
menimbulkan alergi dibandingkan susu sapi. Oleh sebab itu, susu kuda lebih
cocok untuk digunakan sebagai pangan ataupun ingredien fungsional pengganti
susu sapi (Salimei dan Fantuz 2012; Uniacke-Lowe et al. 2010). Aktivitas
penghambatan ACE berkaitan dengan karakter antihipertensi komponen pangan,
dan merupakan mekanisme utama obat-obatan antihipertensi komersial, seperti
Captopril, Enalapril, Lisinopril. Penelitian Chen et al. (2010) mengindikasikan
bahwa susu kuda merupakan sumber peptida-peptida inhibitor ACE yang
potensial. Meskipun demikian, pelepasan peptida-peptida ini sangat dipengaruhi
oleh cara hidrolisisnya.
Bromelin (EC.3.4.22.4) merupakan enzim sistein protease asal tumbuhan
Bromeliaceae, khususnya nanas (Ananas comosus L.) (González-Rábade et al.
2011). Selain bersifat food grade, enzim ini juga dilaporkan memiliki aktivitas
fibrinolitik, antitumor, antiedematus, antineoplastik, antitrombosis, dan
antiinflamasi (González-Rábade et al. 2011). Di sisi lain, protease F11.4 dari
Bacillus licheniformis galur F11.4 telah digunakan untuk memproduksi peptida
kolagen bioaktif penghambat ACE dan antiproliferasi pada sel kanker serviks dan
kolon (Baehaki et al. 2016). Bakteri ini merupakan hasil modifikasi genetik
dengan mendelesi gen ∆pga dan ∆chiBA sehingga produksi proteasenya
meningkat (Hoffmann et al. 2010). Pada penelitian ini, kedua enzim yang sama
akan diaplikasikan terhadap sumber protein yang berbeda –yaitu kasein dan whey
susu kuda, untuk menghasilkan peptida bioaktif yang dapat bertindak sebagai
antioksidan dan penghambat ACE.
Studi proteomik telah menjadi salah satu upaya untuk menjelaskan
hubungan antara bioaktivitas dan profil protein asal susu (Roncada et al. 2012).
Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
merupakan salah satu teknik proteomik yang paling sering digunakan untuk
menganalisis dan mengisolasi protein dari suatu campuran berdasarkan bobot
molekul (BM)-nya (Roncada et al. 2012). Teknik ini telah digunakan pada
beberapa studi susu kuda, antara lain: studi komposisi protein, kerentanan
2
hidrolisisnya, ataupun perubahan profil protein susu kuda selama masa simpan
(Egito et al. 2003; Inglingstad et al. 2010; Miranda et al. 2004). Pada penelitian
ini, SDS-PAGE digunakan untuk mengamati perubahan profil protein setelah
dihidrolisis.
Tekanan pembuluh darah diatur oleh aktivitas angiotensin-I-converting
enzyme (ACE) (EC.3.4.15.1) atau enzim pengonversi angiotensin-I. Enzim ini
merupakan bagian dari sistem renin angiotensin. Enzim ACE ialah enzim
metalopeptidase yang menghidrolisis 2 asam amino (His, Leu) dari ujung
karboksil protein non aktif angiotensin I, sehingga dihasilkan protein aktif
angiotensin II. Angiotensin II merupakan vasokonstriktor kuat dan memicu
sekresi hormon aldosteron yang akan meningkatkan retensi air dan garam mineral,
sehingga tekanan darah akan meningkat. Selain itu, enzim ACE juga
mendegradasi bradikinin, yaitu protein vasodilator kuat yang dihasilkan dari
sistem kallikrein kinin (Li et al. 2004; Wilson et al. 2011). Hipertensi dan stres
oksidatif merupakan pemicu arteriosklerosis yaitu proses penyumbatan pembuluh
darah yang menyebabkan penyakit jantung koroner dan stroke (Fearon dan Faux
2009; WHO 2013).
Efek samping jangka panjang dari obat-obatan antihipertensi sintetik telah
diteliti dan dilaporkan (Flather et al. 2000; Hall dan Israili 1992). Hal tersebut
telah mendorong eksplorasi komponen bioaktif asal pangan yang dinilai lebih
alami dan aman. Peptida-peptida bioaktif tidak hanya menghambat ACE secara in
vitro, tetapi juga menurunkan tekanan darah secara in vivo dan uji klinis.
(Hernandez-Ledesma et al. 2011; Nongonierma dan FitzGerald 2015).
Keunggulan lain dari peptida bioaktif ialah karakter multifungsionalnya. Peptida
ini tidak hanya memiliki karakter antihipertensi, tetapi juga antioksidan,
antihiperkolesterolemik, antiinflamasi sehingga berperan untuk mencegah dan
mengatasi penyakit kardiovaskular secara sistematik (Hernandez-Ledesma et al.
2011; Nongonierma dan FitzGerald 2015).
Perumusan Masalah
Pertumbuhan faktor resiko penyakit kardiovaskular dapat dicegah melalui
sifat fungsional peptida bioaktif sebagai antioksidan dan antihipertensi. Di
Indonesia, susu kuda telah diketahui secara empiris dapat mengobati berbagai
macam penyakit, termasuk kardiovaskular. Meskipun demikian, data penelitian
yang mendukung efikasi tersebut masih sangat terbatas.
Di Indonesia, hingga saat ini, susu kuda masih dikomersialkan dalam
bentuk susu saja. Sebagai upaya untuk meningkatkan nilai tambah susu kuda,
maka perlu dilakukan diversifikasi dan pengayaan produk. Proses hidrolisis
merupakan salah satu teknik yang dapat digunakan untuk meningkatkan nilai
tambah bahan pangan. Nilai tambah bahan pangan ditingkatkan dengan
dihasilkannya berbagai peptida-peptida bioaktif dengan karakter fungsional yang
beragam. Di lain sisi, enzim protease F11.4 dan bromelin –yang terkarakterisasi
dengan baik, telah digunakan untuk memproduksi peptida bioaktif dari kolagen
ikan bandeng dan kerang tiram yang dapat bersifat sebagai antihipertensi,
antioksidan, antiproliferasi sel kanker, dan antimikroba.
3
Tujuan Penelitian
Peptida-peptida bioaktif bersifat inaktif pada protein asalnya dan menjadi
aktif setelah dilepaskan, baik melalui proses pencernaan, fermentasi mikroba,
proteolisis enzim, ataupun proses pengolahan pangan. Studi peptida bioaktif susu
kuda masih sangat terbatas, sehingga menjadi peluang untuk diteliti dan
dikembangkan. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis profil protein,
aktivitas antioksidan dan penghambatan ACE dari kasein, whey susu kuda, dan
hidrolisatnya.
Hipotesis Penelitian
Hipotesis yang ingin dibuktikan pada penelitian ini, yaitu (1) hidrolisis
protein (kasein dan whey) susu kuda oleh enzim protease B. licheniformis F11.4
dan bromelin akan menghasilkan profil protein (SDS-PAGE) hidrolisat yang
berbeda, (2) dari hidrolisis tersebut akan dihasilkan peptida-peptida antioksidan
dan ACE inhibitor. Profil SDS-PAGE hidrolisat yang berbeda menunjukkan
perbedaan titik potong kedua enzim terhadap substrat yang spesifik.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini memberikan informasi tentang: (1) profil protein susu skim,
kasein, dan whey dari kuda asal Indonesia; (2) perubahan profil protein (SDSPAGE) selama hidrolisis; dan (3) korelasinya dengan aktivitas antioksidan dan
penghambatan ACE kasein dan whey susu kuda. Informasi ini diperlukan sebagai
dasar untuk memproduksi peptida-peptida bioaktif asal susu kuda.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini dibatasi pada aspek profil protein, yaitu profil SDS-PAGE dari
susu skim, kasein, whey, dan hidrolisatnya serta korelasinya dengan aktivitas
DPPH∙ radical scavenging, Fe reducing power, dan penghambatan ACE secara in
vitro. Produksi peptida bioaktif dibatasi pada peptida-peptida hidrolisat kasar
kasein dan whey susu kuda.
2 TINJAUAN PUSTAKA
Karakter Komponen Nutrisi Susu Kuda
Komposisi susu kuda ditentukan oleh beberapa faktor, yaitu genetik
(galur) dan lingkungan (jenis makanan, cara pemeliharaan dan pemerahan). Oleh
sebab itu, komposisi susu kuda dari berbagai daerah tidaklah selalu sama. Pada
umumnya susu kuda mengandung 102 g total padatan, 21.4 g protein, 0.5–2.0 g
lemak, 1.5–2.8 g protein, 5.8–7.0 g laktosa, dan 9.3–11.6 g abu per 100 g susu
(Park 2009). Komposisi ini sangat unik bila dibandingkan dengan beberapa
4
spesies penghasil susu lainnya, seperti sapi, kambing, domba, dan kerbau. Kadar
protein, lemak, garam anorganik susu kuda lebih rendah, sedangkan kadar
laktosanya lebih tinggi bila dibandingkan dengan susu sapi. Kadar laktosa susu
kuda mendekati kadar laktosa Air Susu Ibu (ASI) (Tabel 1). Oleh sebab itu, bila
dibandingkan dengan susu dari spesies lainnya, karakter nutrisi susu kuda lebih
mendekati ASI.
Susu kuda memiliki karakter tolerabilitas dan digestibilitas yang jauh lebih
baik dibandingkan dengan susu sapi (Salimei dan Fantuz 2012). Percobaan
Inglingstad et al. (2010) menunjukkan bahwa protein susu kuda lebih mudah
dicerna oleh enzim-enzim protease gastrointestinal. Uniacke-Lowe et al. (2010)
menyatakan bahwa karakter digestibilitas protein susu sangat ditentukan oleh
rasio kasein/whey nya. Data ekplorasi menunjukkan bahwa rasio kasein terhadap
whey pada susu kuda, jauh lebih mendekati karakter rasio kasein/whey ASI (Tabel
1). Hal ini menunjukkan potensi susu kuda sebagai pengganti susu sapi,
khususnya bagi orang yang memiliki masalah alergi. Hal ini disebabkan karena
karakter digestibilitas protein susu kuda yang lebih tinggi bila dibandingkan
dengan susu sapi dan kambing. Potensi ini juga didukung oleh kajian Roncada et
al. (2012) yang menunjukkan bahwa sekuen -kasein susu famili Equidae (kuda
dan keledai) sangat berkerabat dekat dengan sekuen kasein susu manusia (ASI).
Profil komposisi protein susu kuda hampir mirip dengan ASI, bila
dibandingkan dengan susu sapi. Susu kuda mengandung lebih sedikit kasein
(
INHIBITOR ACE DARI SUSU KUDA
DAN HIDROLISATNYA
MUHAMMAD NOVIANTO BAYU SAPUTRO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Profil Protein, Aktivitas
Antioksidan, dan Inhibitor ACE dari Susu Kuda dan Hidrolisatnya adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2016
Muhammad Novianto Bayu Saputro
NIM F251120021
RINGKASAN
MUHAMMAD NOVIANTO BAYU SAPUTRO. Profil Protein, Aktivitas
Antioksidan, dan Inhibitor ACE dari Susu Kuda dan Hidrolisatnya. Dibimbing
oleh MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO dan NURHENI SRI PALUPI.
Tingginya prevalensi dan mortalitas penyakit kardiovaskular seperti jantung
koroner dan stroke telah mendorong eksplorasi komponen peptida bioaktif asal
protein pangan. Susu kuda telah sejak lama dikonsumsi sebagai sumber nutrisi
bagi bayi ataupun pangan fungsional bagi orang dewasa. Ditinjau dari segi
komposisinya (protein dan laktosa), susu kuda lebih menyerupai susu ASI
dibandingkan susu sapi. Susu kuda secara spesifik telah digunakan sebagai
sumber nutrisi pengganti susu sapi bagi anak-anak dan bayi penderita alergi. Hal
ini disebabkan oleh karakter digestibilitas dan tolerabilitas yang lebih baik dari
susu sapi.
Peningkatan minat konsumen terhadap susu kuda disebabkan oleh efek
pencegahan dan pengobatan terhadap beberapa penyakit, termasuk penyakitpenyakit kardiovaskular. Susu kuda secara empiris telah digunakan sebagai obat
terapi untuk mengatasi penyakit-penyakit metabolik, gastrointestinal, dan hati.
Selain itu, susu kuda juga telah digunakan sebagai obat untuk mengobati atau
mencegah arteriosklerosis, artritis, bahkan kanker. Sifat fungsional susu kuda
diduga berkaitan erat dengan pelepasan peptida-peptida bioaktif. Peptida-peptida
tersebut bersifat non-aktif pada protein asalnya dan menjadi aktif ketika
dilepaskan melalui proses hidrolisis. Pelepasan peptida-peptida tersebut sangat
ditentukan oleh cara hidrolisisnya. Hal tersebut menjadi aspek utama dari
penelitian ini.
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis profil protein, aktivitas
antioksidan dan penghambat ACE dari kasein, whey susu kuda, dan hidrolisatnya.
Protease Bacillus licheniformis F11.4 diproduksi pada media kaldu Luria Bertani
dengan modifikasi (5 g L-1 tripton, 2.5 g L-1 ekstrak khamir, NaCl 5 g L-1) dan 1%
(b/v) susu skim bubuk sebagai penginduksi. Bromelin diekstrak dari buah nanas
segar jenis Queen tanpa kulit (Ananas comosus L.) dengan tingkat kematangan
buah 50–75%. Protease F11.4 dan bromelin ekstrak kasar lalu dipresipitasi dengan
amonium sulfat hingga mencapai tingkat kejenuhan 60% (b/v). Setelah
disentrifugasi, presipitat –yaitu protease F11.4 dan bromelin semimurni digunakan
untuk menghidrolisis protein kasein dan whey susu kuda.
Kasein susu kuda dipisahkan dari whey pada pH isoelektrik 4.2. Sebanyak
10 unit mL-1 bromelin atau protease Bacillus licheniformis galur F11.4 semimurni
digunakan untuk menghidrolisis 100 mg mL-1 kasein dan whey susu kuda.
Hidrolisis dilakukan pada suhu 45 oC, pH 7, selama 30, 60, 90, dan 120 menit.
Analisis SDS-PAGE dilakukan untuk mengetahui pola hidrolisis masing-masing
perlakuan. Komposisi gel poliakrilamida yang digunakan ialah 15 dan 18%.
Elektroforesis dilakukan pada tegangan konstan 70 volt dan arus 50 mA. Gel
diwarnai dengan CBB R-250 dan perak nitrat. Setelah itu, hidrolisat diuji
bioaktivitasnya untuk mengetahui pengaruh hidrolisis terhadap aktivitas DPPH∙
radical scavenging, Fe reducing power, dan ACE inhibitor.
Hasil SDS-PAGE menunjukkan bahwa profil protein susu kuda asal
Indonesia mirip dengan susu kuda asal Eropa. Kasein susu kuda dihidrolisis
sangat efektif oleh enzim bromelin dan protease F11.4, bila dibandingkan dengan
whey. Bromelin efektif menghidrolisis semua jenis kasein, protein no. 10, dan
protein no. 9 (tipikal laktoferin). Di sisi lain, protease F11.4 efektif menghidrolisis
-kasein, -laktoglobulin I, lisozim, protein no. 10, dan 9 (tipikal laktoferin). Dua
pita protein baru dihasilkan dari hidrolisis kasein dan whey oleh bromelin.
Sebaliknya, hidrolisis kasein ataupun whey oleh protease F11.4 tidak
menunjukkan pembentukan pita protein baru. Hal ini mengindikasikan
terbentuknya peptida-peptida yang berukuran kecil.
Proses hidrolisis meningkatkan bioaktivitas kasein susu kuda. Aktivitas
DPPH∙ radical scavenging dan Fe reducing power tertinggi diperoleh dari kasein
susu kuda yang dihidrolisis oleh bromelin dan F11.4 pada kisaran menit ke-60 dan
90. Aktivitas spesifik DPPH∙ radical scavenging nya setara dengan 124–150 ppm
asam askorbat per 25 mg protein terlarut, sedangkan pada Fe reducing power-nya
3–4 kali lebih tinggi dari asam askorbat standar 100 M per 10 mg protein terlarut.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa susu kuda menunjukkan aktivitas
penghambatan ACE yang tinggi, hampir setara dengan 1 mg mL-1 Captopril.
Kasein ialah bagian yang paling kaya dengan ACE inhibitor. Ketika dihidrolisis,
terjadi peningkatan signifikan aktivitas spesifik penghambatan ACE dari hidrolisat
kasein. Aktivitas penghambatan tertinggi ditemukan pada hidrolisat kaseinbromelin, yaitu 84.75±0.71% per 50 µg protein. Hasil penelitian ini menunjukkan
bahwa hidrolisis kasein kuda oleh bromelin dan protease F11.4 telah
menghasilkan peptida-peptida antioksidan dan inhibitor ACE.
Kata kunci: susu kuda, antioksidan, antihipertensi, SDS-PAGE, kasein, whey
SUMMARY
MUHAMMAD NOVIANTO BAYU SAPUTRO. Protein Profile, Antioxidant,
and ACE-Inhibitory Activity of Equine Milk and Its Hydrolysates. Supervised by
MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO dan NURHENI SRI PALUPI.
High prevalent and mortality of Cardiovascular Disease (CVD‘s) such as
coronary heart disease and stroke activate exploration of bioactive peptides from
many food protein sources. Equine‘s milk has been used not only as nutritious
food for the infant but also as functional foods for adults. From the compositional
point of view, equine milk is more similar to human milk than bovine milk. It has
been used as a substitute for bovine milk, especially for children and the young
infant who severe from the alergenic reaction. There have been increasing
interests on equine‘s milk consumption due to their good effect on human health
and disease therapy, including CDV‘s. Equine milk has been used as a curative
agent for some disease, e.g. for treating metabolic, gastrointestinal, and liver
problems, for curing or preventing atherosclerosis, arthritis, and cancer. In
addition, in Indonesia, fermented equine milk has been marketed and claimed for
its functional properties. The functional properties of equine milk may relate to
the release of bioactive peptides which non-active at their parent protein and
become active after hydrolysis. The release of these peptides mainly depends on
the hydrolysis step, which becomes the main aspects of this research.
The aim of this research was to study the protein profiles and to explore the
antioxidant and ACE inhibitory potentials of equine casein, whey, and its
hydrolysates, hydrolyzed by bromelain and Bacillus licheniformis F11.4 protease.
Bacillus licheniformis F11.4 protease was produced using modified Luria-Bertani
Broth (5 g L-1 tryptone, 2.5 g L-1 yeast extract, NaCl 5 g L-1) and 1% (b/v)
skimmed milk powder as an inducer. The bromelain was extracted from fleshy
ripe Queen pineapple fruits (Ananas comosus L.) which have 50–75% maturation
point. Both crude F11.4 protease and bromelain was precipitated using
ammonium sulfate until it reaches 60% (b/v) saturation point. After centrifuging,
the precipitate i.e. semipurified protease was used to hydrolyze equine milk
protein. The equine casein was separated at its isoelectric point (pH 4.2). As much
as 10 Unit mL-1 of semipurified bromelain and Bacillus licheniformis F11.4
protease were used to hydrolyze 100 mg mL-1 both casein and whey at 45 oC, pH
7, during 30–120 minutes. The SDS-PAGE analysis was performed by using 15
and 18% polyacrylamide gel. The electrophoresis was conducted under constant
voltage 70 volts and 50 mA electrical currents. The gels were stained using
Coomassie Blue and silver staining technique. After electrophoresis, the
bioactivity tests including DPPH∙ radical scavenging, Fe reducing power, and
ACE-inhibitory activity were conducted in order to know the influence of
hydrolysis to the antioxidant and antihypertensive activity.
The SDS-PAGE shows high similarity of equine milk protein profile from
Indonesia with European breeding equine milk. The SDS-PAGE also shows that
equine casein is more susceptible to both enzymes than the whey. Bromelain was
effective in hydrolyzing all type of casein, protein no. 10, and lactoferrin-like
proteins, while the F11.4 protease was effective to hydrolyze -like casein, lactoglobulin I, lysozyme, protein no. 10 and lactoferrin-like protein. Two new
protein band with rather high molecular weight (MW) were produced by
bromelain. Meanwhile, F11.4 proteases did not generate new protein/peptide
bands, which indicated a much smaller peptides product.
Hydrolysis enhanced the bioactivity of equine casein. The highest radical
scavenging and reducing power activity were obtained using bromelain and F11.4
protease after 60–90 min incubation times. The highest radical scavenging activity
was equal to 124–150 ppm ascorbic acid‘s activity at β5 mg solubilized protein.
Meanwhile, the highest reducing power was 3–4 times higher than 100 M
ascorbic acid‘s activity, at 10 mg solubilized protein. The highest ACE inhibitory
specific activity was obtained using bromelain on casein after 90 min incubation
times. The ACE inhibitory activity was 84.75±0.71% at 50 µg protein content,
which is close to the 1 mg mL-1 Captopril‘s activity (λ7.γκ%). The enhanced
bioactivities might be related to the release of small peptides from equine casein
by both bromelain and F11.4 protease activity.
Keywords: equine milk, antioxidant, antihypertensive, SDS-PAGE, casein, whey
©Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PROFIL PROTEIN, AKTIVITAS ANTIOKSIDAN, DAN
INHIBITOR ACE DARI SUSU KUDA
DAN HIDROLISATNYA
MUHAMMAD NOVIANTO BAYU SAPUTRO
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof Dr Ir Sedarnawati Yasni, MAgr
Judul Tesis : Profil Protein, Aktivitas Antioksidan, dan Inhibitor ACE dari Susu
Kuda dan Hidrolisatnya
Nama
: Muhammad Novianto Bayu Saputro
NIM
: F251120021
Komisi Pembimbing
Prof Dr Ir Maggy T. Suhartono
Ketua
Dr Ir Nurheni Sri Palupi, MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Pangan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Harsi D. Kusumaningrum
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
27 Juli 2016
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala ridho dan karunia-Nya sehingga Tesis yang berjudul ―Profil Protein,
Aktivitas Antioksidan, dan Inhibitor ACE dari Susu Kuda dan Hidrolisatnya‖
berhasil diselesaikan. Penulis mengucapkan terima kasih kepada proyek Penelitian
Unggulan, DIPA IPB (kode MAK 2013.089.521219) yang telah mendanai
penelitian ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih dan memberikan penghargaan yang
tak terhingga kepada:
1 Ibu Prof Dr Ir Maggy Thenawidjaja Suhartono dan Ibu Dr Ir Nurheni Sri
Palupi, MSi selaku komisi pembimbing atas semua waktu, ilmu, bimbingan,
arahan, dan motivasi selama masa studi, perencanan dan pelaksanaan
penelitian, penulisan laporan, penulisan jurnal, dan laporan akhir sehingga
tesis ini dapat terselesaikan dengan baik.
2 Ibu Prof Dr Ir Sedarnawati Yasni, MAgr selaku Penguji di luar komisi atas
semua waktu, saran dan kritik demi kesempurnaan karya tulis ini.
3 Ibu Dr Ir Endang Prangdimurti, MSi selaku perwakilan departemen Ilmu
Pangan dan juga para dosen atas semua ilmu yang telah diberikan selama
masa perkuliahan.
4 Bapak Prof Dr Ir Sony Suharsono, DEA selaku Kepala Pusat Penelitian
Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB atas ijin penggunaan
fasilitas laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia di gedung Pusat Antar
Universitas IPB.
5 Ibu Ika Malikah dan teknisi lainnya atas semua ilmu, teknik, dan semangat
kerja sehingga kegiatan penelitian ini dapat berjalan dengan lancar.
6 Bapak, Ibu, dan adinda Awalia Indahsaputri atas semua doa, dukungan moral
dan finansial sehingga penulis dapat menyelesaikan studinya dengan baik.
7 Rekan-rekan seperjuangan peptida bioaktif, antara lain: Diana, Mba Ino,
Silvie atas kebersamaannya selama masa pelaksanaan penelitian.
8 Para sahabat, yaitu Fajri, Kamil, Danang, Edo, Reno atas semua doa,
semangat, dukungan, dan bantuan sehingga tesis ini dapat terselesaikan
dengan baik.
9 Rekan-rekan Ilmu Pangan atas semua kebersamaan dan kerjasamanya selama
menempuh studi di program studi Ilmu Pangan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2016
Muhammad Novianto Bayu Saputro
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
xiv
DAFTAR GAMBAR
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
xv
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Hipotesis Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
2
3
3
3
3
2 TINJAUAN PUSTAKA
Karakter Komponen Nutrisi Susu Kuda
Sifat Fungsional Beberapa Protein Susu Kuda
Protease
Aplikasi Protease dalam Pembuatan Peptida Bioaktif
Bromelin
Bacillus licheniformis Galur F11.4 Sebagai Bakteri Proteolitik
Peptida Bioaktif
Peptida Antioksidan
Peptida Inhibitor Angiotensin-I-Converting Enzyme (ACE)
3
3
5
5
7
8
9
9
10
12
3 METODE
Waktu dan Lokasi Penelitian
Bahan Penelitian
Peralatan Penelitian
Metode Penelitian
14
14
14
15
15
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Profil Protein Susu Kuda
Profil Hidrolisat Kasein dan Whey Susu Kuda
Aktivitas Antioksidan Susu Kuda dan Hidrolisatnya
Aktivitas Penghambatan ACE oleh Susu Kuda dan Hidrolisatnya
22
22
24
27
30
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
34
34
34
DAFTAR PUSTAKA
34
LAMPIRAN
40
RIWAYAT HIDUP
52
DAFTAR TABEL
1 Komposisi total zat gizi pada berbagai jenis susu
2 Konsentrasi kasein dan whey protein (g kg-1) pada susu kuda, ASI,
dan susu sapi
3 Kondisi hidrolisis dan protease yang digunakan untuk menghasilkan
berbagai peptida bioaktif
4 Sumber, jenis, cara hidrolisis, dan sifat fungsional beberapa contoh
peptida bioaktif
5 Metode Bergmeyer dan Grassel (1983) dengan modifikasi.
6 Perbandingan jumlah pereaksi yang digunakan untuk membuat gel
pemisah dan penahan
7 Prosedur uji Fe reducing power
8 Prosedur uji penghambatan ACE
6
7
8
11
18
19
20
21
DAFTAR GAMBAR
1 Peptida bioaktif asal susu dan sifat fungsionalnya. Sumber: Korhonen
(2009).
2 Mekanisme peptida bioaktif sebagai antioksidan, antara lain: (1)
pengkelat logam, (2) radical scavenging, dan (3) sebagai pelindung.
Sumber: Yoshinori et al. 2010).
3 Peran ACE di dalam pengaturan tekanan pembuluh darah. Sumber:
Li et al. 2004.
4 Kecenderungan beberapa asam amino untuk berikatan dengan sisi
aktif ACE pada ujung 3 C terminal. Sumber: Wilson et al. (2011).
5 Tiga tahap utama rancangan penelitian.
6 Perbandingan antara profil SDS-PAGE susu kuda dari Indonesia dan
beberapa studi terdahulu, serta susu sapi dan ASI. Gambar A, protein
susu skim dari kuda poni pada gel 12% (Miranda et al. 2004); B, susu
kuda skim pada gel 15% (Inglingstad et al. 2010); S, K, dan W = susu
skim, kasein 10% (b/v), dan konsentrat whey; C dan D, susu sapi dan
ASI pada gel 15% (Inglingstad et al. 2010).
7 Pengaruh hidrolisis terhadap profil protein kasein susu kuda oleh
enzim bromelin (A) dan protease F11.4 (B). Pita protein yang
terhidrolisis ditunjukkan oleh tanda panah. Pita protein baru
ditunjukkan oleh tanda panah dan abjad. M1 dan M2 ialah penanda
protein ber-BM tinggi dan rendah. Gel diwarnai dengan perak nitrat.
8 Hidrolisis kasein oleh kimosin pada gel poliakrilamida 15%.
Keterangan: eCN, kasein kuda; bGMP, glikomakropeptida sapi.
Fragmen a, b dan e ialah hasil hidrolisis kasein kuda. Sumber: Egito
et al. 2001.
9 Pengaruh hidrolisis terhadap profil protein whey susu kuda oleh
enzim bromelin (A) dan protease F11.4 (B). Pita protein yang
terhidrolisis ditunjukkan oleh tanda panah. Pita protein baru
ditunjukkan oleh tanda panah dan abjad. M1 dan M2 ialah penanda
protein ber-BM tinggi dan rendah. Gel diwarnai dengan CBB R-250.
12
13
13
14
16
23
25
25
26
10 Supramolekul kasein distabilkan oleh -kasein dan nanokluster CaP. Gambar A, model McMahon dan Oommen (2008) berdasarkan
hasil TEM; dan B, model Walstra (1999) di dalam Phadungath (2005)
11 Aktivitas antioksidan DPPH∙ radical scavenging (A) dan Fe reducing
power (B) dari kasein dan whey susu kuda.
12 Pengaruh hidrolisis terhadap aktivitas spesifik DPPH∙ radical
scavenging (A) dan Fe reducing power (B) dari kasein dan whey susu
kuda. Keterangan: CB, kasein + bromelin; CF, kasein + protease
F11.4; WB, whey + bromelin; dan WF, whey + protease F11.4.
13 Aktivitas penghambatan ACE dari kasein dan whey susu kuda.
14 Pengaruh hidrolisis terhadap aktivitas spesifik penghambatan ACE
dari kasein dan whey susu kuda. Keterangan: CB, kasein + bromelin;
CF, kasein + protease F11.4; WB, whey + bromelin; dan WF, whey +
protease F11.4.
15 Mekanisme absorbsi peptida bioaktif. Sumber: Wada dan Lönnerdal
(2014).
27
29
30
31
32
33
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Prosedur pembuatan pereaksi metode Bradford
Kurva standar protein
Prosedur pembuatan pereaksi metode Bergmeyer dan Grassel (1983)
Prosedur pembuatan pereaksi metode SDS-PAGE
Pereaksi untuk prosedur pewarnaan Coomassie Blue
Pereaksi untuk prosedur pewarnaan Silver Staining
Prosedur pewarnaan Silver Staining
Korelasi antara konsentrasi asam askorbat dan aktivitas DPPH∙
radical scavenging
Prosedur pembuatan pereaksi metode Fe reducing power
Prosedur pembuatan pereaksi metode inhibitor ACE
Kadar protein terlarut susu kuda dan hidrolisatnya
Uji statistika aktivitas DPPH∙ radical scavenging spesifik dari
hidrolisat kasein- bromelin (CB)
Uji statistika aktivitas DPPH∙ radical scavenging spesifik dari
hidrolisat kasein-F11.4 (CF)
Uji statistika aktivitas reducing power spesifik dari hidrolisat kasein
Uji statistika aktivitas penghambatan ACE spesifik dari hidrolisat
kasein
41
41
42
43
44
44
44
45
45
46
47
48
49
50
51
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Susu kuda (Equus caballus) telah dikonsumsi secara tradisional pada
masyarakat di beberapa wilayah dunia, khususnya Asia Tengah, Mongolia, dan
Rusia, seperti Kazakhstan, Kyrgyzstan, and Tajikistan. Selain memberikan nutrisi
yang baik, susu kuda dipercaya dan telah digunakan untuk mencegah dan
mengobati berbagai macam penyakit, seperti: kelainan metabolik, gastrointestinal,
liver, arteriosklerosis, artritis, bahkan kanker (Claeys et al. 2014). Di Indonesia,
minuman fermentasi susu kuda telah dipasarkan dan diklaim sifat fungsionalnya.
Meskipun demikian studi mekanisme fungsionalnya masih sangat terbatas.
Beberapa sifat fungsional yang telah diteliti antara lain: karakter antimikroba susu
kuda autofermentasi asal Sumba dan Sumbawa, Indonesia Timur (Hermawati
2005; Detha, et al. 2013); dan inhibitor angiotensin-I-converting enzyme (ACE)
dari Koumiss, yaitu minuman fermentasi susu kuda yang terkenal di Mongolia dan
Rusia (Chen et al. 2010). Sebagai jenis susu yang memiliki rasio kasein/whey
yang rendah, susu kuda lebih mudah dicerna dan lebih tidak berpotensi
menimbulkan alergi dibandingkan susu sapi. Oleh sebab itu, susu kuda lebih
cocok untuk digunakan sebagai pangan ataupun ingredien fungsional pengganti
susu sapi (Salimei dan Fantuz 2012; Uniacke-Lowe et al. 2010). Aktivitas
penghambatan ACE berkaitan dengan karakter antihipertensi komponen pangan,
dan merupakan mekanisme utama obat-obatan antihipertensi komersial, seperti
Captopril, Enalapril, Lisinopril. Penelitian Chen et al. (2010) mengindikasikan
bahwa susu kuda merupakan sumber peptida-peptida inhibitor ACE yang
potensial. Meskipun demikian, pelepasan peptida-peptida ini sangat dipengaruhi
oleh cara hidrolisisnya.
Bromelin (EC.3.4.22.4) merupakan enzim sistein protease asal tumbuhan
Bromeliaceae, khususnya nanas (Ananas comosus L.) (González-Rábade et al.
2011). Selain bersifat food grade, enzim ini juga dilaporkan memiliki aktivitas
fibrinolitik, antitumor, antiedematus, antineoplastik, antitrombosis, dan
antiinflamasi (González-Rábade et al. 2011). Di sisi lain, protease F11.4 dari
Bacillus licheniformis galur F11.4 telah digunakan untuk memproduksi peptida
kolagen bioaktif penghambat ACE dan antiproliferasi pada sel kanker serviks dan
kolon (Baehaki et al. 2016). Bakteri ini merupakan hasil modifikasi genetik
dengan mendelesi gen ∆pga dan ∆chiBA sehingga produksi proteasenya
meningkat (Hoffmann et al. 2010). Pada penelitian ini, kedua enzim yang sama
akan diaplikasikan terhadap sumber protein yang berbeda –yaitu kasein dan whey
susu kuda, untuk menghasilkan peptida bioaktif yang dapat bertindak sebagai
antioksidan dan penghambat ACE.
Studi proteomik telah menjadi salah satu upaya untuk menjelaskan
hubungan antara bioaktivitas dan profil protein asal susu (Roncada et al. 2012).
Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
merupakan salah satu teknik proteomik yang paling sering digunakan untuk
menganalisis dan mengisolasi protein dari suatu campuran berdasarkan bobot
molekul (BM)-nya (Roncada et al. 2012). Teknik ini telah digunakan pada
beberapa studi susu kuda, antara lain: studi komposisi protein, kerentanan
2
hidrolisisnya, ataupun perubahan profil protein susu kuda selama masa simpan
(Egito et al. 2003; Inglingstad et al. 2010; Miranda et al. 2004). Pada penelitian
ini, SDS-PAGE digunakan untuk mengamati perubahan profil protein setelah
dihidrolisis.
Tekanan pembuluh darah diatur oleh aktivitas angiotensin-I-converting
enzyme (ACE) (EC.3.4.15.1) atau enzim pengonversi angiotensin-I. Enzim ini
merupakan bagian dari sistem renin angiotensin. Enzim ACE ialah enzim
metalopeptidase yang menghidrolisis 2 asam amino (His, Leu) dari ujung
karboksil protein non aktif angiotensin I, sehingga dihasilkan protein aktif
angiotensin II. Angiotensin II merupakan vasokonstriktor kuat dan memicu
sekresi hormon aldosteron yang akan meningkatkan retensi air dan garam mineral,
sehingga tekanan darah akan meningkat. Selain itu, enzim ACE juga
mendegradasi bradikinin, yaitu protein vasodilator kuat yang dihasilkan dari
sistem kallikrein kinin (Li et al. 2004; Wilson et al. 2011). Hipertensi dan stres
oksidatif merupakan pemicu arteriosklerosis yaitu proses penyumbatan pembuluh
darah yang menyebabkan penyakit jantung koroner dan stroke (Fearon dan Faux
2009; WHO 2013).
Efek samping jangka panjang dari obat-obatan antihipertensi sintetik telah
diteliti dan dilaporkan (Flather et al. 2000; Hall dan Israili 1992). Hal tersebut
telah mendorong eksplorasi komponen bioaktif asal pangan yang dinilai lebih
alami dan aman. Peptida-peptida bioaktif tidak hanya menghambat ACE secara in
vitro, tetapi juga menurunkan tekanan darah secara in vivo dan uji klinis.
(Hernandez-Ledesma et al. 2011; Nongonierma dan FitzGerald 2015).
Keunggulan lain dari peptida bioaktif ialah karakter multifungsionalnya. Peptida
ini tidak hanya memiliki karakter antihipertensi, tetapi juga antioksidan,
antihiperkolesterolemik, antiinflamasi sehingga berperan untuk mencegah dan
mengatasi penyakit kardiovaskular secara sistematik (Hernandez-Ledesma et al.
2011; Nongonierma dan FitzGerald 2015).
Perumusan Masalah
Pertumbuhan faktor resiko penyakit kardiovaskular dapat dicegah melalui
sifat fungsional peptida bioaktif sebagai antioksidan dan antihipertensi. Di
Indonesia, susu kuda telah diketahui secara empiris dapat mengobati berbagai
macam penyakit, termasuk kardiovaskular. Meskipun demikian, data penelitian
yang mendukung efikasi tersebut masih sangat terbatas.
Di Indonesia, hingga saat ini, susu kuda masih dikomersialkan dalam
bentuk susu saja. Sebagai upaya untuk meningkatkan nilai tambah susu kuda,
maka perlu dilakukan diversifikasi dan pengayaan produk. Proses hidrolisis
merupakan salah satu teknik yang dapat digunakan untuk meningkatkan nilai
tambah bahan pangan. Nilai tambah bahan pangan ditingkatkan dengan
dihasilkannya berbagai peptida-peptida bioaktif dengan karakter fungsional yang
beragam. Di lain sisi, enzim protease F11.4 dan bromelin –yang terkarakterisasi
dengan baik, telah digunakan untuk memproduksi peptida bioaktif dari kolagen
ikan bandeng dan kerang tiram yang dapat bersifat sebagai antihipertensi,
antioksidan, antiproliferasi sel kanker, dan antimikroba.
3
Tujuan Penelitian
Peptida-peptida bioaktif bersifat inaktif pada protein asalnya dan menjadi
aktif setelah dilepaskan, baik melalui proses pencernaan, fermentasi mikroba,
proteolisis enzim, ataupun proses pengolahan pangan. Studi peptida bioaktif susu
kuda masih sangat terbatas, sehingga menjadi peluang untuk diteliti dan
dikembangkan. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis profil protein,
aktivitas antioksidan dan penghambatan ACE dari kasein, whey susu kuda, dan
hidrolisatnya.
Hipotesis Penelitian
Hipotesis yang ingin dibuktikan pada penelitian ini, yaitu (1) hidrolisis
protein (kasein dan whey) susu kuda oleh enzim protease B. licheniformis F11.4
dan bromelin akan menghasilkan profil protein (SDS-PAGE) hidrolisat yang
berbeda, (2) dari hidrolisis tersebut akan dihasilkan peptida-peptida antioksidan
dan ACE inhibitor. Profil SDS-PAGE hidrolisat yang berbeda menunjukkan
perbedaan titik potong kedua enzim terhadap substrat yang spesifik.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini memberikan informasi tentang: (1) profil protein susu skim,
kasein, dan whey dari kuda asal Indonesia; (2) perubahan profil protein (SDSPAGE) selama hidrolisis; dan (3) korelasinya dengan aktivitas antioksidan dan
penghambatan ACE kasein dan whey susu kuda. Informasi ini diperlukan sebagai
dasar untuk memproduksi peptida-peptida bioaktif asal susu kuda.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini dibatasi pada aspek profil protein, yaitu profil SDS-PAGE dari
susu skim, kasein, whey, dan hidrolisatnya serta korelasinya dengan aktivitas
DPPH∙ radical scavenging, Fe reducing power, dan penghambatan ACE secara in
vitro. Produksi peptida bioaktif dibatasi pada peptida-peptida hidrolisat kasar
kasein dan whey susu kuda.
2 TINJAUAN PUSTAKA
Karakter Komponen Nutrisi Susu Kuda
Komposisi susu kuda ditentukan oleh beberapa faktor, yaitu genetik
(galur) dan lingkungan (jenis makanan, cara pemeliharaan dan pemerahan). Oleh
sebab itu, komposisi susu kuda dari berbagai daerah tidaklah selalu sama. Pada
umumnya susu kuda mengandung 102 g total padatan, 21.4 g protein, 0.5–2.0 g
lemak, 1.5–2.8 g protein, 5.8–7.0 g laktosa, dan 9.3–11.6 g abu per 100 g susu
(Park 2009). Komposisi ini sangat unik bila dibandingkan dengan beberapa
4
spesies penghasil susu lainnya, seperti sapi, kambing, domba, dan kerbau. Kadar
protein, lemak, garam anorganik susu kuda lebih rendah, sedangkan kadar
laktosanya lebih tinggi bila dibandingkan dengan susu sapi. Kadar laktosa susu
kuda mendekati kadar laktosa Air Susu Ibu (ASI) (Tabel 1). Oleh sebab itu, bila
dibandingkan dengan susu dari spesies lainnya, karakter nutrisi susu kuda lebih
mendekati ASI.
Susu kuda memiliki karakter tolerabilitas dan digestibilitas yang jauh lebih
baik dibandingkan dengan susu sapi (Salimei dan Fantuz 2012). Percobaan
Inglingstad et al. (2010) menunjukkan bahwa protein susu kuda lebih mudah
dicerna oleh enzim-enzim protease gastrointestinal. Uniacke-Lowe et al. (2010)
menyatakan bahwa karakter digestibilitas protein susu sangat ditentukan oleh
rasio kasein/whey nya. Data ekplorasi menunjukkan bahwa rasio kasein terhadap
whey pada susu kuda, jauh lebih mendekati karakter rasio kasein/whey ASI (Tabel
1). Hal ini menunjukkan potensi susu kuda sebagai pengganti susu sapi,
khususnya bagi orang yang memiliki masalah alergi. Hal ini disebabkan karena
karakter digestibilitas protein susu kuda yang lebih tinggi bila dibandingkan
dengan susu sapi dan kambing. Potensi ini juga didukung oleh kajian Roncada et
al. (2012) yang menunjukkan bahwa sekuen -kasein susu famili Equidae (kuda
dan keledai) sangat berkerabat dekat dengan sekuen kasein susu manusia (ASI).
Profil komposisi protein susu kuda hampir mirip dengan ASI, bila
dibandingkan dengan susu sapi. Susu kuda mengandung lebih sedikit kasein
(