menggunakan jarum inokulasi steril yang selanjutnya ditumbuhkan pada media PDA
Potatos Dextrose Agar segar yang telah diberi antibiotik kloramfenikol. Cawan
kemudian diinkubasi selama 5 hari pada suhu ruang. Setelah itu, isolat dipindahkan
ke agar miring dalam tabung dan diinkubasi selama 5 hari. Kultur selanjutnya di-
murnikan melalui isolasi spora tunggal dengan cara memasukkan air steril sebanyak
10 ml ke dalam tabung yang berisi isolat Rhizopus sp. tersebut dan di vortex hingga
sporanya larut. Setelah itu, larutan spora diencerkan hingga mencapai 10
5
kali. Sebanyak 1 µl larutan spora disebarkan pada
permukaan media Gellan gum. Kemudian spora diamati dibawah mikroskop, setiap
spora tunggal yang letaknya terpisah, diisolasi dan ditumbuhkan pada media PDA
segar. Spora yang tumbuh kemudian diidentifikasi berdasarkan morfologi
cendawan yaitu sporangiofor, sporangium dan sporangio-spora dengan menggunakan
kunci identifikasi Rifai 1973. Setelah itu, isolat dari spora tunggal dipindahkan ke
dalam 2 tabung, tabung pertama digunakan untuk pengujian selanjutnya dan tabung
yang kedua disimpan untuk keperluan koleksi.
II. Produksi Miselia 1. Pemilihan isolat
. Isolat-isolat murni yang telah
diidentifikasi selanjutnya ditumbuhkan pada cawan yang berisi PDA dan diinkubasi pada
suhu ruang selama 5 hari. Jumlah spora yang terbentuk pada masing-masing spesies
diukur dengan menggunakan Hema- sitometer. Ketiga isolat yang telah di-
identifikasi masing-masing ditumbuhkan pada 5 ml PDA dalam tabung reaksi
berdiameter 1.5 cm dan diinkubasi selama 5 hari pada suhu ruang. Pada hari ke-5, spora
dipanen dengan cara memasukkan air steril sebanyak 20 ml ke dalam tabung kultur, lalu
dihomogenkan hingga sporanya larut. Larutan spora selanjutnya diencerkan hingga
mencapai 10
5
kali pengenceran. Kemudian, 0.1 ml larutan spora yang telah diencerkan
dimasukkan ke dalam Hemasitometer dan di hitung jumlah sporanya di bawah mikroskop
dengan perbesaran 4x10. Percobaan ini dilakukan dengan 3 kali ulangan.
Koloni yang tumbuh diamati dan diukur diameternya setiap hari sampai kultur
berumur 5 hari. Isolat tersebut diseleksi berdasarkan pada pertumbuhan miselia dan
produksi spora. Isolat yang menghasilkan pertumbuhan miselia paling cepat tetapi
bersporulasi paling lambat atau menghasilkan spora dalam jumlah sedikit dipakai untuk
pengujian selanjutnya. Percobaan ini dilakukan dengan 3 kali ulangan.
2. Pemilihan media tumbuh dan konsentrasi gula
. Jenis media tumbuh dan kandungan gula
media sangat mempengaruhi pertumbuhan cendawan. Dua macam media cair, yaitu
ekstrak kentang dan ekstrak kedelai, dan enam penambahan konsentrasi gula , yaitu 0, 2, 3, 4, 5
dan 6 grL digunakan dalam penelitian ini. Gula yang digunakan ialah sukrosa teknis.
a. Ekstrak Kentang
Dua ratus gram kentang yang telah dikupas dipotong dadu, kemudian di rebus dalam 1 liter
air selama 20 menit. Setelah itu, air rebusan disaring, lalu ditambahkan antibiotik
kloramfenikol 0.03 grL dan ditambahkan gula sesuai dengan perlakuan, kemudian di tera
hingga 1 liter. Sebelum disterilisasi, sebanyak 300 ml ekstrak kentang dituang ke dalam
erlenmeyer 1 liter. Media selanjutnya di- sterilisasi pada suhu 121
o
C dan tekanan 1 atm selama 20 menit.
b. Ekstrak Kedelai
Satu kilogram kedelai direbus dalam air sebanyak 3 liter selama 15 menit, kemudian
dibiarkan selama 24 jam, lalu air rendaman kedelai disaring dan ditambah antibubble 0.2
mlL dan antibiotik kloramfenikol 0.03 grL. Setelah itu, ditambahkan gula sesuai dengan
perlakuan, dan air hingga volumenya mencapai 3 liter. Sebelum disterilisasi, 300 ml ekstrak
kedelai dituang ke dalam erlenmeyer 1 liter. Media selanjutnya disterilisasi selama 20 menit
pada suhu 121
o
C dan tekanan 1 atm.
Gambar 2 Produksi massal biomassa miselia R. oligosporus
Isolat yang terpilih R. oligosporus, yaitu isolat yang menghasilkan pertumbuhan miselia
paling cepat tetapi bersporulasi paling lambat atau menghasilkan spora dalam jumlah sedikit,
ditumbuhkan pada 100 ml media PDA dalam
erlenmeyer 250 ml selama 5 hari, kemudian kultur ditambah air steril sebanyak 30 ml
dan dikocok sampai sporanya larut dalam air. Setelah itu, larutan spora dituangkan ke
dalam 300 ml ekstrak kedelai steril dalam erlenmeyer 1 liter dengan kondisi aseptik,
lalu diinkubasi selama 5 hari dengan shaker Gambar 2.
III. Perlakuan penurunan asam nukleat
. Penurunan asam nukleat dilakukan
dengan cara memanaskan massa miselia selama 15 menit pada suhu 50
o
C dan 65
o
C dalam penangas air. Setelah itu miselia
disaring dengan menggunakan kain kassa steril dan dikering ovenkan pada suhu 40
o
C selama 4-5 hari. Setelah itu bobot keringnya
ditimbang, sampel selanjutnya dianalisis kandungan asam nukleatnya. Miselia tanpa
perlakuan pemanasan digunakan sebagai kontrol.
Analisis kandungan asam nukleat di- lakukan sebagai berikut, Sebanyak 1.5 gram
miselia kering R. oligosporus dicuci dengan air dingin sebanyak dua kali, kemudian
dihaluskan. Selanjutnya di-tambahkan 5 ml larutan PCA Perchloric Acid 0.5 N dingin
dan larutan disentrifugasi selama 15 menit pada suhu 4
o
C pada 3000 rpm. Bagian residu yang dihasilkan dilarutkan dalam 5
ml PCA 0.5 N dan dipanaskan pada suhu 100
o
C selama 15 menit. Setelah dingin larutan tersebut disentrifugasi selama 15
menit pada 3000 rpm. Bagian supernatan yang dihasilkan kemudian dianalisis meng-
gunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 260 nm.
HASIL
I. Isolasi dan Identifikasi Hasil isolasi dari 12 jumlah sampel
tempe yang berasal dari 12 daerah di Indonesia, diperoleh 58 isolat Tabel 1. Ke-
58 isolat teridentifikasi ke dalam 3 spesies, yaitu Rhizopus oryzae, R. stolonifer dan R.
oligosporus
berdasarkan morfologi sporangiofor, sporangium, sporangiospora
dan rizoid Tabel 2. R. oligosporus merupakan spesies yang dijumpai pada
seluruh sampel tempe. R. stolonifer dijumpai pada 10 sampel tempe dan tidak dijumpai
pada sampel yang berasal dari Aceh dan Yogyakarta. Sedangkan R. oryzae hanya
dijumpai pada 3 sampel yang berasal dari Cilegon, Jakarta dan Yogyakarta Tabel 1.
Karakteristik setiap spesies Rhizopus yang berhasil diisolasi dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 1 Hasil pemurnian dan identifikasi Rhizopus yang berasal dari sampel tempe
Lokasi Jumlah
isolat Hasil Identifikasi
Aceh 4 R. oligosporus
Padang 6 R. oligosporus,
R. stolonifer Cilegon 5
R. oligosporus, R. Stolonifer, R. oryzae
Jakarta 7 R. oligosporus,
R. Stolonifer, R. oryzae Bekasi 4
R. oligosporus, R. Stolonifer
Bogor 5 R. oligosporus,
R. Stolonifer Yogyakarta 5 R. oligosporus, R. oryzae
Malang 5 R. oligosporus,
R. Stolonifer Jember 4
R. oligosporus, R. oryzae Bondowoso 5
R. oligosporus, R. Stolonifer
Situbondo 4 R. oligosporus,
R. Stolonifer Balikpapan 4
R. oligosporus, R. Stolonifer
Total Isolat 58
Tabel 2 Identifikasi Rhizopus berdasarkan kunci identifikasi Rifai 1973
Spesies Karakteristik Identifikasi
R. oryzae
- sporangiofor dan sporangium selalu membentuk sporangiospora.
- ukuran spora berkisar 8-9 µm. - Sporangiofor berizoid kaku dan
dengan panjang dari 2-4 mm.
R. stolonifer
- sporangiofor dan sporangium selalu membentuk sporangiospora.
- ukuran spora berkisar 16-20 µm. - Sporangiofor berizoid kaku dan
dengan panjang dari 2-4 mm.
R. oligosporus
- sporangiofor dan sporangium selalu membentuk sporangiospora.
- ukuran spora berkisar 12-15 µm. - permukaan spora halus tidak
bergaris.
Diperoleh dari hasil identifikasi.
a b
c
S sf
st sp
50µm 50µm
50µm
Gambar 3 Struktur mikroskopis Rhizopus dengan perbesaran 40x pada media air. a. R.
oryzae., b. R. stolonifers, c. R. oligosporus S Sporangium, sf sporangiofor, st stolon,
sp kumpulan spora
Kurva rata-rata bobot kering R. oligosporus pada media cair ekstrak kentang dan kedelai
0.2 0.4
0.6 0.8
1
1 2
3 4
5 6
Konse ntrasi gula grL R
a ta
-r a
ta b
o bo
t ke
r ing
m is
e li
a
R . ol
igos por
u s
g r
Ekstrak kedelai Ekstrak kentang
kurva rata-rata pertumbuhan miselia R. oryzae, R. stolonifer dan R. oligosporus
0.5 1
1.5 2
2.5 3
3.5 4
4.5 5
1 2
3 4
5 Hari ke-
R a
ta -r
a ta
pe rt
um buha
n m
is el
ia cm
R. oryzae R. stolonifer
R. oligosporus
Diagram rata-rata jumlah spora R. oryzae, R. stolonifer dan R. oligosporus
0.5 1
1.5 2
spesies
J u
m lah
s p
o ra
d a
la m
10 m
l
II. Produksi Miselia
