UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hubungan Kuantitatif Struktur Aktifitas Model Hansch
Merumuskan hubungan kuantitatif sementara antara struktur – aktifitas
biologis dari senyawa yang jumlahnya terbatas dengan menggunakan statistik analisa regresi.
4.1.1 Pemilihan Deskriptor.
Parameter sifat kimia fisika yang sering digunakan dalam HKSA model Hansch adalah parameter hidrofobik, elektronik dan sterik. Siswandono, 2008.
Pada penelitian ini dipilih satu deskriptor yang menggambarkan masing- masing parameter model HKSA Hansch. Pada penelitian ini, dipilih koefisien
partisi log P untuk parameter hidrofobik lipofilik, CPSA Charged Partial Surface Areas
untuk parameter elektronik, dan Harary Index untuk parameter sterik.
Program komputer yang digunakan untuk memperoleh nilai HKSA ini adalah CDK Descriptor, yang digunakan untuk mencari nilai CPSA, dan Marvinskecth ,
digunakan untuk mencari nilai LogP dan Harary Index. Untuk memperoleh nilai elektronik, menggunakan program CDK Descriptor,
pada folder electronic → Charged Partial Surface Areas → Go. Dengan
menggunakan Marvin sketch, senyawa yang diuji diiubah dalam bentuk aromatis dan dibersihkan secara 3 dimensi, lalu pilih calculating
→ partition → LogP untuk memperoleh nilai logP. Selanjutnya, untuk nilai sterik pilih calculating
→ geometrical
→ Topology Analysis → Harary Index → ok. Untuk setiap nilai deskriptor yang diperoleh, masing-masing dikelompokkan
pada senyawanya membentuk kelompok training set, test set, dan sample set. 4.1.2
Training Set Training set
menggunakan 5 senyawa turunan asam sinamat yang telah diketahui aktifitas anti tuberkulosisnya terhadap bakteri spesies Mycobacterium
tuberculosis
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
H37Rv. Pemilihan data training set maupun test set didasarkan pada kemiripan struktur senyawa dari data yang tersedia. Training set ini digunakan untuk
memperoleh persamaan HKSA model Hansch.
Tabel 4. Hasil HKSA Training set.
N o
Nama Senyawa MIC
uM Log
MIC LogP
Log CPSA
Log Sterik
Log MIC Uji
uM MIC Uji
1 4-O-geranylcoumaric acid 66.8
1.824 5.3
2.431 1.821 1.826
66.989 2 3-O-prenylcoumaric acid
172 2.235
3.4 2.329 1.674
2.233 171.230
4 4-coumaric acid 244
2.387 1.67
2.095 1.459 2.386
243.311 5 Trans-cinnamic acid
270 2.431
1.94 2.166 1.399
2.432 270.733
3 3,4-methylenedioxycinnamic
acid 312
2.494 1.63
2.166 1.580 2.495
313.130
Persamaan Hansch yang diperoleh: Log MIC = a logP + b LogCPSA + c LogSterik + d
Log MIC = -0.2909LogP+1.6411LogCPSA-0.1497Log sterik- 0.3491
R
2
=0.999964 Dari persaman yang diperoleh diatas, deskriptor variabel dari parameter
fisika kimia Log CPSA elektronik, Log P koefisien partisi, dan Log Sterik sterik berpengaruh terhadap aktifitas anti tuberculosis secara linier.
Persamaan diatas, digunakan untuk mecari nilai MIC uji, dengan memasukkan nilai LogP, LogCPSA, dan Log Sterik. Hasil nilai MIC uji atau prediksi yang
diperoleh masing-masing senyawa sudah mendekati nilai MIC sebenarnya in vitro
. Nilai R
2
=0.999964 menunjukan nilai hubungan linearitas antara parameter sifat fisika kimia struktur senyawa tehadap aktifitas anti tuberkulosis. Nilai r
2
harus ≤1, dan nilai r
2
dapat diterima dengan nilai diatas 0,8 80, jadi nilai r
2
yang diperoleh dari persamaan diatas dapat diterima Rivai, 2014.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.1.3 Test Set
Test set juga menggunakan 5 senyawa turunan asam sinamat yang telah
diketahui aktifitas anti tuberkulosisnya terhadap bakteri spesies Mycobacterium tuberculosis
H37Rv. Test set bertujuan untuk menilai dan memvalidasi persamaan HKSA model Hansch yang dihasilkan dari training set yang dilihat dari nilai
RMSD Root Mean Square Deviation. Menggunakan persamaan yang diperoleh dari training set, didapatkan nilai
MIC uji test set dengan memasukkan nilai LogP, Log CPSa, dan Log Sterik masing-masing senyawa test set. Kemudian dihitung perbedaaan MIC uji dengan
MIC in vitro dengsn nilai Standar Deviation SD dan Root Mean Square Deviation
RMSD. Tabel 5. Hasil HKSA Test Set.
N o
Nama Senyawa MIC
uM Log
MIC LogP
Log CPSA
Log Sterik
Log MIC Uji
MIC Uji uM
SD SD2
1 Ehretiolide 41
1.612 8.73 2.659
2.363 1.122 13.244
-0.490 0.240
2 4-O-prenylcoumaric acid 86.1 1.935 3.4
2.351 1.669 2.270
186.591 0.335
0.112 3 3-coumaric acid
366 2.563 1.67
2.095 1.461 2.385
243.134 -0.177
0.031 4 4-coumaric acid
244 2.387 1.67
2.095 1.459 2.386
243.311 -0.001
1.51 5 EPMS
242 2.383 2.41
2.413 1.595 2.670
468.755 0.287
0.082 Total
SD2 0.467
RMSD 0.683
Nilai RMSD yang diperoleh dari nilai Log MIC in vitro dan Log MIC uji: SD = Log MIC uji
– Log MIC in vitro RMSD diperoleh dengan Microsoft Exel dengan formula =SQRT
∑SD
2
Hasil RMSD yand diperoleh dari test set adalah 0.683 dimana masih dalam rentang nilai yang dapat diterima yaitu lebih kecil atau sama dengan 2. Hal ini
membuktikan bahwa nilai RMSD masih dapat diterima dan persamaan linear yang diperoleh dinyatakan akurat.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.1.4 Sample Set
Senyawa uji dibuat dengan menggunakan program Marvin sketch. Sample set adalah senyawa nitrasi EPMS yang sudah ada disintesis tetapi belum ada data
pengujian terhadap Mycobacterium tuberculosis, sehingga menjadi dasar untuk mengetahui aktivitasnya terhadap bakteri tersebut. Senyawa uji yang digunakan
yaitu, 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde, 3-nitrocinnamic acid, 4-nitrophenyl 4- coumarate, 4-nitrocinnamic acid
, 2E
‐3‐4‐methoxyphenyl‐N,N‐dioxoprop‐2‐ enamide, 2E
‐3‐4‐methoxy‐3,5‐dinitrophenyl‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide. Nilai MIC prediksi senyawa uji sampel diperoleh dengan memasukkan nilai
Alog P, Log CPSA, dan Log Sterik sampel set ke dalam persamaan HKSA yang diperoleh sebelumnya. Dari persamaan, diperolehlah nilai MIC uji atau prediksi
sampel. Tabel 6. Hasil HKSA Sample Set.
No Nama Senyawa
ALogP Log
CPSA Log
Sterik Log
MIC Uji
MIC Uji
uM 1
4-nitrophenyl 4-coumarate 3.41
2.304 1.821 2.167 147.035
2 3-nitrocinnamic acid
1.9 2.018 1.564 2.176
150.111
3 2E
‐3‐4‐methoxy‐3,5‐ dinitrophenyl
‐N,N‐dioxoprop‐2‐ enamide
1.59 2.048 1.839 2.274
188.181
4 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde
2.48 2.184 1.573 2.278
189.929 5
4-nitrocinnamic acid 1.9
2.158 1.560 2.406 255.09
6 2E
‐3‐4‐methoxyphenyl‐N,N‐ dioxoprop
‐2‐enamide 1.66
2.235 1.601 2.596 394.664
Dari data diatas, nilai MIC uji prediksi terhadap Mycobacterium tuberculosis berturut-turut dari yang paling kecil adalah 4-nitrophenyl 4-coumarate 147.035
uM, 3-nitrocinnamic acid 150.111 uM, 2E ‐3‐4‐methoxy‐3,5‐dinitrophenyl‐
N,N ‐dioxoprop‐2‐enamide 188.181 uM, 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde
189.929 uM, 4-nitrocinnamic acid 255.09 uM, 2E ‐3‐4‐methoxyphenyl‐
N,N ‐dioxoprop‐2‐enamide 394.664 uM. Hal ini menunjukan bahwa dari sampel
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yang diuji, senyawa yang memiliki MIC terendah adalah 4-nitrophenyl 4- coumarate
dengan MIC=147.035 uM dan diprediksi sebagai senyawa yang paling tinggi aktifitasnya sebagai anti tuberkulosis.
Dibandingkan dengan senyawa lead compound EPMS dengan aktifitas 242 uM dan asam sinamat 270 uM, terdapat 4 dari 6 senyawa uji memiliki prediksi
aktifitas anti tuberkulosis yang lebih baik MIC lebih rendah, yaitu 2-nitro-4- methylcinnamaldehyde
189.929 uM, 3-nitrocinnamic acid 150.111 uM, 4- nitrophenyl
4-coumarate 147.035uM,
dan 2E
‐3‐4‐methoxy‐3,5‐ dinitrophenyl
‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide 188.181uM. Dibandingkan dengan senyawa 3-coumaric acid 243.13 uM
, senyawa 3- nitrocinnamic acid
150.11 uM memiliki nilai MIC uji prediksi yang lebih rendah, sehingga menunjukan bahwa perubahan gugus hidroksi OH pada rantai
samping senyawa asam kumarat menjadi nitro NO2, pada posisi yang sama yaitu meta, meningkatkan aktifitas anti tuberkulosis senyawa turunan asam
sinamat. Berdasarkan struktur molekul, senyawa 3-nitrocinnamic acid 150.111 uM
dan 4-nitrocinnamic acid 255.09 uM hanya terdapat perbedaan letak gugus nitro NO
2
pada cincin aromatis, namun 3-nitrocinnamic acid memiliki MIC uji lebih rendah dan affinitas yang lebih rendah juga, sehingga dianggap memiliki aktifitas
antituberkulosis yang lebih baik dibanding 4-nitrocinnamic acid. 4.2
Penambatan Molekul dengan Autodock Vina 4.2.1
Penyiapan Ligand Ligand yang digunakan adalah senyawa uji yang telah berikatan dengan
NAD+, karena mengikuti mekanisme kerja Isoniazid yang berikatan dengan NAD+ membentuk INADH sebelum berikatan pada reseptor inhA dan
menimbulkan aktifitas. Stigliani et al, 2008. Sedangkan kontrol positif Isoniazid diambil dari situs PubChem. Selanjutnya,
senyawa-senyawa uji tersebut diubah menjadi bentuk aromatis dan dibersihkan secara 3 dimensi.
Optimasi ligand dilakukan dengan AutoDockTools dengan cara mengatur torsi
, dan mengubah formatnya menjadi .pdbqt. Berikut adalah contoh gambar struktur sampel yang telah beikatan:
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 3. NAD+ https:pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
Gambar 4. 4-nitrophenyl 4-coumarate-NAD+ Marvin Sketch 4.2.2
Penyiapan Reseptor Reseptor yang digunakan adalah inhA PDB:1ZID yang diunggah dari situs
Protein Data Bank http:www.rcsb.orgpdb
. Reseptor dioptimasi dengan program
Discovery studio menghilangkan ligand-ligand yang masih ada berikatan pada reseptor, Scripts
– Selections – Select Ligand – delete. Selanjutnya menghilangkan molekul air agar tidak mengganggu penambatan dan agar pada
saat penambatan, dan hanya ligang uji lah yang akan menambat, Scripts –
Selection – Select Water Molekules – delete. Selanjutnya penambahan molekul
hidrogen dengan AutoDock Tools , Edit – Hidrogen – Add, dan disimpan dalam
format .pdbqt.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 5. Reseptor 1ZID http:www.rcsb.orgpdb
4.2.3 Penambatan Molekular
Molecular docking atau penambatan molekul adalah prosedur komputasional
yang digunakan untuk memprediksi ikatan nonkovalen makromolekul, lebih sering, sebuah molekul besar reseptor dan sebuah molekul kecil ligan secara
efisien, dimulai dari struktur-struktur yang tidak saling berikatan, struktur yang ditemukandari simulasi dinamika molekul, homology modeling, dan lain-lain.
Tujuan dari molecular docking adalah untuk memprediksi konformasi ikatan dan afinitas pengikatan. Arry yanuar, 2012
Sebelum memulai penambatan, pada folder vina harus sudah ada file-file reseptor 1ZID.pdbqt, ligan 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde.pdbqt, conf.txt,
vina, vina_license, dan vina split. Pada file conf.txt, diisi gridbox sesuai pengaturan dengan size 70x70x70, dan autocenter.
Penambatan dimulai dengan membuka program Command Prompt, dan ditulis perintah sebagai berikut.
Vina –config conf.txt –log log.txt
Setelah proses penambatan selesai maka akan muncul file baru yang berisi nilai hasil penambatan molekul setiap sampel uji, lalu dari 9 nilai yang muncul dari masing-masing
sampel, diambil nilai pertama yang dianggap paling baik.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 7. Hasil Penambatan Molekular Sampel Uji. No Nama Sampel
Affinitas kcalmol
4 4-nitrophenyl 4-coumarate
-11.2 1
2-nitro-4-methylcinnamaldehyde -10.9
2 3-nitrocinnamic acid
-10.5 5
2E ‐3‐4‐methoxyphenyl‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide -10.2
6 2E
‐3‐4‐methoxy‐3,5‐dinitrophenyl‐N,N‐dioxoprop‐ 2
‐enamide -9.6
3 4-nitrocinnamic acid
-9.2
7 Isoniazid INH
-10.5
Hasil penambatan molekuler adalah afinitas ikatan antara ligan dengan reseptor yang dinyatakan dengan energi bebas Gibb. Nilai affinitas yang muncul
adalah nilai entalpi energi Gibb, dimana nilai - 0 menunjukan reaksi eksotermik yang melepaskan panas. Bresnick, 2004.
Dari hasil penambatan molekul, senyawa yang memiliki affinitas energi yang paling rendah adalah 4-nitrophenyl 4-coumarate dengan -11.2 kcalmol, diikuti
oleh 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde -10.9 kcalmol, 3-nitrocinnamic acid -10.5 kcalmol, 2E
‐3‐4‐methoxyphenyl‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide -10.2 kcalmol, 2E
‐3‐4‐methoxy‐3,5‐dinitrophenyl‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide -9.6 kcalmol, dan 4-nitrocinnamic acid -9.2 kcalmol. Sedangkan kontrol positif INH memiliki
affinitas energy -10.5 kcalmol. Nilai affinitas energi yang rendah menunjukan ikatan yang stabil, sehingga,
semakin rendah nilai affinitas, maka semakin stabil dan lebih tidak reaktif energi yang dimaksud adalah energi bebas dari Gibb, G. Bresnick,2004
Dari data diatas, maka ligan senyawa uji yang memiliki nilai affinitas yang paling rendah dan ikatan yang paling stabil dengan reseptornya adalah 4-
nitrophenyl 4-coumarate.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.2.4 Visualisasi Hasil Penambatan Molekul
Visualisasi docking dilakukan dengan menggunaka program PyMol dan LigPlot. PyMol bertujuan untuk melihat posisi ligand di dalam situs tambatnya
pada reseptor secara tiga dimensi, sedangkan LigPlus bertujuan untuk memperoleh ikatan ligand dengan asam amino
– asam amino yang terdapat pada reseptor serta jarak masing-masing ikatan tersebut.
Tabel 8. Hasil Visualisasi Senyawa Uji dengan LigPlus. No Nama Senyawa
Nama Asam Amio Jarak Å
1 4-nitrophenyl 4-coumarate
Ser94 Gly96
Thr39 Ile15
Gly14 Val65
2.94 2.81
3.08 2.67
2.87 2.94
2 2-nitro-4-
methylcinnamaldehyde Lys165
Thr196 Ala22
Met147 2.84
3.12 2.94
3.29 3
3-nitrocinnamic acid Val65
Asp64 Gly14
Thr196 2.99
3.34 3.04
2.79 4
Isoniazid INH Leu63
Gly14 Ser94
Thr196 Gly96
3.15 2.96
2.72 3.17
2.88
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Sambungan 5
2E ‐3‐4‐methoxyphenyl‐N,N‐
dioxoprop ‐2‐enamide
Met147 Lys165
Gly96 Thr196
Lys118 3.08
3.02 2.96
2.98 3.05
6 2E
‐3‐4‐methoxy‐3,5‐ dinitrophenyl
‐N,N‐dioxoprop‐ 2
‐enamide Arg153
Asp150 Gln267
Ile21 Thr196
Asp148 2.95
2.50 2.97
3.01 2.97
3.04 7
4-nitrocinnamic acid Gln100
Met98 Gly96
3.24 2.79
2.83
Dari hasil visualisali dengan Ligplot dapat ditarik kesimpulan bahwa, perubahan molekul senyawa yang berikatan dengan NAD+ menimbulkan
perubahan konformasi ligand ikatan molekul dengan NAD+ dalam situs tambat reseptor, sehingga mengakibatkan perbedaan jenis dan jumlah ikatan yang
terbentuk dengan residu asam amino reseptor. Dari data diatas, terlihat bahwa semua sampel uji memiliki interaksi dengan
reseptor yang terlihat dari sam amino yang terikat. Sampel uji mengikat 3 – 6
asam amino reseptor secara bervariasi, sedangkan kontrol positif INH berikatan dengan 5 asam amino. Semakin banyak ikatan ligand dengan asam amino
reseptor, serta semakin dekat jarak antara ikatan tersebut, maka ikatan yang dihasilkan akan semakin kuat.
Senyawa uji yang memiliki afinitas terbaik -11.2 kcalmol, 4-nitrophenyl 4- coumarate
mengikat 6 asam amino, dan 3 diantaranya adalah asam amino yang sama diikat oleh kontrol positif INH yaitu Ser94, Gly96, dan Gly14. Senyawa uji
dengan affinitas ke-2, 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde -10.9 kcalmol mengikat 1 asam amino yang sama dengan INH yaitu Thr196 dengan jarak ikatan yang
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
lebih dekat. Sedangkan senyawa uji dengan affinitas yang sama dengan kontrol positif INH -10,5kcalmol, 3-nitrocinnamic acid mengikat 2 asam amino yang
sama dengan INH yaitu Gly14, dan Thr196. Tamires C. at all 2014, menyebutkan dalam penelitiannya bahwa gugus
ribose pada adenine dan pyrophosphate pada isoniazid+NADH INADH berpengaruh secara kuat terhadap interaksi INADH dengan inhA. Ia juga
menyebutkan bahwa, ikatan hidrogen memiliki peran penting dalam perhitungan nilai energi ikatan residu terhadap INADH, serta interaksi hidrofobik secara
signifikan berkontribusi pada beberapa residu asam amino yang penting, diantaranya adalah Val65, Ile16, dan Met147.
Keterangan: Hijau : C
Merah : O Biru : N
Putih : H Jingga : P
Gambar 6. Perbandingan hasil Visualisasi 4-nitrophenyl 4-coumarate dengan PyMol kiri dengan LigPlot kanan.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 9. Perbandingan Hasil Penambatan Molekular dengan HKSA Sampel. No
Nama Sampel Penambatan Molekul HKSA
Affinitas kcalmol MIC Uji
1 4-nitrophenyl 4-coumarate
-11.2 147.035
2 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde -10.9
189.929 3
3-nitrocinnamic acid -10.5
150.111 4
2E ‐3‐4‐methoxyphenyl‐N,N‐
dioxoprop ‐2‐enamide
-10.2 394.664
5 2E
‐3‐4‐methoxy‐3,5‐ dinitrophenyl
‐n,n‐dioxoprop‐2‐ enamide
-9.6 188.181
6 4-nitrocinnamic acid
-9.2 255.09
Dari perbandingan diatas, diketahui bahwa senyawa 4-nitrophenyl 4-coumarate memiliki nilai MIC terendah sekaligus didukung dengan
hasil docking energi affinitas ikatan terkecil, sehingga dapat disimpulkan bahwa 4-nitrophenyl 4-coumarate merupakan senyawa paling berpotensi
terhadap aktifitas anti tuberkulosis secara teoritis.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 5 PENUTUP
